Summary
反復関連非ATG依存的翻訳産物は、いくつかの繰り返し拡張ベースの疾患の新たな病原性特徴である。記載されたプロトコルの目的は、モデル系C.elegansにおける行動および細胞アッセイを用いてこれらのペプチドによって引き起こされる毒性を評価することである。
Abstract
C.エレガンスは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)やハンチントン病などの繰り返し膨張突然変異によって引き起こされる、年齢関連神経変性疾患をモデル化するために一般的に使用されます。近年、反復膨張含有RNAは、反復関連非AUG依存性(RAN)翻訳と呼ばれる新規型のタンパク質翻訳の基質であることが示された。正規翻訳とは異なり、RAN変換は開始コドンを必要とせず、繰り返しがしきい値の長さを超えた場合にのみ発生します。読み取りフレームを決定する開始コドンがないため、RAN変換は、反復膨張シーケンスを含むセンスおよびアンチセンスRNAテンプレートの両方からすべての読み取りフレームで発生します。したがって、RAN翻訳は、疾患関連の有毒ペプチドの数を1から6に拡大する。これまで、RAN翻訳は、8つの異なる反復拡張ベースの神経変性疾患および神経筋疾患で文書化されてきた。いずれの場合も、どのRAN製品が毒性であるか、ならびに毒性のメカニズムを解読することは、これらのペプチドが疾患病態生理学にどのように寄与するかを理解するための重要なステップです。本論文では、モデル系C.エレガンスにおけるRANペプチドの毒性を測定する戦略を紹介する。まず、開発中のC.エレガンスの成長と運動性に関するRANペプチド毒性を測定する手順を説明する。第2に、RANペプチドが運動性に及ぼす、発達後の年齢依存性の影響を測定するためのアッセイを詳述する。最後に、ニューロンの形態に対するRANペプチドの効果を評価するための神経毒性アッセイについて述べます。これらのアッセイは、RANペプチド毒性の広範な評価を提供し、疾患のメカニズムまたは治療法を同定するために大規模な遺伝的または低分子スクリーンを実行するのに有用であり得る。
Introduction
DNA反復配列の不適切な拡大は筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭型認知症(FTD)、ハンチントン病(HD)1などのいくつかの神経変性疾患の遺伝的基盤である。これらの疾患には確立された細胞モデルと動物モデルがあるが、これらの条件の根底にあるメカニズムは十分に定義されていない。例えば、HDは、ハンチンチンタンパク質Htt2に対するコード配列におけるCAG反復配列の拡張によって引き起こされる。CAGはアミノ酸グルタミンをコードするので、CAGの繰り返し拡張は、ポリグルタミン、またはポリQ内の配列を挿入する結果、Tt.拡張されたポリQタンパク質の中で、毒性33、44に関連する長さと年齢依存性タンパク質凝集体を形成する。驚くべきことに、2つの最近の研究は、polyQ配列の長さがHD疾患発症の主な要因ではないことを示唆し、ポリQ独立因子も疾患55、66に寄与する可能性があることを示唆している。
可能なポリQ非依存のメカニズムの1つは、Repeat Aon-AUG依存(RAN)翻訳7と呼ぶ新たに発見されたタイプのタンパク質翻訳を含む。その名前が示すように、RAN変換は、拡張された繰り返しシーケンスが存在し、正規開始コドンを必要としない場合にのみ発生します。したがって、RAN変換は、3つの異なるポリペプチドを産生する繰り返しの3つの読み取りフレームすべてに起こる。また、多くの遺伝子が、拡大された反復配列の逆補体を含むアンチセンス転写産物を産生するので、アンチセンス転写物の3つの読み取りフレームにおいてもRAN変換が起こる。RANの翻訳は、1つのペプチドから6つのペプチドに拡大された反復含有DNA配列から産生されるタンパク質の数を拡大する。現在までに、RAN翻訳は少なくとも8つの異なる反復拡張障害8において観察されている。RANペプチドは、死後の患者サンプルにおいて観察され、患者が拡大された繰り返し99、1010を運ぶ場合にのみ観察される。これらのペプチドは患者細胞に明らかに存在するが、疾患病態生理学への寄与は不明である。
RANペプチドに関連する潜在的な毒性をより良く定義するために、いくつかのグループは、酵母、ハエ、マウス、および組織培養細胞,11、12、13、14、15、16,12,13,14などの様々なモデルシステムで各ペプチド15を16発現している。これらのモデルは、発現に繰り返し配列を利用するのではなく、反復配列が除去されるがアミノ酸配列が保存されるコドン変動アプローチを採用している。翻訳開始は正規ATGを介して起こり、ペプチドは通常、N末端またはC末端の蛍光タンパク質に融合し、いずれもRANペプチド毒性を妨げているようには見えなくなる。したがって、各コンストラクトは単一のRANペプチドを過剰発現する。多細胞生物の異なるRAN製品を、RANペプチド毒性を測定する簡単なアッセイでモデリングすることは、各疾患を引き起こす反復膨張とは異なるRAN製品が細胞機能障害や神経変性にどのように寄与するかを理解するために極めて重要です。
