Summary
हम ऑर्गानोटिपिक ट्यूमर ऊतक स्लाइस में वास्तविक समय दवा प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल शुरू करते हैं। यहां उल्लिखित प्रायोगिक रणनीति पूर्व वीवो स्थितियों में नैदानिक या माउस ट्यूमर से प्राप्त ऊतक स्लाइस पर मध्यम उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीन को पूरा करने के लिए एक मंच प्रदान करती है।
Abstract
ट्यूमर ऊतक कैंसर कोशिकाओं, घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट, और बाह्युशिएबल मैट्रिक्स से बना रहे हैं। यह जटिल परिवेश ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट (TME) का गठन करता है और वीवो या ड्रग रिस्पांस एक्स वीवो में चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया को मिलासकता है। पारंपरिक कैंसर दवा डिस्कवरी स्क्रीन एक मोनोलेयर में सुसंस्कृत कोशिकाओं पर किया जाता है, एक प्रणाली गंभीर रूप से TME के प्रभाव की कमी है । इस प्रकार, शारीरिक TME के साथ संवेदनशील और उच्च थ्रूपुट परखों को एकीकृत करने वाली प्रायोगिक प्रणालियां प्रीक्लीनिकल ड्रग खोज प्रक्रिया को मजबूत करेंगी। यहां, हम मध्यम उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए एक मंच के रूप में पूर्व वीवो ट्यूमर ऊतक टुकड़ा संस्कृति शुरू करते हैं । ऑर्गानोटिक ऊतक स्लाइस संस्कृति ठीक-कट, पतली ट्यूमर वर्गों का गठन करती है जो तरल-वायु इंटरफ़ेस में एक छिद्रपूर्ण झिल्ली के समर्थन से बनाए रखी जाती है। इस प्रोटोकॉल में, हम रोगी-व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) मॉडल से माउस ट्यूमर और ट्यूमर से तैयार ऊतक स्लाइस की तैयारी और रखरखाव का वर्णन करते हैं। दवा उपचार के जवाब में ऊतक व्यवहार्यता में परिवर्तन का आकलन करने के लिए, हमने एक जैव संगत ल्यूमिनेसेंस-आधारित व्यवहार्यता परख का लाभ उठाया जो ऊतक में व्यवहार्य कोशिकाओं के वास्तविक समय, तेजी से और संवेदनशील माप को सक्षम बनाता है। इस प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके, हमने मल्टी-काइनेज अवरोधक, स्तारोस्पोरिन और साइटोटॉक्सिक एजेंट, डोक्सोरुबिसिन के लिए ऊतक स्लाइस की खुराक-निर्भर प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया। इसके अलावा, हम एक ही पीडीएक्स ट्यूमर से तैयार ऊतक स्लाइस पर 17 नैदानिक और प्रीनैदानिक दवाओं की स्क्रीनिंग करके पूर्व वीवो फार्माकोलॉजी के लिए ऊतक स्लाइस के आवेदन को प्रदर्शित करते हैं। हमारे शारीरिक रूप से प्रासंगिक, अत्यधिक संवेदनशील, और मजबूत पूर्व वीवो स्क्रीनिंग मंच प्रीक्लिनिकल ऑन्कोलॉजी दवा खोज और उपचार निर्णय लेने को बहुत मजबूत करेगा।
Introduction
आसपास के स्ट्रोमल ऊतक के भौतिक और जैव रासायनिक गुणों के साथ कैंसर सेल बातचीत TME बनाती है। TME ट्यूमर के विकास को प्रोत्साहित कर सकते हैं, मेटाटैसिस, और चिकित्सा1के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया मिलाना । पारंपरिक प्रीक्लीनिकल दवा विकास में, दवा उम्मीदवारों को आम तौर पर पहली बार सुसंस्कृत कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करके जांच की जाती है, एक परख मंच जिसमें गंभीर रूप से TME2का अभाव है। सेल आधारित प्रीस्क्रीनिंग चरणों में शारीरिक TME की यह कमी ट्यूमर असर पशु मॉडल में प्रभावी एजेंटों की खोज को सीमित कर सकते है और विकास के बाद नैदानिक चरणों में कई होनहार ऑन्कोलॉजी दवाओं की उच्च उदासीनता दर में योगदान कर सकते हैं3।
ट्यूमर दवा प्रतिक्रियाओं को मॉड्यूल करने में TME के महत्व के बावजूद, प्रयोगात्मक बाधाएं दवा खोज और विकास के प्रारंभिक दौर के दौरान अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रणालियों के आवेदन को सीमित करती हैं। पशु मॉडल या रोगी ट्यूमर नमूनों से ट्यूमर पर चिकित्सकीय एजेंटों के सैकड़ों स्क्रीन करने के लिए अव्यावहारिक है। दरअसल, सर्जिकल नमूने विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ दुर्लभ संसाधन हैं और पशु मॉडल में हजारों उम्मीदवार अणुओं की स्क्रीनिंग प्रायोगिक पैमाने, लागत और पशु कल्याण के कारण व्यवहार्य नहीं है।
