Summary
I prodotti traslazionali non dipendenti dall'ATG sono caratteristiche patogene emergenti di diverse malattie basate sull'espansione delle ripetizioni. L'obiettivo del protocollo descritto è quello di valutare la tossicità causata da questi peptidi utilizzando saggi comportamentali e cellulari nel sistema modello C. elegans.
Abstract
C. elegans è comunemente usato per modellare malattie neurodegenerative legate all'età causate da mutazioni di espansione ripetute, come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la malattia di Huntington. Recentemente, l'RNA che lo contiene espansione ripetuta è il substrato per un nuovo tipo di traduzione di proteine chiamato traduzione non dipendente da AUG (RAN) associata alla ripetizione. A differenza della traduzione canonica, la conversione RAN non richiede un codone iniziale e si verifica solo quando le ripetizioni superano una lunghezza di soglia. Poiché non esiste un codone iniziale per determinare il fotogramma di lettura, la traduzione RAN si verifica in tutti i fotogrammi di lettura da modelli di RNA di senso e antisenso che contengono una sequenza di espansione di ripetizione. Pertanto, la traduzione RAN espande il numero di possibili peptidi tossici associati alla malattia da uno a sei. Finora, la traduzione RAN è stata documentata in otto diverse malattie neurodegenerative e neuromuscolari basate sull'espansione delle ripetizioni. In ogni caso, decifrare quali prodotti RAN sono tossici, così come i loro meccanismi di tossicità, è un passo fondamentale per capire come questi peptidi contribuiscono alla fisiopatologia della malattia. In questo articolo, presentiamo strategie per misurare la tossicità dei peptidi RAN nel sistema modello C. elegans. In primo luogo, descriviamo le procedure per misurare la tossicità dei peptidi RAN sulla crescita e la motilità dello sviluppo di C. elegans. In secondo luogo, abbiamo dettagliato un saggio per misurare gli effetti post-sviluppo dipendenti dall'età dei peptidi RAN sulla motilità. Infine, descriviamo un saggio di neurotossicità per valutare gli effetti dei peptidi RAN sulla morfologia dei neuroni. Questi saggi forniscono un'ampia valutazione della tossicità dei peptidi RAN e possono essere utili per l'esecuzione di schermi genetici o di piccole molecole su larga scala per identificare meccanismi o terapie della malattia.
Introduction
L'espansione inappropriata delle sequenze di ripetizione del DNA è la base genetica di diverse malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la demenza frontotemporale (FTD) e la malattia di Huntington (HD)1. Sebbene esistano modelli cellulari e animali consolidati per queste malattie, i meccanismi alla base di queste condizioni non sono ben definiti. Ad esempio, l'HD è causato dalle espansioni di una sequenza di ripetizione CAG nella sequenza di codifica per la proteina Huntingtina Htt2. Poiché CAG codifica la glutammina degli amminoacidi, l'espansione della ripetizione CAG comporta l'inserimento di una sequenza poliglutamina, o poliQ, all'interno di Htt. Proteine polyQ espanse formano aggregati proteici di lunghezza e di età associati alla tossicità3,4. Sorprendentemente, due studi recenti suggeriscono che la lunghezza della sequenza poliQ non è il principale fattore di insorgenza della malattia MH, suggerendo che anche fattori indipendenti dal poliq possono contribuire alla malattia5,6.
Un possibile meccanismo indipendente dal poliQ prevede un tipo di traduzione di proteine appena scoperto chiamato Repeat Associated Non-AUG-dependent (RAN) traduzione7. Come suggerisce il nome, la traduzione RAN si verifica solo quando è presente una sequenza di ripetizione espansa e non richiede un codon di inizio canonico. Pertanto, la traduzione RAN avviene in tutti e tre i fotogrammi di lettura della ripetizione per produrre tre polipeptidi distinti. Inoltre, poiché molti geni producono anche una trascrizione antisenso che contiene il complemento inverso della sequenza di ripetizione espansa, la traduzione RAN si verifica anche in tutti e tre i fotogrammi di lettura della trascrizione antisenso. Insieme, la traduzione RAN espande il numero di proteine prodotte da una sequenza di DNA espansa contenente ripetizioni da un peptide a sei peptidi. Ad oggi, la traduzione ran è stata osservata in almeno otto diversi disturbi di espansione ripetuta8. I peptidi RAN sono osservati nei campioni di pazienti postmortem e solo nei casi in cui il paziente porta una ripetizione espansa9,10. Mentre questi peptidi sono chiaramente presenti nelle cellule del paziente, il loro contributo alla fisiopatologia della malattia non è chiaro.