他のモデルシステムと同様に、C.elegansは、RANペプチド毒性などの新しい疾患メカニズムの研究を可能にする柔軟で効率的な実験プラットフォームを提供します。ワームは、RANペプチド毒性の他のモデルでは現在利用できないいくつかのユニークな実験的属性を提供します。第一に、C.エレガンスは生まれてから死ぬまで光学的に透明である。これにより、RANペプチド発現と局在化の簡単な可視化、ならびに生きた動物における神経変性のインビボ分析が可能になります。第2に、RANペプチド発現モデルを生成するためのトランスジェニック方法は、安価で高速である。C.エレガンスの短い3日間のライフサイクルを考えると、細胞型特異的な方法で任意のRANペプチドを発現する安定したトランスジェニックラインは、1週間以内に生成することができる。第三に、単純な表現型の出力は、化学変異誘発またはRNAiスクリーニングなどの遺伝子スクリーニング方法と組み合わせて、RANペプチド毒性に不可欠な遺伝子を迅速に同定することができる。最後に、C.エレガンスの短い寿命(〜20日)は、ほとんどの繰り返し拡張疾患の最大の危険因子である老化がRANペプチド毒性にどのように影響するかを決定することを可能にする。一緒に、実験属性のこの組み合わせは、他のモデルシステムでは比類のない、RANペプチド毒性の研究のための強力なプラットフォームを提供しています。
ここでは、C.エレガンスの実験的利点を利用して、RANペプチドの毒性を測定し、この毒性の遺伝的修飾因子を同定するいくつかのアッセイについて説明する。コドン変化したATG開始RANペプチドはGFPでタグ付けされ、myo-3プロモーターの下の筋肉細胞またはUNC-47プロモーターの下のGABAergic運動ニューロンのいずれかで個別に発現する。筋肉細胞の発現に関しては、毒性のRANペプチドが緑色蛍光タンパク質(GFP)、またはRNAiの摂食ベクターで標的とすることができる他の蛍光タンパク質(FP)タグでタグ付けされることが重要です。これは、毒性RANペプチド発現が通常増殖を妨げ、そのような株を生存不可能にするためである。gfp(RNAi)の使用は、条件付きでRANペプチド発現を不活性化し、ひずみの維持、遺伝的十字架などを可能にします。アッセイの場合、これらの動物は、RANペプチドの発現と結果の表現型を可能にするgfp(RNAi)から除去される。コドン多様なRANペプチド発現構築物を設計するための分子戦略に加えて、発生毒性(幼虫運動性および成長アッセイ)、発生後の年齢関連毒性(麻痺アッセイ)、およびニューロン形態異常(コミュニケールアッセイ)を測定するためのアッセイについて述べています。
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Protocol
1. コドン変化型RANペプチド発現構築物の生成
- 基本的な反復的なDNA/RNA構造を排除するが、上にあるアミノ酸配列を保持するために、同義コドンを利用して個々のRANペプチドコード配列を設計する。
- カスタムコドンシーケンスを、研究に必要な繰り返し長さで商業的に注文します(通常は5~100の繰り返し)。5' の終わりに HindIII 制限サイトと 3' の終わりに BamHI 制限サイトを含める pPD95.79 などのC. エレガンス発現ベクターへのクローニングを容易にします。
注:より大きな構成体の合成が困難であることが判明した場合、より小さなビルディングブロックシーケンスを合成し、方向結紮戦略17を使用してより大きな繰り返しに組み込むことができます。 - 標準的なT4ライゲーション法を用いてペプチド配列をC.エレガンス発現ベクターにサブクローニングする。
- ランペプチド配列の前でPCRによって生成された細胞型特異的プロモーター配列をサブクローニングし、組織特異的なRANペプチド-GFP発現を駆動する。
- 野生型C.エレガンスの生殖腺にRANペプチドコンストラクトをマイクロインジェクトし、標準方法18を用いて染色体外配列を含むトランスジェニック株を生成する。共注射マーカーの場合、筋肉特異的RFPレポーター(myo-3p::RFP(pCFJ104)))を利用したが、他のマーカーも利用できる。pCFJ104
- 標準的なC.エレガンス統合スクリーニング方法19を用いて、安定な遺伝子をゲノムに統合する。
- RANペプチドが有毒でトランスジェニック動物が生き残らない場合、動物にgfp(RNAi)を供給し、注射前および注射後に細菌を発現させ、有毒タンパク質の発現を静かにする。
注:gfp(RNAi)から動物を除去すると、下記のアッセイを用いた表現型解析のためのRANペプチド発現が可能になります。
