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Biology

Medição da Toxicidade do Peptídeo RAN em C. elegans

Published: April 30, 2020 doi: 10.3791/61024
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Os produtos translacionais não dependentes do ATG são características patogênicas emergentes de várias doenças baseadas em expansão repetida. O objetivo do protocolo descrito é avaliar a toxicidade causada por esses peptídeos utilizando ensaios comportamentais e celulares no sistema modelo C. elegans.

Abstract

C. elegans é comumente usado para modelar doenças neurodegenerativas relacionadas à idade causadas por mutações de expansão repetidas, como a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) e a doença de Huntington. Recentemente, o RNA contendo expansão repetida mostrou-se o substrato para um novo tipo de tradução proteica chamada tradução não-dependente de AUG (RAN). Ao contrário da tradução canônica, a tradução RAN não requer um codon inicial e só ocorre quando as repetições excedem um comprimento de limiar. Como não há codon de início para determinar o quadro de leitura, a tradução RAN ocorre em todos os quadros de leitura tanto de modelos de RNA de sentido quanto de RNA antissentido que contêm uma seqüência de expansão repetida. Portanto, a tradução ran expande o número de possíveis peptídeos tóxicos associados à doença de um para seis. Até agora, a tradução ran foi documentada em oito diferentes doenças neurodegenerativas e neuromusculares baseadas em expansão. Em cada caso, decifrar quais produtos RAN são tóxicos, bem como seus mecanismos de toxicidade, é um passo crítico para entender como esses peptídeos contribuem para a fisiopatologia da doença. Neste artigo, apresentamos estratégias para medir a toxicidade dos peptídeos RAN no sistema modelo C. elegans. Em primeiro lugar, descrevemos procedimentos para medir a toxicidade do peptídeo RAN sobre o crescimento e a motilidade do desenvolvimento de C. elegans. Em segundo lugar, detalhamos um ensaio para medir efeitos pós-desenvolvimento, dependentes da idade dos peptídeos RAN sobre a motilidade. Finalmente, descrevemos um ensaio de neurotoxicidade para avaliar os efeitos dos peptídeos ran na morfologia dos neurônios. Esses ensaios fornecem uma ampla avaliação da toxicidade do peptídeo RAN e podem ser úteis para a realização de telas genéticas ou pequenas moléculas em larga escala para identificar mecanismos ou terapias de doenças.

Introduction

A expansão inadequada das sequências de repetição do DNA é a base genética para várias doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA), a demência frontotemporal (TFT) e a doença de Huntington (HD)1. Embora existam modelos celulares e animais estabelecidos para essas doenças, os mecanismos subjacentes a essas condições não são bem definidos. Por exemplo, o HD é causado pelas expansões de uma seqüência de repetição CAG na seqüência de codificação para a proteína Huntingtin Htt2. Como o CAG codifica a glutamina de aminoácidos, a expansão de repetição do CAG resulta na inserção de uma seqüência de poliglutamina, ou poliQ, dentro de Htt. Proteínas poliQ expandidas formam agregados proteicos dependentes de comprimento e idade que estão associados à toxicidade3,4. Surpreendentemente, dois estudos recentes sugerem que o comprimento da seqüência de poliQ não é o principal condutor do início da doença de HD, sugerindo que fatores independentes do poliQ também podem contribuir para a doença5,6.

Um possível mecanismo independente de poliQ envolve um tipo recém-descoberto de tradução proteica denominado Repeat Asociated Non-AUG-dependent (RAN) tradução7. Como o nome indica, a tradução RAN só ocorre quando uma seqüência de repetição expandida está presente e não requer um códon de partida canônico. Portanto, a tradução RAN ocorre em todos os três quadros de leitura da repetição para produzir três polipeptídeos distintos. Além disso, como muitos genes também produzem uma transcrição anti-sentido que contém o complemento reverso da seqüência de repetição expandida, a tradução RAN também ocorre em todos os três quadros de leitura da transcrição antisense. Em conjunto, a tradução ran expande o número de proteínas produzidas a partir de uma seqüência de DNA repetitiva expandida de um peptídeo para seis peptídeos. Até o momento, a tradução ran foi observada em pelo menos oito diferentes distúrbios de expansão repetitiva8. Os peptídeos RAN são observados em amostras de pacientes pós-morte e somente nos casos em que o paciente carrega uma repetição expandida9,10. Embora esses peptídeos estejam claramente presentes nas células do paciente, sua contribuição para a fisiopatologia da doença não é clara.

Para melhor definir a potencial toxicidade associada aos peptídeos RAN, vários grupos expressaram cada peptídeo em vários sistemas modelo, como leveduras, moscas, camundongos e células de cultura tecidual11,,12,,13,,14,,15,16. Em vez de utilizar a seqüência de repetição para expressão, esses modelos empregam uma abordagem de variação de códon em que a seqüência de repetição é eliminada, mas a seqüência de aminoácidos é preservada. A iniciação da tradução ocorre através de um ATG canônico e o peptídeo é tipicamente fundido a uma proteína fluorescente no N- ou C-terminus, nenhum dos quais parece interferir com a toxicidade do peptídeo RAN. Portanto, cada construção superexpressa um único peptídeo RAN. Modelar os diferentes produtos RAN em um organismo multicelular com ensaios simples para medir a toxicidade do peptídeo RAN é de vital importância para entender como os diferentes produtos RAN de cada expansão repetitiva causadora de doenças contribuem para a disfunção celular e neurodegeneração.

