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Biology

सी एलिगेंस में भागा पेप्टाइड विषाक्तता को मापने

Published: April 30, 2020 doi: 10.3791/61024
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

दोहराने से जुड़े गैर-एटीजी-निर्भर ट्रांसलेशनल उत्पाद कई दोहराने विस्तार आधारित बीमारियों की रोगजनक विशेषताएं उभर रहे हैं। वर्णित प्रोटोकॉल का लक्ष्य मॉडल सिस्टम सी एलिगेंसमें व्यवहार और सेलुलर परखों का उपयोग करके इन पेप्टाइड्स के कारण विषाक्तता का मूल्यांकन करना है।

Abstract

सी एलिगेंस का उपयोग आमतौर पर उम्र से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों को मॉडल करने के लिए किया जाता है, जो दोहराने वाले विस्तार उत्परिवर्तनों के कारण होते हैं, जैसे एम्योट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस) और हंटिंगटन की बीमारी। हाल ही में, दोहराने विस्तार युक्त आरएनए को दोहराने से जुड़े गैर-अगस्त-निर्भर (आरएएन) अनुवाद नामक प्रोटीन अनुवाद के एक उपन्यास प्रकार के लिए सब्सट्रेट दिखाया गया था। विहित अनुवाद के विपरीत, भागा अनुवाद को स्टार्ट कोडन की आवश्यकता नहीं होती है और केवल तभी होता है जब दोहराता है एक सीमा लंबाई से अधिक होता है। क्योंकि पढ़ने के फ्रेम को निर्धारित करने के लिए कोई शुरुआत कोडन नहीं है, भागा अनुवाद भावना और एंटीसेंस आरएनए टेम्पलेट्स दोनों से सभी रीडिंग फ्रेम में होता है जिसमें दोहराने वाला विस्तार अनुक्रम होता है। इसलिए, भागा अनुवाद संभावित रोग से जुड़े विषाक्त पेप्टाइड्स की संख्या को एक से छह तक बढ़ाता है। इस प्रकार अब तक, भागा अनुवाद आठ अलग-अलग दोहराने विस्तार आधारित न्यूरोडीजेनेरेटिव और न्यूरोमस्कुलर रोगों में प्रलेखित किया गया है। प्रत्येक मामले में, यह समझना कि कौन से उत्पाद जहरीले हैं, साथ ही विषाक्तता के उनके तंत्र, यह समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है कि ये पेप्टाइड्स रोग रोग विज्ञान में कैसे योगदान देते हैं। इस पेपर में, हम मॉडल सिस्टम सी एलिगेंस में आरएएन पेप्टाइड्स की विषाक्तता को मापने के लिए रणनीतियां प्रस्तुत करते हैं। सबसे पहले, हम सी एलिगेंसके विकास और गतिशीलता पर RAN पेप्टाइड विषाक्तता को मापने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं । दूसरा, हम गतिशीलता पर भागा पेप्टाइड्स के पोस्टडेवलपमेंटल, आयु-निर्भर प्रभावों को मापने के लिए एक परख का विस्तार करते हैं। अंत में, हम न्यूरॉन आकृति विज्ञान पर आरएएन पेप्टाइड्स के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक न्यूरोटॉक्सिकपरेपन का वर्णन करते हैं। ये परखों से आरएएन पेप्टाइड विषाक्तता का व्यापक आकलन प्रदान किया जाता है और रोग तंत्र या उपचारों की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर आनुवंशिक या छोटे अणु स्क्रीन प्रदर्शन के लिए उपयोगी हो सकता है।

Introduction

डीएनए रिपीट दृश्यों का अनुचित विस्तार कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस), फ्रंटोटेम्पोरल डिमेंशिया (एफटीडी), और हंटिंगटन की बीमारी (एचडी)1के लिए आनुवंशिक आधार है। जबकि इन रोगों के लिए स्थापित सेलुलर और पशु मॉडल हैं, इन स्थितियों में अंतर्निहित तंत्र अच्छी तरह से परिभाषित नहीं हैं। उदाहरण के लिए, एचडी हंटिंगटिन प्रोटीनएचटीटी 2के लिए कोडिंग अनुक्रम में कैग दोहराने के अनुक्रम के विस्तार के कारण होता है। क्योंकि कैग अमीनो एसिड ग्लूटामाइन को एन्कोड करता है, सीएजी दोहराता है कि टीएचटी के भीतर पॉलीग्लूटामाइन या पॉलीक्यू, अनुक्रम के सम्मिलन में विस्तार होता है। विस्तारित पॉलीक्यू प्रोटीन लंबाई और उम्र पर निर्भर प्रोटीन समुचित रूप से होता है जो विषाक्तता3,,4से जुड़े होते हैं। आश्चर्य की बात है, हाल के दो अध्ययनों से पता चलता है कि पॉलीक्यू अनुक्रम की लंबाई एचडी रोग की शुरुआत का मुख्य चालक नहीं है, यह सुझाव देते हुए कि पॉलीक्यू-स्वतंत्र कारक भी5,6रोगमें योगदान दे सकते हैं।

एक संभावित पॉलीक्यू-स्वतंत्र तंत्र में एक नए खोजे Aगए प्रकार के प्रोटीन अनुवाद शामिल हैं, जो आरए ए सोशिएट एनऑन-अगस्त-निर्भर (आरएएन) अनुवाद7कहा जाता है। जैसा कि इसका नाम निकलता है, भागा अनुवाद केवल तब होता है जब एक विस्तारित दोहराने वाला अनुक्रम मौजूद होता है और इसके लिए विहित स्टार्ट कोडन की आवश्यकता नहीं होती है। इसलिए, भागा अनुवाद दोहराने के सभी तीन पढ़ने के फ्रेम में होता है तीन अलग पॉलीपेप्टाइड्स का उत्पादन करने के लिए। इसके अलावा, क्योंकि कई जीन भी एक एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्ट का उत्पादन करते हैं जिसमें विस्तारित दोहराने अनुक्रम का रिवर्स पूरक होता है, भागा अनुवाद एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्ट के सभी तीन रीडिंग फ्रेम में भी होता है। एक साथ, भागा अनुवाद एक पेप्टाइड से छह पेप्टाइड्स तक विस्तारित दोहराने वाले डीएनए अनुक्रम से उत्पादित प्रोटीन की संख्या का विस्तार करता है। आज तक, भागा अनुवाद कम से कम आठ अलग-अलग दोहराने वाले विस्तार विकारों8में देखा गया है। डॉ . पेप्टाइड्स पोस्टमॉर्टम में मरीज के नमूनों में देखा जाता है और केवल ऐसे मामलों में जहां मरीज का विस्तारित रिपीट9,10होता है . जबकि ये पेप्टाइड्स रोगी कोशिकाओं में स्पष्ट रूप से मौजूद हैं, रोग रोग विज्ञान में उनका योगदान अस्पष्ट है।