2. RNAiベース遺伝子ノックダウン後のRANペプチドの発生毒性の測定:ビデオ速度解析プロトコル
- 標準線虫増殖培地(NGM)RNAi 24 ウェルプレートに 1 mM イソプロピル β-D-1 チオガラクトピラノシド(IPTG)と25 μg/mL カルベニシリンを注ぎます。
- HT115細菌中のRNAiフィードクローンを引き抜き、ルリアスープ(LB)+カルベニシリン(25μg/mL)寒天プレートに試験し、37°Cで24時間増殖します。 empty vector(RNAi) gfp(RNAi)
- 各クローンに対して、LB +カルベニシリン液体培地の1mLに単一コロニーを選び、1分あたり250回転(RPM)で振りながら37°Cで18時間細菌を増殖させます。
- NGM RNAI 24ウェルの4つの個々のウェルを、次の一晩細菌培養の20 μLで発見する:カラム1ウェル= gfp(RNAi)列 2 ウェル = (EV)RNAi;カラム3~6ウェル=試験対象遺伝子に対するRNAi。RNAi細菌が室温(RT)で一晩dsRNA産生を誘導することを可能にする。
- 一日目から卵を分離し、標準的な次亜塩素酸法と種子〜30 C.エレガンス卵をNGM RNAi24ウェルプレートの各ウェルに用いて、統合されたRANペプチドトランスジーンを発現させる。
- 24ウェルを20°Cで7日間インキュベートします。
注:このインキュベーション時間は、PR50またはGR50などの有毒C9orf72 RANジペプチドを発現する株のためのものです。他の株は、細菌の供給源の枯渇とその後の飢餓を防ぐために短いインキュベーション時間を必要とするかもしれません。 - Leica AFビデオ取得ソフトウェア(バージョン2.6.0.7266)を搭載したWindows対応PCに接続されたDFC345FXモノクロカメラを装着したライカMZ16FAステレオ解剖顕微鏡を使用して、伝送光ビデオを取得します。
- ウェル間の一貫したビデオ取得設定を使用して、RNAi条件ごとに2つの別々の井戸から2つのビデオを取得します。各ビデオに対して、18.6X倍率(AFソフトウェアで1.49ズーム設定)を使用して、800 x 600ピクセルの解像度で10秒、毎秒13.16フレーム(時間ボクセル寸法= 0.076秒)を取得します。イメージの露出時間を 4 ミリ秒に設定します。各ビデオには、ひずみ、RNAi 条件、およびウェル番号をすぐにラベル付けします。
- ビデオの順序をランダム化し、ビデオの名前を数字に変更することにより、各ビデオファイルに関連付けられている遺伝子型に実験者を盲目にします。このグループのビデオを新しいファイルとして保存します。解析が完了した後、実験者のブラインドを解除します。
- 各ビデオから20種類の動物の「移動距離」と各動物の長さを測定し、RNAiの状態ごとに合計約40匹のワームを調べる。
- ソフトウェアで、注釈ツールボタンを選択し、次にテキスト描画ツールを選択します。ビデオの最初のフレームで測定されているワームの中央にある点をクリックし、数字としてマークします。ワームの移動経路を視覚的に追跡しながらビデオを最後まで進めます。最後のフレームで、測定対象のワームの中心にある点をクリックし、次の対応する番号をマークします。次に、描画スケールバー ツールを使用して、最初の数値から 2 番目の数値までの線を描画して、"移動距離" を記録します。
- 「移動距離」は、2 つの中心点間の距離です。この距離は、測定ラインの隣に表示されます。この測定値をスプレッドシートに記録します。解析ウィンドウで個々の測定を保存しながら、ビデオ内の19の他のワームに対してこの測定を繰り返します。
- 動きがなく、データを麻痺に偏らないように、最も強い動きを示す動物からの測定を行います。測定が完了したら、すべての測定ラインを示す最終的なビデオフレームのスナップショットを作成し、データを元の動物に戻すことができます。
- 4 列のスプレッドシートを使用してデータを分析します。列1はワーム「識別子」であり、列2は走行距離/時間(速度)である。
- 各ビデオの時間は、実験の下でビデオを右クリックし、ビデオのプロパティに行くことによって見つけることができます。
- [定量]を選択し、ソフトウェアの[統計情報]を選択して、各動物の長さを見つけることによって速度測定を正規化します。ビデオディスプレイ上の注釈ツールのアイコンをクリックすると、「ポリラインを描画」ツールを使用できるようになります。このツールは、頭の先端から尾の先端までのビデオからC.エレガンスを自由に追跡するために使用することができます。行の長さは統計の下に記録されます。
- データを元の動物にさかのぼることができるように、C.エレガンスのサイジングに使用されるすべてのポリラインを示す最後のビデオフレームのスナップショットを撮ります。
- スプレッドシートに 2 つの列を追加して、データを分析します。3列目は「動物の長さ」、4列目は「正規化された速度」(速度/動物の長さ)です。一方向 ANOVA を使用して正規化された速度データを分析し、非定常テストと空ベクトル(RNAi) を使用します。
3. RANペプチドの発生毒性の測定:成長アッセイ
- gfp(RNAi)、(EV)RNAi、(EV)RNAi,または(遺伝子特異的)6cmRNAiプレートのいずれかで、50μLの次亜塩素酸溶液(漂白剤10mL、10 N NaOHの2.5mL、dH2Oの37.5 mL)に〜30匹のグラビド動物を選びます。 RNAi
- 24時間後、次亜塩素酸溶液のスポットから這い出した6個のトランスジェニック前生を、次亜塩素酸溶液処理を施したプレート上のRNAi条件と同一の新しい6cm RNAiプレートに移動する。これらの子孫(F1)を20°Cに入れて成長し、再現します。
- 24~48時間後、動物が成長しているRNAi条件に一致する6cm RNAiに10匹のトランスジェニックL4動物を選びます。20°Cインキュベーターで24時間産卵をパルスする動物を許可します。
- 24時間後、成虫の動物を取り除き、捨てる。機械的なハンドヘルドカウンターを使用して、24時間の間に産卵とL1幼虫の数を数えます。これは総ブロードサイズです。
- 次の72時間にわたって、L4または古い段階に達する動物の数を数えます。各動物がカウントされると、プレートから取り出します。
- 「成長率」を、総ブロードサイズからL4以上の段階に達する動物の割合として定量化します。
- 2 x 2 フィッシャーの正確な検定と空ベクトル(RNAi)を実行して、成長率が統計的に有意かどうかを判断します。比較対象のカテゴリは、「成長」(72時間でL4以上の段階に達した動物の数)と「成長なし」(総ブロードサイズから72時間でL4以上の段階に達する動物の数を差し引いた量)です。
4. 発達後のRANペプチド麻痺アッセイ
- 6 cm gfp (RNAi) プレートに 4 ~6 トランスジェニック L4 を配置し、20 °C でワームを成長させることにより、gfp(RNAi) の筋肉に RAN ペプチドGFPを発現する統合されたC. エレガンス トランスジェニック株を維持します。
- 実験がRNAiを利用してRANペプチド毒性に対する遺伝的影響をテストしている場合、10人のトランスジェニック・グラビッド成人を未飢えプレートから2つの6cm空ベクトル(RNAi)のそれぞれ(麻痺の陽性対照、遺伝的影響に対する陰性対照)、gfp(RNAi)(麻痺の陰性対照、遺伝的効果に対する陽性対照)、遺伝子特異的(RNAi)(i.06.0.10.10.1.0.10.1.cm.1.1.1.cm.)に移動させる。
- 変異体がRANペプチド毒性に対する遺伝的効果を分析するために使用されている場合、2つの6 cm空ベクトル(RNAi)またはgfp(RNAi)プレートのそれぞれに同じRANトランスジーンを発現する10gravid WTまたは変異動物を配置する。20°Cで48時間成長します。
- 6 cm RNAiプレートから10個のトランスジェニックL4を10セット選び、各セットを3cmのRNAiプレート(すなわち、遺伝子型ごとに100匹)に置きます。アッセイに選択されたL4が表面的に正常な運動性を持っていることを確認してください。水分を保持するためにジッパー収納バッグ内にプレートを置きます。
- 袋に入れたプレートをL4と一緒に25°Cインキュベーターに入れ、
- 24時間後に25°Cインキュベーターから24時間後に1株ずつ取り出し、RTで出ている時間を最小限に抑える。
- 解剖顕微鏡のプレートをタップして、動きを確認します。動物が体長以上に移動する場合は、移動体として動物を数え、新しい3cm RNAiプレートに移します。頭や尾の残りのワームをタップするプラチナピックを使用してください。動物が体の長さ以上に動く場合は、移動体として動物を数え、新しい3 cm RNAiプレートに移します。
注: 転送時にプレートあたり 10 個を超えないようにしてください。アッセイは次の高齢動物のみに依存するため、新しいRNAiプレートに子孫を移動しないように注意してください。 - すべての動かないワームをグループ化して、体長以上の動きを簡単に検出できるようにします。動物に少なくとも1分を与え、1つ以上の体長を動かす。それでも動かない場合は、麻痺、袋詰め(つまり、幼虫が母親の中で孵化)、または死んでいる。
- 袋詰めを示す動物を検閲し、プレートの側面に乾燥させ、押出された腸を示し、巣穴、失われた、または検出時にアッセイで死ぬ。麻痺したワームは数え、古いRNAiプレートに残され、廃棄される。
- ステップ 4.6 ~ 4.9 で説明されているように、毎日 5 ~ 7 日間、動物の麻痺をスコア付けします。
- 寿命の分析に使用されるログランクテストと同じで麻痺データを分析します。この統計分析では、動くワームは「生きている」とスコア付けされ、麻痺したワームは「死んだ」とスコア付けされ、死んだ、袋詰めされた、腸が押し出され、乾燥させられた、穴があく、または他の方法で失われたワームは「検閲」として採点されます。
注: この分析では、「アライブ率」の数値は「移動率」動物を示します。逆は「麻痺率」を表します。ログランク統計分析を実行するには、オンライン分析ツール OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/) を使用します。
5. ニューロン病理の測定:コミシュアアッセイ
- UNC-47プロモーターを用いてGABAergicニューロンに関心のあるRANペプチドを発現するトランスジェニックC.エレガンスを生成する。また、GABAニューロンの細胞形態を明らかにするために、unc-47p::GFPまたはunc-47p::RFPを発現する。
- 50匹のトランスジェニックL4動物を選び、25°Cの6cm OP50プレートに24時間置きます。
- 50匹のトランスジェニック動物を25°Cの新しい6cm OP50プレートに24時間移します。
- 広視野顕微鏡下で動物を画像化するためのアガロースパッドを作ります。
- 2つの顕微鏡スライドの上に2枚のテープを置きます。テープなしでクリーニングしたスライドを、テープで貼った 2 つのスライドの中央に置きます。
- 3%溶融アガロースの100 μL(使い捨てプラスチック製のパスツールピペットから1滴)を、使い捨て可能な無菌移動ピペットで中央スライドに分配します。
- すぐに溶融アガロースの滴を横切って2番目のきれいなスライドを置き、テーピングされたスライドの上に置き、スライド間に薄くて均一なアガロースの層を作り出します。
- アガロースが冷却して固まった後、それらを分離することなく、それらの間にアガロースの層を持つ2つのスライドを慎重に取り除き、その下に湿った紙を入れたビニール袋に入れます。10 個のワームにつき 1 つのスライドを作成し、3 つの追加スライドと共に検査します。
- トランスジェニックC.エレガンスを25°Cインキュベーターから取り出し、10個のトランスジェニックC.エレガンスを100μLの100 μLの10mMレバミソーレにガラスうつ病スライドで取り出します。10分間、または動物が麻痺するまでインキュベートします。
- ビニール袋からスライドペアを取り出し、慎重に分離します。ジノタイプでアガロースでスライドにラベルを付け、アガロースの真ん中に10 mMレバミゾールの2μLを追加します。アガロースパッドのレバミゾールに10匹の動物を移動します。動物を#1厚いカバースリップで覆います。
- 外陰部が向きが付いている画像動物は、動物の右側にある。外陰部が頭の左側にある場合、運動ニューロンのコミュニケーションは動物の下にあり、はっきりと見えなくなり、正確な定量化が困難になります。これらの動物から定量を省略する。この向きでは、運動ニューロンのコミュニケーションはカバースリップに最も近く、反転した広視野蛍光顕微鏡ではっきりと見える。63X 1.4X NA油浸漬レンズとライカL5 GFPフィルタセット(Ex480/40nm)を備えた反転広視野蛍光顕微鏡でGFPを発現するニューロンコミュニケーションを視覚化する。Em527/30nm)。ニューロンコミュニケータがGFPの代わりにRFPを発現する場合は、ライカTX2 RFPフィルタセット(Ex560/ 40nm;Em645/75nm)。
- 63x 1.4x NA油浸漬レンズとGFPフィルターセット(Ex480/40 nm)を備えた反転広視野蛍光顕微鏡でGFPを発現するニューロンコミュニケーションを視覚化する。Em527/30 nm)。ニューロンコミュニケートがGFPの代わりにRFPを発現する場合は、赤色蛍光タンパク質(RFP)フィルタセット(Ex560/40 nm)を利用する。エム 645/75 nm)。
- ワームにカバースリップを配置してから45分以内に画像を作成し、固定化による毒性を最小限に抑えます。
- ワームごとに、可視コミュニケートの数を数えます。野生型動物には16の目に見えるコミュニケートがあります。また、コミュニケーションに大きなビーズ(すなわち、ブレブ)を持つコミュニケートの数と壊れているコミュシャスの数を数えます。コミュニケールが壊れているのを確認するには、焦点面を調整して、後側コードから腹側コードまでのコミュニケールに従ってください。
注:unc-47p::GFP蛍光がギャップを示すコミュニケートは壊れていると考えられています。壊れたコミュシュアは通常、休憩の両側にブレブを持ち、コミュニケートが壊れていることを示すのを助ける。20ワームのブリードとブレークの量を数えます。 - 各動物の観察されたコミュニケートの総数にわたってブレブまたはブレークでコミュニケートの割合を計算します。動物1匹あたりのコミュニケーションの絶対数(野生のタイプ、ブリード、壊れたイベントを含む)も測定できます。
- 各カテゴリについて、平均値 ±SDを計算し、2つの集団間の比較のための学生のt検定または3つ以上の集団間の比較のための一方向のANOVAを使用して統計的に分析します。
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Representative Results
ここで説明するアッセイを用いて、G4C2反復増殖を有するALS患者に見られるRANジペプチドの毒性に対する異なる遺伝子阻害2の影響を評価した。成長アッセイを用いて発生毒性を測定し、筋肉発現PR50-GFP毒性のゲノムワイドRNAiスクリーンサプレッサーで同定されたいくつかの遺伝的ノックアウト変異体の効果を分析した。PR50-GFPの発現だけでは完全に浸透性の成長阻止をもたらしたが、いくつかの遺伝子における機能変異の喪失は、PR発生毒性を12〜94%から抑制した(図1A)。
また、ビデオ速度解析法を用いて、PR50発現動物の発達運動性に対する特定の遺伝子ノックダウンの効果を測定した。予想通り、gfp(RNAi)は、PR50-GFP発現の阻害により、空のベクター(RNAi)と比較して運動性が大きく増加した。また、プロテアソームサブユニットrpn-7に対するRNAiがPR50運動性の有意な増加をもたらしたことも明らかにした(図1B)。
ALSは、多くの神経変性疾患と同様に、成人に発生する。そこで、年齢依存性の麻痺アッセイを用いて成体表現型を解析した。PR50-GFPは、5日までに最大80%の麻痺を示した。しかしながら、遺伝子cul-6に向けられたRNAiは、著しく遅れた麻痺を、PR50-GFP毒性に対して必要とされることを示唆している(図1C)。この効果は、袋-1(RNAi)がPR50-GFP毒性を変化させなかったため、袋6(RNAi)に特異的であった。
毒性RANペプチドなどの神経変性タンパク質は、一般的,にC.エレガンス4、20、21、2220,の体壁でモデル化される。42122しかし、ニューロン特異的毒性は多くの神経変性疾患の共通の特徴であるため、RANタンパク質がC.エレガンスニューロンで発現したときに神経病理学を引き起こすかどうかを判断することも重要です。我々は、コミュニケートアッセイを用いてニューロン特異的毒性を調べた。成人2日目では、運動ニューロンにおけるPR50-GFP発現が運動ニューロンの出血の有意な増加につながった。この神経病理学は、インスリン/IGF受容体遺伝子ホモログdaf-2において、いくつかの神経変性タンパク質23の毒性特性を遅延させる変異によって有意に抑制された(図2B)。
図1:筋肉発現RANペプチドの毒性を評価するアッセイ。(A) RANペプチド増殖アッセイ.示された変異体は、gfp(RNAi)条件下でdrIs34(myo-3p::PR50-GFP)遺伝的背景に交差した。 drIs34 myo-3p::PR50-GFP各遺伝子型の上の数字は、成長のために得点された子孫の数を示しています。すべての遺伝子型は、野生のタイプと比較してフィッシャーの正確なテストを使用してp< 0.05を有する。(B) 開発中のRANペプチド毒性を測定するビデオ速度解析。drIs34(myo-3p::PR50-GFP)動物は、gfp(RNAi)、空のベクトル(RNAi)、またはrpn-7(RNAi)の条件下で増殖し、その後、説明したように運動性のために採点された。速度は、gfp(RNAi)処理動物に正規化された。示されるデータは、各遺伝子型について平均±SD、n=40である。**-p < 0.01, ***- p < 0.001, Tukeyポストテストを伴う一方のANOVA。(C) 年齢発症毒性を測定するための麻痺アッセイ.drIs34(myo-3p::PR50-GFP)動物は、空のベクター(RNAi)('WT')、袋-1(RNAi)、または袋6(RNAi)および麻痺が24時間ごとに説明したように採点された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:RANペプチドを発現した運動ニューロンの神経病理学を測定するためのアッセイ。(A) 野生型またはunc-47p::PR50-GFP発現動物におけるGFP運動ニューロンレポーターを発現する成人C.エレガンスの画像。野生型の画像は、通常の伝染形態を示しています。画像は、広視野蛍光顕微鏡で得られた平坦化されたZシリーズスタックを表す。PR50動物は、コミュニケートの破損と出血の例を示しています。(B) PR50コミュニケートブレビングに対するdaf-2(e1370)の影響。ポイントは、単一の動物からのブレッピングコミュニケータのパーセントを表し、平均とSDが示されています。n = 1遺伝子型あたり20匹の動物 **-p < 0.01, ダンのポストホックテストを伴う一方のANOVA。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、筋肉またはC.エレガンスのニューロンでモデル化されたRANペプチド毒性をアッセイするために使用できる方法を報告します。神経変性タンパク質はヒト患者に発症する表現型の年齢を有する一方で、モデル系で過剰発現すると発達毒性を示すこともある。過剰発現には解釈上の限界は大きいが、毒性表現型を逆転させる遺伝子や薬物の同定を目的とした遺伝的または薬理学的スクリーンの強力な出発点を提供する。これは、疾患の最も正確な動物モデルが偏りのないスクリーニングアプローチ24、25、26に適していない表現型または弱い表現型を有しないことを考えると特25,26に重要である。当社のC.エレガンスRANペプチドモデルおよびアッセイは、酵母やショウジョウバエなどの他のRANペプチドモデルシステムに対する強力で補完的なアプローチを表し、これらの新しく記述されたタンパク質の毒性に重要な細胞経路を理解します。
筋肉発現RANペプチドの条件付き毒性
RANペプチド毒性を測定するには、gfp(RNAi)の効果を排除するための追跡期間が必要です。しかし、実験の開始、上演された動物の選択、温度変化などを正確に時間を取らない場合、gfp(RNAi)から除去してから、型の出現までの時間は一貫性がありません。これらのアッセイの経験が増すにつれて、RANペプチド表現型のタイミングと浸透性は比較的一貫しています。これらのアッセイの最も重要なステップの1つは、動物の25°Cへの適切なシフトです。このシフトがなければ、RANペプチドは著しく弱い毒性を示す。しかし、動物は、RANペプチドのベースライン発現が高いため、成長・繁殖しないため、25°Cで継続的に増殖することはできません。これは、毒性RANペプチドを発現する株が寛容な条件(すなわち、低温)下で保たれている酵母やショウジョウバエの状況と異なっていないが、その後、アッセイ13,15の前に制限条件(すなわち、より高い温度)に急激に移行し、15ペプチド発現を増強する。このような条件発現系では、毒性を増強または抑制する遺伝的条件は、ペプチド発現レベルの変化に起因する可能性がある。RANペプチド毒性の遺伝的修飾因子がトランスジーン発現レベルの変化を介して作用するかどうかを判断するために、我々は2つのアプローチを取る。まず、我々のトランスジェニック株の多くは、RANペプチドの発現を駆動するために使用される同じプロモーターの制御下で2番目のRFPレポーターを発現する。RANペプチド発現の低下または増加を引き起こすプロモーター活性の変化は、RFPレベルの同様の減少または増加を引き起こす。我々は、RFPレベルを有意に変化させる変異体またはRNAi条件を非特異的に作用することを考慮する。次に、定量PCRとウェスタンブロッティングを行い、条件間でRANペプチドmRNAまたはタンパク質のレベルが変化するかどうかを判断します。しかし、我々および他の人がC9orf72由来RANペプチドPR50-GFPで観察したように、RANペプチドの西洋ベースの検出は、時には困難または不可能であることが証明される。このような場合、インビボGFPレベルを定量化し、比較される条件間でタンパク質発現が変化するかどうかを判断します。
発生毒性:利点と限界
筋肉中の有毒なRANペプチドの強制過剰発現は、しばしばC.エレガンスの発達停止につながる。これは明らかにヒト疾患病理を模倣するものではありませんが、RAN毒性抑制剤はgfp(RNAi)の不在時に成長し、繁殖する動物として容易に同定されるため、遺伝的サプレッサースクリーンの強力な出発点を提供します。一部のサプレッサーは、遺伝子導入発現の低下による成長を促進する。これらの可能性を区別するために、我々は一般的に我々のRANペプチドトランスジェニック株に同じプロモーターによって駆動される第2のRFPレポーターを含む。トランスジーン発現を抑制または沈黙させるサプレッサーも、RFP発現レベルの低下を示す。一方、正常または高いRFPレベルを示すサプレッサーは、トランスジーン発現の低下によって機能する可能性は低い。酵母増殖やショウジョウバエ眼形態学13、15、27の使用と同様に、15,27これらのアプローチは、ヒトにおける疾患の側面を正確にモデル化していないが、RANペプチド改質剤の初期同定のための強力なスクリーニングツールを提供する。
開発後毒性(麻痺アッセイ):利点と限界
麻痺アッセイの利点は、ワームラボに存在するツールを使用して、相対的に多数の動物(50〜100匹)を測定できることです。麻痺は、検出しやすい重症表現型でもあります。このアッセイの主な制限は、完全な麻痺を引き起こさない運動欠陥に対して無神経である。このような欠陥は、スラッシングアッセイや運動アッセイ28のような、より敏感で定量的なアプローチを測定する必要がある。麻痺アッセイは、可能であれば遺伝子型に対して盲目に行われるべきであり、ワームが他のタイプのストレス(例えば、汚染、飢餓)を受けないように注意する必要があり、それはアッセイ結果に大きな影響を与える可能性があります。毒性RANペプチドを発現するC.エレガンスは、強い麻痺表現型を示すことができない場合がある。これは、GFP(RNAi)がRANペプチド発現を抑制し続けるという持続的な効果が原因である可能性が高い。このような場合、重大な麻痺を観察できなかった場合(>10%)2日目以降の空のベクター(RNAi)コントロール動物では、通常アッセイを終了し、別の複製を開始します。このアッセイの1つの修飾は、代替誘導可能なRANペプチド発現系の使用を含むことができる。C.エレガンスに対して一般的に使用される唯一の他の誘導可能な発現系は、ヒートショックプロモーターである。しかし、必要な熱ショックは、タンパク質の毒性に影響を与える可能性のあるストレス応答を引き起こす可能性があります。オキシン誘導型デグロン(AID)システム29のような他の条件発現システムの将来の応用は、RANペプチド毒性を研究する能力を大幅に高める可能性がある。
神経変性/コミュニケーションアッセイ:利点と限界
C.エレガンスの運動ニューロンコミュニケーションは、腹側と側側神経コードの間を通過する1つの運動ニューロンの軸索を表す。ブレビングと破損は、単離されたコミュニケーションで容易に検出することができ、生きている動物で神経変性を迅速に定量化することができます(図2)。動物を調べている間、これは毒性RANペプチドがない場合に神経の出血や破損につながる早期動物の死を引き起こす可能性があるため、長期間レバミゾールでインキュベートしないことが重要です。場合によっては、コミュニケーションは完全に退化し、もはや見えなくなります。したがって、私たちのアッセイは、観察されたコミュニケートの総数から壊れたり出血したりするコミュレンスの割合を測定するため、神経病理学的特徴に対してスコアリングすることはできません。これらの場合、コミュニケートアッセイはRANペプチドの効果を過小評価する可能性があります。
結論として、本論文に記載されているアッセイは、C.エレガンスにおけるRANペプチドによって引き起こされる毒性を測定するのに有用である。gfp(RNAi)を用いてタンパク質の発現を調節することで、発達後の表現型が観察される。我々のアプローチは、毒性の抑制剤または増強剤のための大規模な遺伝的スクリーンを実行するために容易に適応することができる。麻痺アッセイやコミュニケーションアッセイなどの二次アッセイは、毒性が発生後に抑制されていることを確認し、抑制のメカニズムがニューロンに保存されているかどうかをテストすることができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
NIH R21NS107797
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
References
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
- The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
- Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
- Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
- Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
- Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
- Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877 (2016).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
- Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
- Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).
- Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
- Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
- Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).
- Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
- Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
- O'Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
- Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
- Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