Como outros sistemas modelo, C. elegans fornece uma plataforma experimental flexível e eficiente que permite estudos de novos mecanismos de doença, como a toxicidade do peptídeo RAN. Os worms oferecem vários atributos experimentais únicos que não estão disponíveis atualmente em outros modelos de toxicidade do peptídeo RAN. Primeiro, c. elegans são opticamente transparentes desde o nascimento até a morte. Isso permite a visualização simples da expressão e localização do peptídeo RAN, bem como a análise in vivo da neurodegeneração em animais vivos. Em segundo lugar, os métodos transgênicos para a geração de modelos de expressão de peptídeos RAN são baratos e rápidos. Dado o curto ciclo de vida de três dias de C. elegans,linhas transgênicas estáveis expressando qualquer peptídeo RAN dado de forma específica do tipo celular podem ser produzidas em menos de uma semana. Em terceiro lugar, as saídas pheotípicas simples podem ser combinadas com métodos de triagem genética, como mutagênese química ou triagem RNAi, para identificar rapidamente genes essenciais para a toxicidade do peptídeo RAN. Finalmente, a curta vida útil de C. elegans (~20 dias) permite que os pesquisadores determinem como o envelhecimento, que é o maior fator de risco para a maioria das doenças de expansão repetida, influencia a toxicidade do peptídeo RAN. Juntos, essa combinação de atributos experimentais é incomparável em qualquer outro sistema de modelo e oferece uma plataforma poderosa para o estudo da toxicidade do peptídeo RAN.

Aqui descrevemos vários ensaios que aproveitam as vantagens experimentais de C. elegans para medir a toxicidade dos peptídeos RAN e identificar modificadores genéticos dessa toxicidade. Os peptídeos RAN iniciados pelo códon ATG são marcados com GFP e expressos individualmente em células musculares sob o promotor do mio-3 ou em neurônios motores GABAergic sob o promotor unc-47. Para a expressão em células musculares, é importante que os peptídeos RAN tóxicos sejam marcados com proteína fluorescente verde (GFP), ou outra etiqueta de proteína fluorescente (FP) que pode ser direcionada com um vetor de alimentação RNAi. Isso porque a expressão tóxica do peptídeo RAN geralmente bloqueia o crescimento, tornando tais cepas inviáveis. O uso de gfp(RNAi) inativa condicionalmente a expressão do peptídeo RAN e permite a manutenção de cepas, cruzes genéticas, etc. Para ensaios, esses animais são removidos do gfp(RNAi),que permite a expressão do peptídeo RAN e dos fenótipos resultantes. Além da estratégia molecular para projetar construções de expressão ran-variadas de códon, descrevemos ensaios para medir toxicidade do desenvolvimento (motilidade larval e ensaio de crescimento), toxicidade associada à idade pós-desenvolvimento (ensaio de paralisia) e defeitos morfológicos neuronológicos (ensaio de comissure).

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Protocol

1. Gerando construções de expressão ran variadas de códon

  1. Projete a seqüência individual de codificação de peptídeos RAN utilizando códons sinônimos para eliminar a estrutura fundamental de DNA/RNA repetitivo, mas preservar a seqüência de aminoácidos sobrepostas.
  2. Encomendar as seqüências de códon personalizadas comercialmente nos comprimentos de repetição necessários para os estudos (tipicamente 5-100 repetições). Inclua um local de restrição HindIII no final de 5' e um site de restrição bamhi no final de 3' para facilitar a clonagem em vetores de expressão C. elegans, como pPD95.79.
    NOTA: Se a síntese de construções maiores se mostrar difícil, sequências menores de blocos de construção podem ser sintetizadas e, em seguida, incorporadas em repetições maiores usando uma estratégia de ligadura direcional17.
  3. Subclone a seqüência de peptídeos em um vetor de expressão C. elegans usando métodos de ligadura T4 padrão.
  4. Subclone uma seqüência de promotor específico do tipo de célula gerada pelo PCR na frente da seqüência ran peptídeo para conduzir a expressão RAN peptídeo-GFP específica do tecido.
  5. Microinjetar o peptídeo RAN construção na gônada do tipo selvagem C. elegans para gerar cepas transgênicas contendo matrizes extracromossômicas usando métodos padrão18. Para um marcador de co-injeção, o repórter RFP específico para músculos (myo-3p::RFP (pCFJ104)) foi utilizado, embora outros marcadores também possam ser utilizados.
  6. Integrar um transgene estável no genoma usando os métodos de triagem de integração c. elegans padrão 19.
  7. Se o peptídeo RAN é tóxico e os animais transgênicos não sobrevivem, alimentam os animais gfp (RNAi) expressando bactérias pré e pós-injeção para silenciar a expressão da proteína tóxica.
    NOTA: A remoção de animais do gfp(RNAi) permite a expressão do peptídeo RAN para análises pheotípicas utilizando os ensaios descritos abaixo.

2. Medir a toxicidade do desenvolvimento dos peptídeos RAN após o knockdown genético baseado em RNAi: Protocolo de análise de velocidade de vídeo

  1. Despeje as placas de crescimento de nematóide padrão (NGM) RNAi 24 com isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e 25 μg/mL de carbenicillin.
  2. Espirre os clones de alimentação RNAi em bactérias HT115 para serem testados no caldo luria (LB) + placas de ágar carbenicina (25 μg/mL) e cultivar bactérias a 37 °C por 24 h. Inclua o vetor vazio (RNAi) como o controle positivo para toxicidade e gfp(RNAi) como controle negativo.
  3. Para cada clone, escolha uma única colônia em 1 mL de mídia líquida LB + carbenicillin e plante bactérias durante a noite por 18 horas a 37 °C enquanto agita a 250 rotações por minuto (RPM).
  4. Localize quatro poços individuais do NGM RNAI 24 poços com 20 μL das seguintes culturas bacterianas durante a noite: coluna 1 poços = gfp(RNAi); coluna 2 poços = (EV)RNAi; colunas 3-6 poços = RNAi contra genes a serem testados. Permitir que as bactérias RNAi induzam a produção de dsRNA durante a noite à temperatura ambiente (RT).
  5. Isole os ovos do primeiro dia adulto C. elegans expressando o transgene de peptídeo RAN integrado usando o método padrão de hipoclorito e sementes ~30 C. ovos elegans em cada poço da placa de poço NGM RNAi 24.
  6. Incubar os 24 poços a 20 °C por 7 dias.
    NOTA: Este tempo de incubação é para cepas que expressam dipeptídeos RAN c9orf72 tóxicos, tais como PR50 ou GR50. Outras cepas podem exigir tempos de incubação mais curtos para evitar a exaustão da fonte de alimento bacteriana e a fome subsequente.
  7. Adquira vídeos de luz transmitidos usando um microscópio de dissecção estéreo Leica MZ16FA equipado com uma câmera monocromática DFC345FX conectada a um PC compatível com Windows executando o software de aquisição de vídeo Leica AF (versão 2.6.0.7266).
    1. Adquira dois vídeos de dois poços separados para cada condição RNAi usando configurações consistentes de aquisição de vídeo entre poços. Para cada vídeo, adquira 10 segundos na resolução de 800 x 600 pixels e 13,16 quadros por segundo (dimensão de tempo voxel = 0,076 segundos) usando ampliação de 18,6X (configuração de zoom de 1,49 no software AF). Ajuste o tempo de exposição da imagem para 4 milissegundos. Rotular cada vídeo imediatamente com a tensão, condição RNAi e número do poço.
  8. Cegar o experimentador para o genótipo associado a cada arquivo de vídeo, aleparatizando a ordem dos vídeos e alterando o nome dos vídeos para números. Salve este grupo de vídeos como um novo arquivo. Sem cegar o experimentador depois que a análise estiver completa.
  9. Meça a "distância percorrida" e o comprimento de cada animal para 20 animais diferentes de cada vídeo, examinando um total de ~40 vermes para cada condição RNAi.
    1. No software, selecione o botão ferramentas de anotação e, em seguida, a ferramenta de texto de desenho. Clique em um ponto no centro do worm sendo medido no primeiro quadro do vídeo e marque-o como um número. Avance o vídeo até o final enquanto rastreia visualmente o caminho de movimento do worm. No último quadro, clique em um ponto no centro do worm que está sendo medido e marque o próximo número correspondente. Em seguida, usando a ferramenta draw scalebar, desenhe uma linha do primeiro número para o segundo número para registrar a "distância percorrida".
    2. 'Distância percorrida' é a distância entre os dois pontos centróides. Esta distância é mostrada adjacente à linha de medição. Registre essa medição em uma planilha. Repita esta medição para outros 19 worms no vídeo, preservando cada medida individual na janela de análise.
  10. Fazer medições de animais que apresentam o movimento mais robusto para evitar a seleção de animais que não apresentam movimento e distorcem os dados para a paralisia. Uma vez que as medições estejam concluídas, tire um instantâneo do quadro final do vídeo ilustrando todas as linhas de medição para que os dados possam ser rastreados até o animal de onde se originou.
  11. Analise os dados usando uma planilha de quatro colunas. A primeira coluna é o worm "identificador", a coluna dois é a distância percorrida/tempo (velocidade).
    1. O tempo de cada vídeo pode ser encontrado clicando com o botão direito do mouse no vídeo sob o experimento e indo para as propriedades do vídeo.
  12. Normalize a medição de velocidade encontrando o comprimento de cada animal selecionando Quantify e, em seguida, Estatísticas no software. Clicar no ícone da ferramenta de anotação no visor de vídeo deve permitir o uso da ferramenta "Draw Polyline". Esta ferramenta pode então ser usada para rastrear livremente os C. elegans do vídeo da ponta da cabeça até a ponta da cauda. A duração da linha será registrada sob estatísticas.
    1. Tire uma foto do quadro de vídeo final ilustrando toda a polilina usada para dimensionar os C. elegans para que os dados possam ser rastreados até o animal de onde se originaram.
  13. Analise os dados adicionando duas colunas adicionais à planilha. A coluna três é o "Comprimento animal", e a coluna quatro é a "Velocidade Normalizada" (velocidade/comprimento animal). Analise os dados de velocidade normalizados usando uma ANOVA unidirecional com teste pós-hoc versus vetor vazio (RNAi).

3. Medição da toxicidade do desenvolvimento do peptídeo RAN: Ensaio de crescimento

  1. Escolha ~30 animais gravídicos em uma mancha de 50 μL de solução de hipoclorito (10 mL de alvejante, 2,5 mL de 10 N NaOH, 37,5 mL de dH2O) em uma placa gfp(RNAi), (EV)RNAi ou (específica do gene) 6 cm RNAi.
  2. Depois de 24 h, mova seis descendentes transgênicos que tenham rastejado para fora do ponto de solução de hipoclorito para uma nova placa RNAi de 6 cm idêntica às condições RNAi na placa em que foram submetidos ao tratamento da solução de hipoclorito. Coloque esses descendentes (F1) a 20 °C para crescer e se reproduzir.
  3. Depois de 24-48 h, escolha 10 animais Transgênicos L4 em 6 cm RNAi correspondendo às condições RNAi que os animais têm crescido. Deixe os animais pulsar ovos por 24 h em uma incubadora de 20 °C.
  4. Depois de 24 h, retire os animais adultos e descarte-os. Conte o número de ovos e larvas L1 colocadas durante o período de 24 h usando um contador de mão mecânico. Este é o tamanho total da ninhada.
  5. Nas próximas 72 h, conte o número de animais que atingem o estágio L4 ou mais velho. À medida que cada animal é contado, remova-o da placa.
  6. Quantifique o "Crescimento percentual" como a porcentagem de animais que atingem o estágio L4 ou mais antigo do tamanho total da ninhada.
  7. Realize um teste exato de 2 x 2 Fisher versus vetor vazio (RNAi) para determinar se o crescimento percentual é estatisticamente significativo. As categorias de comparação são "Crescimento" (# de animais que atingiram o estágio L4 ou mais velho em 72 h) e "Sem Crescimento" (tamanho total da ninhada menos o número de animais que atingem L4 ou estágio mais velho em 72 h).

4. Ensaio de paralisia de peptídeos RAN pós-desenvolvimento

  1. Mantenha as cepas transgênicas integradas de C. elegans expressando peptídeo RAN-GFP no músculo em gfp(RNAi) colocando 4-6 L4 transgênicos em uma placa de 6 cm gfp(RNAi) e cultivar os vermes a 20 °C.
  2. Se o experimento estiver utilizando RNAi para testar efeitos genéticos na toxicidade do peptídeo RAN, mova 10 adultos gravídicos transgênicos de uma placa não faminta para cada um dos dois vetores vaziosde 6 cm (RNAi) (controle positivo para paralisia, controle negativo para efeitos genéticos), gfp(RNAi) (controle negativo para paralisia, controle positivo para efeitos genéticos), gene específico(RNAi) (i.e., 10 adultos gravídicos por 6 cm de placa).
  3. Se os mutantes estão sendo usados para analisar efeitos genéticos na toxicidade do peptídeo RAN, coloque 10 animais wt gravídicos ou mutantes expressando o mesmo transgene RAN em cada uma das duas placas de vetores vaziosde 6 cm (RNAi) ou gfp(RNAi). Cresça os vermes a 20 °C por 48 h.
  4. Escolha 10 conjuntos de 10 L4 transgênicos das placas RNAi de 6 cm e coloque cada conjunto em uma placa RNAi de 3 cm (ou seja, n = 100 animais para cada genótipo). Certifique-se de que os L4 selecionados para o ensaio têm motilidade superficialmente normal. Coloque as placas dentro de um saco de armazenamento de zíper para reter a umidade.
  5. Coloque as placas ensacadas com L4 na incubadora de 25 °C.
  6. Remova os animais 24 h mais tarde da incubadora de 25 °C uma cepa de cada vez para minimizar o tempo que eles estão fora em RT.
  7. Toque nas placas do microscópio de dissecação para verificar se há movimento. Se os animais se moverem mais do que um comprimento do corpo, conte o animal como móvel e transfira-o para uma nova placa RNAi de 3 cm. Use uma picareta de platina para tocar os vermes restantes na cabeça ou na cauda. Se o animal se mover mais do que um comprimento do corpo, conte o animal como móvel e transfira-o para uma nova placa RNAi de 3 cm.
    NOTA: Não exceda 10 worms por placa durante a transferência. Tenha cuidado para evitar mover a prole para a nova placa RNAi, pois o ensaio depende apenas de seguir animais idosos.
  8. Agrupar todos os vermes que não se movem para que o movimento de mais de um comprimento corporal possa ser facilmente detectado. Dê ao animal pelo menos um minuto para mover mais de um comprimento do corpo. Se ainda não se move, está paralisada, ensacada (ou seja, larvas eclodidas dentro da mãe) ou mortas.
  9. Censurar animais que exibem ensacados, desseificarem nas laterais da placa, exibem intestinos extrudados, escavam, se perdem ou morrem do ensaio no momento da detecção. Vermes paralisados são contados, deixados na antiga placa RNAi, e descartados.
  10. Marque os animais para paralisia todos os dias durante 5-7 dias, conforme descrito nas etapas 4.6-4.9.
  11. Analisar dados de paralisia com um teste de classificação de log idêntico ao usado para analisar a vida útil. Nesta análise estatística, vermes em movimento são pontuados como "Vivos", vermes paralisados são pontuados como "Mortos", e vermes mortos, ensacados, extrudados, dessecados, escavados ou perdidos são marcados como "Censurados".
    NOTA: Nesta análise, o número "Percentual Vivo" indica os animais "Por cento em movimento". O inverso representa o "Percentual Paralisado". Use a ferramenta de análise on-line OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/)para realizar as análises estatísticas de log-rank.

5. Medição da patologia dos neurônios: ensaio de comissura

  1. Gerar c. elegans transgênicos expressando o peptídeo ran de interesse nos neurônios GABAergic usando o promotor unc-47. Também expresse unc-47p::GFP ou unc-47p::RFP para revelar a morfologia celular dos neurônios GABA.
  2. Escolha 50 animais Transgênicos L4 e coloque-os em uma placa OP50 de 6 cm a 25 °C por 24 horas.
  3. Transfira os 50 animais transgênicos para uma nova placa OP50 de 6 cm a 25 °C por 24 horas.
  4. Faça agaroses para a imagem dos animais sob microscopia de campo largo.
    1. Coloque dois pedaços de fita em cima de dois slides de microscópio. Coloque um slide limpo sem fita no meio dos dois slides gravados.
    2. Dispense ~100 μL (1 gota de uma pipeta pasteur de plástico descartável) de 3% de agarose derretida no escorregador do meio com uma pipeta descartável de transferência estéril.
    3. Coloque imediatamente um segundo slide limpo através da gota de agarose derretida de modo que ele repousa sobre os slides colados e cria uma fina e até mesmo camada de agarose entre os slides.
    4. Depois que a agarose tiver esfriado e solidificado, remova cuidadosamente as duas lâminas com a camada de agarose entre elas, sem separá-las, e coloque-as em um saco plástico com um pedaço de papel úmido sob eles. Faça um slide por 10 worms para ser examinado juntamente com três slides extras.
  5. Remova os c. elegans transgênicos da incubadora de 25 °C e escolha 10 elegans transgênicos em uma queda de 100 μL de 10 mM levamisole em um slide de depressão de vidro. Incubar por 10 min ou até que os animais fiquem paralisados.
  6. Remova um par de slides do saco plástico e separe-os cuidadosamente. Marque o slide com a agarose com o genótipo e adicione 2 μL de 10 mM levamisole ao meio da agarose. Mova os 10 animais para a levamisole na almofada de agarose. Cubra os animais com um #1 de espessura.
  7. Imagem de animais em que a vulva é orientada de tal forma que está do lado direito do animal. Se a vulva estiver no lado esquerdo da cabeça, as comissuras dos neurônios motores estarão sob os animais e não tão claramente visíveis, dificultando a quantificação precisa. Omita a quantificação desses animais. Nesta orientação, as comissuras dos neurônios motores estão mais próximas do deslizamento de cobertura e são claramente visíveis em um microscópio de fluorescência invertida. Visualize as comissuras de neurônios expressando GFP com um microscópio de fluorescência invertida Leica DMI4000B invertido com uma lente de imersão de óleo 63X 1.4X NA e um conjunto de filtro Leica L5 GFP (Ex480/40nm; Em527/30nm). Se os comissordes de neurônios expressarem RFP em vez de GFP, utilize um conjunto de filtros Leica TX2 RFP (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. Visualize as comissuras de neurônios expressando GFP com um microscópio de fluorescência de campo largo invertido com uma lente de imersão a óleo de 63x 1,4x NA e um conjunto de filtroGFP (Ex480/40 nm; Em527/30 nm). Se os comissordes de neurônios expressarem RFP em vez de GFP, utilize um conjunto de filtros de proteína fluorescente vermelha (RFP) (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).
  8. Imagem os vermes dentro de 45 minutos de colocar o deslizamento de cobertura sobre os vermes para minimizar a toxicidade da imobilização.
  9. Para cada worm, conte o número de comissações visíveis. Há 16 comissuras visíveis em animais do tipo selvagem. Conte também o número de comissures que possuem contas grandes (ou seja, blebs) nas comissuras, bem como o número de comisssuras que estão quebradas. Para confirmar que a comissura está quebrada, siga a comissura do cordão dorsal até o cordão ventral, ajustando o plano focal.
    NOTA: As comissações nas quais a fluorescência un-47p::GFP apresenta uma lacuna são consideradas quebradas. Uma comissura quebrada normalmente tem um bleb em ambos os lados do intervalo, ajudando a mostrar que as comissuras estão quebradas. Conte a quantidade de blebbing e quebra susta para 20 vermes.
  10. Calcular a fração de comissuras com blebs ou quebras sobre o número total de comissações observadas para cada animal. O número absoluto de comissures contados por animal (incluindo tipo selvagem, blebbed e eventos quebrados) também pode ser medido.
  11. Para cada categoria, calcule a média ± DS e analise estatisticamente com um teste t de estudante para comparação entre duas populações, ou uma ANOVA unidirecional para comparações entre 3 ou mais populações.

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Representative Results

Utilizou-se os ensaios descritos aqui para avaliar o efeito de diferentes inibições genéticas sobre a toxicidade dos dipeptídeos RAN que são encontrados em pacientes com ELA com uma expansão repetitiva G4C2. Usando o ensaio de crescimento para medir a toxicidade do desenvolvimento, analisamos os efeitos de vários mutantes de nocaute genético identificados em um genoma de supressores de tela RNAi de toxicidade PR50-GFP expressa muscular. Enquanto a expressão de PR50-GFP sozinha resultou em uma prisão de crescimento completamente penetrante, a perda de mutações de função em vários genes suprimiu a toxicidade do desenvolvimento de RP de 12-94%(Figura 1A).

Também medimos o efeito de knockdowns genéticos específicos sobre a motilidade do desenvolvimento de animais expressos em PR50 usando o método de análise de velocidade de vídeo. Como esperado, o gfp(RNAi) resultou em um grande aumento da motilidade em relação ao vetor vazio (RNAi) devido à inibição da expressão PR50-GFP. Também descobrimos que rnai contra a subunidade proteasome rpn-7 resultou em um aumento significativo na motilidade PR50 (Figura 1B).

A ELA, como muitas doenças neurodegenerativas, ocorre em adultos. Por isso, analisamos fenótipos adultos utilizando o ensaio de paralisia dependente da idade. PR50-GFP apresentou até 80% de paralisia por 5 dias de idade. No entanto, RNAi direcionado para o gene cul-6 significativamente retardou a paralisia, sugerindo que o cul-6 é necessário para a toxicidade PR50-GFP(Figura 1C). Este efeito foi específico para cul-6(RNAi) porque o cul-1(RNAi) não alterou a toxicidade PR50-GFP.

Proteínas neurodegenerativas, como peptídeos ran tóxicos, são comumente modeladas na parede corporal de C. elegans4,20,21,22. No entanto, também é importante determinar se as proteínas RAN causam neuropatologia quando expressas em neurônios C. elegans, porque a toxicidade específica dos neurônios é uma característica comum de muitas doenças neurodegenerativas. Examinamos a toxicidade específica do neurônio usando o ensaio de comissura. No dia 2, a expressão pr50-GFP nos neurônios motores levou a um aumento significativo no blebbing de neurônios motores. Esta neuropatologia foi significativamente suprimida por uma mutação no gene receptor insulina/IGF homolog daf-2 que retarda as propriedades tóxicas de várias proteínas neurodegenerativas23 (Figura 2B).

Figure 1
Figura 1: Ensaios para avaliar a toxicidade dos peptídeos RAN expressos por músculos. (A)Ensaio de crescimento de peptídeos RAN. Os mutantes indicados foram cruzados para o fundo genético drIs34 (mio-3p::PR50-GFP) sob as condições de gfp (RNAi). Números acima de cada genótipo indicam o número de descendentes pontuados para o crescimento. Todos os genótipos têm p < 0,05 usando o teste exato do Fisher em comparação com o tipo selvagem. (B) Análise de velocidade de vídeo para medir a toxicidade do peptídeo RAN durante o desenvolvimento. os animais drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) foram cultivados sob as condições gfp(RNAi), vetor vazio (RNAi)ou rpn-7 (RNAi) e, em seguida, pontuados para motilidade conforme descrito. A velocidade foi normalizada para os animais tratados com gfp (RNAi). Os dados apresentados são médios ± DP, n = 40 para cada genótipo. **-p < 0.01, ***- p < 0.001, ANOVA unidirecional com Tukey pós-teste. (C) Ensaio de paralisia para medir a toxicidade do início da idade. os animais drIs34 (myo-3p::PR50-GFP) foram cultivados em vetores vazios (RNAi) ('WT'), cul-1(RNAi)ou cul-6(RNAi) e a paralisia foi pontuada como descrito a cada 24 h. ***-p < 0,001, teste de log-rank com Correção pós-teste de Bonferroni vs. WT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Ensaio para medição da neuropatologia do neurônio motor expresso peptídeos RAN. (A) Imagens de c. elegans adultos expressando o repórter de neurônio motor unc-47p::GFP em tipo selvagem ou unc-47p::PR50-GFP expressando animais. As imagens para o tipo selvagem ilustram a morfologia normal da comissura. As imagens representam pilhas achatadas da série Z obtidas pela microscopia de fluorescência de campo largo. Os animais PR50 demonstram exemplos de quebra de comissura e blebbing. (B) Efeito de daf-2(e1370) em PR50 comissure blebbing. Os pontos representam a porcentagem de comissações de um único animal, com a média e sd mostrados. n = 20 animais por genótipo **-p < 0,01, ANOVA unidirecional com o teste pós-hoc de Dunn. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui relatamos métodos que podem ser usados para ensaio da toxicidade do peptídeo RAN modelado no músculo ou nos neurônios de C. elegans. Embora as proteínas neurodegenerativas tenham um fenótipo de início de idade em pacientes humanos, elas também podem exibir toxicidade de desenvolvimento quando superexpressas em sistemas modelo. A superexpressão tem limitações interpretativos significativas, mas também fornece um ponto de partida poderoso para telas genéticas ou farmacológicas destinadas a identificar genes ou drogas que podem reverter fenótipos tóxicos. Isto é especialmente importante, dado que os modelos animais mais precisos da doença não possuem fenótipo ou fenótipos fracos não adequados para a triagem imparcial se aproxima24,,25,26. Nossos modelos e ensaios de peptídeos ran C. elegans representam uma abordagem poderosa e complementar a outros sistemas de modelos de peptídeos RAN, como levedura e Drosophila,para entender as vias celulares importantes para a toxicidade dessas proteínas recém-descritas.

Toxicidade condicional de peptídeos RAN expressos por músculos
A medição da toxicidade do peptídeo RAN requer um período de perseguição para a eliminação dos efeitos do gfp(RNAi). No entanto, o tempo entre a remoção do gfp(RNAi) e o surgimento de fenótipos pode ser inconsistente se o cuidado não for tomado para cronometrar precisamente o início de experimentos, seleção de animais encenados, mudanças de temperatura, etc. À medida que nos tornamos mais experientes com esses ensaios, o tempo e a penetração dos fenótipos de peptídeos RAN tornaram-se relativamente consistentes. Um dos passos mais críticos nesses ensaios é a mudança adequada dos animais para 25 °C. Sem essa mudança, os peptídeos RAN exibem toxicidade significativamente mais fraca. No entanto, os animais não podem ser continuamente cultivados a 25 °C porque não crescem e se reproduzem, presumivelmente devido à maior expressão de linha de base do peptídeo RAN. Isto não é diferente da situação na levedura ou drosophila onde cepas expressando peptídeos ran tóxicos são mantidos em condições permissivas (ou seja, baixa temperatura), mas depois deslocados agudamente para condições restritivas (ou seja, temperatura mais alta) antes do ensaio13,15 para melhorar a expressão do peptídeo. Nesses sistemas de expressão condicional, condições genéticas que melhoram ou suprimem a toxicidade podem resultar de mudanças nos níveis de expressão de peptídeos. Para determinar se modificadores genéticos da toxicidade do peptídeo RAN agem através de alterações nos níveis de expressão transgênica, tomamos duas abordagens. Primeiro, muitas de nossas cepas transgênicas expressam um segundo repórter rfp sob o controle do mesmo promotor usado para conduzir a expressão do peptídeo RAN. Mudanças na atividade do promotor que causam redução ou aumento da expressão do peptídeo RAN causam reduções ou aumentos semelhantes nos níveis de RFP. Consideramos mutantes ou condições RNAi que alteram significativamente os níveis de RFP para agir de forma não específica. Em segundo lugar, realizamos pcr quantitativo e manchas ocidentais para determinar se os níveis de peptídeo RAN mRNA ou proteína são alterados entre as condições. No entanto, a detecção de peptídeos RAN baseados no ocidente pode às vezes ser difícil ou impossível, como nós e outros observamos com o peptídeo RAN PR50-GFP derivado de C9orf72. Nesses casos, quantificamos os níveis de GFP vivo para determinar se a expressão proteica é alterada entre as condições que estão sendo comparadas.

Toxicidade do desenvolvimento: Vantagens e limitações
A superexpressão forçada de peptídeos ran tóxicos nos músculos muitas vezes leva à prisão de desenvolvimento em C. elegans. Embora isso claramente não imite a patologia da doença humana, fornece um ponto de partida poderoso para as telas supressoras genéticas, pois os supressores de toxicidade RAN são facilmente identificados como animais que crescem e se reproduzem na ausência de gfp(RNAi). Alguns supressores facilitarão o crescimento devido à redução da expressão transgênica. Para diferenciar essas possibilidades, geralmente incluímos um segundo repórter rfp impulsionado pelo mesmo promotor em nossa cepa transgênica de peptídeos RAN. Os supressores que reduzem ou silenciam a expressão transgênica também exibirão níveis reduzidos de expressão rfp. Por outro lado, supressores que exibem níveis normais ou elevados de RFP dificilmente funcionarão através da redução da expressão transgênica. Assim como o uso de levedura susceptino de crescimento de leveduras ou morfologia ocular drosophila 13,15,27, essas abordagens, embora não modelando precisamente aspectos da doença em humanos, fornecem uma poderosa ferramenta de triagem para a identificação inicial de modificadores de peptídeos RAN.

Toxicidade pós-desenvolvimento (ensaio de paralisia): Vantagens e limitações
A vantagem do ensaio de paralisia é que um número relativo de animais (50-100) pode ser medido com ferramentas presentes em qualquer laboratório de vermes. A paralisia também é um fenótipo grave que é facilmente detectado. A principal limitação deste ensaio é que é insensível a defeitos de movimento que não causam paralisia completa. Tais defeitos podem exigir abordagens mais sensíveis e quantitativas para medir, como28os ensaios de espancamento ou ensaios de movimento cinemático28 . Os ensaios de paralisia devem ser realizados cegos ao genótipo, se possível, e devem ser tomados cuidados para garantir que os vermes não estejam sofrendo nenhum outro tipo de estresse (por exemplo, contaminação, fome), que possa impactar significativamente os resultados do ensaio. C. elegans expressando peptídeos ran tóxicos às vezes não exibem um fenótipo de paralisia robusta. Isso é provavelmente devido aos efeitos persistentes do gfp(RNAi) continuando a suprimir a expressão do peptídeo RAN. Nestes casos, se não observarmos paralisia significativa (>10%) no vetor vazio (RNAi) controlar animais após o dia 2, normalmente terminamos o ensaio e iniciamos outra réplica. Uma modificação deste ensaio poderia envolver o uso de sistemas alternativos de expressão de peptídeos RAN indutíveis. O único outro sistema de expressão induível comumente usado para C. elegans é o promotor do choque térmico. No entanto, o choque térmico necessário pode causar respostas ao estresse que podem afetar a toxicidade das proteínas. A aplicação futura de outros sistemas de expressão condicional, como o sistema de degron auxin-induível (AID)29,poderia aumentar significativamente nossa capacidade de estudar a toxicidade do peptídeo RAN.

Ensaio neurodegeneração/comissure: Vantagens e limitações
As comissuras do neurônio motor em C. elegans representam o axôon de um neurônio motor que passa entre os fios ventral e dorsal nervoso. Blebbing e quebra podem ser facilmente detectados nas comissuras isoladas, permitindo que a neurodegeneração seja rapidamente quantificada em animais vivos (Figura 2). Ao examinar os animais, é importante que eles não incubam em levamisole por um longo período de tempo, pois isso pode causar morte prematura de animais, o que leva a blebbing neuronal e quebra na ausência de qualquer peptídeo RAN tóxico. Em alguns casos, as comissações são completamente degeneradas e não são mais visíveis. Portanto, eles não podem ser pontuados para características neuropatológicas porque nosso ensaio mede os percentuais de comissuras quebradas ou blebbing fora do número total de comissações observadas. Nestes casos, o ensaio de comissura pode subestimar o efeito do peptídeo RAN.

Em conclusão, os ensaios descritos neste artigo são úteis para medir a toxicidade causada pelos peptídeos RAN em C. elegans. O uso de gfp(RNAi) para regular a expressão das proteínas permite que fenótipos pós-desenvolvimento sejam observados. Nossas abordagens podem ser facilmente adaptadas para realizar telas genéticas em larga escala para supressores ou intensificadores de toxicidade. Ensaios secundários, como o ensaio de paralisia e o ensaio de comissura podem confirmar que a toxicidade é suprimida após o desenvolvimento e testar se o mecanismo de supressão é conservado nos neurônios.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

NIH R21NS107797

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile CELLTREAT Scientific Products 50-202-036 Nematode growth plates and RNAi
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM BD DIAGNOSTIC SYSTEMS DF0145070 Nematode growth plates and RNAi
AGAROSE ULTRAPURE LIFE TECHNOLOGIES 16500500 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
CARBENICILLIN 5G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP26485 Nematode growth plates and RNAi
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK THERMO SCI ERIE 12542B Imaging for commissure assay
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242952008 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK THERMO SCI ERIE 125485C Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides THERMO SCI ERIE 12-550-15 Imaging for commissure assay
Gibco Bacto Peptone  Gibco  DF0118-17-0 Nematode growth plates and RNAi
HALOCARBON OIL 700 SIGMA-ALDRICH INC H8898-50ML Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
IPTG BIOTECH 10G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP162010 Nematode growth plates and RNAi
Leica Advanced Fluorescence imaging software Leica Microsystems LAS-AF Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay
Leica Immersion type N (Oil) W NUHSBAUM INC NC9547002 Imaging for commissure assay
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR THERMO SCI ACROS ORGANICS AC187870100 Imaging for commissure assay
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242956003 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains

PETRI DISH, 60X15MM,500/CS		 CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC FB0875713A Nematode growth plates and RNAi
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS CORNING LIFE SCIENCES DL 87721 Nematode growth plates and RNAi

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Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans. J. Vis. Exp. (158), e61024, doi:10.3791/61024 (2020).

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