आरएएन पेप्टाइड्स से जुड़ी संभावित विषाक्तता को बेहतर ढंग से परिभाषित करने के लिए, कई समूहों ने विभिन्न मॉडल प्रणालियों में प्रत्येक पेप्टाइड व्यक्त किया है, जैसे खमीर, मक्खियों, चूहों और ऊतक संस्कृति कोशिकाओं11,,12,,13,,14,,15,,16। अभिव्यक्ति के लिए दोहराने के अनुक्रम का उपयोग करने के बजाय, ये मॉडल एक कोडन-भिन्नता दृष्टिकोण को नियोजित करते हैं जिसमें दोहराने का अनुक्रम समाप्त हो जाता है लेकिन अमीनो एसिड अनुक्रम को संरक्षित किया जाता है। अनुवाद दीक्षा एक विहित ATG के माध्यम से होता है और पेप्टाइड आम तौर पर एन या सी-टर्मिनस पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़ा हुआ है, जिनमें से न तो भागना पेप्टाइड विषाक्तता के साथ हस्तक्षेप प्रतीत होता है । इसलिए, प्रत्येक निर्माण एक ही भागा पेप्टाइड को ओवरएक्सप्रेस करता है। सरल परख के साथ एक बहुकोशिकीय जीव में विभिन्न भाग उत्पादों मॉडलिंग के लिए सरल परख के साथ RAN पेप्टाइड विषाक्तता को मापने के लिए महत्वपूर्ण है समझने के लिए कैसे प्रत्येक रोग से विभिन्न भाग उत्पादों के कारण दोहराने के विस्तार सेलुलर रोग और न्यूरोडिजेनरेशन के लिए योगदान महत्वपूर्ण है ।

अन्य मॉडल प्रणालियों की तरह, सी एलिगेंस एक लचीला और कुशल प्रयोगात्मक मंच प्रदान करता है जो नए रोग तंत्र के अध्ययन को सक्षम बनाता है, जैसे कि आरएएन पेप्टाइड विषाक्तता। कीड़े कई अद्वितीय प्रयोगात्मक विशेषताएं प्रदान करते हैं जो वर्तमान में आरएएन पेप्टाइड विषाक्तता के अन्य मॉडलों में उपलब्ध नहीं हैं। सबसे पहले, सी एलिगेंस जन्म से मृत्यु तक ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी होते हैं। यह RAN पेप्टाइड अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण के सरल दृश्य के साथ-साथ जीवित जानवरों में न्यूरोडिजेनरेशन के वीवो विश्लेषण में अनुमति देता है। दूसरा, RAN पेप्टाइड अभिव्यक्ति मॉडल पैदा करने के लिए ट्रांसजेनिक तरीके सस्ती और तेज हैं। सी एलिगेंसके छोटे तीन दिवसीय जीवन चक्र को देखते हुए, स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों को एक सेल प्रकार विशिष्ट तरीके से किसी भी दिया गया आरएएन पेप्टाइड को व्यक्त करने के लिए एक सप्ताह के तहत उत्पादित किया जा सकता है । तीसरा, सरल फेनोटाइपिक आउटपुट को आनुवंशिक स्क्रीनिंग विधियों के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे रासायनिक म्यूटाजेनेसिस या आरएनएआई स्क्रीनिंग, तेजी से RAN पेप्टाइड विषाक्तता के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए। अंत में, सी एलिगेंस (~ 20 दिनों) की छोटी उम्र जांचकर्ताओं को यह निर्धारित करने की अनुमति देती है कि उम्र बढ़ने कैसे, जो सबसे दोहराने वाले विस्तार रोगों के लिए सबसे बड़ा जोखिम कारक है, भागा पेप्टाइड विषाक्तता को प्रभावित करता है। साथ में, प्रयोगात्मक विशेषताओं का यह संयोजन किसी भी अन्य मॉडल प्रणाली में बेजोड़ है और आरएएन पेप्टाइड विषाक्तता के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करता है।

यहां हम कई परखों का वर्णन करते हैं जो आरएएन पेप्टाइड्स की विषाक्तता को मापने और इस विषाक्तता के आनुवंशिक संशोधकों की पहचान करने के लिए सी एलिगेंस के प्रायोगिक फायदों का लाभ उठाते हैं। कोडन-विविध एटीजी-शुरू किए गए आरएएन पेप्टाइड्स को जीएफपी के साथ टैग किया जाता है और मायो-3 प्रमोटर के तहत या यूएनसी-47 प्रमोटर के तहत गैबार्गिक मोटर न्यूरॉन्स में व्यक्तिगत रूप से व्यक्त किया जाता है। मांसपेशियों की कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि विषाक्त RAN पेप्टाइड्स को हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) टैग के साथ टैग किया जाता है जिसे आरएनएआई फीडिंग वेक्टर के साथ लक्षित किया जा सकता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि विषाक्त भागा पेप्टाइड अभिव्यक्ति आमतौर पर विकास को अवरुद्ध करती है, इस तरह के उपभेदों को अव्यवहार्य प्रदान करती है। जीएफपी (आरएनएआई) का उपयोग सशर्त RAN पेप्टाइड अभिव्यक्ति को निष्क्रिय करता है और तनाव रखरखाव, आनुवंशिक क्रॉस आदि की अनुमति देता है। परखों के लिए, इन जानवरों को जीएफपी (आरएनएआई)से हटा दिया जाता है, जो आरएएन पेप्टाइड और परिणामस्वरूप फेनोटाइप की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। कोडन-विविध भागा पेप्टाइड अभिव्यक्ति निर्माण डिजाइन करने के लिए आणविक रणनीति के अलावा, हम विकासात्मक विषाक्तता (लार्वा गतिशीलता और विकास परख), विकासके बाद की उम्र से जुड़ी विषाक्तता (पक्षाघात परख), और न्यूरॉन रूपात्मक दोषों (संजीदगी परख) को मापने के लिए परखों का वर्णन करते हैं।

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Protocol

1. कोडन-विविध आरएएन पेप्टाइड अभिव्यक्ति का निर्माण

  1. डिजाइन व्यक्ति भागा पेप्टाइड कोडिंग अनुक्रम मौलिक दोहराव डीएनए/आरएनए संरचना को खत्म करने के लिए पर्याय वाधिओं का उपयोग लेकिन अंतर्निहित अमीनो एसिड अनुक्रम की रक्षा ।
  2. अध्ययन के लिए आवश्यक दोहराने की लंबाई पर व्यावसायिक रूप से कस्टम कोडन दृश्यों को ऑर्डर करें (आमतौर पर 5-100 दोहराता है)। 5 ' अंत में एक हिंडIII प्रतिबंध साइट और 3 ' अंत में एक BamHI प्रतिबंध साइट शामिल करने के लिए सी elegans अभिव्यक्ति वैक्टर, जैसे pPD95.79 में क्लोनिंग की सुविधा ।
    नोट: यदि बड़े निर्माणों का संश्लेषण मुश्किल साबित होता है, तो छोटे बिल्डिंग ब्लॉक दृश्यों को संश्लेषित किया जा सकता है और फिर एक दिशात्मक लिगेशन रणनीति17का उपयोग करके बड़े दोहराता में बनाया गया है।
  3. मानक T4 लिगेशन विधियों का उपयोग करके सी एलिगेंस एक्सप्रेशन वेक्टर में पेप्टाइड अनुक्रम को सबक्लोन करें।
  4. ऊतक-विशिष्ट आरएएन पेप्टाइड-जीएफपी अभिव्यक्ति को चलाने के लिए आरएएन पेप्टाइड अनुक्रम के सामने पीसीआर द्वारा उत्पन्न एक सेल प्रकार-विशिष्ट प्रमोटर अनुक्रम को सबक्लोन करें।
  5. माइक्रोइंजेक्ट रैन पेप्टाइड मानक विधियों18का उपयोग करके एक्सेक्रोमोसोमल सरणी युक्त ट्रांसजेनिक उपभेदों को उत्पन्न करने के लिए जंगली प्रकार सी एलिगेंस के गोनाड में निर्माण करता है। सह-इंजेक्शन मार्कर के लिए, मांसपेशियों के विशिष्ट आरएफपी रिपोर्टर(मायो-3पी:: आरएफपी (pCFJ104))का उपयोग किया गया था, हालांकि अन्य मार्कर का भी उपयोग किया जा सकता है।
  6. मानक सी एलिगेंस एकीकरण स्क्रीनिंग विधियों19का उपयोग करजीनोम में एक स्थिर ट्रांसजीन को एकीकृत करें।
  7. यदि भागा पेप्टाइड विषाक्त है और ट्रांसजेनिक जानवर जीवित नहीं रहते हैं, तो जहरीले प्रोटीन की अभिव्यक्ति को शांत करने के लिए बैक्टीरिया पूर्व और इंजेक्शन के बाद व्यक्त करने वाले जानवरों को खिलाएं।
    नोट: जीएफपी (आरएनएआई) से जानवरों को हटाने से नीचे वर्णित परखों का उपयोग करके फेनोटाइपिक विश्लेषणों के लिए आरएएन पेप्टाइड अभिव्यक्ति सक्षम बनाता है।

2. आरएनएआई-आधारित जीन नॉकडाउन के बाद आरएएन पेप्टाइड्स की विकासात्मक विषाक्तता को मापना: वीडियो गति विश्लेषण प्रोटोकॉल

  1. 1 mm आइसोप्रोपिल के साथ स्टैंडर्ड नेमाटोड ग्रोथ मीडियम (एनजीएम) आरएनएआई 24 वेल प्लेट्स डालो-डी-1-थिओगलकटोपिरानोसाइड (आईपीटीजी) और 25 μg/mL कार्बेनिकलिन ।
  2. HT115 बैक्टीरिया में RNAi खिला क्लोन बाहर लकीर Luria शोरबा (पौंड) + carbenicillin (25 μg/mL) आगर प्लेटों पर परीक्षण किया जाएगा और 24 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया बढ़ने के लिए विषाक्तता और GFp (RNAi) के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में खाली वेक्टर (RNAi) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल हैं ।
  3. प्रत्येक क्लोन के लिए, एलबी + कार्बेनसिलिन तरल मीडिया के 1 मिलील में एक ही कॉलोनी चुनें और प्रति मिनट 250 घूर्णन (आरपीएम) पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए रात भर बैक्टीरिया बढ़ें।
  4. निम्नलिखित रातों में जीवाणु संस्कृतियों के 20 माइक्रोन के साथ एनजीएम आरएनएआई 24 कुओं के चार व्यक्तिगत कुओं को स्पॉट करें: कॉलम 1 कुएं = जीएफपी (आरएनएआई); कॉलम 2 कुएं = (ईवी) आरएनएआई; कॉलम 3-6 कुओं = जीन के खिलाफ आरएनएआई परीक्षण किया जाएगा। आरएनएआई बैक्टीरिया को कमरे के तापमान (आरटी) पर रात भर dsRNA उत्पादन को प्रेरित करने की अनुमति दें।
  5. एक दिन से अंडे अलग एक वयस्क सी elegans एकीकृत RAN पेप्टाइड ट्रांसजीन व्यक्त मानक हाइपोक्लोराइट विधि और बीज ~30 सी elegans अंडे एनजीएम RNAi 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में ।
  6. 24 कुओं को 7 दिन के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह इनक्यूबेशन समय विषाक्त C9orf72 आरएएन डिपेप्टाइड्स, जैसे PR50 या GR50 व्यक्त उपभेदों के लिए है। अन्य उपभेदों को बैक्टीरियल खाद्य स्रोत और बाद में भुखमरी की थकावट को रोकने के लिए इनक्यूबेशन बार कम की आवश्यकता हो सकती है।
  7. एक Leica MZ16FA स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रेषित प्रकाश वीडियो प्राप्त एक DFC345FX मोनोक्रोम कैमरे के साथ लगे एक विंडोज संगत पीसी चल Leica AF वीडियो अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (संस्करण 2.6.0.7266) से जुड़े ।
    1. कुओं के बीच लगातार वीडियो अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करके प्रत्येक आरएनएआई स्थिति के लिए दो अलग-अलग कुओं से दो वीडियो प्राप्त करें। प्रत्येक वीडियो के लिए, 18.6 X आवर्धन (एएफ सॉफ्टवेयर में 1.49 जूम सेटिंग) का उपयोग करके 800 x 600 पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन और 13.16 फ्रेम प्रति सेकंड (समय स्वर आयाम = 0.076 सेकंड) पर 10 सेकंड प्राप्त करें। इमेज एक्सपोजर को 4 मिलीसेकंड तक सेट करें। प्रत्येक वीडियो को तुरंत तनाव, आरएनएआई स्थिति और अच्छी तरह से संख्या के साथ लेबल करें।
  8. वीडियो के आदेश को यादृच्छिक बनाकर और वीडियो का नाम संख्याओं में बदलकर प्रत्येक वीडियो फ़ाइल से जुड़े जीनोटाइप के लिए प्रयोगकर्ता को अंधा करें। वीडियो के इस समूह को एक नई फ़ाइल के रूप में सहेजें। विश्लेषण पूरा होने के बाद प्रयोगकर्ता को अनब्लाइंड कर दिया गया है।
  9. प्रत्येक वीडियो से 20 विभिन्न जानवरों के लिए 'दूरी कूच' और प्रत्येक जानवर की लंबाई को मापें, प्रत्येक आरएनएआई स्थिति के लिए कुल ~ 40 कीड़े की जांच करें।
    1. सॉफ्टवेयर में, एनोटेशन टूल बटन का चयन करें, फिर ड्रा टेक्स्ट टूल। कीड़ा के केंद्र में एक बिंदु पर क्लिक करें वीडियो के पहले फ्रेम में मापा जा रहा है और यह एक संख्या के रूप में चिह्नित । नेत्रहीन कीड़ा के आंदोलन पथ पर नज़र रखने के दौरान वीडियो को अंत तक अग्रिम करें। अंतिम फ्रेम में, कीड़ा मापा जा रहा है और अगले इसी संख्या को चिह्नित करने के केंद्र में एक बिंदु पर क्लिक करें । फिर, ड्रा स्केलबार टूल का उपयोग करके, "दूरी कूच" रिकॉर्ड करने के लिए पहले नंबर से दूसरे नंबर पर एक लाइन खींचें।
    2. 'दूरी कूच' दो सेंट्रोइड बिंदुओं के बीच की दूरी है। यह दूरी माप रेखा से सटी दिखाई गई है। इस माप को स्प्रेडशीट में रिकॉर्ड करें। विश्लेषण खिड़की में प्रत्येक व्यक्तिमाप को संरक्षित करते समय वीडियो में 19 अन्य कीड़े के लिए इस माप को दोहराएं।
  10. जानवरों से माप बनाने के लिए कोई आंदोलन का प्रदर्शन और पक्षाघात की ओर डेटा पक्षपाती जानवरों के चयन से बचने के लिए सबसे मजबूत आंदोलन का प्रदर्शन । एक बार माप पूरा हो जाने के बाद, अंतिम वीडियो फ्रेम का एक स्नैपशॉट लें जो सभी माप रेखाओं को दर्शाती है ताकि डेटा को उस जानवर को वापस ढूंढा जा सके जहां से यह उत्पन्न हुआ था।
  11. चार कॉलम स्प्रेडशीट का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें। कॉलम एक कीड़ा "पहचानकर्ता" है, कॉलम दो दूरी कूच/
    1. प्रत्येक वीडियो का समय प्रयोग के तहत वीडियो पर सही क्लिक करके और वीडियो के गुणों पर जाकर पाया जा सकता है।
  12. क्वांटिफाई का चयन करके प्रत्येक जानवर की लंबाई खोजकर गति माप को सामान्य करें, फिर सॉफ्टवेयर पर आंकड़े। वीडियो डिस्प्ले पर एनोटेशन टूल आइकन पर क्लिक करने से "ड्रा पॉलीलाइन" टूल के उपयोग के लिए अनुमति देनी चाहिए। इस उपकरण का उपयोग सिर की नोक से लेकर पूंछ की नोक तक वीडियो से सी एलिगेंस को स्वतंत्र रूप से ट्रेस करने के लिए किया जा सकता है। आंकड़ों के तहत लाइन की लंबाई दर्ज की जाएगी।
    1. सी एलिगेंस को आकार देने के लिए उपयोग किए जाने वाले पॉलीलाइन के सभी को दर्शाते हुए अंतिम वीडियो फ्रेम का एक स्नैपशॉट लें ताकि डेटा को उस जानवर को वापस ढूंढा जा सके जहां से उनकी उत्पत्ति हुई थी।
  13. स्प्रेडशीट में दो अतिरिक्त कॉलम जोड़कर डेटा का विश्लेषण करें। कॉलम तीन "पशु लंबाई" है, और कॉलम चार "सामान्यीकृत गति" (गति/पशु लंबाई) है । खाली वेक्टर (आरएनएआई)बनाम पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एक-तरफा ANOVA का उपयोग करके सामान्यीकृत गति डेटा का विश्लेषण करें।

