Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling av RAN Peptid toksisitet i C. elegans

Published: April 30, 2020 doi: 10.3791/61024
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Gjentatte tilknyttede ikke-ATG-avhengige translasjonelle produkter er nye patogene trekk ved flere gjentatte ekspansjonsbaserte sykdommer. Målet med den beskrevne protokollen er å evaluere toksisitet forårsaket av disse peptidene ved hjelp av atferds- og cellulære analyser i modellsystemet C. elegans.

Abstract

C. elegans brukes ofte til å modellere aldersrelaterte nevrodegenerative sykdommer forårsaket av gjentatte ekspansjonsmutasjoner, som amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Huntingtons sykdom. Nylig ble gjentatt ekspansjonsholdig RNA vist seg å være substratet for en ny type proteinoversettelse kalt gjentatt assosiert ikke-AUG-avhengig (RAN) oversettelse. I motsetning til kanonisk oversettelse krever IKKE RAN-oversettelse en start-kodon, og oppstår bare når gjentakelser overskrider en terskellengde. Fordi det ikke er noen start codon å bestemme leserammen, OPPSTÅR RAN oversettelse i alle leserammer fra både sense og antisense RNA-maler som inneholder en gjentatt utvidelsessekvens. Ran-oversettelse utvider derfor antall mulige sykdomsrelaterte toksiske peptider fra én til seks. Så langt har RAN oversettelse blitt dokumentert i åtte forskjellige gjenta ekspansjonsbaserte nevrodegenerative og nevromuskulære sykdommer. I hvert tilfelle er dechiffrering som RAN-produkter er giftige, så vel som deres toksisitetsmekanismer, et kritisk skritt mot å forstå hvordan disse peptidene bidrar til sykdomspatiologi. I denne artikkelen presenterer vi strategier for å måle toksisiteten av RAN peptider i modellsystemet C. elegans. Først beskriver vi prosedyrer for måling av RAN peptidtoksisitet på vekst og motilitet av å utvikle C. elegans. For det andre beskriver vi en analyse for måling av postutvikling, aldersavhengige effekter av RAN-peptider på motilitet. Til slutt beskriver vi en nevrotoksisitetsanalyse for evaluering av effekten av RAN peptider på nevronmorfologi. Disse analysene gir en bred vurdering av RAN peptid toksisitet og kan være nyttig for å utføre store genetiske eller små molekylskjermer for å identifisere sykdomsmekanismer eller terapier.

Introduction

Den upassende utvidelsen av DNA-gjentatte sekvenser er det genetiske grunnlaget for flere nevrodegenerative sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og Huntingtons sykdom (HD)1. Mens det er etablerte cellulære og dyremodeller for disse sykdommene, er mekanismer som ligger til grunn for disse forholdene ikke godt definert. For eksempel er HD forårsaket av utvidelser av en CAG-gjentakelsessekvens i kodesekvensen for Huntingtin-proteinet Htt2. Fordi CAG koder aminosyreglutamin, resulterer CAG-repetisjonsutvidelsen i innsetting av en polyglutamin, eller polyQ, sekvens i Htt. Utvidede polyQ-proteiner danner lengde- og aldersavhengige proteinaggregater som er forbundet med toksisitet3,4. Overraskende, to nyere studier tyder på at lengden på polyQ sekvensen er ikke den viktigste driveren for HS sykdom utbruddet, noe som tyder på at polyQ-uavhengige faktorer kan også bidra til sykdommen5,6.

En mulig polyQ-uavhengig mekanisme innebærer en nylig oppdaget type protein oversettelse kalt Repeat Enssociated Non-AUG-avhengig (RAN) oversettelse7. Som navnet tilsier, skjer RAN-oversettelse bare når en utvidet gjentakelsessekvens er til stede og krever ikke en kanonisk startcodon. Derfor skjer RAN-oversettelse i alle tre leserammer av repetisjonen for å produsere tre forskjellige polypeptider. I tillegg, fordi mange gener også produserer en antisense transkripsjon som inneholder omvendt komplement av den utvidede gjentakelsessekvensen, oppstår RAN-oversettelse også i alle tre leserammer av antisensetranskripsjonen. Sammen utvider RAN-oversettelse antall proteiner produsert fra en utvidet gjentatt DNA-sekvens fra ett peptid til seks peptider. Hittil har RAN oversettelse blitt observert i minst åtte forskjellige gjentatte ekspansjonsforstyrrelser8. RAN peptider observeres i postmortem pasientprøver og bare i tilfeller der pasienten bærer en utvidet gjentakelse9,10. Mens disse peptidene er tydelig tilstede i pasientceller, er deres bidrag til sykdomspatofiologi uklart.