ट्यूमर ऊतक टुकड़ा संस्कृति, जहां ठीक कटौती, पतली ट्यूमर वर्गों पूर्व vivo सुसंस्कृत हैं, दवा स्क्रीनिंग assays में शारीरिक TME की सीमा को संबोधित कर सकते हैं । ऐतिहासिक रूप से, तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र ने बीड़ा उठाया और मस्तिष्क के ऊतकों4के लिए स्लाइस संस्कृति का व्यापक अनुकूलन किया। हाल ही में, कई अध्ययनों ने सेल लाइन-व्युत्पन्न ट्यूमर, सहज ट्यूमर मॉडल, रोगी-व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स), और प्राथमिक रोगी ट्यूमर सहित विभिन्न प्रकार के ट्यूमर ऊतकों से स्लाइस तैयार करने का प्रदर्शन किया है। पूर्व वीवो टिश्यू स्लाइस कल्चर वीवो और इन विट्रो कल्चर5दोनों से लाभ को एकीकृत करता है । ट्यूमर ऊतक स्लाइस बरकरार ऊतक वास्तुकला और विविध सेल संरचना को बनाए रखने, TME संदर्भ के भीतर कैंसर की कोशिकाओं के अध्ययन को सक्षम करने ।
यह प्रोटोकॉल दवा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए वास्तविक समय, अत्यधिक संवेदनशील व्यवहार्यता परख के साथ संयुक्त एक ऑर्गानोटिक ट्यूमर ऊतक स्लाइस संस्कृति प्रणाली का परिचय देता है। पहले शुरू किए गए प्रोटोकॉल में ऑर्गानोटिक ट्यूमर ऊतक स्लाइस पर दवा प्रभावकारिता परीक्षण फ्लोरोसेंट डाइक समावेश, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी), या एमटीटी ((3-[4, 5-डिमेथिलथियाजोल-2-इल] -2, 5 डिफेनाइल टेट्राजोलियम ब्रोमाइड द्वारा सेल व्यवहार्यता में परिवर्तन को मापने पर भरोसाकरते,7,8,9हैं। हालांकि, इन तरीकों के सभी अंतिम बिंदु परख कर रहे है और कम संवेदनशीलता, लंबे प्रसंस्करण समय, जटिल डेटा विश्लेषण, संकीर्ण संकेत रेंज, और उच्च प्रयोगात्मक त्रुटि से पीड़ित हैं । हमारा ल्यूमिनेसेंस-आधारित लाइव सेल-संगत रिएजेंट पूर्व प्रसंस्करण और न्यूनतम पोस्ट प्रोसेसिंग के बिना एक विस्तृत सिग्नल रेंज और तात्कालिक (~ 5 मिन) माप प्रदान करके इन परखों में सुधार करता है। यह अभिकर्ता अत्यधिक संवेदनशील है और सेल संस्कृति मीडिया में एक साथ रह सकता है, जिससे सेल व्यवहार्यता के निरंतर और समय-पाठ्यक्रम माप की अनुमति मिलती है। यह परख प्रणाली प्रीक्लीनिकल दवा विकास में ऊतक स्लाइस पर दवा उम्मीदवारों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग पर लागू होती है।
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Protocol
पशु कल्याण अधिनियम की प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों और जैव चिकित्सा अनुसंधान में पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य दिशानिर्देश संस्थानों में सभी माउस प्रयोग किए गए थे ।
1. ट्यूमर ऊतक स्लाइस की तैयारी
- तालिका 1में नुस्खा के बाद ऊतक टुकड़ा संस्कृति (TSC) माध्यम तैयार करें । बंध्याकरण करने के लिए 0.45 माइक्रोन वैक्यूम फिल्टर यूनिट के साथ माध्यम को फ़िल्टर करें।
- Aliquot 24 अच्छी तरह से थाली के लिए प्रति अच्छी तरह से टीएससी माध्यम के 250 μL, या एक 6 अच्छी तरह से थाली के लिए प्रति अच्छी तरह से मध्यम के 1 mL। उपयोग तक प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 आर्द्र इनक्यूबेटर में रखें।
नोट: माध्यम और पूरक ऊतक प्रकार और प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है। मध्यम की मात्रा सिर्फ एक संस्कृति डालने की असुरक्षित झिल्ली सोख करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए । झिल्ली के स्तर से अधिक न करें। मध्यम मात्रा को समायोजित करें यदि मध्यम स्तर बहुत कम या बहुत अधिक है। यदि शोधकर्ता इम्यूनोमोडुलेटरी एजेंटों का परीक्षण कर रहे हैं, तो हम आईएल-210के साथ माध्यम के पूरक की सलाह देते हैं। - यदि चूहों से प्राप्त ट्यूमर ऊतक का उपयोग करते हैं, तो चूहों को अनुशंसित प्रक्रिया के साथ इच्छामृत्यु दें, 70% इथेनॉल छिड़ककर चूहों की उजागर त्वचा को साफ करें, और एसेप्टिक तकनीकों के साथ ट्यूमर को काटदें। ट्यूमर ऊतक को बर्फ-ठंडा हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएस) वाली ट्यूब में स्टोर करें।
- यदि ताजा रोगी ट्यूमर ऊतकों का उपयोग कर, अल्पावधि के लिए बर्फ ठंडे HBSS में स्टोर, या बर्फ ठंड बेल्जर विस्कॉंसिन विश्वविद्यालय (UW) लंबे समय तक भंडारण के लिए समाधान (24 घंटे तक) ऊतक व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए ।
नोट: बर्फ-ठंडा UW समाधान में रातोंरात भेजे गए पीडीएक्स ऊतक के स्लाइस सफलतापूर्वक तैयार किए गए हैं। - ट्यूमर ऊतक को बर्फ-ठंडा एचबीएसयुक्त 10 सेमी कल्चर प्लेट में स्थानांतरित करें। बर्फ-ठंडे एचबीएसएस में डूबे हुए स्केलपेल के साथ ट्यूमर को आधा हिस्सों में काट ें। एक 6 मिमी व्यास बायोप्सी पंच का उपयोग कर सिलेंडरों में ट्यूमर ऊतकों आकार और एक फ्लैट सतह बनाने के लिए एक तरफ ट्रिम । ऊतकों को उपयोग तक बर्फ-ठंडा एचबीएसएस में स्टोर करें।
नोट: ऊतक के परिगलित क्षेत्र को शामिल करने से बचें, जो आम तौर पर केंद्र में होता है और इसमें अपारदर्शी और नाजुक उपस्थिति होती है। - वाइब्रेटोम की स्थापना करें। 70% इथेनॉल का उपयोग करके सभी उपकरणों को कीटाणुरहित करें। वाइब्रेटोम आइस बाथ के केंद्र में एक्रेलिक ग्लास ढक्कन से ढके वाइब्रेटोम बफर ट्रे को रखें। बर्फ स्नान करने के लिए बर्फ जोड़ें और ठंडा HBSS के साथ बफर ट्रे को भरने के लिए ऊतक शांत रखने के लिए टुकड़ा करने की क्रिया । ब्लेड धारक के लिए एक रेजर ब्लेड संलग्न करें।
नोट: हालांकि एक अर्धनग्न वातावरण में वाइब्रेटोम रखने से पूर्व प्रयोगों को प्रभावित नहीं किया गया है, लेकिन यदि उपलब्ध हो तो वाइब्रेटोम को बायोसेफ्टी कैबिनेट के तहत स्टोर करने की सिफारिश की जाती है। - ध्यान से दांतेदार संदंश का उपयोग करएचएसएस से एक बायोप्सी मुक्का मारा ट्यूमर ऊतक उठा और एक लिंट मुक्त कागज तौलिया के साथ ऊतक dabbing द्वारा अतिरिक्त बफर को दूर ।
- नमूना प्लेट पर चिकित्सा ग्रेड साइनोक्रिलेट गोंद की एक बूंद रखें और ऊतक को इस बूंद पर रखें। हवा में गोंद को 2-3 मिन के लिए सुखा लें और प्लेट को बफर ट्रे में रखें। कुछ एचबीएसएस के साथ पूरक जब तक ऊतक पूरी तरह से बफर में डूब जाता है।
नोट: एक ईमानदार, स्थिर स्थिति में बढ़ते ऊतकों समान रूप से कटौती स्लाइस उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि घुड़सवार ऊतक अस्थिर हैं, तो या तो एक ईमानदार स्थिति बनाए रखने या ऊतक को उतारने के लिए आसपास के ऊतकों में अधिक गोंद जोड़ें, नीचे समतल करें, और इसे फिर से गोंद करें। लोचदार ऊतक ों को टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान अधिक आसानी से धक्का दिया जाता है और अधिक आसानी से झुक जाते हैं, जिसस्थिति में छोटी लंबाई (& 5 मिमी) और कई रन उपयुक्त हो सकते हैं। बेहद नाजुक ऊतकों के लिए, कागज तौलिए ऊतक को नष्ट कर सकते हैं। इस मामले में, ऊतक को कुछ अतिरिक्त एचबीएसएस को दूर करने के लिए प्लास्टिक की सतह पर रखा जा सकता है। - वाइब्रेटोम सेटिंग्स को समायोजित करें। निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग किया जाता है: मोटाई काटना = 250 माइक्रोन, आयाम = 3.00 मिमी, टुकड़ा करने की क्रिया गति = 0.01-0.25 मिमी/एस, और ब्लेड कोण = 15 ° -21°।
नोट: ऊतक की कठोरता के आधार पर टुकड़ा करने की क्रिया सेटिंग्स का अनुकूलन करें। नरम ऊतकों को कम गति पर गहरे ब्लेड कोण के साथ अधिक आसानी से काटा जाता है। 18 डिग्री का एक ब्लेड कोण, 0.10-0.18 मिमी/एस के बीच गति काटना, और माउस 4T1 और PDX HCI010 ट्यूमर के लिए 3.00 मिमी का एक आयाम अच्छी तरह से काम करता है। स्टिमर ऊतक को तेज ब्लेड गति के साथ काटा जा सकता है। - ब्लेड की शुरुआत और अंत स्थानों को सेट करें और चरण की ऊंचाई को समायोजित करें। ऊतकों को समान रूप से काटने तक कई चक्रों के लिए स्लाइस काटने के लिए निरंतर मोड के साथ उपकरण चलाएं।
- ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया जारी रखें। पूरे स्लाइस को उठाने के लिए सक्शन का उपयोग करके, सेल संस्कृति पर एचबीएसएस बफर की एक छोटी राशि के साथ स्लाइस को सेल संस्कृति डालने पर स्थानांतरित करें। 24 अच्छी प्लेट पर प्रति सम्मिलित एक टुकड़ा रखें। 6 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए एक डालने के लिए एक दोहराने परख के लिए चार स्लाइस को समायोजित कर सकते हैं ।
नोट: यदि ऊतक टुकड़ा का अंतिम किनारा अभी भी अनकट ऊतक से जुड़ा हुआ है, तो वाइब्रेटोम को रोकें और ऊतक स्लाइस को छूने या पोकिंग किए बिना ठीक टिप संदंश के दो जोड़े के साथ ऊतक टुकड़ा अलग करें। हैंगिंग टिश्यू को हटाने में एक अलग रेजर ब्लेड उपयोगी हो सकता है। - एक ठीक टिप हस्तांतरण पिपेट के साथ किसी भी अतिरिक्त बफर निकालें।
- जब ब्लेड चिपके ऊतकों के करीब पहुंचता है, तो उपकरण को रोकें, मंच को कम करें, एक अलग ब्लेड के साथ कठोर ऊतक को हटा दें, और एक नए ऊतक को माउंट करें। पर्याप्त स्लाइस एकत्र किए जाने तक टुकड़ा करने की क्रिया जारी रखें।
- 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर सेट एक आर्द्र इनक्यूबेटर में प्लेटों संस्कृति। ऊतक स्लाइस सेल संस्कृति डालने पर हवा तरल इंटरचरण में सुसंस्कृत हैं। ऊतक स्लाइस प्रारंभिक स्लाइस तैयार करने के बाद 24-48 घंटे प्रयोगों के लिए तैयार हैं। लंबी अवधि की खेती के लिए, हर 2-3 दिनों में माध्यम का आदान-प्रदान करें।
2. व्यवहार्यता माप
- ऊतक टुकड़ा की व्यवहार्यता माप के लिए, निर्माता के निर्देशों के बाद टीएससी माध्यम में 1:1,000 कमजोर पड़ने पर ल्यूसिफ़ेरेज और प्रोसुब्रेट दोनों युक्त ल्यूमिनेसेंस-आधारित व्यवहार्यता माप अभिकर्ता के साथ माध्यम का आदान-प्रदान करें। अभिकर्ता मेटाबोलाइज्ड प्रोसबस्ट्रेटेट की जीवित कोशिकाओं की कमी गतिविधि को लूसिफ़ेरिन11तक मापता है । प्रत्येक ऊतक टुकड़ा के शीर्ष पर एंजाइम सब्सट्रेट मिश्रण के 50 μL स्थानांतरित करें।
- एक कक्षीय शेकर पर कोमल आंदोलन के साथ इनक्यूबेट 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक कक्षीय शकर के साथ 5% सीओ2 रातोंरात के साथ।
- ल्यूमिनेसेंट संकेतों को 24 अच्छी प्लेट में सुसंस्कृत ऊतकों के लिए या तो माइक्रोप्लेट रीडर या वीवो इमेजिंग इंस्ट्रूमेंट का उपयोग करके मापा जा सकता है। एक 6 अच्छी तरह से थाली पर कई ऊतकों की व्यक्तिगत व्यवहार्यता को मापने के लिए, एक में वीवो इमेजिंग प्रणाली का उपयोग किया जाना चाहिए।
- माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करते समय, बिना ढक्कन के माइक्रोप्लेट सेट करें। ल्यूमिनेसेंट तीव्रता को मापने में सक्षम माइक्रोप्लेट रीडर का किसी भी प्रकार प्रयोग के लिए उपयुक्त होना चाहिए। हमने निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग किया: समय = 1 एस पढ़ें, शीर्ष से माप, लाभ = 200।
नोट: उच्च सटीकता के लिए, प्रयोग स्थापित करने के लिए एक सफेद दीवार माइक्रोप्लेट का उपयोग करें। सफेद दीवार, स्पष्ट नीचे 24 अच्छी तरह से प्लेटों का परीक्षण किया गया है, और ज्यादातर मामलों में, स्पष्ट अच्छी तरह से प्लेटें परिणाम समझौता नहीं करते । - व्यवहार्यता को मापने के लिए वीवो इमेजिंग सिस्टम में उपयोग करते समय, प्लेट को मंच के केंद्र में रखें और ढक्कन को हटा दें। सी, ऑटो एक्सपोजर समय, एफ-स्टॉप = 1, विषय ऊंचाई = 0.0 सेमी के साथ माइक्रोप्लेट के रूप में उद्देश्य सेटिंग के साथ ल्यूमिनेसेंट छवियों के बाद सामान्य फोटोग्राफिक छवियों का अधिग्रहण करें।
- वीवो इमेजिंग सिस्टम के साथ इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंट तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें। प्रत्येक ऊतक टुकड़ा के आसपास ब्याज (आरओआई) के लगातार क्षेत्रों को ड्रा करें। यह प्रोटोकॉल आरओआई के रूप में 1 सेमी व्यास सर्कल का उपयोग करता है (चित्रा 1देखें)। क्षेत्र के कुल प्रवाह (पी/एस) को मापें।
- माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करते समय, बिना ढक्कन के माइक्रोप्लेट सेट करें। ल्यूमिनेसेंट तीव्रता को मापने में सक्षम माइक्रोप्लेट रीडर का किसी भी प्रकार प्रयोग के लिए उपयुक्त होना चाहिए। हमने निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग किया: समय = 1 एस पढ़ें, शीर्ष से माप, लाभ = 200।
3. ऊतक स्लाइस पर दवा प्रभाव का मूल्यांकन
- धारा 2 में समझाया गया है कि ल्यूमिनेसेंस-आधारित व्यवहार्यता माप अभिकर्ता का उपयोग करके उपचार से पहले बेसलाइन व्यवहार्यता को मापें।
नोट: यदि कई ऊतकों में दूसरों की तुलना में काफी कम व्यवहार्यता है, तो ऊतकों को परख से छोड़ दें। - स्टॉक समाधान बनाने के लिए डिमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) में दवाओं को भंग करें। वांछित सांद्रता पर टीएससी या अन्य संस्कृति माध्यम (25 μL/अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह से प्लेट के लिए 250 माइक्रोन/ वाहन नियंत्रण के लिए, डीएमएसओ के समकक्ष मात्रा वाले माध्यम को तैयार करें।
- कुएं के नीचे संस्कृति माध्यम के लिए 10x दवा समाधान पूरक। ऊतकों के शीर्ष पर मध्यम के 50 माइक्रोन को पाइपिंग और स्थानांतरित करके मिलाएं।
नोट: यदि कई ऊतक स्लाइस उपलब्ध हैं, तो प्रत्येक स्थिति के लिए डुप्लिकेट या ट्रिपलिकेट्स का परीक्षण करें। - एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,humidified इनक्यूबेटर में एक कक्षीय शेखर पर कोमल मिलाते हुए के साथ रात भर इनक्यूबेट।
- 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,आर्द्र इनक्यूबेटर में शेकर से प्लेट निकालें और स्थिर रूप से इनक्यूबेट करें।
- वांछित समय बिंदुओं पर, माइक्रोप्लेट रीडर या वीवो इमेजिंग सिस्टम में का उपयोग करके ऊतकों से ल्यूमिनेसेंट तीव्रता को मापें। आमतौर पर, दवा प्रभाव उपचार के 1-6 दिनों के बाद पता लगाने योग्य हो जाते हैं।
नोट: ल्यूमिनेसेंस आधारित व्यवहार्यता अभिकर्ता संस्कृति की स्थिति के तहत कम से कम 3 दिनों के लिए स्थिर है। हालांकि, ऊतक की मेटाबोलिक गतिविधि के आधार पर परख के दौरान सब्सट्रेट समाप्त हो सकता है। यदि पहले से उच्च संकेतों वाले ऊतकों में एक महत्वपूर्ण सिग्नल ड्रॉप देखा जाता है, तो सभी कुओं में सब्सट्रेट को पूरक करें। - निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके इलाज ट्यूमर ऊतकों की शेष व्यवहार्यता की गणना करें:
इलाज ऊतक की व्यवहार्यता इसकी बेसलाइन व्यवहार्यता और नियंत्रण ट्यूमर ऊतकों की व्यवहार्यता बदलाव से सामान्यीकृत है।
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Representative Results
यहां, हम माउस 4T1 स्तन ट्यूमर ऊतकों और एक स्तन कैंसर पीडीएक्स मॉडल, एचसीआई01012से तैयार ट्यूमर ऊतक स्लाइस के लिए एक समय-पाठ्यक्रम, कई दवा प्रभावकारिता मूल्यांकन प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। हमने कई माउस-व्युत्पन्न ट्यूमर, पीडीएक्स और ताजा रोगी ट्यूमर10से ऊतक स्लाइस सफलतापूर्वक तैयार किए। ट्यूमर ऊतक तैयार करने और दवा प्रभावकारिता परीक्षण के समग्र कार्यप्रवाह चित्र 1में वर्णित है । सामान्य तौर पर, हम वॉल्यूम में 1,000-1,500 मिमी3 के एक थोक ट्यूमर से 20-40 ऊतक स्लाइस तैयार कर सकते हैं।
व्यवहार्यता मापन के लिए, हमने एक ल्यूमिनेसेंट-आधारित, लाइव सेल-संगत व्यवहार्यता अभिकर्ता का शोषण किया। 4 दिनों के लिए 1 माइक्रोन एकाग्रता पर एक बहु-काइनेज अवरोधक, स्तारोस्पोरिन के उपचार ने डीएमएसओ नियंत्रण(चित्रा 2A)के साथ इलाज किए गए ट्यूमर ऊतकों की तुलना में सिग्नल तीव्रता को 100x तक कम कर दिया। 4T1 ट्यूमर से तैयार ऊतक स्लाइस सामयिक मध्यम विनिमय(चित्रा 2B)के साथ कम से कम 21 दिनों के लिए बनाए रखा गया । अधिकांश दवा प्रतिक्रिया माप ऊतक टुकड़ा तैयार करने से 7 दिनों के भीतर किए गए थे। क्योंकि लाइव सेल-संगत अभिकर्ता को मापसे पहले प्रसंस्करण या निर्धारण की आवश्यकता नहीं होती है, इसने हमें समय-पाठ्यक्रम माप न करने की अनुमति दी। समान 4T1 ट्यूमर ऊतक से ट्यूमर ऊतक स्लाइस की व्यवहार्यता में समय पर निर्भर परिवर्तन चित्रा 2Cमें संक्षेप में कर रहे हैं । ५०० एनएम पर Staurosporine 1 दिन से ल्यूमिनेसेंस कम हो गया और 4 दिन में सबसे निचले स्तर पर पहुंच गया, प्रत्येक बाद के टाइमपॉइंट के लिए कम शेष । इसके विपरीत, DMSO के साथ पूरक ऊतकों के नियंत्रण समूह से ल्यूमिनेसेंट तीव्रता 6 दिन तक स्थिर रही। इसके अतिरिक्त, समान 4T1 ट्यूमर से तैयार ऊतक स्लाइस 4 दिनों के लिए staurosporine (0-1 μM) की धारावाहिक खुराक के साथ इलाज किया गया, और व्यवहार्यता और चुनाव आयोग५० (चित्रा 2D)में खुराक पर निर्भर परिवर्तन दिखाया ।
हमने स्तन कैंसर, एचसीआई010 के ऑर्थोटोपिक पीडीएक्स मॉडल से तैयार ऊतक स्लाइस पर कीमोथेरेपी दवाओं का परीक्षण किया। पीडीएक्स ऊतक स्लाइस को 6 दिनों के लिए 0-5 माइक्रोएम की खुराक पर डोक्सोरुबिसिन, एक मानक कीमोथेरेपी दवा के साथ इलाज किया गया, जो व्यवहार्यता में खुराक-निर्भर परिवर्तन प्रदान करता है(चित्रा 3A)। इसके अलावा, प्रीक्लीनिकल और चिकित्सकीय अनुमोदित दवाओं सहित 17 दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण एक थोक एचसीआई010 ट्यूमर से तैयार ऊतक स्लाइस पर त्रिपाल में किया गया था । दवाओं को ट्रिपलकेट(चित्रा 3B)में 4 दिनों के लिए 0.5 माइक्रोएम पर लागू किया गया था। ये परिणाम प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट प्रदान करते हैं कि मध्यम-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग देशी TME के साथ ट्यूमर स्लाइस पर की जा सकती है।
चित्रा 1: योजनाबद्ध दिखा ऊतक टुकड़ा तैयारी दवा प्रभावकारिता मूल्यांकन के बाद । ट्यूमर ऊतकों को व्यास में स्लाइस 6 मिमी और सेल संस्कृति आवेषण के समर्थन के साथ हवा-तरल इंटरफेज में 250 माइक्रोन मोटी और सुसंस्कृत में संसाधित किया गया था। ऊतक व्यवहार्यता दवा उपचार से पहले और बाद में बायोल्यूमिनेसेंट रिएजेंट का उपयोग करके मापा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: ऊतक स्लाइस व्यवहार्यता माप और दवाओं के लिए प्रतिक्रिया । (क)स्तन ट्यूमर ऊतक स्लाइस में ल्यूमिनेसेंस आधारित व्यवहार्यता माप की प्रतिनिधि छवियां। 4T1 ट्यूमर से ऊतक स्लाइस 4 दिनों के लिए ल्यूमिनेसेंट व्यवहार्यता परख पुनः एजेंट के साथ एक साथ 1 μM staurosporine या DMSO नियंत्रण के साथ इनक्यूबेटेड थे । छवियों को वीवो इमेजिंग सिस्टम में एक का उपयोग करके प्राप्त किया गया था और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया गया था। लाल घेरे बायोल्यूमिनेसेंस के लिए मापा आरओआई का संकेत देते हैं। नीचे = ट्यूमर ऊतक स्लाइस से ल्यूमिनेसेंट संकेत दिखा एक साजिश के रूप में एक वीवो इमेजिंग प्रणाली में द्वारा मापा staurosporine या नियंत्रण के साथ इलाज किया । बार चार ऊतक स्लाइस हलकों (नियंत्रण) या वर्ग (staurosporine इलाज) के रूप में दिखाया के मतलब इंगित करता है । (ख)एक साजिश तैयारी से 21 दिनों के लिए सुसंस्कृत 4T1 ट्यूमर ऊतक स्लाइस की व्यवहार्यता दिखा । 21 दिन में व्यवहार्यता एक वीवो इमेजिंग प्रणाली में एक द्वारा मापा 3 दिन के लिए सामान्यीकृत किया गया था । प्रत्येक डॉट एक टुकड़ा से माप इंगित करता है; बार मतलब इंगित करता है; बॉक्स क्वार्टाइल्स दिखाता है, और मूंछ माप के अधिकतम मूल्य के लिए न्यूनतम दिखाते हैं। (ग)स्टेरोस्पोरिन उपचार के बाद ऊतक व्यवहार्यता का समय-पाठ्यक्रम माप। 4T1 ट्यूमर से ऊतक स्लाइस की व्यवहार्यता staurosporine (५०० एनएम) या एक नियंत्रण के रूप में DMSO के समकक्ष मात्रा के साथ इलाज समय के साथ मापा गया । ल्यूमिनेसेंस तीव्रता को संकेतित टाइमपॉइंट पर एक माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा मापा गया था। प्रत्येक डॉट एक व्यक्तिगत ऊतक टुकड़ा से एक डेटापॉइंट दिखाता है, और बार ग्राफ का मतलब ± एसईएम इंगित करता है।(डी)ऊतक स्लाइस पर स्taurosporine की खुराक-निर्भर उपचार। 4T1 ट्यूमर से तैयार ऊतक स्लाइस एक वाहन नियंत्रण के रूप में staurosporine या DMSO की धारावाहिक खुराक के साथ पूरक थे । ल्यूमिनेसेंस पर आधारित शेष व्यवहार्यता को उपचार दीक्षा के 4 दिनों में वीवो इमेजिंग सिस्टम में मापा गया था। प्रोटोकॉल में दिखाए गए समीकरण का उपयोग करके सापेक्ष व्यवहार्यता की गणना की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: स्तन कैंसर पीडीएक्स मॉडल से तैयार ऊतक स्लाइस में ड्रग स्क्रीन। (A)डोक्सोरुबिसिन की विभिन्न खुराकों के जवाब में व्यवहार्यता में परिवर्तन दिखाने वाला भूखंड। टिश्यू स्लाइस एक ऑर्थोटोपिक ब्रेस्ट कैंसर पीडीएक्स ट्यूमर, एचसीआई010 से तैयार किए गए थे । व्यवहार्यता को डोक्सोरुबिसिन की टिटेटेड खुराक के साथ इलाज किए गए स्लाइस में मापा गया था। 6 दिनों के बाद, ल्यूमिनेसेंस को वीवो इमेजिंग सिस्टम में उपयोग करके मापा गया था। बार = मतलब ± SEM.(B)एक ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर PDX ट्यूमर से ट्यूमर ऊतक स्लाइस पर एक छोटे पैमाने पर कीमोथेरेपी दवा स्क्रीन । बार ग्राफ = मतलब ± ट्रिपलिकेट प्रयोग के SEM। ये आंकड़े पहले10प्रकाशित किए गए हैं . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| सामग्री | मिलीलीटर | अंतिम एकाग्रता | भंडार |
| विलियम के मध्यम ई | 500 | ||
| निकोटिनमाइड | 6 | 12 एमएम | विलियम्स के मीडियम ई में निकोटिनमाइड का 1 एम स्टॉक, निष्फल |
| एस्कोबिक एसिड | 6 | 50.4 μg/mL | विलियम के मीडियम ई में एस्कोम्बिक एसिड का 0.21 जी/50 एमएल (>10 mM स्टॉक) निष्फल |
| सोडियम बाइकार्बोनेट | 15 | 2.25 मिलीग्राम/मिलीग्राम | 7.5% (w/v) समाधान |
| हेप्स बफर | 10 | 20 एमएम | 1 एम स्टॉक समाधान |
| ग्लूकोज | 10 | 5 मिलीग्राम/मीटर | 250 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक, स्टरलाइज्ड |
| सोडियम पायरुवेट | 5 | 1 एमएम | 100 एमएम स्टॉक |
| एल-ग्लूटामाइन | 5 | 2 एमएम | 200 एमएम स्टॉक |
| इसके + प्रीमिक्स | 5 | मानव पुनः संयोजन इंसुलिन, मानव ट्रांसफरिन (12.5 मिलीग्राम प्रत्येक), सेलेनस एसिड (12.5 माइक्रोन), बीएसए (2.5 ग्राम), और लिनोलिक एसिड (10.7 मिलीग्राम) शामिल हैं | |
| पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन | 2 | ४० आईयू/एमएल पेन, ४० μg/mL स्ट्रीप | 10,000 आईयू/एमएल पेन, 10,000 μg/mL स्ट्रीप |
| रीकॉम्बिनेंट ईजीएफ | 0.5 | 20 एनजी/एमएल | 20 μg/mL स्टॉक |
तालिका 1: टीएससी मध्यम नुस्खा।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम नक्टिविटेटिव के लिए एक मंच प्रदर्शित करते हैं, और ऑर्गानोटिपिक ट्यूमर ऊतक स्लाइस पर वास्तविक समय दवा प्रभावकारिता अध्ययन करते हैं। ऊतक टुकड़ा संस्कृति प्रणाली पारंपरिक सेल आधारित इन विट्रो तरीकों पर अलग लाभ प्रदान करता है सेल विषमता और देशी ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट की शारीरिक विशेषताओं पर कब्जा करके । यह मंच दवा प्रभावकारिता परीक्षण के लिए उच्च थ्रूपुट को भी सक्षम बनाता है, जो सेल संस्कृति अध्ययन और वीवो प्रयोगों के बीच की खाई को पाटने में मदद करता है।
सटीक और सुसंगत परिणाम प्राप्त करने के लिए, तैयारी के दौरान ऊतक क्षति को कम करना अनिवार्य है। ऊतक स्लाइस को शारीरिक संपर्क के कारण होने वाले नुकसान से बचने के लिए व्यापक टिप प्लास्टिक पिपेट के साथ संभाला जाना चाहिए। संस्कृति मध्यम मात्रा को बनाए रखा जाना चाहिए ऊतक टुकड़ा प्रयोग की अवधि के लिए हवा और मध्यम दोनों से संपर्क करने की अनुमति है ।
संस्कृति माध्यम को ऊतक प्रकार और प्रायोगिक उद्देश्य के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला टीएससी माध्यम एक सीरम-मुक्त माध्यम है जिसे मूल रूप से प्राथमिक हेपेटोसाइट संस्कृति13के लिए विकसित किया गया था। इस माध्यम का उपयोग स्तन, यकृत, पेट और अग्न्याशय10सहित कई प्रकार के ट्यूमर को बनाए रखने के लिए भी किया गया है। इसके अलावा, हमने एक अनुकूलित डीएमईएम-आधारित मध्यम10का उपयोग करके बढ़ी हुई प्रतिरक्षा कोशिका अस्तित्व का प्रदर्शन किया। कंपन सेटिंग्स को बरकरार और समान ट्यूमर ऊतक स्लाइस प्राप्त करने के लिए ऊतक बनावट के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। नरम टुकड़ा करने की क्रिया और/या शिथिल समेकित ऊतकों आम तौर पर गहरे ब्लेड कोण, धीमी काटने की गति, और मोटा स्लाइस का उपयोग करके आसान बना दिया है । कभी-कभी, ऊतकों को काटने के लिए बहुत नरम होते हैं, जिस स्थिति में शोधकर्ताओं को कम पिघलने वाले बिंदु अगारोज के भीतर ऊतक को एम्बेड करने पर विचार करना चाहिए, जो मस्तिष्क के ऊतकों में आम तकनीक14,,15है।
इससे पहले, कई अध्ययनों ने सुसंस्कृत ऊतक स्लाइस पर चिकित्सीय दवा परीक्षण दृष्टिकोण पेश किए। इन अध्ययनों में फ्लोरोसेंट डाया समावेश, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, या एमटीटी परख ों पर भरोसा किया गया ताकि ऊतक व्यवहार्यता6,,7,,8,,9 का मूल्यांकन किया जासके। इस प्रोटोकॉल में, हमने व्यवहार्यता माप के लिए ल्यूमिनेसेंस-आधारित, लाइव सेल-संगत रिएजेंट रियलटाइम-ग्लो11 का उपयोग किया। ल्यूमिनेसेंस आधारित परखों में पहले इस्तेमाल किए गए तरीकों पर कई लाभ होते हैं, जिनमें बढ़ी हुई संवेदनशीलता, व्यापक सिग्नल रेंज और तेजी से वास्तविक समय व्यवहार्यता मापन बनाने की क्षमता शामिल है। मापने का समय माइक्रोप्लेट पाठकों (~ 1 एस/वेल) और एक में वीवो इमेजिंग सिस्टम (~ 1 मिन/प्लेट) के लिए कम है और न्यूनतम प्रसंस्करण के साथ सीधे सिग्नल तीव्रता रीडिंग प्रदान कर सकता है । सिग्नल का तेजी से अधिग्रहण और कम पोस्टप्रोसेसिंग चरण उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग में आवश्यक विशेषताएं हैं, जिससे ल्यूसिफेरिन-आधारित व्यवहार्यता मापन ऊतक स्लाइस संस्कृति में अधिक से अधिक नमूना थ्रूपुट को सक्षम करने की अनुमति मिलती है। जबकि एक लूसिफ़ेरेज़ आधारित परख पूरे स्लाइस व्यवहार्यता का एक सटीक, मात्रात्मक माप प्रदान करता है, यह ऊतक में दवा प्रेरित सेल प्रकार-विशिष्ट परिवर्तनों का पता लगाने में असमर्थ है। हालांकि, एक ही ऊतक टुकड़ा पर अंत बिंदु आईएचसी के साथ ल्यूमिनेसेंस आधारित व्यवहार्यता मापकोइंग सेल प्रकार-विशिष्ट माप को सक्षम करेगा।
जबकि ऊतक टुकड़ा संस्कृति प्रणाली एक उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग मंच के लिए ट्यूमर ऊतक जटिलता लाने में एक शक्तिशाली उपकरण है, यह कई कमियां है । एक ट्यूमर ऊतक के भीतर अंतर्निहित विषमता भी एक ही थोक ट्यूमर से ऊतक स्लाइस के बीच अंतर दवा प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकता है । अवसर पर, हमने अपने प्रयोगों में ऊतक स्लाइस के बीच दवा प्रतिक्रिया में अपेक्षाकृत बड़े बदलाव देखे। हम आंशिक रूप से एक ही ट्यूमर के भीतर विभिन्न साइटों से तैयार कई ऊतक स्लाइस औसत द्वारा इस भिन्नता को दूर कर सकते हैं। हालांकि ऊतक टुकड़ा संस्कृति कम से कम 21 दिनों के लिए व्यवहार्यता के आधारभूत स्तर पर बनाए रखा जा सकता है(चित्रा 2B),समय के साथ सेल आबादी बदल जाते हैं । हमने ऊतक स्लाइस संस्कृति प्रयोगों के दौरान प्रतिरक्षा कोशिका की आबादी में बदलाव का वर्णन किया है10. इसलिए, हम सलाह देते हैं कि ऊतक स्लाइस की जांच देशी ऊतक विशेषताओं को संक्षिप्त करने के लिए कम समय अंतराल पर की जाए।
ऊतक टुकड़ा संस्कृति उच्च थ्रूपुट सेल संस्कृति स्क्रीनिंग और पशु प्रयोगों के बीच दवा की खोज और विकास में एक महत्वपूर्ण अंतर को भरने के लिए तैयार है । सैकड़ों दवाओं का मूल्यांकन एक ट्यूमर बायोप्सी से उत्पादित स्लाइस पर किया जा सकता है, जिससे पशु अध्ययन से पहले शारीरिक प्रासंगिकता में वृद्धि हुई है। यह प्रणाली दवाओं को बाजार में लाने के लिए आवश्यक पशु प्रयोगों की संख्या को कम करने में मदद कर सकती है । इसके अलावा, रोगी ट्यूमर से तैयार ऊतक स्लाइस क्लिनिक में उपचार की योजना मार्गदर्शक में जानकारीपूर्ण क्षमता है । आज सौ से अधिक चिकित्सीय दवाएं उपलब्ध हैं, फिर भी उनके चयन का मार्गदर्शन करने के लिए कुछ बायोमार्कर हैं। इसके अलावा, रोगियों में विषमता के परिणामस्वरूप भी प्रतिक्रिया में असमानताएं होती हैं । एक रोगी बायोप्सी से ऊतक स्लाइस व्यवस्थित इलाज से पहले कई दवाओं का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक सप्ताह के समय के भीतर दवा प्रभावकारिता के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं । कुल मिलाकर, वास्तविक समय और ऊतक टुकड़ा संस्कृति प्रणालियों का उपयोग कर दवाओं के तेजी से परीक्षण कैंसर दवा के विकास और चिकित्सीय निर्णयों में महान क्षमता है ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704], और सिडनी किमेल फाउंडेशन [किमेल स्कॉलर अवार्ड], फेफड़ों के कैंसर डिस्कवरी पुरस्कार (एलसीडी-505536) द्वारा समर्थित किया गया था । हम स्तन कैंसर PDX ट्यूमर प्रदान करने के लिए डॉ Alana वेल्म (यूटा विश्वविद्यालय) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम भी उपयोगी चर्चा के लिए पीडीएक्स मॉडल और गुजराल लैब के सदस्यों के रखरखाव के लिए तुलनात्मक चिकित्सा, फ्रेड हचिनसन कैंसर अनुसंधान केंद्र (FHCRC) में कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । एनए एफएचसीआरसी से जेएसपीएस ओवरसीज रिसर्च फेलोशिप और इंटरडिसिप्लिनरी ट्रेनिंग ग्रांट द्वारा समर्थित है । ए.जेबी को एफएचसीआरसी से क्रोमोसोम मेटाबोलिज्म और कैंसर प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm dish | Corning | 430293 | |
| 24-well dish | CytoOne | CC7682-7524 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 6 mm diameter Biopsy punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| 6-well plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A8960-5g | For TSC medium |
| Belzer UW cold storage solcution (UW solution) | Bridge to Life | 500 mL | |
| Corning Matrigel Membrane Mix | Fisher scientific | 356234 | |
| DMSO | Corning | MT-25950CQC | |
| Double Edge Stainless Steel Cutting Blades | TED PELLA | 121-6 | For slicing |
| Doxorubicin (hydrochloride) | Cayman Chemical | 15007 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4974 | |
| Fine tip forceps | ROBOZ | RS-4976 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500g | For TSC medium |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Gibco | 14-175-103 | |
| HCI010 | Dr. Alana Welm, University of Utah | Breast cancer PDX | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630080 | For TSC medium |
| ITS + Premix | Fisher Scientific | 354352 | For TSC medium |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | |
| Leica VT1200S Vibratome | Leica | VT1200S | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030164 | For TSC medium |
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM01250 | |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Millipore | PICM03050 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500g | For TSC medium |
| PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive | TED PELLA | 10033 | Glue |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15140163 | For TSC medium |
| RealTime-Glo MT Cell Viability Assay | Promega | G9711 | |
| Recombinant Mouse EGF | BioLegend | 585608 | For TSC medium |
| RPMI1640 | Gibco | 11875135 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades | VWR | 55411-050 | For removing glued tissues |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-CI | For TSC medium |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BW13115E | For TSC medium |
| Staurosporine | Santa Cruz Biotechnology | sc-3510A | |
| Synergy H4 | BioTek | ||
| Tooothed forceps | ROBOZ | RS-5155 | |
| Transfer pipettes | Fisher scientific | 13-711-7M | Wide tip |
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 235 | Fine tip |
| William's medium E, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 12551032 | For TSC medium |
References
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