3. भागा पेप्टाइड की विकासात्मक विषाक्तता को मापने: विकास परख

  1. हाइपोक्लोराइट समाधान के 50 माइक्रोन स्पॉट (ब्लीच के 10 मिलील, 10 एन नाओएच के 2.5 मिलील, डीएच2ओ का 37.5 मिलील) में ~ 30 ग्रेविड जानवरों को या तो जीएफपी (आरएनएआई), (ईवी) आरएनएआई, या (जीन-विशिष्ट) 6 सेमी आरएनएआई प्लेट पर चुनें।
  2. 24 घंटे के बाद, छह ट्रांसजेनिक संतान को स्थानांतरित करें जो प्लेट पर आरएनएआई की शर्तों के समान एक नई 6 सेमी आरएनएआई प्लेट के लिए हाइपोक्लोराइट समाधान स्थान से बाहर निकलते हैं जिस पर उन्हें हाइपोक्लोराइट समाधान उपचार के अधीन किया गया था। इन संतान (F1) को बढ़ने और पुन: पेश करने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. 24-48 घंटे के बाद, 6 सेमी RNAI पर 10 ट्रांसजेनिक L4 जानवरों को लेने के लिए RNAI शर्तों है कि जानवरों पर बढ़ रहा है मिलान । जानवरों को 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए अंडे डालने की अनुमति दें।
  4. 24 घंटे के बाद वयस्क जानवरों को निकालकर त्याग दें। यांत्रिक हैंडहेल्ड काउंटर का उपयोग करके 24 घंटे की अवधि के दौरान रखे गए अंडों और एल1 लार्वा की संख्या की गणना करें। यह कुल चिंता का आकार है।
  5. अगले 72 घंटे से अधिक, एल 4 या पुराने चरण तक पहुंचने वाले जानवरों की संख्या गिनें। जैसे-जैसे प्रत्येक जानवर की गणना की जाती है, उसे प्लेट से हटा दें।
  6. कुल चिंता आकार से एल 4 या पुराने चरण तक पहुंचने वाले जानवरों के प्रतिशत के रूप में "प्रतिशत वृद्धि" की मात्रा निर्धारित करें।
  7. एक 2 x 2 फिशर के सटीक परीक्षण बनाम खाली वेक्टर (RNAi) प्रदर्शन करने के लिए निर्धारित अगर प्रतिशत वृद्धि सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है । तुलना के लिए श्रेणियां "विकास" (जानवरों की # हैं जो 72 घंटे में एल 4 या पुराने चरण तक पहुंच गई हैं) और "नो ग्रोथ" (कुल चिंता आकार 72 एच में एल 4 या पुराने चरण तक पहुंचने वाले जानवरों की संख्या को कम कर ते हैं)।

4. विकास के बाद भागा पेप्टाइड पक्षाघात परख

  1. एकीकृत सी एलिगेंस ट्रांसजेनिक उपभेदों को बनाए रखें जीएफपी(आरएनएआई) पर मांसपेशियों में आरएएन पेप्टाइड-जीएफपी व्यक्त करते हुए 4-6 ट्रांसजेनिक एल4 को 6 सेमी जीएफपी(आरएनएआई) प्लेट पर रखकर और कीड़े को 20 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाएं।
  2. यदि प्रयोग आरनई का उपयोग कर रहा है RAN पेप्टाइड विषाक्तता पर आनुवंशिक प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए, एक भूखे प्लेट से 10 ट्रांसजेनिक gravid वयस्कों को दो 6 सेमी खाली वेक्टर(आरएनएआई) (पक्षाघात के लिए सकारात्मक नियंत्रण, आनुवंशिक प्रभावों के लिए नकारात्मक नियंत्रण), जीएफपी (आरएनएआई) (पक्षाघात के लिए नकारात्मक नियंत्रण, आनुवंशिक प्रभावों के लिए सकारात्मक नियंत्रण), जीन-विशिष्ट(आरएनएआई) (यानी, 10, 10
  3. यदि म्यूटेंट का उपयोग आरएएन पेप्टाइड विषाक्तता पर आनुवंशिक प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए किया जा रहा है, तो 10 ग्रेविड डब्ल्यूटी या उत्परिवर्ती जानवरों को दो 6 सेमी खाली वेक्टर(आरएनएआई) या जीएफपी (आरएनएआई) प्लेटों में से प्रत्येक पर एक ही भागा ट्रांसजीन व्यक्त करें। 48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े उगाएं।
  4. 6 सेमी आरएनएआई प्लेटसे 10 ट्रांसजेनिक एल4 के 10 सेट चुनें और प्रत्येक सेट को 3 सेमी आरएनएआई प्लेट (यानी, एन = 100 जानवरों पर प्रत्येक जीनोटाइप के लिए रखें)। सुनिश्चित करें कि परख के लिए L4 का चयन सभी सतही रूप से सामान्य गतिशीलता है। नमी बनाए रखने के लिए प्लेटों को जिपर स्टोरेज बैग के भीतर रखें।
  5. 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में L4's के साथ जीता प्लेटें रखें।
  6. जानवरों को 24 घंटे बाद 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर एक तनाव से एक समय में हटा दें ताकि वे आरटी में बाहर होने वाले समय की मात्रा को कम कर सके।
  7. आंदोलन की जांच करने के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर प्लेटों को टैप करें। यदि जानवर शरीर की लंबाई से अधिक ले जाते हैं, तो जानवर को मोबाइल के रूप में गिनें और इसे एक नई 3 सेमी आरएनएआई प्लेट में स्थानांतरित करें। सिर या पूंछ पर शेष कीड़े को टैप करने के लिए प्लेटिनम पिक का उपयोग करें। यदि जानवर शरीर की लंबाई से अधिक चलता है, तो जानवर को मोबाइल के रूप में गिनें और इसे एक नई 3 सेमी आरएनएआई प्लेट में स्थानांतरित करें।
    नोट: स्थानांतरित करते समय प्रति प्लेट 10 कीड़े से अधिक न करें। नई RNAi थाली में संतान चलती से बचने के लिए सावधान रहें क्योंकि परख केवल वृद्ध जानवरों के बाद पर निर्भर करता है ।
  8. सभी गैर-चलती कीड़े को एक साथ समूहित करें ताकि शरीर की लंबाई से अधिक की गति का आसानी से पता लगाया जा सके। जानवर को एक से अधिक शरीर की लंबाई को स्थानांतरित करने के लिए कम से कम एक मिनट दें। यदि यह अभी भी आगे नहीं बढ़ता है, तो इसे लकवा मार दिया जाता है, जीता जाता है (यानी, मां के अंदर स्थित लार्वा), या मृत।
  9. उन जानवरों को सेंसर करें जो बैगिंग को प्रदर्शित करते हैं, प्लेट के किनारों पर देते हैं, बाहर निकलते आंतों का प्रदर्शन करते हैं, बिल करते हैं, खो जाते हैं, या पता लगाने के समय परख से मर जाते हैं। झोले के कीड़े गिने जाते हैं, पुरानी आरएनएआई प्लेट पर छोड़ दिया जाता है, और त्याग दिया जाता है।
  10. 4.6-4.9 चरणों में वर्णित 5-7 दिनों के लिए हर दिन पक्षाघात के लिए जानवरों को स्कोर करें।
  11. उम्र का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लॉग-रैंक परीक्षण के समान पक्षाघात डेटा का विश्लेषण करें। इस सांख्यिकीय विश्लेषण में, चलती कीड़े "जीवित" के रूप में बनाए जाते हैं, झोले के कीड़े "मृत" के रूप में बनाए जाते हैं, और मृत, जीता, आंत बाहर निकाला, desiccated, burrowed, या अंयथा खो कीड़े "सेंसर" के रूप में रन बनाए जाते हैं ।
    नोट: इस विश्लेषण में, "प्रतिशत जिंदा" संख्या "प्रतिशत चलती" जानवरों को इंगित करता है । विलोम "प्रतिशत झोले के मारे" का प्रतिनिधित्व करता है । लॉग-रैंक सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए ऑनलाइन विश्लेषण उपकरण ओएसिस(https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/)का उपयोग करें।

5. न्यूरॉन पैथोलॉजी को मापने: Commissure परख

  1. यूएनसी-47 प्रमोटर का उपयोग करके गैबार्गिक न्यूरॉन्स में रुचि के आरएएन पेप्टाइड को व्यक्त करते हुए ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस उत्पन्न करें। इसके अलावा unc-47p व्यक्त:: GFP या unc-47p:: RFP गाबा न्यूरॉन्स के सेलुलर आकृति विज्ञान प्रकट करने के लिए ।
  2. 50 ट्रांसजेनिक एल4 जानवरों को चुनें और उन्हें 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 6 सेमी OP50 प्लेट पर रखें।
  3. 50 ट्रांसजेनिक जानवरों को 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक नई 6 सेमी OP50 प्लेट पर स्थानांतरित करें।
  4. वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी के तहत जानवरों इमेजिंग के लिए अगारोज पैड बनाएं।
    1. दो माइक्रोस्कोप स्लाइड के शीर्ष पर टेप के दो टुकड़े रखें। दो टेप स्लाइड के बीच में टेप के बिना एक साफ स्लाइड रखें।
    2. 3% पिघला हुआ अगारोज के ~100 माइक्रोन (डिस्पोजेबल प्लास्टिक पाश्चर पिपेट से 1 बूंद) को डिस्पोजेबल बाँझ ट्रांसफर पिपेट के साथ बीच की स्लाइड पर बांटें।
    3. तुरंत पिघला हुआ अगागुलाब की बूंद के पार एक दूसरी साफ स्लाइड रखें ताकि यह टेप स्लाइड पर टिकी रहे और स्लाइड के बीच अगारोज की एक पतली और यहां तक कि परत बनाता है।
    4. आगगुलाब ठंडा और जम जाने के बाद, ध्यान से उन दोनों के बीच अगारोज की परत के साथ दो स्लाइड को हटा दें, उन्हें अलग किए बिना, और उन्हें उनके नीचे कागज के एक नम टुकड़े के साथ एक प्लास्टिक बैग में रखें। तीन अतिरिक्त स्लाइड के साथ जांच की जाएगी प्रति 10 कीड़े एक स्लाइड करें।
  5. ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से निकालें और ग्लास डिप्रेशन स्लाइड में 10 मीटर लेविसोल की 100 माइक्रोन ड्रॉप में 10 ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस चुनें। 10 मेंस या जब तक जानवरों को लकवा मार जाता है तब तक इनक्यूबेट।
  6. प्लास्टिक बैग से एक स्लाइड जोड़ी निकालें और ध्यान से उन्हें अलग करें। जीनोटाइप के साथ अगारोज के साथ स्लाइड को लेबल करें और अगारोज के बीच में 10 mM लेवमिसोल के 2 माइक्रोन जोड़ें। अगारोज पैड पर लेविसोल में 10 जानवरों को ले जाएँ। जानवरों को मोटाई कवरस्लिप #1 से ढक दें।
  7. इमेज एनिमल्स जिनमें योनी ओरिएंटेड है, वह जानवर के दाईं ओर हो। यदि योनी सिर के बाईं ओर है, तो मोटर न्यूरॉन्स के संचार जानवरों के नीचे होंगे और स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं देंगे, जिससे सटीक मात्रा मुश्किल हो जाएगी। इन जानवरों से क्विंटिफिकेशन छोड़ दो। इस अभिविन्यास में, मोटर न्यूरॉन्स के संचार कवरस्लिप के निकटतम हैं और एक उल्टे वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं। 63X 1.4X एनए तेल विसर्जन लेंस और एक Leica L5 GFP फिल्टर सेट (Ex480/40nm) के साथ एक Leica DMI4000B उल्टे वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ GFP व्यक्त न्यूरॉन commissures कल्पना; Em527/30nm) । यदि न्यूरॉन जीएफपी के बजाय आरएफपी को व्यक्त करता है, तो एक Leica TX2 आरएफपी फ़िल्टर सेट (Ex560/40nm) का उपयोग करें; Em645/75nm) ।
    1. 63x 1.4x एनए तेल विसर्जन लेंस और एक GFP फिल्टर सेट (Ex480/40 एनएम) के साथ एक उल्टे वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ GFP व्यक्त न्यूरॉन commissures कल्पना; Em527/30 एनएम) । यदि न्यूरॉन जीएफपी के बजाय आरएफपी को व्यक्त करता है, तो लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) फिल्टर सेट (Ex560/40 एनएम) का उपयोग करें; Em 645/75 एनएम) ।
  8. इमेज इम्मोबिलाइजेशन से विषाक्तता को कम करने के लिए कीड़े पर कवरस्लिप रखने के 45 मिनट के भीतर कीड़े।
  9. प्रत्येक कीड़ा के लिए, दिखाई देने वाले संयोजित की संख्या गिनें। वन्य प्रकार के जानवरों में 16 दृश्यमान संयोजिकाएं हैं। इसके अलावा उन कॉम्मिस्योर की संख्या को गिनें जिनमें बड़े मोतियों (यानी ब्लेब्स) होते हैं, साथ ही टूटे हुए कॉम्मिश्योर की संख्या भी होती है। संयोजिका की पुष्टि करने के लिए टूट गया है, फोकल विमान को समायोजित करके पृष्ठीय कॉर्ड से वेंट्रल कॉर्ड तक संचार का पालन करें।
    नोट: Commissures जिसमें unc-47p:: GFP फ्लोरेसेंस एक अंतर प्रदर्शित करता है टूटा हुआ माना जाता है । एक टूटी हुई संयोजिका आम तौर पर तोड़ने के दोनों ओर एक bleb है, मदद से पता चलता है कि commissures टूट गया है । 20 कीड़े के लिए ब्लबिंग और ब्रेक की मात्रा गिनें।
  10. प्रत्येक जानवर के लिए मनाया संयोजित की कुल संख्या पर ब्लेब्स या ब्रेक के साथ संयोजिका के अंश की गणना करें। प्रति पशु गिना संयोजिकाओं की पूर्ण संख्या (जंगली प्रकार, ब्लब्स्ड, और टूटी हुई घटनाओं सहित) को भी मापा जा सकता है।
  11. प्रत्येक श्रेणी के लिए, मतलब ± एसडी की गणना करें और सांख्यिकीय रूप से दो आबादी के बीच तुलना के लिए छात्र के टी-टेस्ट के साथ विश्लेषण करें, या 3 या उससे अधिक आबादी के बीच तुलना के लिए एक तरह से ANOVA।

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Representative Results

हमने यहां वर्णित परखों का उपयोग जी4सी2 दोहराने के विस्तार के साथ एएलएस रोगियों में पाए जाने वाले आरएएन डाइपेप्टाइड्स की विषाक्तता पर विभिन्न जीन संकोच के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया। विकास ात्मक विषाक्तता को मापने के लिए विकास परख का उपयोग करते हुए, हमने मांसपेशियों-व्यक्त PR50-GFP विषाक्तता के जीनोम-वाइड आरएनएआई स्क्रीन दमन में पहचाने गए कई आनुवंशिक नॉकआउट म्यूटेंट के प्रभावों का विश्लेषण किया। जबकि अकेले PR50-GFP की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप पूरी तरह से अपमानजनक विकास की गिरफ्तारी हुई, कई जीन में कार्य उत्परिवर्तन की हानि ने 12-94%(चित्रा 1A)से पीआर विकासात्मक विषाक्तता को दबा दिया।

हमने वीडियो गति विश्लेषण विधि का उपयोग करके पीआर50-व्यक्त जानवरों के विकासपूर्ण गतिशीलता पर विशिष्ट जीन नॉकडाउन के प्रभाव को भी मापा। जैसा कि उम्मीद थी, जीएफपी (आरएनएआई) के परिणामस्वरूप पीआर50-जीएफपी अभिव्यक्ति के अवरोध के कारण खाली वेक्टर (आरएनएआई) की तुलना में गतिशीलता में बड़ी वृद्धि हुई। हमने यह भी पता लगाया कि प्रोटेसोम सबयूनिट आरपीएन-7 के खिलाफ आरएनएआई के परिणामस्वरूप पीआर50 मोटिटी(चित्रा 1 बी)में उल्लेखनीय वृद्धि हुई।

कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों की तरह एएलएस वयस्कों में होता है। इसलिए, हमने उम्र पर निर्भर पक्षाघात परख का उपयोग करके वयस्क फेनोटाइप का विश्लेषण किया। PR50-GFP 5 दिन की उम्र तक 80% पक्षाघात का प्रदर्शन किया। हालांकि, RNAi जीन cul-6 में निर्देशित काफी देरी पक्षाघात, सुझाव है कि cul-6 PR50-GFP विषाक्तता(चित्रा 1C)के लिए आवश्यक है । यह प्रभाव cul-6 (RNAI) के लिए विशिष्ट था क्योंकि cul-1 (RNAi) PR50-GFP विषाक्तता में परिवर्तन नहीं किया ।

न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रोटीन, जैसे विषाक्त आरएएन पेप्टाइड्स, आमतौर पर सी एलिगन्स4,20,,21,,22के शरीर की दीवार में मॉडलिंग की जाती है।, हालांकि, यह निर्धारित करना भी महत्वपूर्ण है कि क्या आरएएन प्रोटीन सी एलिगेंस न्यूरॉन्स में व्यक्त होने पर न्यूरोपैथोलॉजी का कारण बनता है, क्योंकि न्यूरॉन-विशिष्ट विषाक्तता कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की एक आम विशेषता है। हमने कॉम्मिसपर का उपयोग करके न्यूरॉन-विशिष्ट विषाक्तता की जांच की। दिन में 2 वयस्कों, मोटर न्यूरॉन्स में PR50-GFP अभिव्यक्ति मोटर न्यूरॉन ब्लेबिंग में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई। इस न्यूरोपैथोलॉजी को इंसुलिन/आईजीएफ रिसेप्टर जीन होमोलॉग डैफ-2 में उत्परिवर्तन द्वारा काफी दबा दिया गया था जो कई न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रोटीन23 (चित्रा 2B)के जहरीले गुणों में देरी करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: Assays मांसपेशियों की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए व्यक्त की RAN पेप्टाइड्स व्यक्त की । (A)भागा पेप्टाइड विकास परख । संकेतित म्यूटेंट को जीएफपी (आरएनएआई) स्थितियों के तहत drIs34 (myo-3p::PR50-GFP)आनुवंशिक पृष्ठभूमि में पार कर दिया गया था । प्रत्येक जीनोटाइप से ऊपर की संख्या विकास के लिए अर्जित संतान की संख्या का संकेत देती है । सभी जीनोटाइप में जंगली प्रकार की तुलना में फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करके पी एंड एलटी; 0.05 है। (ख)विकास के दौरान RAN पेप्टाइड विषाक्तता को मापने के लिए वीडियो गति विश्लेषण। drIs34 (myo-3p: :PR50-GFP) जानवरों gfp (RNAi), खाली वेक्टर (RNAi),या rpn-7 (RNAi) शर्तों के तहत उगाया गया और फिर वर्णित के रूप में गतिशीलता के लिए रन बनाए । जीएफपी (आरएनएआई) द्वारा इलाज किए गए जानवरों को गति सामान्य ीकृत की गई थी। दिखाए गए डेटा का मतलब है ± एसडी, एन = 40 प्रत्येक जीनोटाइप के लिए। **-पी एंड एलटी; 0.01, ***- पी एंड एलटी;0.001, टकी पोस्ट-टेस्ट के साथ वन-वे एनोवा। (ग)उम्र की शुरुआत विषाक्तता को मापने के लिए पक्षाघात परख। drIs34 (myo-3p: :PR50-GFP) जानवरों को खाली वेक्टर (आरएनएआई) ('WT'), cul-1 (RNAi),या cul-6 (RNAi) और पक्षाघात पर उगाया गया था के रूप में हर 24 घंटे वर्णित रन बनाए गए । ***-पी एंड एलटी; 0.001, बोनफेरोनी पोस्ट-टेस्ट करेक्शन बनाम डब्ल्यूटी एन = 100 जानवरप्रति जीनोटाइप के साथ लॉग-रैंक टेस्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मोटर न्यूरॉन के न्यूरोपैथोलॉजी को मापने के लिए परख ने रैन पेप्टाइड्स व्यक्त किया। (A) यूएनसी-47p को व्यक्त करने वाले वयस्क सी एलिगेंस की छवियां:: जंगली प्रकार या यूएनसी-47p में GFP मोटर न्यूरॉन रिपोर्टर: :PR50-GFP जानवरों को व्यक्त करता है । जंगली प्रकार के लिए छवियां सामान्य संचार आकृति विज्ञान को दर्शाती हैं। छवियां वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त चपटा जेड-सीरीज स्टैक का प्रतिनिधित्व करती हैं। PR50 जानवरों को संमिश्योर टूटना और ब्लेबिंग के उदाहरण प्रदर्शित करता है। (ख)PR50 कॉम्मिश्योर ब्लबिंग पर डीएएफ-2 (e1370) का प्रभाव । अंक एक ही जानवर से प्रतिशत ब्लबिंग कॉम्मिसिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं, मतलब और एसडी के साथ दिखाया गया है । n = 20 जानवर प्रति जीनोटाइप **-पी एंड एलटी; 0.01, डन के पोस्ट-हॉक टेस्ट के साथ वन-वे एनोवा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हम उन तरीकों की रिपोर्ट करते हैं जिनका उपयोग मांसपेशियों में मॉडलिंग या सी एलिगेंसके न्यूरॉन्स में की गई रैन पेप्टाइड विषाक्तता को परख ने के लिए किया जा सकता है। जबकि न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रोटीन में मानव रोगियों में एक उम्र की शुरुआत फेनोटाइप होती है, वे मॉडल सिस्टम में अधिक व्यक्त होने पर विकासात्मक विषाक्तता का प्रदर्शन भी कर सकते हैं। अतिअभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण व्याख्यात्मक सीमाएं हैं, लेकिन यह जीन या दवाओं की पहचान करने के उद्देश्य से आनुवंशिक या औषधीय स्क्रीन के लिए एक शक्तिशाली प्रारंभिक बिंदु भी प्रदान करता है जो विषाक्त फेनोटाइप को रिवर्स कर सकते हैं। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कि रोग के अधिकांश सटीक पशु मॉडलों में या तो कोई फेनोटाइप या कमजोर फेनोटाइप नहीं होता है , जो निष्पक्ष स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं है।,25,26 हमारे सी elegans भागना पेप्टाइड मॉडल और परखों इस तरह के खमीर और ड्रोसोफिलाके रूप में अंय RAN पेप्टाइड मॉडल सिस्टम के लिए एक शक्तिशाली, पूरक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं, सेलुलर इन नए वर्णित प्रोटीन की विषाक्तता के लिए महत्वपूर्ण रास्तों को समझने के लिए ।

मांसपेशियों की सशर्त विषाक्तता व्यक्त की गई आरएएन पेप्टाइड्स
भागा पेप्टाइड विषाक्तता को मापने के लिए जीएफपी (आरएनएआई)के प्रभावों को समाप्त करने के लिए एक चेस अवधि की आवश्यकता होती है। हालांकि, जीएफपी (आरएनएआई) से हटाने और फेनोटाइप के उद्भव के बीच का समय असंगत हो सकता है यदि प्रयोगों की दीक्षा, मंचन जानवरों का चयन, तापमान में बदलाव आदि को ठीक समय तक ध्यान नहीं दिया जाता है। जैसा कि हम इन परख के साथ और अधिक अनुभवी हो गए हैं, समय और RAN पेप्टाइड फेनोटाइप के तपस्या अपेक्षाकृत सुसंगत हो गया है । इन परखों में सबसे महत्वपूर्ण कदम जानवरों का उचित शिफ्ट 25 डिग्री सेल्सियस है। इस बदलाव के बिना, भागा पेप्टाइड्स काफी कमजोर विषाक्तता प्रदर्शित करते हैं। हालांकि, जानवरों को लगातार 25 डिग्री सेल्सियस पर नहीं उगाया जा सकता है क्योंकि वे बड़े नहीं होते हैं और प्रजनन नहीं करते हैं, संभवतः आरएएन पेप्टाइड की उच्च आधारभूत अभिव्यक्ति के कारण। यह खमीर या ड्रोसोफिला की स्थिति के विपरीत नहीं है जहां विषाक्त RAN पेप्टाइड्स व्यक्त करने वाले उपभेदों को स्वतंत्र परिस्थितियों (यानी, कम तापमान) के तहत रखा जाता है, लेकिन फिर पेप्टाइड अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए13,,15 से पहले प्रतिबंधात्मक स्थितियों (यानी, उच्च तापमान) में तीव्रता से स्थानांतरित कर दिया जाता है। इस तरह के सशर्त अभिव्यक्ति प्रणालियों में, आनुवंशिक स्थितियों है कि बढ़ाने या विषाक्तता को दबाने पेप्टाइड अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन से परिणाम सकता है । यह निर्धारित करने के लिए कि ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन के माध्यम से आरएएन पेप्टाइड विषाक्तता अधिनियम के आनुवंशिक संशोधक, हम दो दृष्टिकोण लेते हैं। सबसे पहले, हमारे ट्रांसजेनिक उपभेदों के कई एक ही प्रमोटर के नियंत्रण में एक दूसरे RFP रिपोर्टर व्यक्त करने के लिए भागा पेप्टाइड की अभिव्यक्ति ड्राइव करते थे । प्रमोटर गतिविधि में परिवर्तन जो कम या बढ़ी हुई आरएनपी स्तर ों में समान कटौती या वृद्धि का कारण बनते हैं। हम म्यूटेंट या आरएनएआई स्थितियों पर विचार करते हैं जो आरएफपी के स्तर को गैर-विशिष्ट रूप से कार्य करने के लिए काफी बदल देते हैं। दूसरा, हम मात्रात्मक पीसीआर और पश्चिमी दाग प्रदर्शन करने के लिए निर्धारित अगर RAN पेप्टाइड एमआरएनए या प्रोटीन के स्तर शर्तों के बीच बदल रहे हैं । हालांकि, RAN पेप्टाइड्स का पश्चिमी आधारित पता लगाना कभी-कभी मुश्किल या असंभव साबित हो सकता है, जैसा कि हमने और अन्य लोगों ने C9orf72-व्युत्पन्न आरएएन पेप्टाइड पीआर50-जीएफपी के साथ देखा है। ऐसे मामलों में, हम वीवो जीएफपी के स्तर में यह निर्धारित करने के लिए निर्धारित करते हैं कि क्या तुलना की जा रही शर्तों के बीच प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन किया जाता है।

विकासात्मक विषाक्तता: लाभ और सीमाएं
मांसपेशियों में विषाक्त RAN पेप्टाइड्स की जबरन अतिअभिव्यक्ति अक्सर सी एलिगेंसमें विकासात्मक गिरफ्तारी की ओर ले जाती है। हालांकि यह स्पष्ट रूप से मानव रोग विकृति की नकल नहीं करता है, यह आनुवंशिक दमन स्क्रीन के लिए एक शक्तिशाली प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है, क्योंकि RAN विषाक्तता दमन आसानी से जानवरों के रूप में पहचाने जाते हैं जो जीएफपी (आरएनएआई)की अनुपस्थिति में बढ़ते हैं और प्रजनन करते हैं। ट्रांसजीन अभिव्यक्ति में कमी के कारण कुछ दमनकों को विकास की सुविधा मिलेगी । इन संभावनाओं के बीच अंतर करने के लिए, हम आम तौर पर हमारे भागा पेप्टाइड ट्रांसजेनिक तनाव में एक ही प्रमोटर द्वारा संचालित एक दूसरे RFP रिपोर्टर शामिल हैं । ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को कम या मौन करने वाले दमन भी आरएफपी अभिव्यक्ति के स्तर को कम करेंगे। दूसरी ओर, सामान्य या ऊंचा आरएफपी स्तर प्रदर्शित करने वाले दमनों को ट्रांसजीन अभिव्यक्ति में कमी के माध्यम से कार्य करने की संभावना नहीं है। खमीर विकास या ड्रोसोफिला आई मॉर्फोलॉजी13,,15,,27के उपयोग की तरह, ये दृष्टिकोण, जबकि मनुष्यों में बीमारी के सटीक मॉडलिंग पहलुओं को नहीं, आरएएन पेप्टाइड संशोधककी की प्रारंभिक पहचान के लिए एक शक्तिशाली स्क्रीनिंग उपकरण प्रदान करते हैं।

विकास के बाद विषाक्तता (पक्षाघात परख): लाभ और सीमाएं
पक्षाघात की परख का फायदा यह है कि किसी भी कृमि प्रयोगशाला में मौजूद उपकरणों से बड़ी संख्या में जानवरों (50-100) को मापा जा सकता है। पक्षाघात भी एक गंभीर फेनोटाइप है जिसका आसानी से पता चल जाता है। इस परख की मुख्य सीमा यह है कि आंदोलन दोषों के प्रति असंवेदनशील है जो पूर्ण पक्षाघात का कारण नहीं बनता है। इस तरह के दोषों को मापने के लिए और अधिक संवेदनशील और मात्रात्मक दृष्टिकोण की आवश्यकता हो सकती है, जैसे कि पिटाई परख या काइनेमेटिक आंदोलन28परकहता है । यदि संभव हो तो पक्षाघात परखों को जीनोटाइप से अंधा किया जाना चाहिए और यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि कीड़े किसी अन्य प्रकार के तनाव (जैसे, संदूषण, भुखमरी) से गुजर रहे हैं, जो परख के परिणामों को काफी प्रभावित कर सकता है। विषाक्त भागा पेप्टाइड्स व्यक्त करने वाले सी एलिगेंस कभी-कभी एक मजबूत पक्षाघात फेनोटाइप का प्रदर्शन करने में विफल हो जाते हैं। यह बीएफपी (आरएनएआई) के लगातार प्रभावों के कारण होने की संभावना है जो आरएएन पेप्टाइड अभिव्यक्ति को दबाने के लिए जारी है। इन मामलों में, यदि हम महत्वपूर्ण पक्षाघात (>10%) का पालन करने में विफल रहते हैं 2 दिन के बाद खाली वेक्टर (आरएनएआई) नियंत्रण जानवरों में, हम आम तौर पर परख को समाप्त करते हैं और एक और दोहराने की शुरुआत करते हैं। इस परख के एक संशोधन वैकल्पिक inducible RAN पेप्टाइड अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग शामिल हो सकता है । सी एलिगेंस के लिए केवल अन्य आमतौर पर उपयोग की जाने वाली अनुप्रयोज्य अभिव्यक्ति प्रणाली हीट शॉक प्रमोटर है। हालांकि, आवश्यक गर्मी सदमे तनाव प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकता है जो प्रोटीन की विषाक्तता को प्रभावित कर सकता है। अन्य सशर्त अभिव्यक्ति प्रणालियों के भविष्य के आवेदन, जैसे कि ऑक्सिन-प्रेरक degron (AID) प्रणाली29,आरएएन पेप्टाइड विषाक्तता का अध्ययन करने की हमारी क्षमता को काफी बढ़ा सकता है।

Neurodegeneration/commissure परख: लाभ और सीमाएं
सी एलिगेंस में मोटर न्यूरॉन कॉम्मिसर्स वेंट्रल और पृष्ठीय तंत्रिका रस्सियों के बीच गुजरने वाले एक मोटर न्यूरॉन के अक्षत का प्रतिनिधित्व करते हैं। ब्लेबिंग और टूटना आसानी से अलग संयोजिका में पता लगाया जा सकता है, न्यूरोडिजेनरेशन को जीवित जानवरों(चित्र ा 2)में जल्दी से मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। जानवरों की जांच करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि वे लेविसोल में समय की विस्तारित अवधि के लिए इनक्यूबेट नहीं करते हैं क्योंकि यह समय से पहले पशु मृत्यु का कारण बन सकता है, जो किसी भी जहरीले भागा पेप्टाइड की अनुपस्थिति में न्यूरोनल ब्लबिंग और टूटना की ओर जाता है। कुछ मामलों में, संगार पूरी तरह से विकृत हो जाते हैं और अब दिखाई नहीं देते हैं। इसलिए, उन्हें न्यूरोपैथोलॉजिकल सुविधाओं के लिए नहीं किया जा सकता है क्योंकि हमारी परख देखे गए संमिश्योर की कुल संख्या से टूटी हुई या ब्लबिंग को मापने के प्रतिशत को मापता है। इन मामलों में, संयोजिका परख भागा पेप्टाइड के प्रभाव को कम करके आंका जा सकता है ।

निष्कर्ष में, इस कागज में वर्णित परख सी एलिगेंसमें RAN पेप्टाइड्स की वजह से विषाक्तता को मापने के लिए उपयोगी हैं । प्रोटीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए जीएफपी (आरएनएआई) का उपयोग करने से विकासके बाद के फेनोटाइप देखे जा सकते हैं। हमारे दृष्टिकोण आसानी से दमन या विषाक्तता के बढ़ाने के लिए बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इस तरह के पक्षाघात परख और आत्मबीमा परख के रूप में माध्यमिक परख, पुष्टि कर सकते है कि विषाक्तता के बाद विकास दबा दिया है और परीक्षण अगर दमन के तंत्र न्यूरॉन्स में संरक्षित है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

NIH R21NS107797

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile CELLTREAT Scientific Products 50-202-036 Nematode growth plates and RNAi
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM BD DIAGNOSTIC SYSTEMS DF0145070 Nematode growth plates and RNAi
AGAROSE ULTRAPURE LIFE TECHNOLOGIES 16500500 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
CARBENICILLIN 5G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP26485 Nematode growth plates and RNAi
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK THERMO SCI ERIE 12542B Imaging for commissure assay
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242952008 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK THERMO SCI ERIE 125485C Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides THERMO SCI ERIE 12-550-15 Imaging for commissure assay
Gibco Bacto Peptone  Gibco  DF0118-17-0 Nematode growth plates and RNAi
HALOCARBON OIL 700 SIGMA-ALDRICH INC H8898-50ML Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
IPTG BIOTECH 10G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP162010 Nematode growth plates and RNAi
Leica Advanced Fluorescence imaging software Leica Microsystems LAS-AF Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay
Leica Immersion type N (Oil) W NUHSBAUM INC NC9547002 Imaging for commissure assay
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR THERMO SCI ACROS ORGANICS AC187870100 Imaging for commissure assay
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242956003 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains

PETRI DISH, 60X15MM,500/CS		 CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC FB0875713A Nematode growth plates and RNAi
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS CORNING LIFE SCIENCES DL 87721 Nematode growth plates and RNAi

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जीव विज्ञान अंक 158 न्यूरोडिजेनरेशन एएलएस हंटिंगटन रोग C9orf72 प्रोटेओटॉक्सिकिटी दोहराने विस्तार विकार
<em>सी एलिगेंस</em> में भागा पेप्टाइड विषाक्तता को मापने
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Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans. J. Vis. Exp. (158), e61024, doi:10.3791/61024 (2020).

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