For bedre å definere den potensielle toksisiteten forbundet med RAN peptider, har flere grupper uttrykt hvert peptid i ulike modellsystemer, for eksempel gjær, fluer, mus og vevskulturceller11,,12,13,14,15,16. I stedet for å bruke gjentakelsessekvensen for uttrykk, bruker disse modellene en codon-variasjonstilnærming der gjentakelsessekvensen elimineres, men aminosyresekvensen bevares. Oversettelsesinitiering skjer gjennom en kanonisk ATG, og peptidet er vanligvis smeltet sammen til et fluorescerende protein ved enten N- eller C-terminus, og ingen av dem ser ut til å forstyrre RAN peptidtoksisitet. Derfor overuttrykker hver konstruksjon et enkelt RAN-peptid. Modellering av de forskjellige RAN-produktene i en flercellet organisme med enkle analyser for å måle RAN peptidtoksisitet er viktig å forstå hvordan de forskjellige RAN-produktene fra hver sykdomsfremkallende gjentatt ekspansjon bidrar til cellulær dysfunksjon og nevrodegenerasjon.

Som andre modellsystemer gir C. elegans en fleksibel og effektiv eksperimentell plattform som muliggjør studier av nye sykdomsmekanismer, for eksempel RAN peptidtoksisitet. Ormer tilbyr flere unike eksperimentelle attributter som for øyeblikket ikke er tilgjengelige i andre modeller av RAN peptidtoksisitet. For det første er C. elegans optisk gjennomsiktig fra fødsel til død. Dette gjør det mulig for enkel visualisering av RAN peptid uttrykk og lokalisering, samt in vivo analyse av neurodegeneration i levende dyr. For det andre er transgene metoder for å generere RAN peptiduttrykksmodeller billig og rask. Gitt den korte tre-dagers livssyklusen til C. elegans,stabile transgene linjer som uttrykker en gitt RAN peptid på en celle-type spesifikk måte kan produseres på under en uke. For det tredje kan enkle fenotypic utganger kombineres med genetiske screeningmetoder, som kjemisk mutagenesis eller RNAi screening, for raskt å identifisere gener som er avgjørende for RAN peptidtoksisitet. Til slutt, den korte levetiden til C. elegans (~ 20 dager) tillater etterforskere å bestemme hvordan aldring, som er den største risikofaktoren for de fleste gjentatte ekspansjonssykdommer, påvirker RAN peptid toksisitet. Sammen er denne kombinasjonen av eksperimentelle attributter uovertruffen i et annet modellsystem og tilbyr en kraftig plattform for studiet av RAN peptidtoksisitet.

Her beskriver vi flere analyser som utnytter de eksperimentelle fordelene med C. elegans for å måle toksisiteten til RAN-peptider og for å identifisere genetiske modifikatorer av denne toksisiteten. De codon-varierte ATG-initierte RAN peptider er merket med GFP og uttrykkes individuelt i enten muskelceller under myo-3 arrangør eller i GABAergic motor nevroner under unc-47 arrangør. For uttrykk i muskelceller er det viktig at giftige RAN peptider er merket med grønt fluorescerende protein (GFP), eller andre fluorescerende protein (FP) tag som kan målrettes med en RNAi fôring vektor. Dette er fordi giftig RAN peptid uttrykk vanligvis blokkerer vekst, noe som gjør slike stammer ikke levedyktig. Bruken av gfp(RNAi) betinget inaktiverer RAN peptid uttrykk og tillater belastning vedlikehold, genetiske kors, etc. For analyser fjernes disse dyrene fra gfp(RNAi),som tillater uttrykk for RAN-peptidet og de resulterende fenotypene. I tillegg til den molekylære strategien for å designe codon-varierte RAN peptiduttrykkskonstruksjoner, beskriver vi analyser for måling av utviklingstoksisitet (larvemotilitet og vekstanalyse), postutviklingsalderassosiert toksisitet (lammelsesanalyse) og nevronmorfologiske defekter (commissure analyse).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generere codon-varierte RAN peptid uttrykk konstruksjoner

  1. Design den enkelte RAN peptid koding sekvens ved hjelp av synonymt codons å eliminere den grunnleggende repeterende DNA / RNA struktur, men bevare overliggende aminosyre sekvens.
  2. Bestill de egendefinerte codonsekvensene kommersielt ved de gjentatte lengdene som trengs for studiene (vanligvis 5–100 repetisjoner). Inkluder et HindIII-restriksjonssted ved 5's slutten og et BamHI-restriksjonssted ved utgangen av 3-tallet for å legge til rette for kloning i C. elegans uttrykksvektorer, for eksempel pPD95.79.
    MERK: Hvis syntese av større konstruksjoner viser seg vanskelig, kan mindre byggeblokksekvenser syntetiseres og deretter bygges inn i større repetisjoner ved hjelp av en retningsbestemt ligation strategi17.
  3. Del peptidsekvensen i en C. elegans uttrykksvektor ved hjelp av standard T4 ligation metoder.
  4. Del klon en celletypespesifikk promotorsekvens generert av PCR foran RAN peptidsekvensen for å drive vevsspesifikt RAN peptid-GFP-uttrykk.
  5. Microinject RAN peptid konstruere i gonad av vill type C. elegans å generere transgene stammer som inneholder extrachromosomal arrays ved hjelp av standardmetoder18. For en medinjeksjonsmarkør ble den muskelspesifikke RFP-reporteren (myo-3p::RFP (pCFJ104)) benyttet, selv om andre markører også kan brukes.
  6. Integrer et stabilt transgen i genomet ved hjelp av standard C. elegans integrasjonscreeningsmetoder19.
  7. Hvis RAN-peptidet er giftig og transgene dyr ikke overlever, mate dyr gfp (RNAi) uttrykker bakterier pre- og post-injeksjon for å dempe uttrykket av giftig protein.
    MERK: Fjerning av dyr fra gfp(RNAi) muliggjør RAN peptiduttrykk for fenotypiske analyser ved hjelp av analysene som er beskrevet nedenfor.

