Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Измерение токсичности пептида РАН в C. elegans

Published: April 30, 2020 doi: 10.3791/61024
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Повторные не-ATG-зависимые трансляционные продукты являются патогенными особенностями нескольких повторных заболеваний, основанных на расширении. Цель описанного протокола заключается в оценке токсичности, вызванной этими пептидами с помощью поведенческих и клеточных анализов в модельной системе C. elegans.

Abstract

C. elegans обычно используется для моделирования возрастных нейродегенеративных заболеваний, вызванных повторными мутациями расширения, такими как амиотрофический боковой склероз (ALS) и болезнь Гентингтона. Недавно было показано, что повторное расширение, содержащее РНК, является субстратом для нового типа белкового перевода, называемого повторным независимым (РАН). В отличие от канонического перевода, перевод РАН не требует начала кодона и происходит только тогда, когда повторы превышают пороговую длину. Поскольку нет стартового кодона для определения кадра чтения, перевод RAN происходит во всех кадрах чтения как из смысла, так и из шаблонов РНК- антисмыслов, которые содержат последовательность повторения расширения. Таким образом, перевод РАН увеличивает количество возможных связанных с болезнью токсичных пептидов с одного до шести. До сих пор перевод РАН был задокументирован в восьми различных нейродегенеративных и нервно-мышечных заболеваниях, основанных на повторном расширении. В каждом случае расшифровка продуктов РАН, которые являются токсичными, а также их механизмы токсичности, является важным шагом на пути к пониманию того, как эти пептиды способствуют патологиологии болезни. В этой работе мы представляем стратегии для измерения токсичности пептидов RAN в модельной системе C. elegans. Во-первых, мы описываем процедуры измерения токсичности пептида РАН на рост и подвижность развивающихся C. elegans. Во-вторых, мы подробно ассси для измерения постразвития, возрастно-зависимых эффектов пептидов РАН на подвижность. Наконец, мы описываем нейротоксичность асссы для оценки влияния пептидов РАН на морфологию нейронов. Эти анализы обеспечивают широкую оценку токсичности пептида RAN и могут быть полезны для выполнения крупномасштабных генетических или малых молекул экранов для выявления механизмов заболевания или терапии.

Introduction

Неуместное расширение последовательностей повторения ДНК является генетической основой для нескольких нейродегенеративных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), фронтотемпоральная деменция (FTD) и болезнь Гентингтона (HD)1. Хотя существуют клеточные и животные модели для этих заболеваний, механизмы, лежащие в основе этих условий, не четко определены. Например, HD вызвано расширением последовательности повтора CAG в последовательности кодирования для белка Хантингтин Htt2. Потому что CAG кодирует аминокислоты глутамин, CAG повторить расширение приводит к вставке полиглютамина, или поли, последовательность в Htt. Расширенный поли" белки образуют длину и возраст-зависимых белковых агрегатов, которые связаны с токсичностью3,4. Удивительно, но два последних исследования показывают, что длина последовательности поли" не является основным фактором начала заболевания БГ, предполагая, что поли- независимые факторы могут также способствовать болезни5,6.

Один из возможных поли- независимый механизм включает в себя недавно обнаруженный тип белка перевод называется Repeat Associated Nна-AUG-зависимых (RAN) перевод7. Как следует из названия, перевод РАН происходит только тогда, когда присутствует расширенная повторная последовательность и не требует канонического старта кодона. Таким образом, перевод РАН происходит во всех трех кадрах чтения повтора для получения трех различных полипептидов. Кроме того, поскольку многие гены также производят антисмысловую транскрипт, содержащую обратный дополнение расширенной последовательности повтора, перевод RAN также происходит во всех трех кадрах чтения антисмыслового транскрипта. В совокупности перевод РАН расширяет количество белков, вырабатываемых из расширенной повторяющихся последовательностей ДНК, от одного пептида до шести пептидов. На сегодняшний день перевод РАН наблюдается по крайней мере в восьми различных нарушениях повторного расширения8. Пептиды РАН наблюдаются в посмертных образцах пациентов и только в тех случаях, когда пациент несет расширенное повтор9,,10. Хотя эти пептиды явно присутствуют в клетках пациента, их вклад в патофизиологию болезни неясен.

Чтобы лучше определить потенциальную токсичность, связанную с пептидами RAN, несколько групп выразили каждый пептид в различных модельных системах, таких как дрожжи, мухи, мыши и клетки культуры тканей11,,12,,13,,1515,16., Вместо того, чтобы использовать повторную последовательность для выражения, эти модели используют подход кодон-вариации, в котором повторяющаяся последовательность устраняется, но аминокислотная последовательность сохраняется. Инициация перевода происходит через канонический АТГ и пептид, как правило, сливается с флуоресцентным белком либо n- или C-терминус, ни один из которых, как представляется, вмешиваться в RAN пептид токсичности. Поэтому каждая конструкция переэкспрессирует один пептид РАН. Моделирование различных продуктов РАН в многоклеточном организме с простыми анализами для измерения токсичности пептида РАН жизненно важно понять, как различные продукты РАН от каждого вызывающего заболевание повторного расширения способствуют клеточной дисфункции и нейродегенерации.

