Summary
Organotipik tümör doku dilimlerinde gerçek zamanlı ilaç yanıtını ölçmek için bir protokol uyguluyoruz. Burada özetlenen deneysel strateji, ekstrem koşullarda klinik veya fare tümörlerinden elde edilen doku dilimlerinde orta-yüksek iş yapma ilaç ekranları yürütmek için bir platform sağlar.
Abstract
Tümör dokuları kanserli hücreleroluşur, infiltrasyon bağışıklık hücreleri, endotel hücreleri, fibroblastlar, ve ekstrasellüler matriks. Bu karmaşık ortam tümör mikroçevresini (TME) oluşturur ve in vivo veya ilaç yanıtı ex vivo tedaviye yanıtı modüle edebilir. Konvansiyonel kanser ilaç keşif ekranları tek katmanlı kültürlü hücreler üzerinde yapılır, kritik TME etkisi yoksun bir sistem. Böylece, hassas ve yüksek iş yapma lı tahlilleri fizyolojik TME ile birleştiren deneysel sistemler klinik öncesi ilaç keşif sürecini güçlendirecektir. Burada, orta-yüksek-eldeli ilaç taraması için bir platform olarak ex vivo tümör doku dilimi kültürü tanıtmak. Organotipik doku dilimi kültürü, sıvı hava arabiriminde gözenekli bir zarın desteği ile sürdürülen hassas kesimli, ince tümör kesitleri oluşturur. Bu protokolde fare tümörlerinden ve hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modellerinden alınan tümörlerden hazırlanan doku dilimlerinin hazırlanması ve sürdürülmesi ni açıklanmıştır. İlaç tedavisine yanıt olarak doku canlılığındaki değişiklikleri değerlendirmek için, dokudaki canlı hücrelerin gerçek zamanlı, hızlı ve hassas ölçümlerini sağlayan biyouyumlu lüminesans tabanlı canlılık testinden yararlandık. Bu platformu kullanarak doku dilimlerinin çoklu kiril inhibitörü, staurosporin ve sitotoksik ajan doksorubisin'e verdiği doza bağlı yanıtları değerlendirdik. Ayrıca, tek bir PDX tümöründen hazırlanan doku dilimleriüzerinde 17 klinik ve preklinik ilaç taranarak ex vivo farmakoloji için doku dilimlerinin uygulanmasını gösteriyoruz. Fizyolojik olarak ilgili, son derece hassas ve sağlam ex vivo tarama platformumuz klinik öncesi onkoloji ilaç keşfini ve tedavi karar verme kararını büyük ölçüde güçlendirecektir.
Introduction
Kanser hücresi etkileşimleri ile çevreleyen stromal dokunun fiziksel ve biyokimyasal özellikleri TME'yi oluşturur. TME tümör büyümesini uyarabilir, metastaz, ve tedaviye tümör yanıtı modüle1. Konvansiyonel klinik öncesi ilaç geliştirmede, ilaç adayları genellikle ilk kültürlü kanser hücre hatları kullanılarak taranır, kritik TME yoksun bir test platformu2. Hücre bazlı ön tarama aşamalarında fizyolojik TME Bu eksikliği tümör taşıyan hayvan modellerinde etkili ajanların keşfi ni sınırlayabilir ve gelişmenin daha sonraki klinik aşamalarında birçok umut verici onkoloji ilaçların yüksek yıpranma oranına katkıda bulunabilir3.
TME'nin tümör ilaç yanıtlarının modüle edilmesindeki önemine rağmen, deneysel kısıtlamalar ilaç keşfi ve gelişiminin erken aşamalarında fizyolojik olarak daha alakalı sistemlerin uygulanmasını sınırlandırmaktadır. Hayvan modellerinden veya hasta tümör örneklerinden tümörler de yüzlerce terapötik ajanın taranması pratik değildir. Gerçekten de, cerrahi örnekler çeşitli genetik geçmişe sahip kıt kaynaklardır ve hayvan modellerinde binlerce aday molekülün taranması deneysel ölçek, maliyet ve hayvan refahı nedeniyle mümkün değildir.
Tümör doku dilimi kültürü, tam olarak kesilmiş, ince tümör bölümleri kültürlü ex vivo, ilaç tarama tahlillerinde fizyolojik TME sınırlama adresi olabilir. Tarihsel olarak, nöroloji alanında öncülük ve beyin dokusu için dilim kültürünün geniş optimizasyonlar yaptı4. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, hücre hattı kaynaklı tümörler, spontan tümör modelleri, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) ve primer hasta tümörleri de dahil olmak üzere çeşitli tümör dokusu tiplerinden dilimlerin hazırlanmasını göstermiştir. Ex vivo doku dilimi kültürü hem in vivo hem de in vitro kültür5yararları entegre. Tümör doku dilimleri bozulmamış doku mimarisi ve alacalı hücre bileşimi korumak, TME bağlamında kanser hücrelerinin çalışma sağlayan.
Bu protokol, ilaç yanıtlarını değerlendirmek için gerçek zamanlı, son derece hassas bir canlılık testile birlikte bir organotipik tümör doku dilimi kültür sistemi tanıttı. Daha önce tanıtılan protokollerde organotipik tümör doku dilimleri üzerinde ilaç etkinliği testleri floresan boya dahil, immünohistokimya (IHC) veya MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 difenil tetrazolium bromür) tahlil6,,7,8,9. Ancak, tüm bu yöntemler in bitiş noktası tahlilleri dir ve düşük hassasiyet, uzun işlem süresi, karmaşık veri analizleri, dar sinyal aralığı ve yüksek deneysel hata dan muzdariptir. Bizim lüminesans tabanlı canlı hücre uyumlu reaktif geniş bir sinyal aralığı ve anlık (~ 5 dakika) ölçüm ön işleme ve minimum post processing olmadan sağlayarak bu tahlilleri geliştirir. Bu reaktif son derece hassastır ve hücre kültürü medyasında bir arada bulunabilir, hücre canlılığının sürekli ve zaman içinde ölçülmesine izin verir. Bu araştırma sistemi, klinik öncesi ilaç gelişiminde ilaç adaylarının doku dilimleri üzerinde yüksek işlem taraması için geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fare deneyleri, Hayvan Refahı Yasası Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ndeki tavsiyelere ve biyomedikal araştırmalarda hayvanların bakımı ve kullanımına ilişkin Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına uygun olarak yapılmıştır.
1. Tümör doku dilimlerinin hazırlanması
- Tablo 1'dekitarifi takip eden doku dilimi kültürünü (TSC) hazırlayın. Sterilize etmek için ortamı 0,45 m'lik vakum filtre ünitesiyle filtreleyin.
- Aliquot 250 μL tsc orta iyi başına 24 iyi plaka, ya da 6 iyi plaka için iyi başına orta 1 mL. Plakayı kullanıma kadar %5 CO2 nemli bir kuluçka makinesinde tutun.
NOT: Ortam ve takviyeler doku tiplerine ve deneysel hedeflere bağlı olarak optimize edilebilir. Ortam miktarı sadece bir kültür eklemek gözenekli membran Emmek için yeterli olmalıdır. Membran seviyesini aşmayın. Orta seviye çok düşük veya çok yüksekse orta hacmi ayarlayın. Araştırmacılar immünomodülatör ajanları test ediyorsanız, IL-2 10 ile orta takviyesiöneririz. - Farelerden elde edilen tümör dokusu nu kullanıyorsanız, önerilen bir prosedürle fareleri ötenazi, %70 etanol püskürterek farelerin maruz kalan derisini dezenfekte etmek ve tümörleri aseptik tekniklerle incelemek. Tümör dokusunu buz gibi Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren bir tüpte saklayın.
- Taze hasta tümör dokuları kullanıyorsanız, kısa süreli buz gibi HBSS veya doku canlılığını korumak için uzun süreli depolama (24 saate kadar) için wisconsin Belzer Üniversitesi (UW) çözeltisi saklayın.
NOT: Buz gibi UW çözeltisinde bir gecede gönderilen PDX dokusundan elde edilen dilimler başarıyla hazırlanmıştır. - Tümör dokusunu buz gibi HBSS içeren 10 cm'lik bir kültür plakasına aktarın. Buz gibi HBSS batırılmış ise bir neşter ile yarıya tümör kesin. 6 mm çapında biyopsi zımba kullanarak silindiriçine tümör dokuları şekil ve düz bir yüzey oluşturmak için bir tarafı kırpma. Dokuları kullanıma kadar buz gibi HBSS'de saklayın.
NOT: Genellikle merkezde olan ve opak ve kırılgan bir görünüme sahip olan dokunun nekrotik alanını kullanmaktan kaçının. - Vibratome'yi kur. %70 etanol kullanarak tüm ekipmanları dezenfekte edin. Vibratom tampon tepsisi vibratom buz banyosu nun ortasına akrilik cam kapakla kaplanmış yerleştirin. Buz banyosuna buz ekleyin ve dilimleme sırasında doku serin tutmak için soğutulmuş HBSS ile tampon tepsisini doldurun. Bıçak tutucuya bir jilet takın.
NOT: Vibratomların semisterile bir ortamda tutulması önceki deneyleri etkilemese de, vibratomu varsa biyogüvenlik kabini altında saklaması önerilir. - Dişli forsepskullanarak HBSS'den biyopsi delikli tümör dokusunu dikkatlice kaldırın ve tiftiksiz kağıt havlu ile dokuyu dabbing ederek fazla tamponu çıkarın.
- Numune plakasına bir damla tıbbi dereceli siyanoakrilat tutkal yerleştirin ve dokuyu bu damlanın üzerine yerleştirin. 2-3 dk tutkal için hava kuru ve tampon tepsiye plaka yerleştirin. Doku tamamen tampon batırılmış kadar bazı HBSS ile tamam.
NOT: Dokuların dik ve sabit bir konuma montajı, düzgün kesilmiş dilimler oluşturmak için çok önemlidir. Monte edilmiş dokular kararsızsa, dik bir pozisyonda kalmak için çevre dokuya daha fazla tutkal ekleyin veya dokuyu boşaltın, alttabakayı düzleştirir ve tekrar yapıştırın. Elastik dokular dilimleme sırasında daha kolay itilip bükülme eğilimindedir, bu durumda daha kısa uzunluklarda (<5 mm) ve birden fazla çalıştırma uygun olabilir. Son derece kırılgan dokular için, kağıt havlu doku yok edebilir. Bu durumda, doku bazı aşırı HBSS uzak wick plastik bir yüzeye yerleştirilebilir. - Vibratom ayarlarını ayarlayın. Aşağıdaki ayarlar kullanılır: kesme kalınlığı = 250 μm, genlik = 3,00 mm, dilimleme hızı = 0,01-0,25 mm/s ve bıçak açısı = 15°–21°.
NOT: Dilimleme ayarlarını dokunun sertliğine bağlı olarak optimize edin. Daha yumuşak dokular daha düşük hızda daha derin bir bıçak açısı ile daha kolay kesilir. 18°'lik bir bıçak açısı, 0.10-0.18 mm/sn arasındaki kesme hızı ve 3.00 mm genliği mouse 4T1 ve PDX HCI010 tümörleri için iyi çalışır. Daha sert doku daha hızlı bir bıçak hızı ile kesilebilir. - Bıçağın başlangıç ve bitiş konumlarını ayarlayın ve sahnenin yüksekliğini ayarlayın. Dokular düzgün bir şekilde kesilene kadar birkaç döngü için dilimleri kesmek için sürekli modile cihazı çalıştırın.
- Dokuyu dilimletmedevam et. Dilimleri az miktarda HBSS arabelleği ile birlikte geniş uçlu transfer pipetli orta hücre kültürü kesici uça aktarın ve dilimin tamamını kaldırmak için emme yi bırakın. 24 kuyu luk bir tabağa kesici uç başına bir dilim yerleştirin. 6 kuyu plakası için bir kesici uç, çoğaltma telbetteiçin en fazla dört dilim barındırabilir.
NOT: Doku diliminin son kenarı hala kesilmemiş dokuya bağlıysa, vibratomu durdurun ve doku dilimlerine dokunmadan veya dürtmeden iki çift ince uçlu forceps ile doku dilimini ayırın. Ayrı bir jilet asılı doku çıkarmada yararlı olabilir. - İnce uçlu transfer pipetiyle fazla arabelleği çıkarın.
- Bıçak yapıştırılmış dokulara yaklaştığında, aleti durdurun, sahneyi düşürün, sertleştirilmiş dokuyu ayrı bir bıçakla çıkarın ve yeni bir doku tonu. Yeterli dilim toplanana kadar dilimleme devam edin.
- Kültür 37 °C, 5% CO2olarak belirlenen bir nemlendirilmiş kuluçka plakaları . Doku dilimleri hücre kültürü eklemek hava-sıvı interfaz kültürlü. Doku dilimleri ilk dilim hazırlığından sonra 24-48 saat deneyler için hazırdır. Uzun süreli ekim için, her 2-3 günde bir orta değişimi.
2. Canlılık ölçümü
- Doku diliminin canlılık ölçümü için, üreticinin talimatları doğrultusunda TSC ortamda 1:1.000 seyreltme de hem luciferase hem de secde içeren bir lüminesans bazlı canlılık ölçüm reaktifi ile orta değişimi. Reaktif luciferin11metabolize secde canlı hücrelerin indüksiyon aktivitesini ölçer. Her doku diliminin üzerine 50 μL enzim-substrat karışımı aktarın.
- Bir gecede % 5 CO2 ile 37 °C'de bulunan nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinin içinde bulunan bir orbital shaker üzerinde nazik ajitasyon ile kuluçka.
- Parlak sinyaller bir mikroplaka okuyucu veya 24 kuyu plaka kültürlü dokular için bir in vivo görüntüleme aracı kullanılarak ölçülebilir. 6 kuyu plakaüzerinde birden fazla doku bireysel canlılığını ölçmek için, bir in vivo görüntüleme sistemi kullanılmalıdır.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanırken, kapak olmadan mikroplaka ayarlayın. Parlak yoğunluğu ölçebilen her türlü mikroplaka okuyucu deney için uygun olmalıdır. Biz aşağıdaki ayarları kullanılır: okuma süresi = 1 s, üstten ölçüm, kazanç = 200.
NOT: Daha yüksek doğruluk için, denemeyi ayarlamak için beyaz duvarlı bir mikroplaka kullanın. Beyaz duvar, açık alt 24 kuyu plakaları test edilmiştir, ve çoğu durumda, net kuyu plakaları sonuçları tehlikeye yok. - Canlılığı ölçmek için in vivo görüntüleme sistemi kullanırken, plakayı sahnenin ortasına yerleştirin ve kapağı çıkarın. C'de sahne ayarı alanı, otomatik pozlama süresi, f-stop = 1, nesne yüksekliği = 0,0 cm olan mikroplaka olarak nesnel ayar ile parlak görüntüler takip normal fotoğrafgörüntüleri elde edin.
- In vivo görüntüleme sistemi ile birlikte görüntüleme yazılımı kullanarak Parlak yoğunluğunu ölçün. Her doku diliminin etrafına tutarlı ilgi alanları (YG) çizin. Bu protokol, yg'ler olarak 1 cm çapında bir daire kullanır (Bkz. Şekil 1). Alanın toplam akısı (p/s) ölçün.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanırken, kapak olmadan mikroplaka ayarlayın. Parlak yoğunluğu ölçebilen her türlü mikroplaka okuyucu deney için uygun olmalıdır. Biz aşağıdaki ayarları kullanılır: okuma süresi = 1 s, üstten ölçüm, kazanç = 200.
3. Doku dilimleri üzerinde ilaç etkisinin değerlendirilmesi
- Bölüm 2'de açıklandığı gibi, lüminesans bazlı canlılık ölçüm reaktifini kullanarak tedaviden önce temel canlılığı ölçün.
NOT: Birkaç doku diğerlerine göre önemli ölçüde daha düşük canlılığa sahipse, tözden dokuları atla. - Stok çözeltileri yapmak için dimetil sülfoksit (DMSO) içinde ilaç çözünür. TSC veya diğer kültür ortamı (25 μL/iyi, 250 μL orta içeren 24 kuyu plakası için) istenilen konsantrasyonlarda 10 x uyuşturucu çözeltisi hazırlayın. Araç kontrolü için, eşdeğer bir DMSO hacmi içeren ortam hazırlayın.
- Ek 10x ilaç çözümü kuyunun altındaki kültür ortamına. Pipetleme ile karıştırın ve dokuların üzerine ortamın 50°L'sini aktarın.
NOT: Birkaç doku dilimi varsa, her durum için test yinelemeleri veya üçlemeler. - Bir gecede 37 °C, %5 CO2,nemlendirilmiş bir inkübatörde bir orbital shaker üzerinde hafif çetren sallayarak inkübül.
- 37 °C, %5 CO2,nemlendirilmiş inkübatörde plakayı çalkalayıcıdan çıkarın ve statik olarak inkübedin.
- İstenilen zaman noktalarında, bir mikroplaka okuyucu veya in vivo görüntüleme sistemi kullanarak dokulardan gelen Parlak yoğunluğu ölçün. Genellikle, ilaç etkileri tedavinin 1-6 gün sonra tespit edilebilir hale gelir.
NOT: Lüminesans bazlı canlılık reaktifi kültür koşullarında en az 3 gün stabildir. Ancak, substrat doku metabolik aktivitesine bağlı olarak tsurel sırasında tükenmiş olabilir. Daha önce yüksek sinyallere sahip dokularda önemli bir sinyal düşüşü gözlenirse, tüm kuyularda substrat tamam. - Aşağıdaki denklemi kullanarak tedavi edilen tümör dokularının kalan canlılığını hesaplayın:
Tedavi edilen dokunun canlılığı, kontrol tümör dokularının temel canlılığı ve canlılık değişimi ile normale döner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, fare 4T1 meme tümörü dokuları ve meme kanseri PDX modeli, HCI01012hazırlanan tümör doku dilimleri için bir zaman ders, çoklu ilaç etkinliği değerlendirme protokolü göstermek. Biz başarıyla birkaç fare kaynaklı tümörler, PDX ve taze hasta tümörleri10doku dilimleri hazırladı. Tümör doku preparatı ve ilaç etkinliği testinin genel iş akışı Şekil 1'deaçıklanmıştır. Genel olarak, 1.000-1.500 mm3 hacimli tek bir tümörden 20-40 doku dilimi hazırlayabiliriz.
Canlılık ölçümleri için, parlak tabanlı, canlı hücre uyumlu canlılık reaktifinden yararlandık. Multi-kigaz inhibitörü staurosporinin tedavisi, 1 μM konsantrasyonda 4 gün boyunca sinyal yoğunluğunu 100x azaltarak DMSO kontrolü ile tedavi edilen tümör dokularına göre(Şekil 2A) 4T1 tümöründen hazırlanan doku dilimleri ara sıra orta değişim ile en az 21 gün muhafaza edildi(Şekil 2B). İlaç yanıt ölçümlerinin çoğu doku dilimi hazırlığından itibaren 7 gün içinde yapıldı. Canlı hücre uyumlu reaktif ölçümden önce işleme veya fiksasyon gerektirmediği için, zaman-kurs ölçümleri yapmamıza olanak sağlar. Aynı 4T1 tümör dokusundan tümör doku dilimlerinin canlılığındaki zamana bağlı değişiklikler Şekil 2C'deözetlenmiştir. 500 nM'deki Staurosporin1 günden itibaren parlaklığı azalttı ve 4. Buna karşılık, DMSO ile desteklenen dokuların kontrol grubundan gelen Parlak yoğunluk 6. Ayrıca, özdeş 4T1 tümörlerinden hazırlanan doku dilimleri 4 gün boyunca seri dozlarda staurosporin (0-1 μM) ile tedavi edildi ve canlılık ve EC50'de doza bağlı değişiklikler görüldü(Şekil 2D).
Biz meme kanseri bir ortotopik PDX modeli, HCI010 hazırlanan doku dilimleri üzerinde kemoterapötik ilaçlar test edilmiştir. PDX doku dilimleri, standart bir kemoterapötik ilaç olan doksorubisin ile 6 gün boyunca 0-5 μM dozlarda tedavi edilmiştir ve canlılıkta doza bağlı değişiklikler sağlanabilir(Şekil 3A). Ayrıca, preklinik ve klinik onaylı ilaçlar da dahil olmak üzere 17 ilacın etkinliği, tek bir toplu HCI010 tümöründen hazırlanan doku dilimleri üzerinde triplicate olarak test edilmiştir. İlaçlar 4 gün boyunca 0.5 μM olarak triplicate olarak uygulandı (Şekil 3B). Bu sonuçlar, orta iş itme ilaç taramasının yerli TME ile tümör dilimlerinde yapIlebildiği ne kadar kanıtlanabilir.
Şekil 1: Doku dilimi hazırlamave ilaç etkinliği değerlendirmesini gösteren şema. Tümör dokuları 6 mm çapında ve 250 μm kalınlığında dilimler halinde işlendi ve hücre kültürü eklerinin desteği ile hava-sıvı interfazında kültürlendi. Doku canlılığı ilaç tedavisinden önce ve sonra biyolüminesans reaktif kullanılarak ölçüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Doku dilimi canlılık ölçümü ve ilaçlara yanıt. (A) Meme tümör doku dilimlerinde lüminesans bazlı canlılık ölçümlerinin temsili görüntüleri. 4T1 tümöründen doku dilimleri 1 μM staurosporin veya DMSO kontrolü ile birlikte 4 gün boyunca parlak canlılık istigeresinde inkübe edildi. Görüntüler in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak elde edilmiş ve eşlik eden görüntü analiz yazılımı ile analiz edilmiştir. Kırmızı daireler biyolüminesans için ölçülen Yatırım Getirisi'ni gösterir. Alt = İn vivo görüntüleme sistemi ile ölçülen staurosporin veya kontrol ile tedavi edilen tümör doku dilimlerinden gelen Parlak sinyali gösteren bir plandır. Çubuk, daire (kontrol) veya kare (staurosporine tedavi) olarak gösterilen dört doku diliminin ortalamasını gösterir. (B) Hazırlıktan itibaren 21 gün boyunca kültürlenmiş 4T1 tümör doku dilimlerinin canlılığını gösteren bir arsa. In vivo görüntüleme sistemi ile ölçülen 21. Her nokta tek bir dilimden ölçüm gösterir; çubuğu ortalamayı gösterir; kutu dörtte biri gösterir ve bıyıklar ölçüm minimum maksimum değeri gösterir. (C) Staurosporin tedavisi sonrası doku canlılığının zaman-kurs ölçümleri. Staurosporin (500 nM) veya kontrol olarak DMSO eşdeğer hacmi ile tedavi edilen 4T1 tümöründen doku dilimlerinin canlılığı zaman içinde ölçüldü. Luminesans yoğunlukları belirtilen zaman dilimleri üzerinde bir mikroplaka okuyucu tarafından ölçüldü. Her nokta tek bir doku diliminden bir veri noktası gösterir ve çubuk grafisi doku dilimleri üzerinde staurosporinin doza bağlı tedavisi ± SEM. (D) gösterir. 4T1 tümöründen hazırlanan doku dilimleri araç kontrolü olarak seri dozlarda staurosporin veya DMSO ile desteklendi. Luminesansa dayalı kalan canlılık, tedavinin başlamasından 4 gün sonra in vivo görüntüleme sistemi ile ölçüldü. Göreli canlılık protokolde gösterilen denklem kullanılarak hesaplanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Meme kanseri PDX modelinden hazırlanan doku dilimlerinde ilaç taraması. (A) Doksorubisin çeşitli dozlarda yanıt olarak canlılık değişiklikleri gösteren bir arsa. Doku dilimleri bir ortotopik meme kanseri PDX tümör, HCI010 hazırlandı. Canlılık doksorubisin titre dozları ile tedavi dilimleri ölçüldü. 6 gün sonra, lüminesans in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak ölçüldü. Bar = ortalama ± SEM. (B) Ortotopik meme kanseri PDX tümörütümör doku dilimleri üzerinde küçük ölçekli kemoterapötik ilaç ekranı. Çubuk grafiği = üçe trilicate deneyinin ± SEM anlamına gelir. Bu veriler daha önce10olarak yayınlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Malzeme | Ml | Son Konsantrasyon | Stok |
| William'ın Orta E | 500 | ||
| Nikotinamid | 6 | 12 mM | Williams 'Orta E Nicotinamide 1 M stok, sterilize |
| Askorbik Asit | 6 | 50,4 μg/mL | William'ın Orta E'sinde 0,21 g/50 mL (>10 mM stok) Askorbik Asit, sterilize |
| Sodyum Bikarbonat | 15 | 2.25 mg/mL | %7,5 (w/v) çözeltisi |
| HEPES Tampon | 10 | 20 mM | 1 M stok çözümü |
| Glikoz | 10 | 5 mg/mL | 250 mg/ml stok, sterilize |
| Sodyum Piruvat | 5 | 1 mM | 100 mM stok |
| L-Glutamin | 5 | 2 mM | 200 mM hisse senedi |
| ITS + Premix | 5 | İnsan rekombinant insülin, insan transferrin (her biri 12,5 mg), selenöz asit (12,5 g), BSA (2,5 g) ve linoleik asit (10,7 mg) içerir | |
| Penisilin-Streptomisin | 2 | 40 IU/mL Kalem, 40 g/mL Strep | 10.000 IU/mL Kalem, 10.000 μg/mL Strep |
| Rekombinant EGF | 0.5 | 20 ng/mL | 20 μg/mL stok |
Tablo 1: TSC orta tarifi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde, organotipik tümör doku dilimleri üzerinde kantitatif ve gerçek zamanlı ilaç etkinliği çalışmaları için bir platform gösteriyoruz. Doku dilimi kültür sistemi, hücre heterojenliğini ve doğal tümör mikroortamının fizyolojik özelliklerini yakalayarak geleneksel hücre bazlı in vitro yöntemlere göre farklı avantajlar sağlar. Bu platform aynı zamanda uyuşturucu etkinliği testi için daha yüksek verim sağlar, hücre kültürü çalışmaları ve in vivo deneyler arasındaki boşluğu köprü yardımcı.
Doğru ve tutarlı sonuçlar elde etmek için, hazırlık sırasında doku hasarını en aza indirmek zorunludur. Doku dilimleri fiziksel temasın neden olduğu hasarı önlemek için geniş uçlu plastik pipetlerle işlenmelidir. Doku diliminin deney süresince hem havayla hem de ortamla temas kurabilmesi için kültür orta hacmi korunmalıdır.
Kültür ortamı doku tipine ve deneysel amaca göre optimize edilmelidir. Bu protokolde kullanılan TSC ortamı, başlangıçta primer hepatosit kültürü13için geliştirilmiş serumsuz bir ortamdır. Bu ortam aynı zamanda meme, karaciğer, kolon ve pankreas10dahil olmak üzere tümörlerin çeşitli korumak için kullanılmıştır. Ayrıca, optimize dmem tabanlı orta10kullanarak gelişmiş bağışıklık hücresi sağkalım gösterdi. Vibratom ayarları bozulmamış ve düzgün tümör doku dilimleri elde etmek için doku dokusuna göre optimize edilmelidir. Daha yumuşak ve/veya gevşek birleştirilmiş dokuların dilimleme silik genellikle daha derin bıçak açıları, daha yavaş kesme hızı ve kalın dilimler kullanılarak daha kolay hale getirilir. Bazen, dokular kesmek için çok yumuşak, bu durumda araştırmacılar düşük erime noktası agarose içinde doku gömme düşünmelisiniz, beyin dokusu dilimleme yaygın bir teknik14,15.
Daha önce, çeşitli çalışmalar kültürlü doku dilimleri üzerinde terapötik ilaç testi yaklaşımları tanıttı. Bu çalışmalar floresan boya dahil, immünohistokimya, veya MTT testleri doku canlılığı6,7,,8,9değerlendirmek için dayanıyordu . Bu protokolde, canlılık ölçümü için lüminesans bazlı, canlı hücre uyumlu reaktif RealTime-Glo11'i kullandık. Luminescence tabanlı tahliller daha önce kullanılan yöntemlerüzerinde çeşitli yararları vardır, artan hassasiyet dahil, daha geniş sinyal aralığı, ve hızlı bir şekilde gerçek zamanlı canlılık ölçümleri yapmak yeteneği. Ölçüm süresi hem mikroplaka okuyucular için kısa (~1 s/well) hem de in vivo görüntüleme sistemi (~1 dk/plaka) ve sinyal yoğunluğu ölçümlerini doğrudan minimum işleme ile sağlayabilir. Sinyalin daha hızlı elde edilmesi ve daha az işlem sonrası adım, yüksek iş hacmine sahip ilaç taramasında gerekli özelliklerdir ve bu da doku dilimi kültüründe çok daha büyük bir numune verimine olanak sağlamak için luciferin bazlı canlılık ölçümlerine olanak tanır. Luciferase tabanlı bir test tüm dilim canlılığının doğru, nicel bir ölçüm sağlarken, dokudaki ilaca bağlı hücre tipine özgü değişiklikleri tespit edemiyor. Ancak, aynı doku dilimi üzerinde bitiş noktası IHC ile lüminesans tabanlı canlılık ölçümleri hücre tipine özgü ölçümler sağlayacaktır.
Doku dilimi kültür sistemi yüksek iş letimat tarama platformuna tümör doku karmaşıklığı getiren güçlü bir araç olsa da, çeşitli dezavantajları vardır. Tümör dokusu içinde doğal heterojenlik doku dilimleri arasında diferansiyel ilaç yanıtları bile aynı toplu tümör neden olabilir. Zaman zaman, deneylerimizde doku dilimleri arasında ilaç yanıtında nispeten büyük farklılıklar gözlemledik. Aynı tümör içinde farklı bölgelerden hazırlanan birden fazla doku diliminin ortalamasını alarak bu varyasyonun kısmen üstesinden gelebiliriz. Doku dilimi kültürü en az 21 gün(Şekil 2B)canlılık temel düzeyinde tutulabilir rağmen, hücre popülasyonları zaman içinde değişir. Doku dilimi kültürü deneyleri sırasında bağışıklık hücre popülasyonundaki değişimleri anlattık10. Bu nedenle, doku dilimlerinin doğal doku özelliklerini yeniden özetlemek için daha kısa doku zaman aralıklarında incelenmesini öneriyoruz.
Doku dilimi kültürü, yüksek iş artışı hücre kültürü taraması ve hayvan deneyleri arasında ilaç keşfi ve gelişiminde kritik bir boşluğu doldurmaya hazırlanıyor. Yüzlerce ilaç, tek bir tümör biyopsisinden üretilen dilimler üzerinde değerlendirilebilir ve hayvan çalışmaları öncesinde fizyolojik önemi artırılır. Bu sistem piyasaya uyuşturucu getirmek için gerekli hayvan deneyleri sayısını azaltmaya yardımcı olabilir. Ayrıca hasta tümörlerinden hazırlanan doku dilimleri klinikte tedavi planlarına rehberlik etmede bilgilendirici potansiyele sahiptir. Yüzden fazla terapötik ilaçlar bugün mevcuttur, henüz onların seçimi rehberlik etmek için birkaç biyobelirteçleri vardır. Ayrıca, hastalarda heterojenlik de yanıt eşitsizlikleri ile sonuçlanır. Bir hasta biyopsisi doku dilimleri sistemik tedavi önce birden fazla ilaç test etmek için kullanılabilir, bir hafta içinde ilaç etkinliği hakkında değerli bilgiler sağlayan. Genel olarak, doku dilimi kültür sistemleri kullanarak ilaçların gerçek zamanlı ve hızlı test kanser ilaç geliştirme ve terapötik kararlar büyük bir potansiyele sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] ve Sidney Kimmel Vakfı [Kimmel Scholar Award], Akciğer Kanseri Discovery Ödülü (LCD-505536) tarafından desteklendi. Biz Dr Alana Welm (Utah Üniversitesi) meme kanseri PDX tümör sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Karşılaştırmalı Tıp, Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi (FHCRC) pdx modeli ve yararlı tartışmalar için Gujral laboratuvar üyeleri bakımı için personel teşekkür etmek istiyorum. N.N.A, FHCRC'nin JSPS Yurtdışı Araştırma Bursu ve Disiplinlerarası Eğitim Bursu ile desteklenir. A.J.B. FHCRC'den Kromozom Metabolizması ve Kanser Eğitim Bursu ile desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