2. Måle utviklingstoksisiteten til RAN-peptider etter RNAi-basert genknockdown: Videohastighetsanalyseprotokoll

  1. Hell standard nematode vekst medium (NGM) RNAi 24 brønnplater med 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) og 25 μg/ml karbenicillin.
  2. Strekk ut RNAi-fôringskloner i HT115 bakterier som skal testes på Luria buljong (LB) + karbenicillin (25 μg/ml) agarplater og vokse bakterier ved 37 °C i 24 timer. Inkluder tom vektor (RNAi) som positiv kontroll for toksisitet og gfp(RNAi) som negativ kontroll.
  3. For hver klone, velg en enkelt koloni i 1 ml LB + karbenicillin flytende medier og vokse bakterier over natten i 18 timer ved 37 °C mens du rister på 250 rotasjoner per minutt (RPM).
  4. Spot fire individuelle brønner av NGM RNAI 24 brønner med 20 μL av følgende over natten bakterielle kulturer: kolonne 1 brønner = gfp (RNAi); kolonne 2 brønner = (EV)RNAi; søyler 3–6 brønner = RNAi mot gener som skal testes. Tillat RNAi-bakterier å indusere dsRNA-produksjon over natten ved romtemperatur (RT).
  5. Isoler egg fra dag én voksen C. elegans som uttrykker det integrerte RAN peptidtransgene ved hjelp av standard hypoklorittmetode og frø ~ 30 C. elegans egg i hver brønn av NGM RNAi 24 brønnplate.
  6. Inkuber de 24 brønnene ved 20 °C i 7 dager.
    MERK: Denne inkubasjonstiden er for stammer som uttrykker giftige C9orf72 RAN dipeptider, for eksempel PR50 eller GR50. Andre stammer kan kreve kortere inkubasjonstider for å forhindre utmattelse av bakteriell matkilde og påfølgende sult.
  7. Skaff deg overførte lysvideoer ved hjelp av et Leica MZ16FA stereodissekerende mikroskop utstyrt med et DFC345FX monokromt kamera koblet til en Windows-kompatibel PC som kjører Leica AF videooppkjøpsprogramvare (versjon 2.6.0.7266).
    1. Kjøp to videoer fra to separate brønner for hver RNAi-tilstand ved hjelp av konsekvente innstillinger for videoanskaffelse mellom brønner. For hver video kan du skaffe deg 10 sekunder med oppløsning på 800 x 600 piksler og 13,16 bilder per sekund (tidsvoxeldimensjon = 0,076 sekunder) ved hjelp av 18,6 X forstørrelse (1,49 zoominnstilling i AF-programvare). Sett bildeeksponeringstiden til 4 millisekunder. Merk hver video umiddelbart med belastningen, RNAi-tilstanden og brønnnummeret.
  8. Blinde eksperimentereren til genotypen som er knyttet til hver videofil, ved å randomisere rekkefølgen på videoene og endre navnet på videoene til tall. Lagre denne gruppen videoer som en ny fil. Ublind eksperimentereren etter at analysen er fullført.
  9. Mål "tilbakelagt avstand" og lengden på hvert dyr for 20 forskjellige dyr fra hver video, og undersøke totalt ~ 40 ormer for hver RNAi tilstand.
    1. I programvaren velger du merknadsverktøyknappen og deretter tegnetekstverktøyet. Klikk på et punkt i midten av ormen som måles i den første rammen av videoen, og merk den som et tall. Gå videoen til slutten mens du visuelt sporer bevegelsesbanen til ormen. I siste ramme klikker du på et punkt i midten av ormen som måles, og markerer neste tilsvarende nummer. Deretter trekker du en linje fra det første tallet til det andre tallet ved hjelp av tegneskalaverktøyet for å registrere "tilbakelagt avstand".
    2. "Distanse reist" er avstanden mellom de to centroid poeng. Denne avstanden vises ved siden av målelinjen. Ta opp denne målingen i et regneark. Gjenta denne målingen for 19 andre ormer i videoen samtidig som du beholder hver enkelt måling i analysevinduet.
  10. Foreta målinger fra dyr som viser den mest robuste bevegelsen for å unngå valg av dyr som ikke viser bevegelse og forutser dataene mot lammelse. Når målingene er fullført, ta et øyeblikksbilde av den endelige videorammen som illustrerer alle målelinjene slik at dataene kan spores tilbake til dyret som det stammer fra.
  11. Analyser dataene ved hjelp av et regneark med fire kolonner. Kolonne en er ormen "identifikator", kolonne to er avstanden reist / tid (hastighet).
    1. Tidspunktet for hver video kan bli funnet ved å høyreklikke på videoen under eksperimentet og gå til egenskapene til videoen.
  12. Normaliser hastighetsmålingen ved å finne lengden på hvert dyr ved å velge Kvantifiser, deretter Statistikk på programvaren. Ved å klikke på merknadsverktøyikonet på videoskjermen skal det tillate bruk av "Tegn polyline"-verktøyet. Dette verktøyet kan deretter brukes til å fritt spore C. elegans fra videoen fra spissen av hodet til spissen av halen. Lengden på linjen vil bli registrert under statistikk.
    1. Ta et øyeblikksbilde av den endelige videorammen som illustrerer alle polyline brukes for å dimensjonere C. elegans slik at dataene kan spores tilbake til dyret som de oppsto fra.
  13. Analyser dataene ved å legge til to ekstra kolonner i regnearket. Kolonne tre er "Animal Length", og kolonne fire er "Normalisert hastighet" (hastighet / dyr lengde). Analyser de normaliserte hastighetsdataene ved hjelp av en enveis ANOVA med post-hoc-testing kontra tom vektor (RNAi).

