Summary
我们介绍了一种用于测量有机肿瘤组织切片中实时药物反应的协议。此处概述的实验策略为在临床或小鼠肿瘤的临床或小鼠肿瘤衍生的组织切片上进行中高通量药物屏幕的平台。
Abstract
肿瘤组织由癌细胞、渗透免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞和细胞外基质组成。这种复杂的环境构成肿瘤微环境（TME），可以调节对体内治疗或药物反应的反应。传统的癌症药物发现屏幕是在单层培养的细胞上进行的，这个系统严重缺乏TME的影响。因此，将敏感和高通量测定与生理TME相结合的实验系统将加强临床前药物发现过程。在这里，我们介绍活体肿瘤组织切片培养作为中高通量药物筛选的平台。组织组织切片培养构成精确切割的薄肿瘤部分，在液-空气界面中多孔膜的支持下进行维护。在此协议中，我们描述了从小鼠肿瘤和患者衍生异种移植 （PDX） 模型中制备的组织切片的制备和维护。为了评估组织活力的变化，以回应药物治疗，我们利用了基于生物相容性发光的生存能力测定，能够实时、快速和灵敏地测量组织中的活细胞。利用这个平台，我们评估了组织切片对多激酶抑制剂、松孢菌素和细胞毒性剂多索鲁比辛的剂量依赖反应。此外，我们通过将17种临床和临床前药物筛选出从单个PDX肿瘤制备的组织切片上，证明了组织切片在体内药理学中的应用。我们的生理相关、高度敏感、健壮的外体筛查平台将大大加强临床前肿瘤药物的发现和治疗决策。
Introduction
癌细胞与周围基质组织的物理和生化特性相互作用形成TME。TME可以刺激肿瘤生长，转移，并调节肿瘤反应的治疗1。在传统的临床前药物开发中，药物候选药物通常首先使用培养的癌细胞系进行筛选，这是一个严重缺乏TME2的测定平台。这种在细胞预筛选阶段缺乏生理TME可能限制在含肿瘤动物模型中发现有效制剂，并可能导致许多有前途的肿瘤药物在发育后期阶段出现高流失率。
尽管TME在调节肿瘤药物反应方面的重要性，但实验约束限制了在药物发现和开发的早期阶段应用更具有生理相关性的系统。从动物模型或患者肿瘤标本中筛选数百种肿瘤治疗剂是不切实际的。事实上，手术标本是具有不同遗传背景的稀缺资源，由于实验规模、成本和动物福利，在动物模型中筛选数千种候选分子是不可行的。
肿瘤组织切片培养，其中精确切割，薄肿瘤部分培养外活体，可以解决生理TME在药物筛选检测中的局限性。从历史上看，神经科学领域开创了脑组织切片培养的先河，并进行了广泛的优化。最近，许多研究已经证明了从所有类型的肿瘤组织切片的准备，包括细胞系衍生肿瘤，自发肿瘤模型，患者衍生异种移植（PDX）和原发性患者肿瘤。外活体组织切片培养整合了体内和体外培养5的益处。肿瘤组织切片保留完整的组织结构及变状细胞组成，从而在TME语境内研究癌细胞。
该协议引入了一种组织性肿瘤组织切片培养系统，结合实时、高灵敏度的生存能力测定来评估药物反应。在以前引入的协议中，对有机肿瘤组织切片的药物疗效测试依赖于通过荧光染料合并、免疫组织化学（IHC）或MTT（（3-4、5-二甲基苯甲酸酯-2-yl_-2、5二苯基四苯基溴化）测定66、7、8、97,8,9来测量细胞生存能力的变化。然而，这些方法都是端点测定，灵敏度低，处理时间长，数据分析复杂，信号范围窄，实验误差高。我们的基于发光的活细胞兼容试剂通过提供广泛的信号范围和即时（±5 分钟）测量，无需事先处理和最少的后处理，从而改进了这些检测。这种试剂高度敏感，可以在细胞培养培养培养培养培养基中共存，从而能够连续和时间程测量细胞的可行性。该检测系统适用于临床前药物开发中组织切片药物候选药物的高通量筛选。
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Protocol
所有小鼠实验都是根据《动物福利法》《实验室动物护理和使用指南》和《国家卫生研究院关于在生物医学研究中照顾和使用动物的准则》中的建议进行的。
1. 肿瘤组织切片的制备
- 按照表 1中的配方制备组织切片培养 （TSC） 介质。使用 0.45 μm 真空过滤器单元过滤介质以进行消毒。
- 对于 24 孔板，每口井的 250 μL TSC 介质为 6 孔板，或 6 孔板每口 1 mL 介质。将板保持在 37 °C、5% CO2加湿培养箱中，直到使用。