Как и другие модельные системы, C. elegans обеспечивает гибкую и эффективную экспериментальную платформу, которая позволяет проводить исследования новых механизмов заболевания, таких как токсичность пептида РАН. Черви предлагают несколько уникальных экспериментальных атрибутов, которые в настоящее время не доступны в других моделях пептидной токсичности RAN. Во-первых, C. elegans оптически прозрачны от рождения до смерти. Это позволяет просто визуализировать экспрессию и локализацию пептида РАН, а также анализ нейродегенерации у живых животных. Во-вторых, трансгенные методы генерации моделей экспрессии пептида РАН являются недорогими и быстрыми. Учитывая короткий трехдневный жизненный цикл C. elegans, стабильные трансгенные линии, выражающие любой пептид РАН в клеточном типе специфическим образом, могут быть произведены менее чем за неделю. В-третьих, простые фенотипические выходы могут сочетаться с методами генетического скрининга, такими как химический мутагенез или скрининг РНК, чтобы быстро определить гены, необходимые для токсичности пептида РАН. Наконец, короткая продолжительность жизни C. elegans (20 дней) позволяет следователям определить, как старение, которое является наибольшим фактором риска для большинства повторных заболеваний расширения, влияет на токсичность пептида РАН. В совокупности это сочетание экспериментальных атрибутов не имеет себе равных ни в одной другой модельной системе и предлагает мощную платформу для изучения токсичности пептида РАН.

Здесь мы описываем несколько анализов, которые используют экспериментальные преимущества C. elegans для измерения токсичности пептидов РАН и для выявления генетических модификаторов этой токсичности. Кодон-разнообразные ПЕПтиды ПО РАН помечены GFP и выражается индивидуально в любом мышечных клетках под промоутером мио-3 или в ГАМК-моторных нейронов под unc-47 промоутер. Для экспрессии в мышечных клетках, важно, чтобы токсичные пептиды RAN помечены зеленым флуоресцентным белком (GFP), или другим флуоресцентным белком (FP) тегом, который может быть направлен с вектором кормления РНК. Это потому, что токсичные экспрессии пептида RAN обычно блокирует рост, что делает такие штаммы нежизнеспособными. Использование gfp (RNAi) условно инактивирует экспрессию пептида RAN и позволяет проводить поддерживающие деформации, генетические кресты и т.д. Для анализов, эти животные удаляются из gfp (RNAi), что позволяет выражение пептида РАН и в результате фенотипов. В дополнение к молекулярной стратегии для проектирования кодон-разнообразных конструкций экспрессии RAN пептида, мы описываем анализы для измерения токсичности развития (личиальная подвижность и анализ роста), пост-развития возрастной токсичности (парализующий анализ), и нейронных морфологических дефектов (анализ commissure).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Создание кодон-разнообразных конструкций экспрессии пептида РАН

  1. Дизайн индивидуальной последовательности пептидного кодирования RAN с использованием синонимных кодонов для устранения фундаментальной повторяющейся структуры ДНК/РНК, но сохранить надлежащую аминокислотную последовательность.
  2. Закажите пользовательские последовательности кодона на коммерческой степени на длинах повтора, необходимых для исследований (обычно 5-100 повторов). Включите сайт ограничения HindIII в конце 5' и сайт ограничения BamHI в конце 3', чтобы облегчить клонирование в вектор выражения C. elegans, таких как pPD95.79.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если синтез больших конструкций оказывается трудным, меньшие последовательности строительного блока могут быть синтезированы, а затем встроены в большие повторы с помощью стратегии направленной перевязки17.
  3. Подклон пептидной последовательности в C. elegans экспрессии вектор с использованием стандартных методов перевязки T4.
  4. Подклон клеточного типа конкретных промоутер последовательность, генерируемая ПЦР перед последовательность пептида RAN для привода ткани конкретных RAN пептид-GFP выражение.
  5. Микроинъекция струи1и RAN в гонад дикого типа C. elegans для генерации трансгенных штаммов, содержащих экстрахромосомные массивы с использованием стандартных методов18. Для совместного инъекционного маркера, мышцы конкретных RFP репортер(мио-3p::RFP (pCFJ104)) был использован, хотя другие маркеры могут быть использованы также.
  6. Интеграция стабильного трансгена в геном с помощью стандартных методов интеграционного скрининга C. elegans 19.
  7. Если пептид РАН токсичен, а трансгенные животные не выживают, кормите животных gfp (RNAi), выражая бактерии до и после инъекции, чтобы заставить замолчать выражение токсичного белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление животных из gfp (RNAi) позволяет экспрессии пептида РАН для фенотипических анализов с использованием анализов, описанных ниже.

2. Измерение токсичности развития пептидов RAN после нокдауна гена на основе РНК: Протокол анализа скорости видео

  1. Налейте стандартный нематод роста среды (NGM) РНК 24 хорошо пластины с 1 мМ изопропил -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) и 25 мкг /мЛ карбенициллин.
  2. Полоса из РНК кормления клонов в HT115 бактерий, которые будут протестированы на бульон Лурия (LB) и карбенициллин (25 мкг/мл) агар пластин и выращивать бактерии при 37 кС для 24 ч. Включите пустой вектор (RNAi) в качестве положительного контроля за токсичность и gfp (RNAi) в качестве отрицательного контроля.
  3. Для каждого клона, выбрать одну колонию в 1 мл LB и карбенициллин жидких носителей и выращивать бактерии на ночь в течение 18 часов при 37 градусов по Цельсию при встряхивании при 250 вращений в минуту (RPM).
  4. Обнаружите четыре отдельные скважины NGM RNAI 24 скважин с 20 qL следующих ночных бактериальных культур: колонка 1 скважины и gfp (RNAi); колонка 2 скважины (EV)RNAi; столбцы 3-6 скважин и РНК против генов, которые должны быть протестированы. Разрешить РНК бактерий, чтобы вызвать dsRNA производства на ночь при комнатной температуре (RT).
  5. Изолировать яйца с первого дня взрослых C. elegans, выражающих интегрированный трансген пептида RAN, используя стандартный метод гипохлорит и семена 30 C. elegans яйца в каждый колодец NGM RNAi 24 хорошо пластины.
  6. Инкубировать 24 скважины при 20 градусах по Цельсию в течение 7 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это время инкубации для штаммов, выражающих токсичные диспептиды C9orf72 RAN, такие как PR50 или GR50. Другие штаммы могут потребовать более короткого времени инкубации, чтобы предотвратить истощение бактериального источника пищи и последующего голодания.
  7. Приобретайте передаваемые световые видео с помощью стереораспарирующего микроскопа Leica M-16FA, оснащенного монохромной камерой DFC345FX, подключенной к совместимому с Windows КОМПЬЮТЕРом под управлением программного обеспечения для приобретения видео Leica AF (версия 2.6.0.7266).
    1. Приобретите два видео из двух отдельных скважин для каждого состояния РНК, используя согласованные настройки приобретения видео между скважинами. Для каждого видео, приобрести 10 секунд при разрешении 800 х 600 пикселей и 13,16 кадров в секунду (время вокселя размер0,0,076 секунды) с помощью 18,6X увеличение (1,49 зум настройки в программном обеспечении AF). Установите время экспозиции изображения до 4 миллисекунд. Этикетка каждое видео сразу с штаммом, состояние РНК, и хорошо номер.
  8. Ослепите экспериментатора на генотип, связанный с каждым видео файлом, рандомизировав порядок видео и изменив название видео на числа. Сохранить эту группу видео в качестве нового файла. Отпустите экспериментатора после завершения анализа.
  9. Измерьте «пройденное расстояние» и длину каждого животного для 20 различных животных из каждого видео, изучая в общей сложности 40 червей для каждого состояния РНК.
    1. В программном обеспечении выберите кнопку аннотации инструментов, а затем нарисовать текстовый инструмент. Нажмите на точку в центре червя измеряется в первом кадре видео и пометить его как число. Предварительное видео до конца, визуально отслеживая траекторию движения червя. В последнем кадре нажмите на точку в центре измеряемого червя и пометьте следующее соответствующее число. Затем, используя инструмент шкалы рисования, нарисуйте линию от первого номера до второго числа, чтобы записать "пройденное расстояние".
    2. «Расстояние пройдено» — это расстояние между двумя центроидными точками. Это расстояние отображается рядом с линией измерения. Запись этого измерения в электронной таблице. Повторите это измерение для 19 других червей в видео, сохраняя при этом каждое отдельное измерение в окне анализа.
  10. Сделайте измерения от животных, демонстрирующих наиболее надежное движение, чтобы избежать отбора животных, не проявляющих движения и смещения данных к параличу. После завершения измерений сфотографировать окончательный видеокадр, иллюстрирующие все линии измерения, чтобы данные можно было проследить до животного, из которого они возникли.
  11. Проанализируйте данные с помощью электронной таблицы из четырех столбцов. Колонка 1 червь "идентификатор", колонка 2 расстояние пройденное / время (скорость).
    1. Время каждого видео можно найти, нажав на видео под экспериментом и перейдя к свойствам видео.
  12. Нормализуйте измерение скорости, найдя длину каждого животного, выбрав количественную, а затем статистику по программному обеспечению. Нажатие на значок аннотации инструмента на дисплее видео должно позволить использовать инструмент "Draw Polyline". Этот инструмент может быть использован для свободного отслеживания C. elegans от видео от кончика головы до кончика хвоста. Длина линии будет записана в статистике.
    1. Сфотографать окончательный видеокадр, иллюстрирующий все полилиновые, используемые для размеров C. elegans, чтобы данные могли быть прослежены до животного, из которого они возникли.
  13. Проанализируйте данные, добавив два дополнительных столбца в электронную таблицу. Колонка 3 — «Длина животных», а четвертой — «Нормализация скорости» (скорость/длина животных). Проанализируйте нормализованные данные о скорости с помощью односторонней ANOVA с пост-специального тестирования по сравнению с пустым вектором (RNAi).

3. Измерение токсичности развития пептида РАН: Оценка роста

  1. Выберите 30 gravid животных в 50 л пятно гипохлоритного раствора (10 мл отбеливателя, 2,5 мл 10 N NaOH, 37,5 мл dH2O) либо на gfp (РНК), (EV)RNAi, или (ген-специфический) 6 см РНК пластины.
  2. После 24 ч переместите шесть трансгенных потомков, которые выползли из гипохлоритного пятна раствора, в новую 6-сантиметровую пластину РНК, идентичную условиям РНК на пластине, на которой они подвергались лечению гипохлоритного раствора. Положите эти потомства (F1) на 20 градусов по Цельсию, чтобы расти и размножаться.
  3. После 24-48 ч, выбрать 10 трансгенных l4 животных на 6 см РНК соответствия РНК условия, что животные растут на. Разрешить животным пульс отложить яйца в течение 24 ч в инкубаторе 20 градусов по Цельсию.
  4. После 24 ч, удалить взрослых животных и отказаться от них. Подсчитайте количество яиц и личинок L1, отложенных в течение 24 ч период с помощью механического портативного счетчика. Это общий размер выводка.
  5. В течение следующих 72 ч, подсчитайте количество животных, которые достигают L4 или старше стадии. По мере того как каждое животное подсчитано, извлеките его от плиты.
  6. Количественно "Процентный рост" как процент животных, которые достигают L4 или старше стадии из общего размера выводка.
  7. Выполните точный тест 2 x 2 Fisher по сравнению с пустым вектором (RNAi), чтобы определить, является ли процентный рост статистически значимым. Категории для сравнения: "Рост" (" животных, достигших L4 или старшей стадии в 72 ч) и "Нет роста" (общий размер выводка минус количество животных, достигающих L4 или старше стадии в 72 ч).

4. Пост-развития РАН пептидный паралич асссее

  1. Поддерживайте интегрированные Трансгенные штаммы C. elegans, выражающие пептид-GFP РАН в мышцах на gfp(RNAi), поместив 4-6 трансгенных L4 на пластину 6 см gfp(RNAi) и выращивайте червей при 20 градусах Цельсия.
  2. Если эксперимент использует РНК для проверки генетического воздействия на токсичность пептида РАН, переместить 10 трансгенных gravid взрослых из неголоданой пластины к каждому из двух 6 см пустой вектор(RNAi) (положительный контроль за параличом, отрицательный контроль за генетические эффекты), gfp (RNAi) (отрицательный контроль за параличом, положительный контроль генетических эффектов), ген-специфический(РНК) (т.е., 10 gravid взрослых на 6 пластин).
  3. Если мутанты используются для анализа генетического воздействия на токсичность пептида РАН, поместите 10 гравидов WT или мутантов животных, выражающих тот же трансген РАН на каждом из двух 6 см пустых векторов(РНК) или gfp (RNAi) пластин. Выращивайте червей при 20 градусах по Цельсию в течение 48 ч.
  4. Выберите 10 наборов из 10 трансгенных L4 из 6-сантиметровых пластин РНК и поместите каждый набор на 3 см пластины РНК (т.е. n и 100 животных для каждого генотипа). Убедитесь, что Выбранный для асссея L4 имеет поверхностно нормальную подвижность. Поместите пластины в мешок для хранения молнии, чтобы сохранить влагу.
  5. Поместите мешки пластин с L4 в инкубаторе 25 градусов по Цельсию.
  6. Удалите животных 24 ч позже из инкубатора 25 градусов по Цельсию один штамм в то время, чтобы свести к минимуму количество времени, которое они находятся на RT.
  7. Нажмите пластины на рассекающий микроскоп, чтобы проверить движение. Если животные двигаются больше, чем длина тела, посчитайте животное мобильным и перенесите его на новую 3-сантиметровую пластину РНК. Используйте платиновый выбор, чтобы коснуться оставшихся червей на голове или хвосте. Если животное движется больше, чем длина тела, посчитайте животное как мобильное и перенесите его на новую 3-сантиметровую пластину РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышать 10 червей на тарелку при передаче. Будьте осторожны, чтобы избежать перемещения потомства к новой пластине РНК, потому что результат ы зависит только от следующих возрастных животных.
  8. Группируйте всех неподвижных червей вместе, так что движение больше, чем длина тела может быть легко обнаружено. Дайте животному хотя бы одну минуту, чтобы переместить более одной длины тела. Если он все еще не двигается, он парализован, мешках (т.е. личинки вылупились внутри матери), или мертв.
  9. Цензор животных, которые демонстрируют мешки, desiccate по бокам пластины, экспонат экструдированных кишечника, норы, заблудиться, или умереть от испытания во время обнаружения. Парализованные черви подсчитываются, оставляют на старой пластине РНК и выбрасывают.
  10. Оценка животных для паралича каждый день в течение 5-7 дней, как описано в шагах 4,6-4,9.
  11. Проанализируйте данные о параличе с помощью теста, идентичного тесту, используемому для анализа продолжительности жизни. В этом статистическом анализе, движущихся червей забил как "живой", парализованные черви забил как "Мертвые", и мертвые, мешки, кишечник экструдируется, высохли, зарытые, или иным образом потеряли червей забил как "цензура".
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе, "Процент жив" число указывает на "Процент Перемещение" животных. Обратное представляет собой "Процент парализованных". Используйте инструмент онлайн-анализа OASIS(https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/)для выполнения статистического анализа ранга журнала.