3. Måling av utviklingstoksisitet av RAN peptid: Vekstanalyse

  1. Plukk ~ 30 gravid dyr i en 50 μL flekk av hypokloritt løsning (10 ml blekemiddel, 2,5 ml av 10 N NaOH, 37,5 ml dH2O) på enten en gfp (RNAi), (EV)RNAi, eller (genspesifikk) 6 cm RNAi plate.
  2. Etter 24 timer, flytt seks transgen avkom som har kravlet ut av hypoklorittløsningsstedet til en ny 6 cm RNAi-plate som er identisk med RNAi-forholdene på platen der de ble utsatt for hypoklorittløsningsbehandlingen. Sett disse avkom (F1) på 20 ° C for å vokse og reprodusere.
  3. Etter 24–48 timer plukker du 10 transgene L4-dyr på 6 cm RNAi som matcher RNAi-forholdene som dyrene har vokst på. La dyrene pulslegge egg i 24 timer i en 20 °C inkubator.
  4. Etter 24 timer, fjern de voksne dyrene og kast dem. Tell antall egg og L1 larver lagt i løpet av 24 timer ved hjelp av en mekanisk håndholdt teller. Dette er den totale brødstørrelsen.
  5. I løpet av de neste 72 timer, telle antall dyr som når L4 eller eldre scenen. Når hvert dyr telles, fjern det fra platen.
  6. Kvantifiser "Prosentvekst" som prosentandel av dyr som når L4 eller eldre scenen ut av den totale brødstørrelsen.
  7. Utfør en 2 x 2 Fishers eksakte test kontra tom vektor (RNAi) for å avgjøre om prosentveksten er statistisk signifikant. Kategoriene for sammenligning er "Vekst" (# av dyr som nådde L4 eller eldre scenen i 72 h) og "Ingen vekst" (total brødstørrelse minus antall dyr som når L4 eller eldre stadium i 72 timer).

4. Post-utvikling RAN peptid lammelse analyse

  1. Vedlikehold integrerte C. elegans transgene stammer som uttrykker RAN peptid-GFP i muskelen på gfp(RNAi) ved å plassere 4–6 transgene L4-er på en 6 cm gfp(RNAi) plate og vokse ormene ved 20 °C.
  2. Hvis eksperimentet bruker RNAi til å teste for genetiske effekter på RAN peptid toksisitet, flytte 10 transgenic gravid voksne fra en unstarved plate til hver av to 6 cm tom vektor(RNAi) (positiv kontroll for lammelse, negativ kontroll for genetiske effekter), gfp (RNAi) (negativ kontroll for lammelse, positiv kontroll for genetiske effekter), genspesifikk(RNAi) (dvs. 10 voksne per gravid plate).
  3. Hvis mutanter brukes til å analysere genetiske effekter på RAN peptid toksisitet, plassere 10 gravid WT eller mutant dyr uttrykke samme RAN transgene på hver av to 6 cm tom vektor(RNAi) eller gfp (RNAi) plater. Dyrk ormene ved 20 °C i 48 timer.
  4. Plukk 10 sett med 10 transgene L4-plater fra 6 cm RNAi-platene og plasser hvert sett på en 3 cm RNAi-plate (dvs. n = 100 dyr for hver genotype). Sørg for at L4 er valgt for analysen alle har overfladisk normal motilitet. Plasser platene i en oppbevaringspose med glidelås for å beholde fuktigheten.
  5. Plasser de posede platene med L4 i 25 °C inkubatoren.
  6. Fjern dyrene 24 timer senere fra 25 °C inkubatoren en stamme om gangen for å minimere tiden de er ute på RT.
  7. Trykk på platene på dissekeringsmikroskopet for å se etter bevegelse. Hvis dyrene beveger seg mer enn en kroppslengde, telle dyret som mobil og overføre det til en ny 3 cm RNAi plate. Bruk en platina plukke for å trykke på de resterende ormene på hodet eller halen. Hvis dyret beveger seg mer enn en kroppslengde, telle dyret som mobil og overføre det til en ny 3 cm RNAi plate.
    MERK: Ikke overstige 10 ormer per plate ved overføring. Vær forsiktig så du unngår å flytte avkom til den nye RNAi-platen fordi analysen bare avhenger av å følge eldre dyr.
  8. Grupper alle de ikke-bevegelige ormene sammen slik at bevegelse av mer enn en kroppslengde lett kan oppdages. Gi dyret minst ett minutt til å flytte mer enn ett kroppslengde. Hvis det fortsatt ikke beveger seg, er det lammet, pakket (dvs. larver klekket inni mor), eller død.
  9. Sensurere dyr som viser bagging, tørkes på sidene av platen, viser ekstrudert tarm, burrow, gå tapt, eller dø av analysen på tidspunktet for deteksjon. Lammede ormer telles, igjen på den gamle RNAi-platen og kasseres.
  10. Score dyrene for lammelse hver dag i 5-7 dager som beskrevet i trinn 4.6-4.9.
  11. Analyser lammelsesdata med en loggrangeringstest som er identisk med den som brukes til å analysere levetid. I denne statistiske analysen blir bevegelige ormer scoret som "Alive", lammede ormer scores som "Dead", og døde, bagged, gut ekstrudert, uttørket, gravd eller på annen måte tapte ormer blir scoret som "Sensurert".
    MERK: I denne analysen indikerer "Percent Alive"-nummeret "Prosent flytting" dyr. Den inverse representerer "Prosent lammet". Bruk det nettbaserte analyseverktøyet OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/) til å utføre statistiske analyser av loggrangeringen.

5. Måle nevronpatologi: Commissure analyse

  1. Generer transgene C. elegans som uttrykker RAN-peptidet av interesse for GABAergic nevroner ved hjelp av unc-47-arrangøren. Uttrykk også unc-47p::GFP eller unc-47p::RFP for å avsløre den cellulære morfologien til GABA-nevronene.
  2. Plukk 50 transgene L4 dyr og plasser dem på en 6 cm OP50 plate ved 25 °C i 24 timer.
  3. Overfør de 50 transgene dyrene til en ny 6 cm OP50-plate ved 25 °C i 24 timer.
  4. Lag agarose pads for å forestille dyrene under widefield mikroskopi.
    1. Plasser to stykker tape på toppen av to mikroskoplysbilder. Plasser et rengjort lysbilde uten tape midt i de to teipede lysbildene.
    2. Dispenser ~ 100 μL (1 dråpe fra en engangsplast Pasteur pipette) på 3% smeltet agarose på midten lysbildet med en engangs steril overføringspipette.
    3. Plasser umiddelbart et annet rent lysbilde over dråpe smeltet agarose slik at den hviler på de teipede lysbildene og skaper et tynt og jevnt lag med agarose mellom lysbildene.
    4. Etter at agarose har avkjølt og størknet, fjern forsiktig de to lysbildene med laget av agarose mellom dem, uten å skille dem, og legg dem i en plastpose med et fuktig stykke papir under dem. Gjør ett lysbilde per 10 ormer som skal undersøkes sammen med tre ekstra lysbilder.
  5. Fjern transgene C. elegans fra 25 °C inkubatoren og plukk 10 transgene C. elegans i en 100 μL dråpe på 10 mM levamisole i et glass depresjon lysbilde. Inkuber i 10 min eller til dyr er lammet.
  6. Fjern et glidepar fra plastposen og skill dem forsiktig. Merk lysbildet med agarose med genotypen og tilsett 2 μL av 10 mM levamisole til midten av agarose. Flytt de 10 dyrene inn i levamisålen på agaroseputen. Dekk dyrene med en #1 tykkelse coverslip.
  7. Bildedyr der vulva er orientert slik at det er på høyre side av dyret. Hvis vulva er på venstre side av hodet, vil kommissurene til motornevronene være under dyrene og ikke så godt synlig, noe som gjør nøyaktig kvantifisering vanskelig. Utelate kvantifisering fra disse dyrene. I denne orienteringen er kommissurene til motornevronene nærmest dekkslipen og er tydelig synlige på et omvendt widefield fluorescensmikroskop. Visualiser nevronencommissures uttrykke GFP med en Leica DMI4000B invertert widefield fluorescens mikroskop med en 63X 1.4X NA olje nedsenking linse og en Leica L5 GFP filter sett (Ex480/40nm; Em527/30nm). Hvis nevronen commissures uttrykke RFP i stedet for GFP, bruke en Leica TX2 RFP filtersett (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. Visualiser nevronkommissurene som uttrykker GFP med et omvendt widefield fluorescensmikroskop med et 63x 1,4 x NA-oljenedsenkningslinse og et GFP-filtersett (Ex480/40 nm; Em527/30 nm). Hvis nevronkommissurene uttrykker RFP i stedet for GFP, kan du bruke et filtersett for rødt fluorescerende protein (RFP) (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).
  8. Bilde ormene innen 45 minutter etter å plassere dekkslip på ormene for å minimere toksisitet fra immobilisering.
  9. For hver orm teller du antall synlige commissures. Det er 16 synlige commissures i vill type dyr. Tell også antall commissures som har store perler (dvs. blebs) i commissures samt antall commissures som er brutt. Følg kommissuren fra ryggledningen til luftrøret ved å justere brennvidden for å bekrefte at kommissuren er brutt.
    MERK: Commissures der unc-47p::GFP fluorescens viser et gap anses brutt. En ødelagt commissure har vanligvis en bleb på hver side av pausen, noe som bidrar til å vise at kommissurene er ødelagt. Tell mengden blebbing og pauser for 20 ormer.
  10. Beregn fraksjonen av kommissures med blebs eller brudd over det totale antallet observerte kommissurer for hvert dyr. Det absolutte antallet kommissurere talt per dyr (inkludert vill type, blebbed og ødelagte hendelser) kan også måles.
  11. For hver kategori beregner du gjennomsnittet ± SD og analyserer statistisk med enten en students t-test for sammenligning mellom to populasjoner, eller en enveis ANOVA for sammenligninger mellom 3 eller flere populasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brukte analysene som er beskrevet her for å evaluere effekten av ulike genhemminger på toksisiteten av RAN-dipeptider som finnes hos ALS-pasienter med en G4C 2-repetisjonsutvidelse.2 Ved hjelp av vekstanalysen for å måle utviklingstoksisitet analyserte vi effekten av flere genetiske knockout-mutanter identifisert i en genomomfattende RNAi-skjermsuppressorer av muskeluttrykt PR50-GFP toksisitet. Mens uttrykk for PR50-GFP alene resulterte i en fullstendig gjennomtrengende vekststans, undertrykte tap av funksjonsmutasjoner i flere gener PR utviklingstoksisitet fra 12–94% (Figur 1A).

Vi målte også effekten av spesifikke genknockdowns på utviklingsmotiliteten til PR50-uttrykkende dyr ved hjelp av videohastighetsanalysemetoden. Som forventet resulterte gfp(RNAi) i en stor økning i motilitet sammenlignet med tom vektor(RNAi) på grunn av hemming av PR50-GFP-uttrykk. Vi oppdaget også at RNAi mot proteasome subunit rpn-7 resulterte i en betydelig økning i PR50 motilitet (Figur 1B).

ALS, som mange nevrodegenerative sykdommer, forekommer hos voksne. Derfor analyserte vi voksne fenotyper ved hjelp av aldersavhengig lammelseanalyse. PR50-GFP viste opptil 80% lammelse etter 5 dager. RNAi rettet imidlertid mot genets blindvei 6 betydelig forsinket lammelse, noe som tyder på at blindvei er nødvendig for PR50-GFP toksisitet (figur 1C). Denne effekten var spesifikk for blindvei 6(RNAi) fordi blindvei(RNAi) ikke endret PR50-GFP toksisitet.

Nevrodegenerative proteiner, som giftige RAN peptider, er vanligvis modellert i kroppsveggen av C. elegans4,20,21,22. Det er imidlertid også viktig å avgjøre om RAN-proteiner forårsaker nevropatologi når uttrykt i C. elegans nevroner, fordi nevronspesifikk toksisitet er et vanlig trekk ved mange nevrodegenerative sykdommer. Vi undersøkte nevronspesifikk toksisitet ved hjelp av commissure-analysen. I dag 2 voksne, PR50-GFP uttrykk i motor neurons førte til en betydelig økning i motor neuron blebbing. Denne nevropatologien ble signifikant undertrykt av en mutasjon i insulin/IGF reseptorgenet homolog daf-2 som forsinker de giftige egenskapene til flere nevrodegenerative proteiner23 (Figur 2B).

Figure 1
Figur 1: Analyser for å evaluere toksisiteten av muskeluttrykte RAN-peptider. (A) RAN peptid vekst analyse. De angitte mutantene ble krysset inn i drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) genetisk bakgrunn under gfp (RNAi) forhold. Tall over hver genotype indikerer antall avkom scoret for vekst. Alle genotyper har p < 0,05 ved hjelp av Fishers eksakte test sammenlignet med vill type. (B) Videohastighetsanalyse for å måle RAN peptidtoksisitet under utvikling. dyr (myo-3p::PR50-GFP) ble dyrket under gfp(RNAi), tom vektor(RNAi)eller rpn-7(RNAi) og deretter scoret for motilitet som beskrevet. Hastigheten ble normalisert til gfp(RNAi) behandlede dyr. Data vist er gjennomsnittlig ± SD, n = 40 for hver genotype. **-p < 0,01, ***- p < 0,001, enveis ANOVA med Tukey etter test. (C) Lammelse analyse for å måle alder utbruddet toksisitet. drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) dyr ble dyrket på tom vektor (RNAi) ('WT'), cul-1(RNAi), eller cul-6 (RNAi) og lammelse ble scoret som beskrevet hver 24 h. ***-p < 0,001, log-rank test med Bonferroni post-test korreksjon vs. WT. n = 100 dyr per genotype. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Analyse for måling av nevropatologi av motorneuron uttrykte RAN peptider. (A) Bilder av voksne C. elegans uttrykker unc-47p::GFP motor neuron reporter i vill type eller unc-47p: :PR50-GFP uttrykker dyr. Bildene for vill type illustrerer normal commissure morfologi. Bilder representerer flate Z-serie stabler oppnådd av widefield fluorescens mikroskopi. PR50 dyr viser eksempler på commissure brudd og blebbing. (B) Effekten av daf-2(e1370) på PR50 commissure blebbing. Poeng representerer prosenten blebbing commissures fra et enkelt dyr, med gjennomsnittet og SD vist. n = 20 dyr per genotype **-p < 0,01, enveis ANOVA med Dunns post-hoc-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her rapporterer vi metoder som kan brukes til å analyse RAN peptid toksisitet modellert i muskelen eller i nevronene i C. elegans. Mens nevrodegenerative proteiner har en aldersinnsettende fenotype hos menneskelige pasienter, kan de også vise utviklingsmessig toksisitet når de er overuttrykt i modellsystemer. Overexpression har betydelige tolkende begrensninger, men det gir også et kraftig utgangspunkt for genetiske eller farmakologiske skjermer som tar sikte på å identifisere gener eller legemidler som kan reversere giftige fenotyper. Dette er spesielt viktig gitt at de fleste presise dyremodeller av sykdommen enten ikke har fenotype eller svake fenotyper som ikke er egnet for objektivscreening tilnærminger24,25,26. Våre C. elegans RAN peptid modeller og analyser representerer en kraftig, komplementær tilnærming til andre RAN peptid modellsystemer, som gjær og Drosophila, for å forstå cellulære veier viktig for toksisitet av disse nylig beskrevne proteiner.

Betinget toksisitet av muskeluttrykte RAN peptider
Måling av RAN peptidtoksisitet krever en jaktperiode for eliminering av effekten av gfp(RNAi). Men tiden mellom fjerning fra gfp (RNAi) og fremveksten av fenotyper kan være inkonsekvent hvis det ikke tas hensyn til nøyaktig tid initiering av eksperimenter, valg av iscenesatte dyr, temperaturskift, etc. Etter hvert som vi har blitt mer erfarne med disse analysene, har timingen og penetrance av RAN peptid fenotyper blitt relativt konsekvent. Et av de mest kritiske trinnene i disse analysene er riktig skifte av dyr til 25 °C. Uten dette skiftet viser RAN peptider betydelig svakere toksisitet. Dyr kan imidlertid ikke dyrkes kontinuerlig ved 25 °C fordi de ikke vokser og reproduserer, antagelig på grunn av høyere baseline uttrykk for RAN peptid. Dette er ikke ulikt situasjonen i gjær eller Drosophila hvor stammer som uttrykker giftige RAN peptider holdes under tillatte forhold (dvs. lav temperatur), men deretter akutt skiftet til restriktive forhold (dvs. høyere temperatur) før analysen13,15 for å forbedre peptiduttrykk. I slike betingede uttrykkssystemer kan genetiske forhold som forbedrer eller undertrykker toksisitet, skyldes endringer i peptiduttrykksnivåer. For å finne ut om genetiske modifikatorer av RAN peptid toksisitet handle via endringer i transgene uttrykknivåer, tar vi to tilnærminger. For det første uttrykker mange av våre transgene stammer en annen RFP-reporter under kontroll av den samme arrangøren som brukes til å drive uttrykk for RAN-peptidet. Endringer i promoteraktivitet som forårsaker redusert eller økt RAN peptiduttrykk forårsaker lignende reduksjoner eller økninger i RFP-nivåer. Vi anser mutanter eller RNAi-forhold som endrer RFP-nivåene betydelig for å handle ikke spesifikt. For det andre utfører vi kvantitativ PCR og vestlig blotting for å avgjøre om nivåene av RAN peptid mRNA eller protein endres mellom forholdene. Imidlertid kan vestlig-basert deteksjon av RAN peptider noen ganger vise seg vanskelig eller umulig, som vi og andre har observert med C9orf72-avledet RAN peptid PR50-GFP. I slike tilfeller kvantifiserer vi in vivo GFP-nivåer for å avgjøre om proteinuttrykk endres mellom forholdene som sammenlignes.

Utviklingstoksisitet: Fordeler og begrensninger
Tvungen overuttrykk av giftige RAN peptider i muskel fører ofte til utviklingsarrest i C. elegans. Selv om dette åpenbart ikke etterligner menneskelig sykdomspatologi, gir det et kraftig utgangspunkt for genetiske suppressorskjermer, fordi RAN toksisitetssuppressorer lett identifiseres som dyr som vokser og reproduserer i fravær av gfp (RNAi). Noen undertrykkere vil legge til rette for vekst på grunn av reduksjon av transgeneuttrykk. For å skille mellom disse mulighetene, inkluderer vi vanligvis en annen RFP-reporter drevet av samme promotor i vår RAN peptid transgene belastning. Suppressors som reduserer eller demper transgenuttrykk vil også vise reduserte RFP-uttrykksnivåer. På den annen side er det lite sannsynlig at suppressorer som viser normale eller forhøyede RFP-nivåer, vil fungere via reduksjon av transgenuttrykk. Mye som bruk av gjær vekst eller Drosophila øye morfologi13,15,27, disse tilnærmingene, mens ikke nøyaktig modellering aspekter av sykdommen hos mennesker, gir et kraftig screeningverktøy for den første identifisering av RAN peptid modifikatorer.