注：根据组织类型和实验目标，可以优化介质和补充剂。介质的量应足以浸泡培养刀片的多孔膜。不要超过膜的水平。如果中等电平过低或过高，请调整中等音量。如果研究人员正在测试免疫调节剂，我们建议用IL-210补充该介质。 - 如果使用从小鼠中提取的肿瘤组织，请通过推荐程序对小鼠进行安乐死，通过喷洒 70% 乙醇对小鼠暴露的皮肤进行消毒，并使用无菌技术解剖肿瘤。将肿瘤组织存放在含有冰冷汉克平衡盐溶液（HBSS）的管中。
- 如果使用新鲜的患者肿瘤组织，则短期储存在冰冷的 HBSS 中，或将威斯康星大学 （UW） 的冰冷的贝尔策 （UW） 溶液储存起来，用于长期储存（高达 24 小时），以保持组织生存能力。
注：在冰冷的UW溶液中通宵运输的PDX组织的切片已成功制备。 - 将肿瘤组织转移到含有冰冷HBSS的10厘米培养板中。用手术刀将肿瘤切成两半，同时浸入冰冷的HBSS中。使用直径为 6 mm 的活检冲孔将肿瘤组织塑造成圆柱体，并修剪一侧以创建平面。将组织存放在冰冷的 HBSS 中，直到使用。
注：避免包括组织的坏死区域，这通常是在中心，有一个不透明和易碎的外观。 - 设置振动器。使用 70% 乙醇对所有设备进行消毒。将装有丙烯酸玻璃盖的振动缓冲托盘放在振动冰浴的中心。将冰块添加到冰浴中，用冷却的 HBSS 填充缓冲盘，在切片时保持组织冷却。将剃刀刀片连接到刀片支架上。
注：虽然在半无菌环境中保持振动，但不会影响先前的实验，但建议将振动菌存放在生物安全柜下（如有）。 - 使用齿形钳子小心地从 HBSS 中取出活检的肿瘤组织，并使用无绒纸巾擦拭纸巾，去除多余的缓冲液。
- 将一滴医级氰丙烯酸酯胶水放在试样板上，并将组织放在这种滴上。将胶水晾干 2⁄3 分钟，并将板放入缓冲盘中。补充一些HBSS，直到组织完全浸入缓冲液。
注：将组织安装在直立、稳定的位置对于生成均匀切片至关重要。如果安装的组织不稳定，要么向周围的组织添加更多胶水以保持直立位置，要么卸载组织，平展底部，然后再次粘附。弹性组织在切片过程中更容易被推和弯曲，在这种情况下，较短的长度（<5 mm）和多次运行可能是合适的。对于极其脆弱的组织，纸巾会破坏组织。在这种情况下，组织可以放置在塑料表面，以芯去一些多余的HBSS。 - 调整振动设置。使用以下设置：切割厚度 = 250 μm，振幅 = 3.00 mm，切片速度 = 0.01±0.25 mm/s，刀片角度 = 15°±21°。
注：根据组织的刚度优化切片设置。较软的纸巾更容易切割，以较低的速度以更深的刀片角度切割。刀片角度为 18°，切割速度介于 0.10±0.18 mm/s 之间，振幅为 3.00 mm 适用于鼠标 4T1 和 PDX HCI010 肿瘤。更硬的组织可以以更快的刀片速度切割。 - 设置刀片的开始和结束位置并调整舞台的高度。以连续模式运行仪器，将切片切成多个周期，直到组织均匀切割。
- 继续切片组织。将切片和少量 HBSS 缓冲液转移到带宽尖转移移液器的介质的细胞培养插件上，使用吸力提升整个切片。将每个刀片一片放在 24 孔板上。6 个孔板的刀片最多可容纳 4 个切片进行复制测定。
注：如果组织切片的最后一个边缘仍附着在未切割的组织上，则停止振动，用两对细尖钳子分离组织切片，而不会接触或戳动组织切片。单独的剃刀刀片可用于去除悬挂组织。 - 使用精细尖端转移移液器拆下任何多余的缓冲液。
- 当刀片接近粘合组织时，停止仪器，降低舞台，用单独的刀片去除硬化组织，并安装新的组织。继续切片，直到收集了足够的切片。
- 将板培养在37°C、5%CO2的加湿培养箱2中。组织切片在细胞培养插件上的空液间相进行培养。组织切片在初始切片制备后24~48小时即可进行实验。对于长期栽培，每2-3天交换一次。
2. 可行性测量
- 对于组织切片的生存能力测量，根据制造商的说明，在 TSC 介质中 1：1，000 稀释时，将介质与含透明酶和蛋白基的基于发光的活能测量试剂交换。试剂测量代谢蛋白基活性降低至透明蛋白11。在每个组织切片顶部转移50μL的酶基质混合物。
- 在位于37°C的加湿培养箱内，在5%CO2过夜的加湿培养箱内，用温和的搅拌孵育。
- 发光信号可以使用微板读取器或体内成像仪器测量，用于在 24 孔板中培养的组织。为了测量6孔板上多个组织的个体生存能力，应使用体内成像系统。
- 使用微板读取器时，设置没有盖子的微板。任何类型的微板读取器，能够测量发光强度应适合实验。我们使用以下设置：读取时间 = 1 s，从顶部测量，增益 = 200。
注：为了更高的精度，请使用白壁微孔板来设置实验。白墙、透明底部24个井板已经过测试，在大多数情况下，清除井板不会损害结果。 - 当使用体内成像系统测量可行性时，将板放在舞台中心并取下盖子。获取正常摄影图像，然后获取发光图像，在 C 处具有舞台设置场、自动曝光时间、f-stop = 1、目标设置为具有主体高度 = 0.0 厘米的微孔板。
- 使用与体内成像系统配套的成像软件量化发光强度。在每个组织切片周围绘制一致的兴趣区域 （ROI）。该协议使用直径为 1 厘米的圆作为 ROI（参见图 1）。测量区域的总通量（p/s）。
- 使用微板读取器时，设置没有盖子的微板。任何类型的微板读取器，能够测量发光强度应适合实验。我们使用以下设置：读取时间 = 1 s，从顶部测量，增益 = 200。
3. 评价药物对组织切片的影响
- 使用基于发光的生存能力测量试剂进行治疗前的基线可行性，如第2节所述。
注：如果与其它组织相比，多个组织的生存能力明显较低，则从测定中省略组织。 - 溶解二甲基亚硫酸盐（DMSO）中的药物，以做出库存解决方案。在所需浓度下，使用 TSC 或其他培养介质（25 μL/well，用于含有 250 μL 介质的 24 孔板）制备 10 倍药物溶液。对于车辆控制，准备含有等效体积 DMSO 的介质。
- 将10倍药物溶液补充到井底的培养介质中。通过移液和转移50μL的介质在组织的顶部混合。
注：如果有多个组织切片可用，则针对每种情况测试重复或三联。 - 在37°C、5%CO2的轨道振动器上轻轻摇动，在一夜之间孵育2，加湿培养箱。
- 从摇床中取出板，在37°C、5%CO2、加湿培养箱中静2孵化。
- 在所需的时间点，使用微孔读取器或体内成像系统测量组织的发光强度。通常，药物效果在治疗1-6天后可检测。
注：在培养条件下，基于发光的生存能力试剂至少稳定3天。然而，根据组织的代谢活性，基质在测定过程中可能会耗尽。如果在具有以前高信号的组织中观察到显著的信号落点，则补充所有井中的基板。 - 使用以下方程计算已处理的肿瘤组织的剩余生存能力：
经治疗组织的可行性通过其基线生存能力和控制肿瘤组织的生存能力转移而规范化。
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Representative Results
在这里，我们演示了一个时间过程，多种药物疗效评估方案，肿瘤组织切片从小鼠4T1乳腺癌组织和乳腺癌PDX模型，HCI01012制备。我们成功地准备了从几个小鼠衍生肿瘤，PDX和新鲜患者肿瘤10的组织切片。图1描述了肿瘤组织制备和药物疗效测试的总体工作流程。一般来说，我们可以从体积为1，000~1，500毫米的单个大宗肿瘤中制备20~40个组织切片。
对于可行性测量，我们利用了一种基于发光的活细胞兼容活能试剂。与通过DMSO控制治疗的肿瘤组织相比，在1μM浓度下治疗多激酶抑制剂staurosporine4天，信号强度降低了100倍。"从4T1肿瘤制备的组织切片保持至少21天，偶尔进行中等交换（图2B）。大多数药物反应测量是在组织切片制备后的7天内进行的。由于活细胞兼容试剂在测量前不需要处理或固定，因此允许我们进行时间过程测量。图2C中总结了相同4T1肿瘤组织肿瘤组织肿瘤组织切片的可生存性随时间变化。从第 1 天开始，500 nM 处的 Staurosporine 减少了发光，并在第 4 天达到最低水平，此后每个时间点都保持在较低水平。相反，由DMSO补充的组织的对照组的发光强度保持稳定，直到第6天。此外，从相同的4T1肿瘤制备的组织切片用连续剂量的孢子孢菌素（0+1 μM）治疗4天，并显示出剂量依赖性的变化，在生存能力和EC50（图2D）。
我们在乳腺癌的正交PDX模型HCI010制备的组织切片上测试了化疗药物。PDX组织切片用多索鲁比辛（一种标准化疗药物）进行治疗，剂量为0~5μM，为期6天，提供剂量依赖性变化（图3A）。此外，17种药物的疗效，包括临床前和临床批准的药物，在从单个散装HCI010肿瘤制备的组织切片上进行了三重测试。药物在0.5μM下涂4天（图3B）。这些结果提供了概念证明，即中通量药物筛选可以使用本地 TME 在肿瘤切片上进行。
图1：显示组织切片制剂的原理图，然后进行药物疗效评估。肿瘤组织被加工成直径6毫米、厚250μm的切片，并在细胞培养插入物的支持下在液相中培养。在药物治疗前后使用生物发光试剂测量组织生存能力。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：组织切片可行性测量和药物反应。（A） 乳房肿瘤组织切片中基于发光的生存能力测量的代表性图像。4T1肿瘤的组织切片与1μM孢菌孢菌素或DMSO对照以及发光活力测定试剂一起孵育4天。图像是使用体内成像系统获取的，并通过随附的图像分析软件进行分析。红色圆圈表示生物发光的 ROI 测量。底部 = 显示肿瘤组织切片的发光信号的图，由体内成像系统测量，用孢子孢子素处理或对照。条形表示四个组织切片的平均值，显示为圆（控制）或正方形（治疗过孢子虫素）。（B） 显示 4T1 肿瘤组织切片的生存能力的情节，从制备开始培养 21 天。由体内成像系统测量的21天的可行性标准化为第3天。每个点表示来自单个切片的测量值;柱表示均值;该框显示四分位数，胡须显示测量的最小值到最大值。（C） 治疗孢子虫后组织生存能力的时间过程测量。随着时间的推移，测量4T1肿瘤组织切片的生存能力，这些肿瘤用孢子孢子素（500 nM）或等量DMSO作为对照进行测量。发光强度由微孔读取器在指示的航点上测量。每个点都说明了单个组织切片的数据点，条形图表示组织切片上对松孢菌素D的剂量相关处理。从4T1肿瘤制备的组织切片补充了连续剂量的孢子素或DMSO作为车辆控制。在治疗开始后4天，体内成像系统测量了基于发光的剩余生存能力。使用协议中显示的方程计算了相对可行性。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：从乳腺癌 PDX 模型制备的组织切片中的药物筛选。（A） 显示各种剂量多索鲁比辛的生存能力变化的情节。组织切片是从正交性乳腺癌PDX肿瘤，HCI010制备的。活力以用数分剂量的多索鲁比辛治疗的切片测量。6天后，使用体内成像系统测量发光。Bar = 均值 = SEM. （B） 从正交乳腺癌 PDX 肿瘤肿瘤肿瘤组织切片上进行小规模化疗药物筛查。条形图 = 均值 = 三联实验的 SEM。这些数据已经公布之前10。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 材料 | 毫升 | 最终浓度 | 股票 |
| 威廉的中度 E | 500 | ||
| 烟 酰 胺 | 6 | 12 mM | 1M库存在威廉姆斯的中E，消毒 |
| 抗坏血酸 | 6 | 50.4 微克/米L | 0.21 g/50 mL （>10 mM 库存） 在威廉的中E中，灭菌 |
| 碳酸氢钠 | 15 | 2.25毫克/米拉 | 7.5% （v/v） 解决方案 |
| 赫佩斯缓冲区 | 10 | 20 mM | 1 M 库存解决方案 |
| 葡萄糖 | 10 | 5毫克/米拉 | 250毫克/毫升库存，消毒 |
| 火焰钠 | 5 | 1 mM | 100 mM 库存 |
| L-谷氨酰胺 | 5 | 2 mM | 200 mM 库存 |
| ITS = 预混料 | 5 | 含有人类重组胰岛素、人转移素（每份12.5毫克）、硒酸（12.5微克）、BSA（2.5克）和亚油酸（10.7毫克） | |
| 青霉素-链霉素 | 2 | 40 IU/mL 笔，40 μg/mL 链球菌 | 10，000 IU/mL 笔，10，000 μg/mL 链球菌 |
| 重组 EGF | 0.5 | 20 纳克/mL | 20 微克/mL 库存 |
表1：TSC中等配方。
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Discussion
在该协议中，我们演示了一个对有机肿瘤组织切片进行定量和实时药物疗效研究的平台。组织切片培养系统通过捕捉原生肿瘤微环境的细胞异质性和生理特征，比传统的细胞体外方法具有明显的优势。该平台还提高了药物疗效测试的吞吐量，有助于弥合细胞培养研究与体内实验之间的差距。
为了获得准确和一致的结果，在制备过程中必须尽量减少组织损伤。组织切片应用宽尖塑料移液器处理，以避免物理接触造成的损坏。必须保持培养介质体积，使组织切片在实验期间与空气和介质接触。
培养基应根据组织类型和实验目的进行优化。该协议中使用的TSC介质是一种无血清介质，最初是为原发性肝细胞培养13而开发的。这种介质也被用来维持几种类型的肿瘤，包括乳房，肝脏，结肠和胰腺10。此外，我们使用基于DMEM的优化介质10证明了增强免疫细胞存活率。应根据组织纹理优化振动设置，以获得完整且均匀的肿瘤组织切片。使用较深的刀片角度、较慢的切割速度和较厚的切片，通常更容易切割更软和/或松散合并组织。偶尔，组织太软，不能切割，在这种情况下，研究人员应该考虑嵌入低熔点阿加罗斯的组织，这是脑组织切片14，15,15中常见的技术。
此前，几项研究在培养组织切片上引入了治疗药物测试方法。这些研究依靠荧光染料的整合，免疫组织化学，或MTT测定来评估组织的可行性66，7，8，9。7,8,9在此协议中，我们使用基于发光的活细胞兼容试剂实时-Glo11进行可行性测量。与以前使用的方法（包括更高的灵敏度、更宽的信号范围）和快速进行实时可行性测量的能力，基于发光的测定具有多种优点。微板读取器（+1 s/well）和体内成像系统（±1 分钟/板）的测量时间较短，可直接提供信号强度读数，只需最少的处理。在高通量药物筛选中，更快采集信号和更少的后处理步骤是必要的功能，从而允许基于荧金的生存能力测量，从而在组织切片培养中实现更高的样品吞吐量。虽然基于荧光酶的测定提供了对整个切片可行性的准确定量测量，但它无法检测组织中药物诱导的细胞类型特异性变化。然而，将基于发光的生存能力测量与同一组织片上的端点IHC耦合，将实现细胞类型特异性测量。
组织切片培养系统是将肿瘤组织复杂性引入高通量筛选平台的有力工具，但存在几个缺点。肿瘤组织内固有的异质性可能导致组织切片之间的不同药物反应，甚至来自同一大宗肿瘤。有时，我们在实验中观察到组织切片中药物反应的较大变化。通过平均从同一肿瘤内不同部位制备的多个组织切片，我们可以部分克服这种变化。虽然组织切片培养可以维持在基线的生存能力水平至少21天（图2B），细胞群会随时间而变化。我们已经描述了免疫细胞群在组织切片培养实验过程中的变化10。因此，我们建议在较短的培养时间间隔内检查组织切片，以重述原生组织特征。
组织切片培养有望填补高通量细胞培养筛选和动物实验之间药物发现和开发方面的一个关键空白。数以百计的药物可以在单一肿瘤活检产生的切片上进行评估，从而在动物研究之前增加生理相关性。该系统可以帮助减少将药物推向市场所需的动物实验数量。此外，从患者肿瘤制备的组织切片在指导临床治疗计划方面具有丰富的潜力。今天有一百多种治疗药物，但几乎没有生物标志物来指导它们的选择。此外，患者的异质性也会导致反应差异。患者活检组织切片可用于在系统治疗前测试多种药物，在一周内提供有关药物疗效的宝贵信息。总体而言，使用组织切片培养系统对药物进行实时、快速检测，在癌症药物开发和治疗决策方面具有巨大潜力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH/NCI[K22CA201229，P30CA015704]和西德尼·金梅尔基金会[金梅尔学者奖]、肺癌发现奖（LCD-505536）的支持。我们要感谢阿拉娜·韦姆博士（犹他大学）提供乳腺癌PDX肿瘤。我们还要感谢比较医学、弗雷德·哈钦森癌症研究中心（FHCRC）的工作人员对PDX模型的维护以及Gujral实验室的成员进行了有益的讨论。N.N.A得到JSPS海外研究奖学金和FHCRC跨学科培训赠款的支持。A.J.B.由FHCRC的染色体代谢和癌症培训补助金提供支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
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