5. Измерение патологии нейронов: Оценка ассоциатизм

  1. Генерировать трансгенные C. elegans, выражающие пептид RAN интереса к ГАМК нейронов с помощью unc-47 промоутер. Также выразить unc-47p::GFP или unc-47p::RFP выявить клеточной морфологии нейронов ГАМК.
  2. Выберите 50 трансгенных l4 животных и поместите их на 6 см OP50 пластины на 25 градусов по Цельсию в течение 24 ч.
  3. Перенесите 50 трансгенных животных на новую 6-сантиметровую пластину OP50 при 25 градусах по Цельсию в течение 24 ч.
  4. Сделать агарозные прокладки для визуализации животных под широкоугольной микроскопией.
    1. Поместите два куска ленты поверх двух слайдов микроскопа. Поместите очищенный слайд без ленты в середине двух лентой слайдов.
    2. Распределить 100 юл (1 капля из одноразовой пластиковой пипетки Pasteur) 3% расплавленной агарозы на средний слайд с одноразовой стерильной передачи пипетки.
    3. Немедленно поместите второй чистый слайд через каплю расплавленной агарозы так, что он опирается на лентой слайды и создает тонкий и ровный слой агарозы между слайдами.
    4. После того, как агарозо остынет и затвердеет, аккуратно удалите два слайда слоем агарозы между ними, не разделяя их, и поместите их в полиэтиленовый пакет с влажным листом бумаги под ними. Сделайте один слайд на 10 червей, которые будут рассмотрены вместе с тремя дополнительными слайдами.
  5. Удалите трансгенные C. elegans из инкубатора 25 градусов по Цельсию и выберите 10 трансгенных C. elegans в 100 лл капли 10 мМ левамизола в стеклянной депрессии слайд. Инкубировать в течение 10 минут или до тех пор, пока животные не будут парализованы.
  6. Удалите пару слайдов из полиэтиленового пакета и тщательно разделите их. Пометьте слайд агарозой с генотипом и добавьте 2 зл и 10 мМ левамизола к середине агарозы. Переместите 10 животных в левамизол на агарозной площадке. Обложка животных с #1 толщиной coverslip.
  7. Изображение животных, в которых вульвы ориентированы так, что он находится на правой стороне животного. Если вульва находится на левой стороне головы, commissures моторных нейронов будет под животных, а не так четко видны, что делает точную количественную оценку трудно. Опустить количественную оценку этих животных. В этой ориентации, commissures моторных нейронов находятся ближе всего к coverslip и хорошо видны на перевернутой широкоугольной флуоресцентный микроскоп. Визуализируйте нейронные коммюники, выражающие GFP с перевернутым широкоугольным флуоресценционным микроскопом Leica DMI4000B с объективом погружения масла 63X 1.4X NA и набором фильтров Leica L5 GFP (Ex480/40nm; Em527/30nm). Если нейрон commissures выразить RFP вместо GFP, использовать leica TX2 RFP набор фильтров (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. Визуализируйте нейронные коммюники, выражающие GFP с перевернутым широкоугольным флуоресценционным микроскопом с объективом погружения масла 63x 1.4x NA и набором фильтров GFP (Ex480/40 nm; Em527/30 нм). Если нейрон commissures выразить RFP вместо GFP, использовать красный флуоресцентный белок (RFP) фильтр набор (Ex560/40 нм; Em 645/75 нм).
  8. Изображение червей в течение 45 минут размещения coverslip на червей, чтобы свести к минимуму токсичность от иммобилизации.
  9. Для каждого червя подсчитайте количество видимых спой. Есть 16 видимых commissures в диких животных типа. Также подсчитайте количество commissures которые имеют большие шарики (т.е., blebs) в commissures также, как число commissures которые сломлены. Чтобы подтвердить, что спужная нарушается, следуйте за смягчающим из спинного шнура к брюшному шнуру, регулируя фокусную плоскость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Commissures, в котором unc-47p::GFP флуоресценции экспонатов разрыв считаются сломанной. Сломанный commissure обычно имеет bleb по обе стороны от перерыва, помогая показать, что commissures нарушается. Подсчитайте количество blebbing и перерывы на 20 червей.
  10. Рассчитайте фракцию commissures с blebs или ломает над общим числом наблюдаемых commissures для каждого животного. Можно также измерить абсолютное количество соминостов на одно животное (включая дикий тип, выплеснутые и сломанные события).
  11. Для каждой категории вычислите среднее SD и статистически сравните либо с помощью Т-теста студента для сравнения между двумя популяциями, либо с помощью односторонней ANOVA для сравнения между 3 или более популяциями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы использовали анализы, описанные здесь, чтобы оценить влияние различных ингибиций генов на токсичность дипептиды РАН, которые находятся у больных ALS с расширением повторения G4C2. Используя анализ роста для измерения токсичности развития, мы проанализировали эффекты нескольких генетических мутаций нокаута, выявленных в геноме всей РНК-супрессоры мышечной выраженных PR50-GFP токсичности. В то время как выражение PR50-GFP только привело к полностью проникающий арест роста, потеря функции мутаций в нескольких генах подавлены PR развития токсичности от 12-94% (Рисунок 1A).

Мы также измерили влияние специфических генных нокдаунов на подвижность развития PR50-выражающих животных с помощью метода анализа скорости видео. Как и ожидалось, gfp (RNAi) привело к значительному увеличению подвижности по сравнению с пустым вектором (РНК) из-за ингибирования экспрессии PR50-GFP. Мы также обнаружили, что RNAi против протеасомы субъединицы rpn-7 привело к значительному увеличению подвижности PR50(рисунок 1B).

ALS, как и многие нейродегенеративные заболевания, происходит у взрослых. Поэтому мы проанализировали фенотипы взрослых с помощью возрастно-зависимого паралича. PR50-GFP выставлены до 80% паралича к 5 дней. Тем не менее, РНК направлена на ген cul-6 значительно задерживается паралич, предполагая, что куль-6 требуется для PR50-GFP токсичности(рисунок 1C). Этот эффект был специфичен для куль-6 (РНК), потому что cul-1 (RNAi) не изменил токсичности PR50-GFP.

Нейродегенеративные белки, такие как токсичные пептиды RAN, обычно моделируются в стенке тела C. elegans4,,20,,21,22. Однако, важно также определить, если RAN белки вызывают невропатологию, когда выражается в C. elegans нейронов, потому что нейрон-специфической токсичности является общей чертой многих нейродегенеративных заболеваний. Мы изучили нейрон-специфической токсичности с помощью суверенного асссе. В день 2 взрослых, PR50-GFP выражение в моторных нейронов привело к значительному увеличению двигательных нейронов blebbing. Эта невропатология была значительно подавлена мутацией в гене рецептора инсулина/IGF homolog daf-2, которая задерживает токсичные свойства нескольких нейродегенеративных белков23 (Рисунок 2B).

Figure 1
Рисунок 1: Анализы для оценки токсичности мышечных пептидов RAN. (A) РАН пептид роста асссе. Указанные мутанты были скрещены в drIs34 (мио-3p::PR50-GFP) генетический фон в условиях gfp (RNAi). Цифры над каждым генотипом указывают на количество потомства, забитого для роста. Все генотипы имеют p qlt; 0.05 используя точный тест Фишера по сравнению с диким типом. (B) Видео анализ скорости для измерения RAN пептид токсичности во время разработки. drIs34 (мио-3p::PR50-GFP) животные были выращены под gfp (RNAi), пустой вектор (RNAi), или rpn-7 (RNAi) условиях, а затем забил для подвижности, как описано. Скорость была нормализована до gfp (RNAi) обработанных животных. Показанные данные являются средними и SD, n и 40 для каждого генотипа. - п-т; 0,01,. л.с.; 0,001, в одну сторону ANOVA с Tukey после тестирования. (C) Паралич асссы для измерения возраста начала токсичности. drIs34 (мио-3p::PR50-GFP) животные выращивались на пустом векторе (RNAi) ('WT'), cul-1 (RNAi), или cul-6 (RNAi) и паралич был забит, как описано каждые 24 ч. В-п злт; 0,001, тест на лог-рейтинг с коррекцией Bonferroni после теста против WT. n и 100 животных на генотип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Ассаи для измерения невропатологии моторных нейронов выражены пептиды РАН. (A) Изображения взрослых C. elegans, выражающих unc-47p::GFP двигатель нейрон репортер анавий в диком типе или unc-47p::PR50-GFP, выражающих животных. Изображения для дикого типа иллюстрируют нормальную морфологию суверенного разума. Изображения представляют собой уплощенные стеки серии, полученные с помощью широкоугольной флуоресценции микроскопии. PR50 животных демонстрируют примеры commissure поломки и blebbing. (B) Влияние daf-2 (e1370) на PR50 commissure blebbing. Очки представляют собой процент blebbing commissures от одного животного, со средним и SD показано. n 20 животных на генотип (p)-p slt; 0.01, одностороннее ANOVA с пост-хок-тестом Данна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы сообщаем методы, которые могут быть использованы для ассеидного токсичности пептида RAN, смоделированных в мышцах или в нейронах C. elegans. В то время как нейродегенеративные белки имеют возрастной фенотип у пациентов с людьми, они также могут проявлять развитие токсичности, когда переэкспрессия в модельных системах. Переэкспрессия имеет значительные интерпретаторные ограничения, но она также обеспечивает мощную отправную точку для генетических или фармакологических экранов, направленных на выявление генов или препаратов, которые могут обратить вспять токсичных фенотипов. Это особенно важно, учитывая, что наиболее точные животные модели болезни либо не фенотип или слабые фенотипы не подходят для беспристрастного скрининга подходов24,25,26. Наши модели пептида C. elegans RAN представляют собой мощный, взаимодополняемый подход к другим системам пептидной модели RAN, таким как дрожжи и дрозофилы,для понимания клеточных путей, важных для токсичности этих недавно описанных белков.

Условной токсичности мышечно-выраженных пептидов РАН
Измерение токсичности пептида РАН требует периода погони для устранения эффектов gfp (RNAi). Однако время между удалением из gfp (RNAi) и появлением фенотипов может быть непоследовательным, если не принимать воспринято ею точное время начала экспериментов, отбора постановочных животных, температурных сдвигов и т.д. По мере того как мы стали более опытными с этими анализами, время и penetrance фенотипов пептида RAN были относительно последовательны. Одним из наиболее важных шагов в этих анализов является надлежащее смещение животных до 25 градусов по Цельсию. Без этого сдвига пептиды РАН обладают значительно более слабой токсичностью. Тем не менее, животные не могут быть постоянно выращиваются при 25 градусах Цельсия, потому что они не растут и размножаются, предположительно из-за более высокого базового выражения пептида РАН. Это не отличается от ситуации в дрожжах или дрософиле, где штаммы, выражающие токсичные пептиды РАН, хранятся в разрешительных условиях (т.е. низкой температуре), но затем остро смещаются в ограничительные условия (т.е. более высокую температуру) до асссея13,15 для повышения экспрессии пеппида. В таких условных системах выражения генетические условия, которые усиливают или подавляют токсичность, могут быть результатом изменений в уровнях экспрессии пептида. Чтобы определить, действуют ли генетические модификаторы токсичности пептида РАН через изменения в уровнях экспрессии трансгенов, мы берем два подхода. Во-первых, многие из наших трансгенных штаммов выражают второй репортер RFP под контролем того же промоутера, используемого для привода экспрессии пептида РАН. Изменения в активности промоутера, которые вызывают снижение или увеличение экспрессии пептида РАН, вызывают аналогичные сокращения или увеличение уровня RfP. Мы считаем, мутантов или РНК условия, которые значительно изменить уровни RFP действовать неспецифически. Во-вторых, мы выполняем количественные ПЦР и западного blotting, чтобы определить, если уровни RAN пептид мРНК или белка изменяются между условиями. Тем не менее, западное обнаружение пептидов РАН иногда может оказаться трудным или невозможным, как мы и другие наблюдали с C9orf72 полученных RAN пептид PR50-GFP. В таких случаях мы количественно уровень in vivo GFP определяет, изменяется ли экспрессия белка между сравниваемыми условиями.

Токсичность развития: Преимущества и ограничения
Принудительная переэкспрессия токсичных пептидов РАН в мышцах часто приводит к остановке развития у C. elegans. Хотя это явно не имитирует патологии болезни человека, он обеспечивает мощную отправную точку для генетических супрессоров экранов, потому что РАН токсичности супрессоров легко определить как животные, которые растут и размножаются в отсутствие gfp (RNAi). Некоторые супрессоры будут способствовать росту за счет сокращения трансгенного экспрессии. Чтобы провести различие между этими возможностями, мы обычно включаем второго репортера RFP, движимого тем же промоутером в нашем пептидном трансгенном штамме RAN. Супрессоры, которые уменьшают или замалчивают трансгенное выражение, также демонстрируют пониженные уровни выражения RFP. С другой стороны, супрессоры, которые демонстрируют нормальные или повышенные уровни RFP, вряд ли будут функционировать за счет уменьшения трансгенного экспрессии. Многое, как использование дрожжей роста или Drosophila глаз морфологии13,15,27, эти подходы, хотя и не точно моделирования аспектов болезни у людей, обеспечивают мощный инструмент скрининга для первоначальной идентификации RAN пептидных модификаторов.

Пост-развития токсичности (паралич асссее): Преимущества и ограничения
Преимущество паралича является то, что относительнобольшое большое количество животных (50-100) может быть измерено с помощью инструментов, присутствующих в любой лаборатории червя. Паралич также является тяжелым фенотипом, который легко обнаруживается. Основное ограничение этого ассеа заключается в том, что нечувствительны к дефектам движения, которые не вызывают полного паралича. Такие дефекты могут потребовать более чувствительных и количественных подходов к измерению, таких как обмолот асссы или кинематические анализы движения28. Паралич анализы должны быть выполнены слепых к генотипу, если это возможно, и следует принять меры, чтобы убедиться, что черви не подвергаются какой-либо другой тип стресса (например, загрязнение, голод), которые могут значительно повлиять на результаты опроса. C. elegans, выражающие токсичные пептиды РАН, иногда не проявляют надежного фенотипа паралича. Это, вероятно, из-за стойких эффектов gfp (RNAi) продолжает подавлять экспрессии пептида РАН. В этих случаях, если мы не наблюдаем значительного паралича (10%) в пустом векторе (RNAi) контролировать животных после дня 2, мы обычно прекращаем ассеид и инициировать другой репликации. Одна из модификаций этого анализа может включать в себя использование альтернативных индуцирующих систем экспрессии RAN пептид. Единственной другой широко используемой индуцируемой системой экспрессии для C. elegans является промоутер теплового шока. Тем не менее, необходимый тепловой шок может вызвать стресс ответы, которые могут повлиять на токсичность белков. Будущее применение других условных систем выражения, таких как auxin-индуцируемая система дегрена (AID)29, может значительно повысить нашу способность изучать токсичность пептида РАН.

Нейродегенерация/сомиссивай: Преимущества и ограничения
Моторные нейроны в C. elegans представляют собой аксон одного моторного нейрона, проходящего между брюшными и спинными нервными шнурами. Blebbing и поломки могут быть легко обнаружены в изолированных commissures, что позволяет нейродегенерации, чтобы быть быстро количественно в живых животных (Рисунок 2). При осмотре животных, важно, чтобы они не инкубировать в левамизоле в течение длительного периода времени, как это может привести к преждевременной смерти животных, что приводит к нейрональной блеяние и поломки при отсутствии каких-либо токсичных ran пептид. В некоторых случаях, commissures полностью выродились и больше не видны. Таким образом, они не могут быть забиты для нейропатологических особенностей, потому что наш ассс измеряет проценты commissures сломанной или blebbing из общего числа наблюдаемых commissures. В этих случаях, суверенная оценка может недооценивать эффект пептида РАН.

В заключение, анализы, описанные в настоящей работе полезны для измерения токсичности, вызванной пептидами RAN в C. elegans. Использование gfp (RNAi) для регулирования экспрессии белков позволяет наблюдать фенотипы после развития. Наши подходы могут быть легко адаптированы для выполнения крупномасштабных генетических экранов для супрессоров или усилителей токсичности. Вторичные анализы, такие как паралич анализ и сопили анализ может подтвердить, что токсичность подавляется после развития и проверить, если механизм подавления сохраняется в нейронах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

NIH R21NS107797

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile CELLTREAT Scientific Products 50-202-036 Nematode growth plates and RNAi
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM BD DIAGNOSTIC SYSTEMS DF0145070 Nematode growth plates and RNAi
AGAROSE ULTRAPURE LIFE TECHNOLOGIES 16500500 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
CARBENICILLIN 5G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP26485 Nematode growth plates and RNAi
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK THERMO SCI ERIE 12542B Imaging for commissure assay
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242952008 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK THERMO SCI ERIE 125485C Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides THERMO SCI ERIE 12-550-15 Imaging for commissure assay
Gibco Bacto Peptone  Gibco  DF0118-17-0 Nematode growth plates and RNAi
HALOCARBON OIL 700 SIGMA-ALDRICH INC H8898-50ML Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
IPTG BIOTECH 10G THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS BP162010 Nematode growth plates and RNAi
Leica Advanced Fluorescence imaging software Leica Microsystems LAS-AF Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay
Leica Immersion type N (Oil) W NUHSBAUM INC NC9547002 Imaging for commissure assay
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR THERMO SCI ACROS ORGANICS AC187870100 Imaging for commissure assay
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS E5242956003 Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains

PETRI DISH, 60X15MM,500/CS		 CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC FB0875713A Nematode growth plates and RNAi
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS CORNING LIFE SCIENCES DL 87721 Nematode growth plates and RNAi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
  2. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  3. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
  6. Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
  7. Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
  8. Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
  9. Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
  10. Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
  11. Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
  12. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877 (2016).
  13. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  14. Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
  15. Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
  16. Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).
  17. Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).
  18. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  19. Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
  20. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).
  21. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  22. Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
  23. Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).
  24. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  25. Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
  26. O'Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
  27. Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
  28. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  29. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).

Tags

Биология Выпуск 158 нейродегенерация БАС болезнь Гентингтона C9orf72 протеотоксичность повторные нарушения расширения
Измерение токсичности пептида РАН в <em>C. elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N.,… More

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans. J. Vis. Exp. (158), e61024, doi:10.3791/61024 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter