Summary
Vi indfører en protokol til måling af medicinsk respons i realtid i organotypic tumorvævsskiver. Den eksperimentelle strategi, der er skitseret her giver en platform til at udføre medium-høj gennemløb narkotika skærme på væv skiver stammer fra kliniske eller mus tumorer i ex vivo betingelser.
Abstract
Tumorvæv er sammensat af kræftceller, infiltrerede immunceller, endotelceller, fibroblaster, og ekstracellulære matrix. Dette komplekse miljø udgør tumor mikromiljø (TME) og kan modulere respons på behandling in vivo eller lægemiddelrespons ex vivo. Konventionelle kræft stof opdagelse skærme udføres på celler dyrket i et monolag, et system kritisk mangler indflydelse TME. Således vil forsøgssystemer, der integrerer følsomme analyser med høj gennemløb med fysiologisk TME, styrke den prækliniske lægemiddelopdagelsesproces. Her introducerer vi ex vivo tumorvæv skive kultur som en platform for medium-high-throughput narkotika screening. Organotypic væv skive kultur udgør præcist-cut, tynde tumor sektioner, der opretholdes med støtte fra en porøs membran i en flydende luft interface. I denne protokol beskriver vi forberedelse og vedligeholdelse af vævsskiver fremstillet af musetumorer og tumorer fra patient-afledte xenograft (PDX) modeller. For at vurdere ændringer i vævslevedygtighed som reaktion på narkotikabehandling udnyttede vi en biokompatibel luminescensbaseret levedygtighedsanalyse, der muliggør hurtig og følsom måling af levedygtige celler i vævet i realtid. Ved hjælp af denne platform evaluerede vi dosisafhængige reaktioner af vævsskiver på multikinasehæmmeren, staurosporin og cytotoksisk middel, doxorubicin. Endvidere demonstrerer vi anvendelsen af vævsskiver til ex vivo farmakologi ved screening 17 kliniske og prækliniske lægemidler på vævsskiver fremstillet af en enkelt PDX tumor. Vores fysiologisk relevante, meget følsomme og robuste ex vivo screening platform vil i høj grad styrke prækliniskonologi lægemiddelopdagelse og behandling beslutningstagning.
Introduction
Kræft celle interaktioner med de fysiske og biokemiske egenskaber af de omkringliggende stromale væv danner TME. TME kan stimulere tumorvækst, metastase, og modulere tumor respons på terapi1. I konventionelle prækliniske lægemiddeludvikling, er narkotika kandidater typisk først screenet ved hjælp af kulturformekræft cellelinjer, en analyse platform, der kritisk mangler TME2. Denne mangel på fysiologiskt TME i cellebaserede præscreeningsfaser kan begrænse opdagelsen af effektive midler i tumorholdige dyremodeller og kan bidrage til den høje nedslidningsrate for mange lovende onkologilægemidler i senere kliniske udviklingsstadier3.
På trods af betydningen af TME i modulerende tumor stof svar, eksperimentelle begrænsninger begrænse anvendelsen af mere fysiologisk relevante systemer i de tidlige stadier af narkotika opdagelse og udvikling. Det er upraktisk at screene hundredvis af terapeutiske midler på tumorer fra dyremodeller eller patient tumor prøver. Faktisk er kirurgiske prøver knappe ressourcer med forskellige genetiske baggrunde og screening tusindvis af kandidat molekyler i dyremodeller er ikke muligt på grund af eksperimentelle skala, omkostninger og dyrevelfærd.
Tumorvæv skive kultur, hvor præcist skåret, tynde tumor sektioner er dyrket ex vivo, kan løse begrænsningen af fysiologiske TME i narkotika screening assays. Historisk, inden for neurovidenskab banebrydende og gjort omfattende optimeringer af skive kultur for hjernevæv4. For nylig har mange undersøgelser vist forberedelse af skiver fra forskellige typer af tumorvæv, herunder cellelinje-afledte tumorer, spontane tumormodeller, patient-afledte xenografts (PDX), og primære patient tumorer. Ex vivo væv skive kultur integrerer fordele fra både in vivo og in vitro kultur5. Tumorvæv skiver bevarer intakt væv arkitektur og brogede cellesammensætning, gør det muligt at studere kræftceller i TME sammenhæng.
Denne protokol indfører en organotypic tumorvæv skive kultur system kombineret med en real-time, meget følsom levedygtighed assay at evaluere narkotika reaktioner. Drug effekt test på organotypic tumorvæv skiver i tidligere indførte protokoller er afhængige af måling af ændringer i cellernes levedygtighed ved fluorescerende farvestof inkorporering, immunhistokemi (IHC), eller MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromid) analyse6,7,8,9. Men alle disse metoder er slutpunktsanalyser og lider af lav følsomhed, lang behandlingstid, komplekse dataanalyser, et snævert signalområde og høje eksperimentelle fejl. Vores luminescensbaserede levende cellekompatible reagens forbedrer disse analyser ved at give et bredt signalområde og øjeblikkelig (~5 min) måling uden forudgående behandling og minimal efterbehandling. Dette reagens er meget følsomt og kan eksistere side om side i cellekulturmediet, hvilket muliggør kontinuerlig og tidsforløbsmåling af cellelevedygtighed. Dette analysesystem gælder for screening af lægemidler med høj gennemløb på vævsskiver i præklinisk lægemiddeludvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museforsøg blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr i dyrevelfærdsloven og National Institutes of Health retningslinjer for pleje og anvendelse af dyr i biomedicinsk forskning.
1. Forberedelse af tumorvæv skiver
- Forbered vævsskivekultur (TSC) medium efter opskriften i tabel 1. Mediet filtreres med en vakuumfilterenhed på 0,45 μm, der skal steriliseres.
- Aliquot 250 μL TSC medium pr brønd for en 24 brøndplade, eller 1 ml medium pr. brønd for en 6 brøndplade. Pladen opbevares i en 37 °C, 5% CO2 befugtet inkubator, indtil den anvendes.
BEMÆRK: Mediet og kosttilskud kan optimeres afhængigt af vævstyper og eksperimentelle mål. Mængden af medium skal være lige nok til at suge den porøse membran af en kultur indsætte. Må ikke overstige niveauet af membranen. Juster den mellemstore lydstyrke, hvis middelniveauet er for lavt eller for højt. Hvis forskere tester immunmodulerende midler, anbefaler vi tilskud af mediet med IL-210. - Hvis du bruger tumorvæv stammer fra mus, euthanize mus med en anbefalet procedure, desinficere den eksponerede hud af mus ved sprøjtning 70% ethanol, og dissekere tumorer med aseptiske teknikker. Opbevar tumorvævet i et rør, der indeholder iskold Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
- Hvis du bruger frisk patient tumor væv, opbevares i iskold HBSS på kort sigt, eller iskold Belzer University of Wisconsin (UW) løsning til længere tids opbevaring (op til 24 h) for at bevare væv levedygtighed.
BEMÆRK: Skiver fra et PDX-væv, der afsendes natten over i iskold UW-opløsning, er blevet forberedt med succes. - Overfør tumorvævet til en 10 cm kulturplade indeholdende iskold HBSS. Skær tumor i halve med en skalpel, mens nedsænket i iskold HBSS. Form tumorvæv i cylindre ved hjælp af en 6 mm diameter biopsi punch og trim den ene side for at skabe en flad overflade. Vævsvævet opbevares i iskold HBSS, indtil det bruges.
BEMÆRK: Undgå at inkludere det nekrotiske område af vævet, som generelt er i centrum og har et uigennemsigtigt og skrøbeligt udseende. - Sæt vibratome op. Desinficere alt udstyr med 70% ethanol. Placer vibratome buffer bakken dækket med en akryl glas låg i midten af vibratome isbad. Tilsæt is til isbadet og fyld bufferbakken op med afkølet HBSS for at holde vævet køligt, mens du skærer. Fastgør et barberblad til klingeholderen.
BEMÆRK: Selvom det ikke har påvirket tidligere forsøg at holde vibratomes i et halvsterilt miljø, anbefales det at opbevare vibratomen under et biosikkerhedsskab, hvis det er tilgængeligt. - Løft forsigtigt en biopsi-udstanset tumorvæv fra HBSS ved hjælp af tandede pincet og fjern overskydende buffer ved at duppe vævet med en fnugfri køkkenrulle.
- Placer en dråbe medicinsk kvalitet cyanoacrylat lim på prøvepladen og læg vævet på denne dråbe. Lufttør limen i 2-3 min og læg pladen i bufferbakken. Supplere med nogle HBSS indtil vævet er helt nedsænket i bufferen.
BEMÆRK: Montering af væv i opretstående, stabil position er afgørende for at generere ensartet snit skiver. Hvis monteret væv er ustabile, enten tilføje mere lim til det omgivende væv for at bevare en opretstående position eller losse vævet, flade bunden, og lim det igen. Elastisk væv har tendens til at blive skubbet og bøjet lettere under udskæring, i hvilket tilfælde kortere længder (<5 mm) og flere kørsler kan være passende. For ekstremt skrøbelige væv, kan papirhåndklæder ødelægge vævet. I dette tilfælde kan vævet placeres på en plastikoverflade for at fjerne nogle overskydende HBSS. - Juster indstillingerne for vibratome. Følgende indstillinger anvendes: skæretykkelse = 250 μm, amplitude = 3,00 mm, udskæringshastighed = 0,01-0,25 mm/s og klingevinkel = 15°-21°.
BEMÆRK: Optimer udskæringsindstillingerne afhængigt af vævets stivhed. Blødere væv er lettere at skære med en dybere klingevinkel ved lavere hastighed. En klingevinkel på 18°, skærehastigheden mellem 0,10-0,18 mm/s og en amplitude på 3,00 mm fungerer godt til tumorer med musen 4T1 og PDX HCI010. Stivere væv kan skæres med en hurtigere klingehastighed. - Indstil start- og slutplaceringerne af klingen, og juster højden på scenen. Kør instrumentet med kontinuerlig tilstand for at skære skiver i flere cyklusser, indtil vævene er skåret ensartet.
- Fortsæt med at skære i vævet. Overfør skiverne sammen med en lille mængde HBSS buffer på cellekulturindsatsen med medium med en bredspidset overførselspipette ved hjælp af sugning til at løfte hele skiven. Placer et udsnit pr. skær på en 24 brøndplade. En indsats for 6 godt plader kan rumme op til fire skiver til en replikat assay.
BEMÆRK: Hvis den sidste kant af vævsskiven stadig er fastgjort til det uslebne væv, skal vibratomen stoppes, og vævsskiven adskilles med to par fine spidspincet uden at røre ved eller stikke vævsskiverne. Et separat barberblad kan være nyttigt til at fjerne hængende væv. - Fjern overskydende buffer med en fin spids overførsel pipette.
- Når klingen når tæt på det limede væv, skal du stoppe instrumentet, sænke trinnet, fjerne det afstivede væv med en separat klinge og montere et nyt væv. Fortsæt med at skære, indtil der er indsamlet nok udsnit.
- Kultur pladerne i en befugtet inkubator sat til 37 °C, 5% CO2. Vævsskiverne dyrkes ved den luft-flydende interfase på cellekulturindsatsen. Vævsskiverne er klar til forsøg 24-48 timer efter den første skiveforberedelse. For langsigtet dyrkning, udveksle mediet hver 2-3 dage.
2. Måling af rentabilitet
- Til levedygtighedsmåling af vævsskiven skal mediet udskiftes med et luminescensbaseret reagens med levedygtighedsmåling, der indeholder både luciferase og prosubstat ved 1:1.000 fortynding i TSC-mediet efter fabrikantens anvisninger. Reagenset måler reduktionsaktiviteten af levende celler af metaboliseret prosubstat til luciferin11. 50 μL enzymsubstratblandes oven på hver vævsskive.
- Inkuber med let omrøring på en orbital shaker placeret inde i en befugtet inkubator indstillet til 37 °C med 5% CO2 natten over.
- Selvlysende signaler kan måles ved hjælp af enten en mikropladelæser eller et in vivo-billedbehandlingsinstrument til væv, der er dyrket i en 24 brøndplade. For at måle den individuelle levedygtighed af flere væv på en 6 brøndplade bør der anvendes et in vivo-billeddannelsessystem.
- Når du bruger en mikropladelæser, skal du indstille mikropladen uden låget. Enhver type mikropladelæser, der er i stand til at måle selvlysende intensitet, bør være egnet til forsøget. Vi brugte følgende indstillinger: læs tid = 1 s, måling fra toppen, gevinst = 200.
BEMÆRK: For at opnå større nøjagtighed skal du bruge en mikroplade med hvid væg til at sætte eksperimentet op. Hvid-væg, klar-bund 24 godt plader er blevet testet, og i de fleste tilfælde, klare godt plader ikke kompromittere resultaterne. - Når du bruger et in vivo-billedbehandlingssystem til at måle levedygtigheden, skal pladen placeres midt på scenen og låget fjernes. Anskaf normale fotografiske billeder efterfulgt af selvlysende billeder med et område med indstilling ved C, automatisk eksponeringstid, f-stop = 1, objektiv indstilling som mikroplade med emnehøjde = 0,0 cm.
- Kvantificer den selvlysende intensitet ved hjælp af billedbehandlingssoftwaren ledsaget af in vivo-billedsystemet. Tegn ensartede interesseområder (ROI) omkring hver vævsskive. Denne protokol bruger en cirkel med en diameter på 1 cm som roi (se figur 1). Mål områdets samlede flux (p/s).
- Når du bruger en mikropladelæser, skal du indstille mikropladen uden låget. Enhver type mikropladelæser, der er i stand til at måle selvlysende intensitet, bør være egnet til forsøget. Vi brugte følgende indstillinger: læs tid = 1 s, måling fra toppen, gevinst = 200.
3. Evaluering af narkotikaeffekt på vævsskiverne
- Baseline måles forud for behandlingen ved hjælp af det luminescensbaserede rentabilitetsmålingsreagens som forklaret i afsnit 2.
BEMÆRK: Hvis flere væv har betydeligt lavere levedygtighed i forhold til andre, udelade væv fra analysen. - Opløs lægemidler i dimethylsulfoxid (DMSO) for at lave stamopløsninger. Der fremstilles en 10x lægemiddelopløsning med TSC eller et andet dyrkningsmedium (25 μL/brønd for en 24 brøndplade, der indeholder 250 μL medium) ved de ønskede koncentrationer. Til kontrol af køretøjet skal der fremstilles et medium, der indeholder et tilsvarende volumen Af DMSO.
- Suppler 10x stof løsning til kulturmediet i bunden af brønden. Bland ved pipettering og overførsel 50 μL af mediet oven på vævene.
BEMÆRK: Hvis der er flere vævsskiver til rådighed, skal dubletter eller treeksemplarer testes for hver betingelse. - Inkuber natten over med blidt omrystning på en orbitalshaker i en 37 °C, 5% CO2,befugtet inkubator.
- Pladen fjernes fra rystemaskinen, og inkuber statisk i 37 °C, 5% CO2,befugtet inkubator.
- På de ønskede tidspunkter måles den selvlysende intensitet fra vævene ved hjælp af en mikropladelæser eller et in vivo-billedbehandlingssystem. Normalt, narkotika effekter bliver påviselige efter 1-6 dages behandling.
BEMÆRK: Det luminescensbaserede levedygtighedsreagens er stabilt i mindst 3 dage under dyrkningsforhold. Substratet kan dog være forarmet under analysen afhængigt af vævets metaboliske aktivitet. Hvis et signifikant signalfald observeres i væv med tidligere høje signaler, supplere substratet i alle brøndene. - Beregn den resterende levedygtighed af det behandlede tumorvæv ved hjælp af følgende ligning:
Levedygtigheden af det behandlede væv er normaliseret ved sin baseline levedygtighed og levedygtighed skift af kontrol tumorvæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi en time-kursus, flere drug effekt evaluering protokol for tumorvæv skiver fremstillet af mus 4T1 bryst tumor væv og en brystkræft PDX model, HCI01012. Vi har med succes forberedt væv skiver fra flere mus-afledte tumorer, PDX, og friske patient tumorer10. Den overordnede arbejdsgang for tumorvævspræparatet og lægemiddeleffektivitetstesten er beskrevet i figur 1. Generelt kunne vi forberede 20-40 vævsskiver fra en enkelt bulk tumor på 1.000-1.500 mm3 i volumen.
Til levedygtighedsmålinger udnyttede vi et selvlysende, levende cellekompatibelt rentabilitetsreagens. Behandling af en multi-kinase hæmmer, staurosporin, ved 1 μM koncentration i 4 dage reduceret signalintensiteten med 100x, sammenlignet med tumorvæv behandlet med DMSO kontrol (Figur 2A). Vævsskiverne fremstillet af 4T1 tumoren blev opretholdt i mindst 21 dage med lejlighedsvis medium udveksling (Figur 2B). De fleste af lægemidlet respons målinger blev udført inden for 7 dage fra væv skive forberedelse. Da det levende cellekompatible reagens ikke kræver behandling eller fiksering før måling, gav det os mulighed for at udføre tidsforløbsmålinger. Tidsafhængige ændringer i levedygtigheden af tumorvævsskiver fra det identiske 4T1 tumorvæv er sammenfattet i figur 2C. Staurosporin ved 500 nM faldt luminescens fra dag 1 og nåede det laveste niveau på dag 4, forbliver lav for hvert efterfølgende tidspunkt. I modsætning hertil forblev den selvlysende intensitet fra kontrolgruppen af væv suppleret med DMSO stabil indtil dag 6. Derudover blev vævsskiver fremstillet af identiske 4T1 tumorer behandlet med serielle doser af staurosporin (0-1 μM) i 4 dage og viste dosisafhængige ændringer i levedygtighed og EF50 (Figur 2D).
Vi testede kemoterapeutiske lægemidler på væv skiver fremstillet af en ortopisk PDX model af brystkræft, HCI010. PDX vævsskiver blev behandlet med doxorubicin, et standard kemoterapeutisk lægemiddel, ved doser på 0-5 μM i 6 dage, hvilket giver dosisafhængige ændringer i levedygtighed (Figur 3A). Yderligere, effekten af 17 lægemidler, herunder prækliniske og klinisk godkendte lægemidler, blev testet i tre eksemplarer på væv skiver fremstillet af en enkelt bulk HCI010 tumor. Stofferne blev påført ved 0,5 μM i 4 dage i tre eksemplarer (figur 3B). Disse resultater giver proof-of-concept, at medium-throughput narkotika screening kan udføres på tumor skiver med indfødte TME.
Figur 1: Skema, der viser vævsstofpræparat efterfulgt af lægemiddeleffektivitetsevaluering. Tumorvæv blev forarbejdet til skiver med en diameter på 6 mm og 250 μm tykt og dyrket i den luftvæskeindfase med støtte fra cellekulturindsatser. Vævslevedygtighed blev målt ved hjælp af et bioluminescerende reagens både før og efter lægemiddelbehandling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Måling af vævsskivens levedygtighed og respons på stofferne. (A) Repræsentative billeder af luminescensbaserede levedygtighedsmålinger i brysttumorvævsskiver. Vævsskiver fra 4T1 tumor blev inkuberet med 1 μM staurosporin eller DMSO-kontrol sammen med selvlysende levedygtighed assay reagens i 4 dage. Billeder blev opnået ved hjælp af en in vivo imaging system og analyseret af ledsagende billedanalyse software. Røde cirkler angiver investeringsafkastet målt for bioluminescens. Bund = Et plot, der viser selvlysende signal fra tumorvæv skiver behandlet med staurosporin eller kontrol som målt ved en in vivo imaging system. Bjælken angiver middelværdien af de fire vævsskiver, der vises som cirkler (kontrol) eller kvadratisk (staurosporinbehandlet). (B) Et plot, der viser levedygtigheden af 4T1 tumorvæv skiver dyrket i 21 dage fra forberedelse. Levedygtigheden på dag 21 målt ved hjælp af et in vivo-billedbehandlingssystem blev normaliseret til dag 3. Hver prik angiver måling fra et enkelt udsnit. bjælken angiver middelværdien. Boksen viser kvartiler, og whiskers viser minimum til maksimumværdien af målingen. CC) Tidsforløbsmålinger af vævs levedygtighed efter staurosporinbehandlingen. Levedygtigheden af vævsskiver fra 4T1 tumor behandlet med staurosporin (500 nM) eller tilsvarende volumen af DMSO som en kontrol blev målt over tid. Luminescensintensiteter blev målt af en mikropladelæser over de angivne tidspunkter. Hver prik illustrerer et datapunkt fra en individuel vævsskive, og søjlegrafen angiver gennemsnitlig ± SEM. (D) Dosisafhængig behandling af staurosporin på vævsskiver. Væv skiver fremstillet af 4T1 tumor blev suppleret med serielle doser af staurosporin eller DMSO som et køretøj kontrol. Den resterende levedygtighed baseret på luminescens blev målt ved et in vivo-billeddannelsessystem 4 dage efter behandlingsstart. Relativ levedygtighed blev beregnet ved hjælp af den ligning, der er vist i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Drug skærm i væv skiver fremstillet af en brystkræft PDX model. (A) Et plot, der viser ændringer i levedygtigheden som reaktion på forskellige doser doxorubicin. Vævet skiver blev udarbejdet fra en ortopisk brystkræft PDX tumor, HCI010. Levedygtighedblev målt i skiver behandlet med titreret doser af doxorubicin. Efter 6 dage blev luminescens målt ved hjælp af et in vivo-billedsystem. Bar = betyder ± SEM. (B) En lille kemoterapeutiske stof skærm på tumorvæv skiver fra en ortopisk brystkræft PDX tumor. Søjlegrafen = middel ± SEM af treeksemplarseksperiment. Disse data er tidligere blevet offentliggjort10. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Materiale | Ml | Endelig koncentration | Lager |
| William's Medium E | 500 | ||
| Nicotinamid | 6 | 12 mM | 1 M lager af nicotinamid i Williams' Medium E, steriliseret |
| Ascorbinsyre | 6 | 50,4 μg/ml | 0,21 g/50 ml (>10 mM lager) ascorbinsyre i William's Medium E, steriliseret |
| Natriumbicarbonat | 15 | 2,25 mg/ml | 7,5% (w/v) opløsning |
| HEPES-buffer | 10 | 20 mM | 1 M lagerløsning |
| Glukose | 10 | 5 mg/ml | 250 mg/ml lager, steraliseret |
| Natriumpyruvat | 5 | 1 mM | 100 mM lager |
| L-Glutamin | 5 | 2 mM | 200 mM lager |
| ITS + Forblanding | 5 | Indeholder humant rekombinant insulin, humantransferrin (12,5 mg hver), selensyre (12,5 μg), BSA (2,5 g) og linolsyre (10,7 mg) | |
| Penicillin-Streptomycin | 2 | 40 IE/ml Pen, 40 μg/mL Strep | 10.000 IE/ml Pen, 10.000 μg/mL Strep |
| Rekombinant EGF | 0.5 | 20 ng/ml | 20 μg/ml lager |
Tabel 1: TSC medium opskrift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, Vi viser en platform for kvantitative, og real-time drug effektivitet undersøgelser på organotypic tumorvæv skiver. Vævsskivekultursystemet giver klare fordele i forhold til traditionelle cellebaserede in vitro-metoder ved at opfange celleheterogenitet og fysiologiske egenskaber af det oprindelige tumormikromiljø. Denne platform muliggør også højere gennemløb for test af lægemiddeleffektivitet, hvilket bidrager til at bygge bro mellem cellekulturstudier og in vivo-eksperimenter.
For at opnå nøjagtige og ensartede resultater, Er det bydende nødvendigt at minimere vævsskader under forberedelse. Vævsskiver skal håndteres med brede spidsplastpipetter for at undgå skader forårsaget af fysisk kontakt. Dyrkningsmediets volumen skal opretholdes, således at vævsskiven kan komme i kontakt med både luft og medium under hele forsøget.
Dyrkningsmediet skal optimeres afhængigt af vævstypen og det eksperimentelle formål. Det TSC-medium, der anvendes i denne protokol, er et serumfrit medium, der oprindeligt blev udviklet til primær hepatocytkultur13. Dette medie er også blevet brugt til at opretholde flere typer af tumorer, herunder bryst, lever, kolon, og bugspytkirtel10. Endvidere viste vi forbedret immuncelleoverlevelse ved hjælp af et optimeret DMEM-baseret medium10. Vibratome indstillinger bør optimeres baseret på væv tekstur for at opnå intakt og ensartet tumorvæv skiver. Udskæring blødere og / eller løst konsolideret væv er typisk gjort lettere ved hjælp af dybere klinge vinkler, langsommere skærehastighed, og tykkere skiver. Lejlighedsvis, væv er for bløde til at skære, i hvilket tilfælde forskere bør overveje indlejring af væv i lavt smeltepunkt agarose, en teknik fælles i hjernevæv udskæring14,15.
Tidligere, flere undersøgelser indført terapeutiske drug test tilgange på dyrkede væv skiver. Disse undersøgelser var baseret på fluorescerende indlemmelse, immunhistokemi eller MTT-analyser til vurdering af vævslevedygtighed6,7,8,9. I denne protokol brugte vi luminescens-baserede, levende celle-kompatible reagens RealTime-Glo11 til levedygtighed måling. Luminescensbaserede analyser har flere fordele i forhold til tidligere anvendte metoder, herunder øget følsomhed, bredere signalområde og evnen til hurtigt at foretage realtidsmålinger. Måletiden er kort for både mikropladelæsere (~1 s/well) og et in vivo-billedsystem (~1 min/plade) og kan give signalintensitetsaflæsninger direkte med minimal behandling. Hurtigere erhvervelse af signalet og færre efterbehandlingstrin er nødvendige elementer i screening af lægemidler med høj gennemløb, hvilket gør det muligt at foretage luciferinbaserede levedygtighedsmålinger for at muliggøre en langt større prøveoverførselsgrad i vævsskivekulturen. Mens en luciferase-baseret analyse giver en nøjagtig, kvantitativ måling af hele skiven slevedygtighed, det er ude af stand til at opdage narkotika-induceret celletype-specifikke ændringer i vævet. Koblingsluminescensbaserede levedygtighedsmålinger med slutpunkt IHC på samme vævsskive vil dog muliggøre celletypespecifikke målinger.
Mens væv skive kultur system er et kraftfuldt værktøj i at bringe tumorvæv kompleksitet til en høj-throughput screening platform, det har flere ulemper. Iboende heterogenitet i en tumor væv kan forårsage differentieret lægemiddel respons blandt væv skiver selv fra samme bulk tumor. Nogle gange observerede vi relativt store variationer i lægemiddelrespons blandt vævsskiver i vores eksperimenter. Vi kan delvist overvinde denne variation ved at gennemsnit flere væv skiver udarbejdet fra forskellige steder inden for samme tumor. Selv om vævsskiverkulturen kan opretholdes på baselineniveau i mindst 21 dage (figur 2B), ændrer cellepopulationerne sig over tid. Vi har beskrevet forskydninger i immuncellepopulationen i løbet af vævsskivens dyrkningseksperimenter10. Derfor anbefaler vi vævsskiver undersøges over kortere dyrkningstidsintervaller for at opsummere indfødte vævsegenskaber.
Væv skive kultur er klar til at udfylde et kritisk hul i narkotika opdagelse og udvikling mellem høj gennemløb cellekultur screening og dyreforsøg. Hundredvis af lægemidler kan evalueres på skiver fremstillet af en enkelt tumor biopsi, tilføje øget fysiologisk relevans forud for dyreforsøg. Dette system kan bidrage til at reducere antallet af dyreforsøg, der er nødvendige for at bringe lægemidler på markedet. Endvidere, væv skiver fremstillet af patient tumorer har informativpotentiale i vejledende behandlingsplaner i klinikken. Over hundrede terapeutiske lægemidler er tilgængelige i dag, men der er få biomarkører til at guide deres valg. Desuden fører heterogenitet hos patienter også til forskelle i respons. Væv skiver fra en patient biopsi kan bruges til at teste flere lægemidler før behandling systemisk, giver værdifulde oplysninger om lægemidlets effektivitet inden for en uges tid. Samlet set real-time og hurtig test ning af lægemidler ved hjælp af væv skive kultur systemer har et stort potentiale i kræft stof udvikling og terapeutiske beslutninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] og Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536). Vi vil gerne takke Dr. Alana Welm (University of Utah) for at give brystkræft PDX tumor. Vi vil også gerne takke personalet på Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) for vedligeholdelse af PDX model og medlemmer af Gujral lab for nyttige diskussioner. N.N.A er støttet af JSPS Overseas Research Fellowship og tværfaglig uddannelse Tilskud fra FHCRC. A.J.B. understøttes af kromosommetabolismen og kræfttræningstilskuddet fra FHCRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
- Klemm, F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. Failures in Phase III: Causes and Consequences. Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment. Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).
- van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86 (2006).
- Nagaraj, A. S., et al. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. Journal of Visualized Experiments. (141), e58569 (2018).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. BMC Cancer. 16, 78 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sivakumar, R., et al. Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery. Oncoimmunology. 8 (12), 1670019 (2019).
- Duellman, S. J., et al. Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Lazaro, C. A., et al. Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).
- Chadwick, E. J., et al. A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2015).
- Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. Journal of Visualized Experiments. (105), e53304 (2017).