Per definire meglio la potenziale tossicità associata ai peptidi RAN, diversi gruppi hanno espresso ogni peptide in vari sistemi modello, come lieviti, mosche, topi e cellule di coltura dei tessuti11,12,13,1414,15,16. Anziché utilizzare la sequenza di ripetizione per l'espressione, questi modelli utilizzano un approccio di variazione codon in cui la sequenza di ripetizione viene eliminata ma la sequenza di amminoacidi viene mantenuta. L'avvio della traduzione avviene attraverso un ATG canonico e il peptide è tipicamente fuso in una proteina fluorescente al Capon o Al C, nessuno dei quali sembra interferire con la tossicità del peptide RAN. Pertanto, ogni costrutto sovraesprime un singolo peptide RAN. Modellare i diversi prodotti RAN in un organismo multicellulare con semplici saggi per misurare la tossicità dei peptidi RAN è di vitale importanza per capire come i diversi prodotti RAN da ogni espansione di ripetizione che causa la malattia contribuiscono alla disfunzione cellulare e alla neurodegenerazione.
Come altri sistemi modello, C. elegans fornisce una piattaforma sperimentale flessibile ed efficiente che consente di studi su nuovi meccanismi di malattia, come la tossicità dei peptidi RAN. I vermi offrono diversi attributi sperimentali unici che non sono attualmente disponibili in altri modelli di tossicità peptide RAN. In primo luogo, C. elegans sono otticamente trasparenti dalla nascita alla morte. Ciò consente una semplice visualizzazione dell'espressione e localizzazione dei peptidi RAN, nonché l'analisi in vivo della neurodegenerazione negli animali vivi. In secondo luogo, i metodi transgenici per la generazione di modelli di espressione peptide RAN sono economici e veloci. Dato il breve ciclo di vita di tre giorni di C. elegans,linee transgeniche stabili che esprimono qualsiasi peptide RAN in modo specifico di tipo cellulare possono essere prodotte in meno di una settimana. In terzo luogo, semplici risultati fenotipici possono essere combinati con metodi di screening genetico, come la mutagenesi chimica o lo screening RNAi, per identificare rapidamente i geni essenziali per la tossicità dei peptidi RAN. Infine, la breve durata di vita di C. elegans (20 giorni) consente agli sperimentatori di determinare come l'invecchiamento, che è il più grande fattore di rischio per la maggior parte delle malattie di espansione ripetute, influenza la tossicità dei peptidi RAN. Insieme, questa combinazione di attributi sperimentali non ha eguali in qualsiasi altro sistema di modelli e offre una potente piattaforma per lo studio della tossicità dei peptidi RAN.
Qui descriviamo diversi saggi che sfruttano i vantaggi sperimentali di C. elegans per misurare la tossicità dei peptidi RAN e per identificare i modificatori genetici di questa tossicità. I peptidi RAN iniziati con codone sono etichettati con GFP ed espressi individualmente in cellule muscolari sotto il promotore di myo-3 o nei motoneuroni GABAergic sotto il promotore unc-47. Per l'espressione nelle cellule muscolari, è importante che i peptidi RAN tossici siano etichettati con proteine fluorescenti verdi (GFP) o altre proteine fluorescenti (FP) che possono essere mirate con un vettore di alimentazione RNAi. Questo perché l'espressione tossica del peptide RAN di solito blocca la crescita, rendendo tali ceppi non vitali. L'uso di gfp(RNAi) disattiva in modo condizionale l'espressione dei peptidi RAN e consente il mantenimento della deformazione, le croci genetiche, ecc. Per i saggi, questi animali vengono rimossi da gfp(RNAi), che consente l'espressione del peptide RAN e dei fenotipi risultanti. Oltre alla strategia molecolare per la progettazione di costrutti di espressione peptide RAN varia di codone, descriviamo i saggi per misurare la tossicità dello sviluppo (motilità larvale e test di crescita), la tossicità associata all'età post-sviluppo (analisi della paralisi) e i difetti morfologici del neurone (testare la commissure).
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Protocol
1. Generazione di costrutti di espressione peptide RAN a varia codone
- Progettare la sequenza di codifica dei peptidi RAN utilizzando i codoni sinonimi per eliminare la struttura fondamentale DNA/RNA ripetitivo, ma preservare la sequenza di amminoacidi sovrastante.
- Ordinare le sequenze di codon personalizzate commercialmente alle lunghezze di ripetizione necessarie per gli studi (in genere da 5 a 100 ripetizioni). Includere un sito di restrizione HindIII alla fine 5' e un sito di restrizione BamHI all'estremità 3' per facilitare la clonazione in vettori di espressione C. elegans, ad esempio pPD95.79.
NOTA: Se la sintesi di costrutti più grandi si rivela difficile, le sequenze di blocchi predefiniti più piccole possono essere sintetizzate e quindi incorporate in ripetizioni più grandi utilizzando una strategia di legatura direzionale17. - Subclone della sequenza di peptidi in un vettore di espressione C. elegans utilizzando metodi di legatura T4 standard.
- Subclone una sequenza promotore specifica del tipo di cellula generata dalla PCR davanti alla sequenza di peptidi RAN per guidare l'espressione del tessuto peptide-GFP specifico del tessuto.
- Microinietta il costrutto peptide RAN nella gonad di tipo selvatico C. elegans per generare ceppi transgenici contenenti array esrommosomici utilizzando metodi standard18. Per un marcatore di coiniezione, è stato utilizzato il reporter RFP specifico per il muscolo (myo-3p::RFP (pCFJ104)), anche se possono essere utilizzati anche altri marcatori.
- Integrare un transgene stabile nel genoma utilizzando i metodi standard di screening dell'integrazione di C. elegans 19.
- Se il peptide RAN è animale tossico e transgenico non sopravvive, nutrire gli animali gfp(RNAi) esprimendo batteri pre e post-iniezione per mettere a tacere l'espressione della proteina tossica.
NOTA: la rimozione degli animali da gfp(RNAi) consente l'espressione del peptide RAN per le analisi fenotipiche utilizzando i saggi descritti di seguito.
2. Misurare la tossicità dello sviluppo dei peptidi RAN in seguito all'abbattimento del gene basato su RNAi: protocollo di analisi della velocità video
- Versare il mezzo standard di crescita del nematodo (NGM) RNAi 24 piastre di pozzo con 1 mM di isopropile -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e 25 carbenicillina di g/mL.
- Streak out RNAi-feeding clons in HT115 batteri da testare sul brodo di Luria (LB) - carbenicillin (25 g/mL) piastre di agar e crescere batteri a 37 gradi centigradi per 24 h. Includere il vettore vuoto (RNAi) come controllo positivo per la tossicità e gfp (RNAi) come controllo negativo.
- Per ogni clone, scegli una singola colonia in 1 mL di LB : supporti liquidi di carbenicillina e coltiva batteri durante la notte per 18 ore a 37 gradi centigradi tremando a 250 rotazioni al minuto (RPM).
- Avvistare quattro pozzetti individuali dei pozzi NGM RNAI 24 con 20 gradi delle seguenti colture batteriche overnight: colonna 1 pozzi ( gfp (RNAi); colonna 2 pozzetti (EV)RNAi; colonne 3–6 pozzi - RNAi contro i geni da testare. Consentire ai batteri RNAi di indurre la produzione di dsRNA durante la notte a temperatura ambiente (RT).
- Isolare le uova dal primo giorno C. elegans che esprimono il transgene peptide RAN integrato utilizzando il metodo standard di ipocloresi e seme 30 C. elegans uova in ogni pozzo del NGM RNAi 24 piastra.
- Incubare i 24 pozzi a 20 gradi centigradi per 7 giorni.
NOTA: Questo tempo di incubazione è per i ceppi che esprimono dipeptidi tossici C9orf72 RAN, come PR50 o GR50. Altri ceppi possono richiedere tempi di incubazione più brevi per prevenire l'esaurimento della fonte di cibo batterico e la successiva fame. - Acquisire i video di luce trasmessi utilizzando un microscopio stereo dissecting Leica M-16FA dotato di una fotocamera monocromatica DFC345FX collegata a un PC compatibile con Windows che esegue un software di acquisizione video Leica AF (versione 2.6.0.7266).
- Acquisisci due video da due pozzetti separati per ogni condizione di RNAi utilizzando impostazioni di acquisizione video coerenti tra i pozzetti. Per ogni video, acquisisci 10 secondi con una risoluzione di 800 x 600 pixel e 13,16 fotogrammi al secondo (dimensione voxel temporale : 0,076 secondi) utilizzando l'ingrandimento 18,6X (impostazione dello zoom 1,49 nel software AF). Impostare il tempo di esposizione dell'immagine su 4 millisecondi. Etichettare ogni video immediatamente con la deformazione, condizione RNAi, e il buon numero.
- Accechi lo sperimentatore al genotipo associato a ogni file video randomizzando l'ordine dei video e cambiando il nome dei video in numeri. Salva questo gruppo di video come nuovo file. Svelate lo sperimentatore dopo che l'analisi è stata completata.
- Misurare la "distanza percorsa" e la lunghezza di ogni animale per 20 animali diversi da ogni video, esaminando un totale di 40 vermi per ogni condizione di RNAi.
- Nel software, selezionare il pulsante degli strumenti di annotazione, quindi lo strumento di disegno del testo. Fare clic su un punto al centro del verme misurato nel primo fotogramma del video e contrassegnarlo come numero. Far avanzare il video fino alla fine mentre monitora visivamente il percorso di movimento del verme. Nell'ultimo fotogramma, fare clic su un punto al centro del verme misurato e contrassegnare il numero corrispondente successivo. Quindi, utilizzando lo strumento scala di disegno, disegnare una linea dal primo al secondo numero per registrare la "distanza percorsa".
- La distanza percorsa è la distanza tra i due punti centroidi. Questa distanza viene visualizzata accanto alla linea di misurazione. Registrare questa misurazione in un foglio di calcolo. Ripetere questa misurazione per altri 19 vermi nel video conservando ogni singola misurazione nella finestra di analisi.
- Effettuare misurazioni da animali che mostrano il movimento più robusto per evitare la selezione di animali che non presentano alcun movimento e che disprecono i dati verso la paralisi. Una volta completate le misurazioni, scattare un'istantanea del fotogramma video finale che illustra tutte le linee di misurazione in modo che i dati possano essere ricondotti all'animale da cui hanno avuto origine.
- Analizzare i dati utilizzando un foglio di calcolo a quattro colonne. La colonna uno è il verme "identificatore", la colonna due è la distanza percorsa / tempo (velocità).
- Il tempo di ogni video può essere trovato facendo clic con il pulsante destro del mouse sul video sotto l'esperimento e andando alle proprietà del video.
- Normalizzare la misurazione della velocità trovando la lunghezza di ogni animale selezionando Quantifica, quindi Statistiche sul software. Facendo clic sull'icona dello strumento di annotazione sul display video dovrebbe consentire l'uso dello strumento "Disegna polilinea". Questo strumento può quindi essere utilizzato per tracciare liberamente i C. elegan dal video dalla punta della testa alla punta della coda. La lunghezza della linea sarà registrata sotto le statistiche.
- Scatta un'istantanea del fotogramma video finale che illustra tutto il polilinea utilizzato per ridimensionare i C. elegan in modo che i dati possano essere ricondotti all'animale da cui hanno avuto origine.
- Analizzare i dati aggiungendo altre due colonne al foglio di calcolo. La colonna tre è la "Lunghezza animale", e la colonna quattro è la "Velocità normalizzata" (velocità / lunghezza animale). Analizzare i dati di velocità normalizzati utilizzando un ANOVA unidirezionale con test post-hoc contro vettore vuoto (RNAi).
3. Misurare la tossicità dello sviluppo del peptide RAN: Analisi della crescita
- Scegliete 30 animali gravidi in una soluzione di ipocloto da 50 litri (10 mL di candeggina, 2,5 mL di 10 N NaOH, 37,5 mL di dH2O) su un gfp (RNAi), (EV)RNAi o (gene-specific) di 6 cm di piastra RNAi.
- Dopo 24 h, spostare sei progenie transgeniche che sono strisciate fuori dal punto della soluzione di ipoclorito a una nuova piastra RNAi di 6 cm identica alle condizioni dell'RNAi sulla piastra su cui sono state sottoposte al trattamento della soluzione di ipoclorito. Mettete queste progenie (F1) a 20 gradi centigradi per crescere e riprodurle.
- Dopo 24-48 h, scegli 10 animali L4 transgenici su 6 cm di RNAi che corrispondano alle condizioni dell'RNAi su cui sono cresciuti gli animali. Lasciare che gli animali olighino le uova per 24 ore in un'incubatrice a 20 gradi centigradi.
- Dopo 24 h, rimuovere gli animali adulti e scartarli. Contare il numero di uova e larve L1 deposte durante il periodo di 24 ore utilizzando un contatore portatile meccanico. Questa è la dimensione totale della covata.
- Nel corso dei successivi 72 h, contare il numero di animali che raggiungono lo stadio L4 o più vecchio. Quando ogni animale viene contato, rimuoverlo dal piatto.
- Quantificare la "Crescita percentuale" come percentuale di animali che raggiungono lo stadio L4 o più vecchio rispetto alla dimensione totale della covata.
- Eseguire un test esatto di 2 x 2 Fisher rispetto al vettore vuoto (RNAi) per determinare se la crescita percentuale è statisticamente significativa. Le categorie per il confronto sono "Crescita" (n. di animali che hanno raggiunto lo stadio L4 o più vecchio in 72 h) e "No Growth" (dimensione totale della covata meno il numero di animali che raggiungono L4 o stadio più vecchio in 72 h).
4. Analisi della paralisi dei peptidi RAN post-sviluppo
- Mantenere ceppi transgenici C. elegans integrati che esprimono il peptide-GFP RAN nel muscolo su gfp(RNAi) posizionando 4-6 L4 transgenici su una piastra di 6 cm gfp(RNAi) e far crescere i vermi a 20 gradi centigradi.
- Se l'esperimento utilizza l'RNAi per verificare gli effetti genetici sulla tossicità dei peptidi RAN, spostare 10 adulti gravidi transgenici gravid da una piastra non affamata a ciascuno dei due vettori vuotidi 6 cm (RNAi) (controllo positivo per la paralisi, controllo negativo per gli effetti genetici), gfp(RNAi) (controllo negativo per la paralisi, controllo positivo per gli effetti genetici), gene-specific(RNAi) (cioè 10 adulti gravidiati per la piastra di 6 cm).
- Se i mutanti vengono utilizzati per analizzare gli effetti genetici sulla tossicità dei peptidi RAN, colloca 10 wT gravid o animali mutanti che esprimono lo stesso transgene RAN su ciascuna delle due piastre di vettori vuoti(RNAi) o gfp(RNAi) gravid. Far crescere i vermi a 20 gradi centigradi per 48 h.
- Scegli 10 set di 10 L4 transgenici dalle piastre DI RNAi da 6 cm e posiziona ogni set su una piastra RNAi da 3 cm (ad es. n. 100 animali per ogni genotipo). Assicurarsi che l'L4 selezionato per il saggio abbiano tutti una motilità superficialmente normale. Posizionare le piastre all'interno di un sacchetto di deposito cerniera per trattenere l'umidità.
- Posizionare le piastre insaccate con L4 nell'incubatrice da 25 gradi centigradi.
- Rimuovere gli animali 24 h più tardi dall'incubatrice di 25 gradi centigradi una ceppo alla volta per ridurre al minimo la quantità di tempo in cui sono fuori a RT.
- Toccare le piastre sul microscopio di seziossiazione per verificare il movimento. Se gli animali si muovono più di una lunghezza del corpo, contare l'animale come mobile e trasferirlo in una nuova piastra RNAi di 3 cm. Utilizzare un plettro di platino per toccare i vermi rimanenti sulla testa o sulla coda. Se l'animale si muove più di una lunghezza del corpo, contare l'animale come mobile e trasferirlo in una nuova piastra RNAi di 3 cm.
NOTA: Non superare i 10 vermi per piastra durante il trasferimento. Fare attenzione a evitare di spostare la progenie alla nuova piastra RNAi perché il saggio dipende dal seguire solo gli animali invecchiati. - Raggruppare tutti i vermi che non si muovono in modo che il movimento di più di una lunghezza del corpo possa essere facilmente rilevato. Dare all'animale almeno un minuto per muovere più di una lunghezza del corpo. Se ancora non si muove, è paralizzato, insaccato (cioè, larve covate all'interno della madre), o morto.
- Censorizza gli animali che mostrano l'insaccamento, desicano ai lati del piatto, esibiscono intestini estrusi, scavano, si perdono o muoiono dal saggio al momento del rilevamento. I vermi paralizzati vengono contati, lasciati sulla vecchia piastra RNAi e scartati.
- Segna gli animali per la paralisi ogni giorno per 5-7 giorni come descritto nei passaggi da 4.6 a 4.9.
- Analizzare i dati di paralisi con un test di log-rank identico a quello utilizzato per analizzare la durata. In questa analisi statistica, i vermi in movimento sono classificati come "Vivi", i vermi paralizzati sono segnati come "morti", e i vermi morti, insaccati, estrusi, desiccati, scavati o altrimenti persi sono segnati come "Censored".
NOTA: in questa analisi, il numero "Percentuale in vita" indica gli animali "Percent Moving". L'inverso rappresenta il "Percentuale paralizzato". Utilizzare lo strumento di analisi online OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/) per eseguire le analisi statistiche di livello di log.
5. Misurazione della patologia dei neuroni: saggio della commissure
- Generare C. elegans transgenici che esprimono il peptide RAN di interesse per i neuroni GABAergic utilizzando il promotore unc-47. Esprimere anche unc-47p::GFP o unc-47p::RFP per rivelare la morfologia cellulare dei neuroni GABA.
- Scegli 50 animali l4 transgenici e posizionali su una piastra OP50 di 6 cm a 25 gradi centigradi per 24 ore.
- Trasferire i 50 animali transgenici su una nuova piastra OP50 di 6 cm a 25 gradi centigradi per 24 ore.
- Realizzare pastiglie per l'imaging degli animali sotto microscopia widefield.
- Posizionare due pezzi di nastro adesivo sopra due vetrini del microscopio. Posizionare una diapositiva pulita senza nastro adesivo al centro delle due diapositive registrate.
- Distribuisci 100 dollari (1 goccia da una pipetta di pasteur di plastica usa e getta) del 3% di agarose fuso sullo scivolo centrale con una pipetta di trasferimento sterile usa e getta.
- Posizionare immediatamente una seconda diapositiva pulita attraverso la goccia di agarose fuso in modo che poggia sui vetrini registrati e crea uno strato sottile e uniforme di agarose tra i vetrini.
- Dopo che l'agarose si è raffreddata e solidita, rimuovere con attenzione i due vetrini con lo strato di agarose tra di loro, senza separarli, e metterli in un sacchetto di plastica con un pezzo di carta umido sotto di loro. Fare una diapositiva per 10 vermi da esaminare insieme a tre diapositive in più.
- Togliere i C. elegan transgenici dall'incubatrice da 25 gradi centigradi e raccogliere 10 C. elegan transgenici in una goccia di 100 mM di levamisole in uno scivolo di depressione di vetro. Incubare per 10 min o fino a quando gli animali sono paralizzati.
- Rimuovere un paio di diapositive dal sacchetto di plastica e separarli con cura. Etichettare il vetrino con l'agarose con il genotipo e aggiungere 2 -L L di 10 mM levamisole al centro dell'agarose. Spostare i 10 animali nel levamisuolo sul pad agarose. Coprire gli animali con una coverslip di spessore #1.
- Immagine di animali in cui la vulva è orientata in modo tale che si trova sul lato destro dell'animale. Se la vulva si trova sul lato sinistro della testa, i commissures dei motoneuroni saranno sotto gli animali e non così chiaramente visibili, rendendo difficile la quantificazione accurata. Omettere la quantificazione da questi animali. In questo orientamento, i commissures dei motoneuroni sono più vicini al coverslip e sono chiaramente visibili su un microscopio a fluorescenza widefield invertito. Visualizza i neuroni commissures che esprimono GFP con un microscopio a fluorescenza widefield invertito Leica DMI4000B con una lente ad immersione ad olio 63X 1.4X NA e un set di filtri Leica L5 GFP (Ex480/40nm; Em527/30nm). Se i neuroni commissures esprimono RFP invece di GFP, utilizzare un set di filtri Leica TX2 RFP (Ex560/40nm; Em645/75nm).
- Visualizza i sistemi neuronali che esprimono GFP con un microscopio a fluorescenza widefield invertito con una lente ad immersione ad olio da 63x 1.4x NA e un set di filtri GFP (Ex480/40 nm; Em527/30 nm). Se i neuroni commissures esprimono RFP invece di GFP, utilizzare un set di filtri di proteine fluorescenti rosse (RFP) (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).
- Immagina i vermi entro 45 min di posizionamento del coperchio sui vermi per ridurre al minimo la tossicità dell'immobilizzazione.
- Per ogni verme, contare il numero di commissures visibili. Ci sono 16 commissure visibili negli animali selvatici. Contare anche il numero di commissures che hanno grandi perline (cioè, blebs) nei commissures così come il numero di commissures che sono rotti. Per verificare che il compiacimento sia rotto, seguire il commissure dal cavo dorsale al cavo ventrale regolando il piano focale.
NOTA: Commissures in cui la fluorescenza unc-47p::GFP presenta una lacuna sono considerati rotti. Un commissure rotto ha in genere un bleb su entrambi i lati della rottura, contribuendo a dimostrare che il commissures è rotto. Contare la quantità di sbiancamento e si rompe per 20 vermi. - Calcolare la frazione di commissures con blebs or breaks sul numero totale di commissureosservati osservati per ogni animale. È inoltre possibile misurare il numero assoluto di commissure conteggiati per animale (inclusi tipo selvatico, sbiancamento ed eventi rotti).
- Per ogni categoria, calcolare la media SD e analizzare statisticamente con un test t di Student per il confronto tra due popolazioni o un ANOVA unidirezionale per i confronti tra 3 o più popolazioni.
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Representative Results
Abbiamo usato i saggi descritti qui per valutare l'effetto di diverse inibizioni geniche sulla tossicità dei dipeptidi RAN che si trovano nei pazienti con SLA con un'espansione di ripetizione G4C2. Utilizzando il saggio di crescita per misurare la tossicità dello sviluppo, abbiamo analizzato gli effetti di diversi mutanti con knockout genetico identificati in uno screen soppressori RNAi a livello genomico della tossicità PR50-GFP muscolosamente espressa. Mentre l'espressione di PR50-GFP da sola ha provocato un arresto di crescita completamente penetrante, la perdita di mutazioni di funzione in diversi geni ha soppresso la tossicità dello sviluppo PR dal 12-94% (Figura 1A).
Abbiamo anche misurato l'effetto di specifici knockdown genici sulla motilità dello sviluppo degli animali che esprimono PR50 utilizzando il metodo di analisi della velocità video. Come previsto, gfp(RNAi) ha provocato un forte aumento della motilità rispetto al vettore vuoto (RNAi) a causa dell'inibizione dell'espressione PR50-GFP. Abbiamo anche scoperto che RNAi contro la sottounità proteasome rpn-7 ha provocato un aumento significativo della motilità PR50 (Figura 1B).
La SLA, come molte malattie neurodegenerative, si verifica negli adulti. Pertanto, abbiamo analizzato i fenotipi adulti usando il saggio di paralisi dipendente dall'età. PR50-GFP ha mostrato fino all'80% di paralisi entro 5 giorni di età. Tuttavia, l'RNAi si è rivolto alla paralisi ritardata in modo significativo del cul-6 genico, suggerendo che il cul-6 è necessario per la tossicità PR50-GFP (Figura 1C). Questo effetto è stato specifico per cul-6 (RNAi) perché cul-1 (RNAi) non ha alterato la tossicità PR50-GFP.
Le proteine neurodegenerative, come i peptidi tossici RAN, sono comunemente modellate nella parete del corpo di C. elegans4,20,21,22. Tuttavia, è anche importante determinare se le proteine RAN causano la neuropatologia quando espresse nei neuroni C. elegans, perché la tossicità specifica del neurone è una caratteristica comune di molte malattie neurodegenerative. Abbiamo esaminato la tossicità specifica del neurone usando il saggio di commissure. Nel giorno 2 adulti, PR50-GFP espressione nei motoneuroni ha portato ad un aumento significativo del sbiadimento del motoneurone. Questa neuropatologia è stata significativamente soppressa da una mutazione nel gene del recettore insulino/IGF omolog daf-2 che ritarda le proprietà tossiche di diverse proteine neurodegenerative23 (Figura 2B).
Figura 1: Saggi per valutare la tossicità dei peptidi RAN espressi dai muscoli. (A) Ran saggio sulla crescita dei peptidi. I mutanti indicati sono stati incrociati nel sottofondo genetico di drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) in condizioni gfp(RNAi). I numeri al di sopra di ogni genotipo indicano il numero di progenie segnate per la crescita. Tutti i genotipi hanno p < 0.05 utilizzando il test esatto di Fisher rispetto al tipo selvatico. (B) Analisi della velocità video per misurare la tossicità dei peptidi RAN durante lo sviluppo. gli animali di pIs34 (myo-3p::PR50-GFP) sono stati coltivati in condizioni di gfp(RNAi), vettore vuoto (RNAi)o rpn-7 (RNAi) e quindi hanno ottenuto un punteggio per motilità come descritto. La velocità è stata normalizzata agli animali trattati con gfp(RNAi). I dati mostrati sono medi: SD, n - 40 per ogni genotipo. < 0,01, z- p < 0,001, aNOVA unidirezionale con tukey dopo il test. (C) Saggio di paralisi per misurare la tossicità dell'insorgenza dell'età. gli animali di pIs34 (myo-3p::PR50-GFP) sono stati coltivati su vettori vuoti (RNAi) ('WT'), cul-1 (RNAi)o cul-6 (RNAi) e paralisi sono stati segnati come descritto ogni 24 ore. Il test di log-rank con correzione post-test di Bonferroni rispetto a WT. n è 100 animali per genotipo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il saggio per la misurazione della neuropatologia del motoneurone ha espresso peptidi RAN. (A) Immagini di adulti C. elegans che esprimono il giornalista neurone monomotore unc-47p::GFP in tipo selvaggio o unc-47p::PR50-GFP che esprime animali. Le immagini per il tipo selvaggio illustrano la normale morfologia commissure. Le immagini rappresentano pile appiattite serie z ottenute mediante microscopia a fluorescenza widefield. Gli animali PR50 dimostrano esempi di rottura e sbiancamento commissure. (B) Effetto del daf-2(e1370) sul blebbing pr50 commissure. I punti rappresentano la percentuale di commissure di sbiancamento da un singolo animale, con la media e la SD mostrate. n - 20 animali per genotipo :-p < 0.01, ANOVA unidirezionale con il test post-hoc di Dunn. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui riportiamo metodi che possono essere utilizzati per annotare la tossicità peptide RAN modellata nel muscolo o nei neuroni di C. elegans. Mentre le proteine neurodegenerative hanno un fenotipo inesoramento dell'età nei pazienti umani, possono anche mostrare tossicità dello sviluppo quando sovraespresse nei sistemi modello. La sovraespressione ha notevoli limitazioni interpretive, ma fornisce anche un potente punto di partenza per schermi genetici o farmacologici volti a identificare geni o farmaci in grado di invertire i fenotipi tossici. Ciò è particolarmente importante in quanto i modelli animali più precisi di malattia non hanno fenotipi o fenotipi deboli non adatti per gli approcci di screening imparziale24,25,26. I nostri modelli di peptidi C. elegans RAN e saggi rappresentano un approccio potente e complementare ad altri sistemi di modelli di peptidi RAN, come il lievito e la Drosophila, per comprendere i percorsi cellulari importanti per la tossicità di queste proteine appena descritte.
Tossicità condizionale dei peptidi RAN espressi dai muscoli
Misurare la tossicità dei peptidi RAN richiede un periodo di inseguimento per l'eliminazione degli effetti di gfp(RNAi). Tuttavia, il tempo che interceduelare dalla rimozione da gfp (RNAi) e l'emergere di fenotipi può essere incoerente se non si presta attenzione all'inizio preciso dell'inizio degli esperimenti, della selezione degli animali in scena, degli spostamenti di temperatura, ecc. Man mano che siamo diventati più esperti con questi saggi, la tempistica e la penetrazione dei fenotipi peptidi della RAN sono diventate relativamente coerenti. Uno dei passaggi più critici in questi saggi è il corretto spostamento degli animali a 25 . Senza questo cambiamento, i peptidi RAN mostrano una tossicità significativamente più debole. Tuttavia, gli animali non possono essere continuamente coltivati a 25 gradi centigradi perché non crescono e si riproducono, presumibilmente a causa dell'espressione di base più alta del peptide RAN. Questo non è diverso dalla situazione nel lievito o nella Drosophila, dove i ceppi che esprimono peptidi RR tossici sono tenuti in condizioni permissive (cioè a bassa temperatura) ma poi spostati acutamente a condizioni restrittive (cioè, temperatura più elevata) prima del test13,15 per migliorare l'espressione peptide. In tali sistemi di espressione condizionale, le condizioni genetiche che migliorano o sopprimono la tossicità potrebbero derivare da cambiamenti nei livelli di espressione dei peptidi. Per determinare se i modificatori genetici della tossicità dei peptidi RAN agiscono tramite alterazioni nei livelli di espressione transgenica, adottiamo due approcci. In primo luogo, molti dei nostri ceppi transgenici esprimono un secondo reporter RFP sotto il controllo dello stesso promotore utilizzato per guidare l'espressione del peptide RAN. I cambiamenti nell'attività promotrice che causano una riduzione o una maggiore espressione dei peptidi RAN causano riduzioni o aumenti simili nei livelli di RFP. Consideriamo mutanti o condizioni di RNAi che alterano significativamente i livelli RFP per agire in modo non specifico. In secondo luogo, eseguiamo la PCR quantitativa e il gonfiore occidentale per determinare se i livelli di mRNA o proteine peptidiche RAN vengono alterati tra le condizioni. Tuttavia, rilevamento basato su ovest di peptidi RAN a volte può rivelarsi difficile o impossibile, come noi e altri hanno osservato con il peptide RAN PR50-GFP derivato da C9orf72. In questi casi, quantifichiamo i livelli di GFP in vivo per determinare se l'espressione proteica viene alterata tra le condizioni confrontate.
Tossicità dello sviluppo: vantaggi e limitazioni
La sovraespressione forzata di peptidi RAN tossici nei muscoli spesso porta all'arresto dello sviluppo in C. elegans. Anche se questo chiaramente non imita la patologia della malattia umana, fornisce un potente punto di partenza per gli schermi soppressori genetici, perché i soppressori di tossicità RAN sono facilmente identificabili come animali che crescono e si riproducono in assenza di gfp(RNAi). Alcuni soppressori faciliteranno la crescita a causa della riduzione dell'espressione transgenica. Per differenziare queste possibilità, generalmente includiamo un secondo reporter RFP guidato dallo stesso promotore nel nostro ceppo transgenico peptide RAN. Anche i soppressori che riducono o silenziano l'espressione transgenica presentano livelli di espressione RFP ridotti. D'altra parte, è improbabile che i soppressori che presentano livelli RFP normali o elevati funzionino tramite la riduzione dell'espressione transgenica. Proprio come l'uso della crescita del lievito o della morfologia oculare della Drosophila 13,15,27, questi approcci, pur non proprio modellando gli aspetti della malattia negli esseri umani, forniscono un potente strumento di screening per l'identificazione iniziale dei modificatori di peptidi RAN.
Tossicità post-sviluppo (analisi della paralisi): vantaggi e limitazioni
Il vantaggio del saggio di paralisi è che un gran numero relativo di animali (50-100) può essere misurato con strumenti presenti in qualsiasi laboratorio di worm. La paralisi è anche un fenotipo grave che viene facilmente rilevato. La limitazione principale di questo test è che è insensibile ai difetti di movimento che non causano completa paralisi. Tali difetti possono richiedere approcci più sensibili e quantitativi per misurare, come i saggi battuti o i saggi cinematici28. I saggi di paralisi devono essere eseguiti accecati al genotipo se possibile e occorre prestare attenzione per garantire che i vermi non subiscano qualsiasi altro tipo di stress (ad esempio, contaminazione, fame), che potrebbe avere un impatto significativo sui risultati del saggio. C. elegans che esprimono peptidi RAN tossici a volte non riescono a mostrare un robusto fenotipo della paralisi. Ciò è probabilmente dovuto agli effetti persistenti del fatto che gfp(RNAi) continua a sopprimere l'espressione del peptide RAN. In questi casi, se non osserviamo una paralisi significativa (>10%) nel vettore vuoto (RNAi) controllare gli animali dopo il giorno 2, in genere terminare il saggio e avviare un'altra replica. Una modifica di questo saggio potrebbe comportare l'uso di sistemi alternativi di espressione dei peptidi RAN. L'unico altro sistema di espressione inducibile comunemente usato per C. elegans è il promotore di scosse di calore. Tuttavia, lo shock termico richiesto può causare risposte allo stress che potrebbero influenzare la tossicità delle proteine. La futura applicazione di altri sistemi di espressione condizionale, come ilsistemaAID (ATO) auxin-inducible , potrebbe migliorare significativamente la nostra capacità di studiare la tossicità dei peptidi RAN.
Saggio di neurodegenerazione/commissure: Vantaggi e limitazioni
I commissure dei motoneuroni in C. elegans rappresentano l'assone di un neurone motorio che passa tra le corde nervose ventrali e dorsali. La blebbing e la rottura possono essere facilmente rilevate nei commissure isolati, consentendo di quantificare rapidamente la neurodegenerazione negli animali vivi (Figura 2). Durante l'esame degli animali, è importante che non incubano in levamisole per un lungo periodo di tempo in quanto ciò può causare la morte prematura degli animali, che porta alla labmoderna neuronale e alla rottura in assenza di qualsiasi peptide RAN tossico. In alcuni casi, i commissure sono completamente degenerati e non sono più visibili. Pertanto, non possono essere segnati per le caratteristiche neuropatologiche perché il nostro saggio misura le percentuali di commissures rotti o sbiaditi dal numero totale di commissures osservati. In questi casi, il commissure assay potrebbe sottovalutare l'effetto del peptide RAN.
In conclusione, i saggi descritti in questo articolo sono utili per misurare la tossicità causata dai peptidi RAN in C. elegans. L'uso di gfp(RNAi) per regolare l'espressione delle proteine consente di osservare i fenotipi post-sviluppo. I nostri approcci possono essere facilmente adattati per eseguire schermi genetici su larga scala per soppressori o stimolatori di tossicità. Saggi secondari, come l'analisi della paralisi e il saggio di commissure possono confermare che la tossicità viene soppressa post-sviluppo e testare se il meccanismo di soppressione è conservato nei neuroni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
NIH R21NS107797
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
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