Toksisitet etter utvikling (lammelsesanalyse): Fordeler og begrensninger
Fordelen med lammelseanalysen er at et relativt stort antall dyr (50–100) kan måles med verktøy som finnes i et hvilket som helst ormlaboratorium. Lammelse er også en alvorlig fenotype som lett oppdages. Hovedbegrensningen av denne analysen er at det er ufølsomt for bevegelsesfeil som ikke forårsaker fullstendig lammelse. Slike defekter kan kreve mer følsomme og kvantitative tilnærminger for å måle, for eksempel thrashing analyser eller kinematisk bevegelse analyser28. Lammelseanalyser bør utføres blindet til genotype hvis mulig og forsiktighet bør tas for å sikre at ormer ikke gjennomgår noen annen type stress (f.eks. forurensning, sult), som kan påvirke analysens resultater betydelig. C. elegans uttrykker giftige RAN peptider noen ganger ikke klarer å vise en robust lammelse fenotype. Dette skyldes sannsynligvis vedvarende effekter av gfp (RNAi) som fortsetter å undertrykke RAN peptiduttrykk. I disse tilfellene, hvis vi ikke overholder betydelig lammelse (> 10%) i den tomme vektorkontroll (RNAi) kontroll dyr etter dag 2, avslutter vi vanligvis analysen og starter en annen replika. En endring av denne analysen kan innebære bruk av alternative udugelige RAN peptid uttrykkssystemer. Det eneste andre som vanligvis brukes, uduglig uttrykkssystem for C. elegans er varmesjokkarrangøren. Det nødvendige varmesjokket kan imidlertid forårsake stressrespons som kan påvirke toksisiteten av proteinene. Fremtidig anvendelse av andre betingede uttrykkssystemer, for eksempel auxin-inducible degron (AID) system29,kan betydelig forbedre vår evne til å studere RAN peptid toksisitet.

Neurodegeneration/commissure analyse: Fordeler og begrensninger
Motor neuron commissures i C. elegans representerer akson av en motor neuron passerer mellom ventral og rygg nervøs ledninger. Blebbing og brudd kan lett oppdages i de isolerte kommissurene, slik at nevrodegenerasjon raskt kan kvantifiseres hos levende dyr (figur 2). Mens du undersøker dyrene, er det viktig at de ikke inkuberer i levamisole i en lengre periode, da dette kan forårsake for tidlig dyredød, noe som fører til nevronal blebbing og brudd i fravær av giftig RAN peptid. I noen tilfeller er commissures fullstendig degenerert og ikke lenger synlig. Derfor kan de ikke scores for nevropatologiske egenskaper fordi vår analyse måler prosentandelene av commissures brutt eller blebbing ut av det totale antall observerte commissures. I disse tilfellene kan commissure analysen undervurdere effekten av RAN-peptidet.

Til slutt er de analyser som er beskrevet i dette papiret nyttige for måling av toksisitet forårsaket av RAN peptider i C. elegans. Bruk av gfp(RNAi) for å regulere uttrykk for proteiner gjør det mulig å observere postutviklingsfenotyper. Våre tilnærminger kan enkelt tilpasses for å utføre store genetiske skjermer for suppressors eller enhancers av toksisitet. Sekundære analyser, som lammelseanalysen og commissure analysen, kan bekrefte at toksisitet undertrykkes etter utvikling og tester om undertrykkelsesmekanismen bevares hos nevroner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

NIH R21NS107797

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile CELLTREAT Scientific Products 50-202-036 Nematode growth plates and RNAi
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM BD DIAGNOSTIC SYSTEMS DF0145070 Nematode growth plates and RNAi
AGAROSE ULTRAPURE LIFE TECHNOLOGIES 16500500 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
CARBENICILLIN 5G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP26485 Nematode growth plates and RNAi
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK THERMO SCI ERIE 12542B Imaging for commissure assay
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242952008 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK THERMO SCI ERIE 125485C Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides THERMO SCI ERIE 12-550-15 Imaging for commissure assay
Gibco Bacto Peptone  Gibco  DF0118-17-0 Nematode growth plates and RNAi
HALOCARBON OIL 700 SIGMA-ALDRICH INC H8898-50ML Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
IPTG BIOTECH 10G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP162010 Nematode growth plates and RNAi
Leica Advanced Fluorescence imaging software Leica Microsystems LAS-AF Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay
Leica Immersion type N (Oil) W NUHSBAUM INC NC9547002 Imaging for commissure assay
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR THERMO SCI ACROS ORGANICS AC187870100 Imaging for commissure assay
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242956003 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains

PETRI DISH, 60X15MM,500/CS		 CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC FB0875713A Nematode growth plates and RNAi
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS CORNING LIFE SCIENCES DL 87721 Nematode growth plates and RNAi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
  2. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  3. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
  6. Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
  7. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
  8. Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
  9. Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
  10. Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
  11. Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
  12. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877 (2016).
  13. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  14. Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
  15. Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
  16. Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).
  17. Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).
  18. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  19. Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
  20. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).
  21. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  22. Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
  23. Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).
  24. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  25. Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
  26. O'Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
  27. Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
  28. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  29. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).

Tags

Biologi Utgave 158 nevrodegenerasjon ALS Huntingtons sykdom C9orf72 proteotoksisitet gjentatte ekspansjonsforstyrrelser
Måling av RAN Peptid toksisitet i <em>C. elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N.,… More

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans. J. Vis. Exp. (158), e61024, doi:10.3791/61024 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter