Summary
Vi presenterer en metode for å undersøke tidlige osteoarthritic endringer på mobilnivå i leddbrusk ved hjelp av atomkraft mikroskopi (AFM).
Abstract
Biomekaniske egenskaper av celler og vev ikke bare regulere sin form og funksjon, men er også avgjørende for å opprettholde sin vitalitet. Endringer i elastisitet kan forplante eller utløse utbruddet av store sykdommer som kreft eller slitasjegikt (OA). Atomkraftmikroskopi (AFM) har dukket opp som et sterkt verktøy for kvalitativt og kvantitativt karakterisere de biomekaniske egenskapene til spesifikke biologiske målstrukturer på en mikroskopisk skala, målekrefter i et område fra så lite som piconewton til mikronewton. Biomekaniske egenskaper er av særlig betydning i muskel-skjelettvev, som er utsatt for høye nivåer av belastning. OA som en degenerativ sykdom i brusk resulterer i forstyrrelsen av pericellulær matrise (PCM) og romlig omorganisering av kondrocytter innebygd i deres ekstracellulære matrise (ECM). Avbrudd i PCM og ECM har vært forbundet med endringer i de biomekaniske egenskapene til brusk. I den nåværende studien brukte vi AFM til å kvantifisere disse endringene i forhold til de spesifikke romlige mønsterendringene i kondrocytter. Med hver mønsterendring ble det observert betydelige endringer i elastisitet en PCM og ECM. Måling av lokal elastisitet gjør det mulig å trekke direkte konklusjoner om graden av lokal vevdegenerasjon i OA.
Introduction
Leddbrusk er et avaskulært, aneuralt vev. Tynt spredte kondrocytes produsere, organisere og opprettholde en ekspansiv ekstracellulær matrise (ECM) der de er innebygd. Som en distinkt og spesialisert del av ECM, er chondrocytes omgitt av et tynt lag av spesialisert matrise kjent som den pericellulære matrisen (PCM). PCM fungerer som en mechanosensitive celle-matrise grensesnitt1 som beskytter chondrocytes2 og modulerer deres biosyntetisk respons3. Som tidligere beskrevet4, i sunn brusk, er kondrocytes arrangert i spesifikke, distinkte romlige mønstre som er spesifikke for hvert vev lag og felles4,5 og avhenger av fellesspesifikke mekaniske lastemekanismer6. Disse mønstrene endres fra par og strenger i sunn brusk til doble strenger med utbruddet av slitasjegikt (OA). Med videre progresjon av sykdommen danner kondrocytter små klynger, og øker gradvis i størrelse til store klynger i avansert OA. Et fullstendig tap av enhver organisatorisk struktur og induksjon av apoptose observeres i sluttfasen OA. Dermed kan kondrocyte cellulær arrangement brukes som en bildebasert biomarkør for OA progresjon4.
Biomekaniske egenskaper av celler og vev ikke bare regulere sin form og funksjon, men er også avgjørende for å opprettholde sin vitalitet. Endringer i elastisitet kan forplante eller utløse utbruddet av store sykdommer som kreft eller OA. Atomkraftmikroskopi (AFM) har dukket opp som et kraftig verktøy for kvalitativt og kvantitativt karakterisere de biomekaniske egenskapene til spesifikke biologiske målstrukturer på en mikroskopisk skala, som måler et bredt spekter av kraft, fra piconewton til mikronewton. Den store anvendelsen av AFM er å måle overflatetopografien og mekaniske egenskapene til prøver ved subnanometeroppløsning7. Måleenheten består av tre hovedkomponenter: 1) En AFM-sonde, som er en skarp spiss montert på en cantilever og brukes til direkte interaksjon med overflaten av prøven. Når det påføres kraft på cantilever, oppstår deformasjon av sistnevnte i henhold til det målte vevets egenskaper. 2) Et optisk system som projiserer en laserstråle på cantilever, som deretter reflekteres til en detektorenhet. 3) En fotodiodedetektor som fanger lyset avledet fra cantilever. Den konverterer mottatt informasjon om lasernedbøyning av cantilever til en kraftkurve som kan analyseres.
Dermed er hovedprinsippet for AFM påvisning av kraften som virker mellom AFM-sonden og målstrukturen til prøven. Kraftkurvene som er oppnådd beskriver de mekaniske egenskapene til målstrukturene på prøveoverflaten som elastisitet, ladefordeling, magnetisering, utbyttestress og elastisk plastdeformasjonsdynamikk8. En viktig fordel med AFM over andre bildeteknikker er at AFM kan brukes til å måle de mekaniske egenskapene til levende celler i medium eller vev i en innfødt tilstand uten å skade vevet. AFM kan operere både under flytende eller tørre forhold. Det er ikke noe krav til prøveforberedelse. AFM gir mulighet til å bilde av en prøve og måle sine mekaniske egenskaper samtidig i prøver som er nær fysiologiske forhold. I den nåværende studien beskriver vi en ny tilnærming for å vurdere OA-progresjon ved å måle elastisiteten til PCM og ECM i innfødt leddbrusk. Korrelasjonen av romlig organisering av chondrocytes med graden av lokal vevdegenerasjon gir et helt nytt perspektiv for tidlig påvisning av OA. Den funksjonelle relevansen av disse mønstrene har imidlertid ikke blitt evaluert så langt. Fordi den viktigste funksjonen til leddbrusk er bærende ved lav friksjon, må vevet ha elastiske egenskaper. AFM tillater måling ikke bare elastisiteten til ECM, men også av de romlige cellulære mønstrene innebygd i deres PCM. Den observerte korrelasjonen av elastisitet med romlig mønsterendring av kondrocytter er så sterk at måling av elastisitet alene kan tillate stratifisering av lokal vevdegenerasjon.
Elastisk moduli av PCM og ECM ble vurdert i 35 μm tynne seksjoner ved hjelp av et AFM-system integrert i et omvendt fasekontrastmikroskop som tillot samtidig visualisering av bruskprøven. Denne protokollen er basert på en studie som allerede er publisert fra vårt laboratorium9 og beskriver spesifikt hvordan man karakteriserer det romlige arrangementet av kondrocytter og hvordan man måler elastisiteten til deres tilknyttede PCM og ECM. Med hver mønsterendring av kondrocytter kan det også observeres betydelige endringer i elastisitet for både PCM og ECM, slik at denne teknikken kan brukes til å måle fasen av degenerasjon av brusk.
Denne validerte tilnærmingen åpner opp en ny måte å evaluere OA progresjon og terapeutiske effekter i tidlige stadier før makroskopisk vev nedbrytning faktisk begynner å vises. Å utføre AFM-målinger konsekvent er en vanskelig prosess. I følgende protokoll beskriver vi hvordan du klargjør prøven som skal måles av AFM, hvordan du utfører de faktiske AFM-målingene som starter med utarbeidelse av cantilever, hvordan du kalibrerer AFM, og deretter hvordan du utfører målingene. Trinnvise instruksjoner gir en klar og konsis tilnærming til å skaffe pålitelige data og gi grunnleggende strategier for behandling og tolking av dem. Diskusjonsdelen beskriver også de vanligste fallgruvene i denne strenge metoden og gir nyttige feilsøkingstips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De menneskelige bruskprøvene ble hentet fra pasienter som gjennomgikk total kneartroplastikk ved Institutt for ortopedisk kirurgi ved Universitetssykehuset i Tuebingen, Tyskland, og Winghofer-sykehuset, Rottenburg a.N., Tyskland, for sluttstadiet OA i kneet. Full avdelings-, institusjonell og lokal etisk komitégodkjenning ble innhentet før studiestart (prosjektnummer 674/2016BO2). Skriftlig informert samtykke ble mottatt fra alle pasienter før deltakelse. Metodene ble utført i henhold til de godkjente retningslinjene.
1. Prøveforberedelse
- Forbereder brusk for kryotome snitting
- For å evaluere degenerative endringer i kneleddet, ta leddbruskprøver hentet fra bærende sone av lårkondylene etter vevreseksjon fra pasientene.
MERK: Prøver som undersøkes bør fortsatt inneholde minst et tynt lag av subkondralbein for å tillate klar identifisering av vevsorienteringen med hensyn til den indre og ytre overflaten, og dermed også tillate en standardisert vevshøsting av det øverste brusklaget. Brusk kan brukes til AFM-målinger til 24 timer etter operasjonen. Vevet kan lagres i serumfri Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) med 2% (v / v) penicillin-streptomycin og 1,2% (v / v) amfotericin B før bruk. Lagring av prøvene i mer enn 24 timer kan imidlertid forårsake artefakter i AFM-målingene på grunn av vevshevelse. - Klipp leddbrusk som helhet fra subkondralbenet ved hjelp av en skalpell, og bygg deretter inn bruskprøven i vannløselig innebyggingsmedium på kryotomeknotten som fryser under lav temperatur i kryotomeenheten.
MERK: Det frosne mediet stabiliserer vevet det omslutter. Det resulterer også i frysing av bruskprøven sammen med innebyggingsmediet. Når du kutter brusk fra beinet, spore retningen av vevet. Vevet som er innebygd for kryoseksjonene må plasseres på en slik måte at det øverste laget (dvs. leddoverflaten) av brusk vender mot bladet. Vær oppmerksom på at vevet må dekkes helt av innebyggingsmediet.
- For å evaluere degenerative endringer i kneleddet, ta leddbruskprøver hentet fra bærende sone av lårkondylene etter vevreseksjon fra pasientene.
- Kryotome snitting av brusk
- Ved hjelp av en standard kryotome, seksjon vevet med en tykkelse på 35 μm fra det øverste laget (dvs. leddoverflaten) av leddbrusk som er innebygd i det frosne vannløselige innebyggingsmediet.
MERK: Totalt kan opptil 300 μm (som tilsvarer omtrent ni seksjoner) deles og brukes til analysene. Den foreslåtte grensen på 300 μm tilsvarer den visuelle penetrasjonsdybden som vanligvis kan oppnås med fluorescensmikroskopi i hyalinbrusk som leddbrusk. Dermed er det mulig å sortere brusk i henhold til det dominerende lokale romlige mønsteret og deretter måle disse mønstrene i de tilsvarende delene. - Samle delene på et glasslysbilde og skyll avsnittene 3x med fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne det vannløselige innebyggingsmediet.
- Ved hjelp av en standard kryotome, seksjon vevet med en tykkelse på 35 μm fra det øverste laget (dvs. leddoverflaten) av leddbrusk som er innebygd i det frosne vannløselige innebyggingsmediet.
- Liming av bruskseksjoner på en AFM-kompatibel petriskål
MERK: Fordi AFM samler inn data ved mekanisk innrykk på prøven, må seksjonene festes på plass for å tillate nøyaktige målinger.- Lim forsiktig de 35 μm tykke delene med biokompatibel prøvelim på vevkulturretter som er kompatible med AFM-enheten. For å gjøre dette, ta 2-3 dråper lim og legg dem på vevkulturfatet på stedet der kanten av seksjonen vil ende opp. Legg nå bruskseksjonen på limet og la den holde seg fast til overflaten av vevskulturfatet.
MERK: De 35 μm tykke delene av hyalin leddbrusk er ikke veldig utsatt for curling. Hvis curling oppstår når du fjerner prøvene fra buffermediet, må du imidlertid kontrollere at så lite væske som mulig holder seg til prøvene. Så snart det overskytende vannet har tørket opp, sprer du direkte vevet på de spredte flekkene av lim slik at det er festet til overflaten av cellekulturparabolen. Limet påføres i et tynt lag bare på kantene av prøven og ikke på hele delen. Mål bare den delen av prøven som er langt fra det limte området for å eliminere muligheten for limet som forstyrrer målingene. - Inkuber seksjonene ved romtemperatur (RT) i 2 min for å la lim og vev binde sert. Dekk deretter seksjonene med Leibovitz's L-15 medium uten L-glutamin og uten natriumbikarbonat slik at de er helt nedsenket.
MERK: Plutselige bevegelser av prøven under fiksering eller utilstrekkelig limapplikasjon er vanlige feil som resulterer i vevets løsrivelse fra kulturretten. Videre bør bruk av Leibowitz-mediet gjøres på en mild måte, for ikke å løsne prøven fra overflaten på grunn av "bølger" skapt av mediet. - Plasser petriskålen med de limte delene i standard cellekulturinkubator ved 37 °C til målingene utføres.
MERK: Pass på at vevsseksjonene er stabile og ikke løsner fra overflaten av vevskulturfatet ved å utføre hvert trinn sakte.
- Lim forsiktig de 35 μm tykke delene med biokompatibel prøvelim på vevkulturretter som er kompatible med AFM-enheten. For å gjøre dette, ta 2-3 dråper lim og legg dem på vevkulturfatet på stedet der kanten av seksjonen vil ende opp. Legg nå bruskseksjonen på limet og la den holde seg fast til overflaten av vevskulturfatet.
2. Cantilever forberedelse (lime mikrosfærene)
- Klargjøre AFM-enheten og fortynne mikrosfærene
- Plasser cantilever på glassblokken som er angitt for luftmålinger, fest den med fjæren og monter glassblokken på AFM-hodet.
- Fortynn mikrosfærene i 100% etanol (100 partikler / 10 μL) og ultrasonicate for 10 s, slik at mikrosfærene er skilt og ikke klumper seg sammen.
- Klargjøre oppsettet for liming
- Rengjør et glasslysbilde med 70 % etanol og monter den på prøveholderen på AFM-enheten.
MERK: Rensingen av lysbildet forhindrer støvflekker som kan forstyrre limingsprosessen fra å samle seg på lysbildets overflate. - Plasser 2 μL av mikrosfæresuspensjonen midt i lysbildet og 2 μL lim i nærheten av mikrosfæresuspensjonen.
MERK: Å plassere mikrosfærefjæringen og limet nær hverandre anbefales å tillate en rask overgang av cantilever mellom limet og mikrosfærene. Hvis overgangen mellom å dyppe cantilever inn i limet og få kontakt med en mikrosfære er for lang, vil limet til slutt stivne, og dermed miste sine selvklebende egenskaper. - La etanolvæsken i mikrosfærefjæringen lufttørke, slik at mikrosfærene er på plass.
- Rengjør et glasslysbilde med 70 % etanol og monter den på prøveholderen på AFM-enheten.
- Liming av mikrosfærene på cantilever-spissen
- Dypp cantilever manuelt inn i limet ved hjelp av stepper motoren i 10 μm trinn til spissen er dekket av lim. Utfør dette trinnet raskt, da limet tørker raskt.
- Trekk tilbake cantilever igjen med 100 μm, flytte den mot mikrosfærene, og plasser cantilever spissen rett over en enkelt mikrosfære.
- Kjør en kraftspektroskopimåling for å dyppe cantilever-spissen på den valgte mikrosfæren med parametrene som vises i tabell 1.
MERK: Ved å utføre dette trinnet brukes en måling av mikrosfærens overflate til å etablere kontakt mellom cantilevers spiss og mikrosfæren. Den relativt lange kontakttiden som vises i tabell 1 gir god bindingstid mellom lim og mikrosfære. Kraftavstandskurven oppnådd i løpet av dette trinnet genereres som et biprodukt av liming av mikrosfæren på cantilever-spissen og behandles ikke for videre analyse. - Når en mikrosfære er festet til cantilever, trekk glassblokken tilbake med cantilever montert på toppen og deretter fjerne AFM hodet fra mikroskopet. Til slutt demonteres glassblokken og kantilende fra AFM-hodet.
- Inkuber cantilever ved 65 °C i 2 timer og la den tørke over natten ved RT før du starter målingene.
MERK: Inkubasjon av cantilever forbedrer limets selvklebende egenskaper, noe som gjør cantilever-mikrosfærekomplekset mer stabil.
3. Klargjøre AFM-enheten for målinger
- Juster en glassblokk som er angitt for måling i et flytende miljø på AFM-holderen, slik at den øvre overflaten er rett og parallelt med AFM-holderen.
- Ved hjelp av pinsett monterer du forsiktig den valgte cantileveren på overflaten av glassblokken, slik at AFM-spissen med mikrosfæren stikker ut over det polerte optiske planet.
MERK: Cantilevers spiss må stikke ut over det polerte flyet for å kunne reflektere AFM-laseren på fotodetektoren. Vær veldig forsiktig når du plasserer cantilever på AFM for ikke å skrape den polerte optiske overflaten av glassblokken. Riper glassblokken kan føre til vanskeligheter med å justere laserjusteringen og kan forstyrre de påfølgende målingene. - Fordi cantilever vil bli utsatt for mekanisk trykk, må den festes på plass. Stabiliser cantilever på glassblokken ved å skyve den metalliske fjæren inn i sporet av blokken og klemme toppen av cantilever med våren ved hjelp av pinsett.
- Plasser glassblokken forsiktig med cantilever på AFM-hodet og fest den med den integrerte låsemekanismen. Pass på at fjæren vender mot venstre side slik at cantilever er plassert i riktig retning. Monter deretter AFM-hodet med cantilever på AFM-enheten.
4. Legge inn prøven og kalibreringen av cantilever
MERK: Her utføres kalibrering av enheten ved å kjøre en kraftkurve på den rene overflaten av Petri-skålen fylt med Leibovitz medium uten prøvevev. Kalibrering kan også utføres ved hjelp av en separat kontroll AFM-fat fylt bare med AFM-mediet uten prøven.
- Montere prøven på AFM-enheten
- Plasser petriskålen som er tilberedt i trinn 1.3.3 på AFM-prøveholderen.
- Slå på petriskålvarmeren og sett den på 37 °C. La vevskulturretten nå optimal temperatur (dvs. 20 min).
- Plasser en beskyttende folie på bunnen av cantilever-enheten for å unngå kondens av medium i AFM-hodet.
- Kalibrering av enheten
- Åpne programvaren (Materialtabellen), etterfulgt av laserjusteringsvinduet, og vinduet som viser innstillingene for tilnærmingsparameteren. Slå deretter på steppermotoren, laserlyset og CCD-kameraet.
- Bruk CCD-kameraet på mikroskopet til å visualisere og identifisere cantilever. Ved hjelp av stepper motorfunksjon, senk cantilever i 100 μm trinn til cantilever er helt nedsenket i mediet.
MERK: Nedsenkingen av cantilever i væsken er visuelt identifiserbar via CCD-kameraet. Når den bryter vannoverflaten, skaper cantilever-spissen lett merkbare sirkulære refleksjoner i vannet. - Rett laseren oppå cantilever ved hjelp av justeringsskruene.
MERK: Ikke overvind skruene, da dette vil skade laserjusteringsmekanismen. Cantilever er sett nedenfra og laserstrålen kommer ovenfra. - Når laseren er plassert på cantilever, juster laserstrålen ved hjelp av skruer i AFM-enheten slik at den reflekterte strålen faller på midten av fotodetektoren. Fortsett å overvåke plasseringen av laserstrålen ved hjelp av laserjusteringsfunksjonen.
MERK: Detektoren plukker opp nedbøyningen av laserstrålen som reflekteres av cantilever og konverterer den til et elektrisk signal. - Etter laser-cantilever justering, sum signalet må være 1 V eller over mens lateral og vertikale nedbøyninger må være nær 0. Hvis disse verdiene ikke er oppnådd, justerer du fotodetektoren.
- Oppnå kalibreringskraftkurven
- For å nå overflaten på AFM-fatet for å starte målingene, kjør en skanner Approach med tilnærmingsparametrene gitt i tabell 2. Når bunnen av vevskulturretten er nådd, trekk tilbake cantilever med 100 μm.
MERK: På dette punktet er sonden nøyaktig 100 μm over fra bunnen av vevskulturfatet. - Definer RUN-parameterne og juster parameterne som vises i tabell 3. Klikk KJØR-knappen for å starte en måling og få en kalibreringskraftavstandskurve.
MERK: Kraftkurven som er oppnådd her, vises i figur 1. - På kalibreringskraftavstandskurven velger du regionen for en lineær tilpasning av den tilbaketrukne kurven i programvaren.
MERK: Den lineære passformen gjøres for å måle cantilevers følsomhet. Når den lineære passformen er på plass, lagres verdiene av programvaren. Vårkonstantmålingen eller den termiske støyen fra cantilever beregnes av programvaren etterpå. - Ettersom målingene utføres i middels ved en temperatur på 37 °C, setter du temperaturvariabelen ved 37 °C i programvaren for å etterligne fysiologiske forhold så nært som mulig.
MERK: Ved slutten av kalibreringen lagres den vertikale nedbøyningen og vises i kraftenheten, Newton (N), i stedet for volt (V), som er enheten for den opprinnelige registreringen av fotodiodedetektoren.
- For å nå overflaten på AFM-fatet for å starte målingene, kjør en skanner Approach med tilnærmingsparametrene gitt i tabell 2. Når bunnen av vevskulturretten er nådd, trekk tilbake cantilever med 100 μm.
5. Biomekanisk karakterisering av ECM og PCM ved å utføre elastisitetsmålinger via AFM
- Identifisere kontrocyttmønstre i bruskseksjonen
- Vær oppmerksom på bruskseksjonen under et fasekontrastmikroskop integrert i AFM-systemet og identifiser de spesifikke cellulære mønstrene10 av leddbrusk fra osteoarthritic kneet: enkeltstrenger (sunne vevsområder), doble strenger (begynnelsen vev degenerasjon), små og store klynger (begge avansert vev degenerasjon). Se figur 2A–D.
- Når det spesifikke ønsket mønsteret er identifisert, måler du to områder per valgt mønster per matrisetype (PCM eller ECM) og utfører ni målingsrepetisjoner på hvert målested (Figur 2E,F). Sikre en utvalgsstørrelse som er stor nok til å ta høyde for mulige unøyaktigheter.
MERK: For PCM-målingene plasserer du cantilever i nærheten av cellene (som vist av de røde sirklene i figur 2E,F). For å gjennomføre målinger av ECM velger du en region uten celler (vist av det blå området i figur 2E,F)og utfører innrykket som beskrevet i trinn 5.2.
- Innrykk av det målrettede området
- Utfør en tilnærming etterfulgt av en tilbaketrekking slik at cantilever er plassert 100 μm over vevet, som vil være startposisjonen for de påfølgende målingene.
- Fokuser på PCM eller ECM av mønsteret som skal måles og fikse datamaskinen musen på det tidspunktet.
MERK: Musen vil fungere som en visuell markør for målstedet for innrykk. Når fokuset skifter til cantilever-spissen, vil vevsstrukturene bli uutslettelige eller uskarpe. - Fokuser nå på sonden og flytt spissen av sonden til det punktet som tidligere var festet av datapilen. Start deretter målingene med RUNved hjelp av parameteren for angittpunkt oppnådd ved kalibrering av cantilever.
MERK: En eksemplarisk kraftkurve hentet fra måling av PCM i en enkelt streng vises i tilleggsfigur 1.
6. Databehandling
MERK: Dataanalysen eller fastsettelsen av den elastiske modulusen utføres ved hjelp av en Hertz-modell som beskrevet tidligere11,12. Innrykks formen var sfærisk på grunn av bruk av mikrosfærer på spissen og Poissons forhold ble holdt på 0,5 basert på tidligere litteratur13,14,15.
- Åpne databehandlingsprogramvaren (Table of Materials) som er kompatible med dataene hentet fra AFM-enheten.
- Velg Hertz-modellen i programvaren for behandling av kraftavstandskurvene. Still inn Poisson-forholdet på 0,5 og velg spissfiguren som sfærisk og en spissradius på 12,5 μm.
- Når alle parametrene er justert, er resultatene montert, og Youngs modulus beregnes og vises av programvaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Langs den fysiopatologiske modellen fra strenger til doble strenger, til små og til slutt til store klynger, reduserte både ECM (Figur 3A) og PCM (Figur 3B) elastisk moduli betydelig mellom hver mønsterendring. Det eneste unntaket var forskjellen i ECM mellom strenger og doble strenger (p = 0,072). Resultatene viser at ECM/PCM-forholdet (figur 4B) ikke endret seg betydelig, mens en markert reduksjon i de absolutte forskjellene i elastisitet mellom ECM og PCM ble observert (figur 4A). Videre viser resultatene ingen signifikant tilknytning til ECM/PCM-forholdet eller tilhørende endringer i cellulær romlige rom (r = -0,099, p = 0,281).
Figur 1: Skjematisk representasjon av en kraftavstandskurve i AFM-kontaktmodus. Når sonden nærmer seg overflaten, er kreftene for små til å gi en målbar nedbøyning av spissen først, og dermed forlate spissen i sin uforstyrrede posisjon (1). Deretter, når cantilever er svært nær prøven, på grunn av klebende krefter som er aktive mellom spissen og sonden, klikker cantilever faktisk raskt mot prøven (2). Med sonden som nærmer seg prøven ytterligere, vender den frastøtende nedbøyningen mot bevegelse av retning, med en nesten lineær funksjon av høyde og nedbøyning til den vertikale nedbøyningen når den relative settpunktverdien (3). Ved tilbaketrekking (4), i tillegg til senkende deflektorkrefter, er adhesjonskrefter også til stede mens cantilever trekkes tilbake i Z-aksen fra prøven. Når AFM-sonden trekkes av kontakten med prøven, blir den først "sittende fast" før den er i stand til å løsne fra vedheftet ved grensesnittet, selv fører til en kort negativ nedbøyning av cantilever, før den igjen når sin ubøyde nøytrale posisjon uten kontakt med sonden (5). Omfanget av nedbøyning uttrykkes i styrken som arbeider på cantilever uttrykt i nanonewtons. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativ romlig karakterisering av kondrocytter og AFM-målinger av den ekstracellulære matrisen (ECM) og pericellulær matrise (PCM). - Jeg har ikke noe åsi. Karakterisering av cellemønstrene: strenger (A), doble strenger (B), små klynger (C) og store klynger (D). Den elastiske moduli av PCM (røde sirkler) og ECM (blått område) (E/F) ble vurdert for de ulike cellulære mønstre i osteoarthritic brusk. Målesteder for ECM og PCM ble valgt av eksperimentereren og er grafisk indikert av svarte kors. Cantilever-spissen som brukes til målingene er preget av en hvit stjerne. Skalalinjer representerer 10 μm (A-D)og 100 μm (E/F). Figuren er tilpasset og modifisert fra Danalache et al.9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av den kvantifiserte Youngs moduli av den ekstracellulære matrisen (ECM) og den pericellulære matrisen (PCM) som en funksjon av romlig chondrocyte organisasjon. Med progressiv patologisk romlig chondrocyte organisasjon, en gradvis reduksjon av elastisitet ble notert i boksenplots for både ECM (A) og PCM (B) (* p < 0,05, *** p < 0,001). Forkortelser: SS: enkeltstrenger, DS: doble strenger, SC: små klynger, BC: store klynger. Tallene er hentet fra Danalache et al.9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Forholdet mellom Youngs moduli av den ekstracellulære matrisen (ECM) og den pericellulære matrisen (PCM) som en funksjon av cellulær romlig organisasjon. En stadig mer patologisk romlig chondrocyte organisasjon var forbundet med en reduksjon av Youngs moduli for både ECM og PCM (A). Mens disse romlige endringene fant sted, forble forholdet mellom ECM og PCM elastisitet konstant, og viste ingen signifikante endringer (B). Dataene presenteres som et linjediagram med gjennomsnittlig ± standardfeil (A) og boxplots (B). Forkortelser: SS: enkeltstrenger, DS: doble strenger, SC: små klynger, BC: store klynger. Tallene er hentet fra Danalache et al.9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Representativ kraftkurve oppnådd ved innrykk av den pericellulære matrisen (PCM) av et enkelt strengmønster som viser passformresultatene (oransje pil) samt den gjenværende rotgjennomsnittsfirkanten (gjenværende RMS; svart pil). Tilpasningsresultatene inkluderer kontaktpunktet mellom utvalg og tips, Young's Modulus og grunnlinjen. Den gjenværende RMS-en som vises nedenfor beskriver forskjellen mellom passformen og kraftdataene, og representerer dermed kvaliteten på en kraftkurvepassform. Vennligst klikk her for å laste ned denne figuren.
| Tabell 1. Parametere for liming av en mikrosfære på AFM-sonden | |
| Parametere | Verdi |
| Setpoint | 5.0 V (andre versjon) |
| Juster opprinnelig plan | 1 |
| Trekk lengde | 90,0 μm |
| Z-bevegelse | Konstant hastighet |
| Utvid hastigheten | 5,0 μm/s |
| Forlenge tid | 18.0 s |
| Kontakttid | 90.0 s |
| Forsinkelsesmodus | Konstant kraft |
| Samplingsfrekvens | 2000 Hz |
Tabell 1. Parametere for liming av en mikrosfære på AFM-sonden.
| Tabell 2. Tilnærming parametere | |
| Tilnærming parametere | Verdi |
| Tilnærming IGain | 5,0 Hz |
| Tilnærming PGain | 0.0002 |
| Tilnærming målhøyde | 10,0 μm |
| Settpunkt for tilnærming | 5.00 V (andre kan være på linje med |
| Tilnærming baseline | 0.00 V (0.00) |
Tabell 2. Tilnærming parametere.
| Tabell 3. Kjør parametere | |
| Parametere | Verdi |
| Setpoint | 1.0 V |
| Juster opprinnelig plan | 1 |
| Trekk lengde | 90,0 μm |
| Z-bevegelse | Konstant hastighet |
| Utvid hastigheten | 5,0 μm/s |
| Forlenge tid | 18.0 s |
| Kontakttid | 0.0 s |
| Forsinkelsesmodus | Konstant kraft |
| Samplingsfrekvens | 2000 Hz |
Tabell 3. Kjør parametere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av AFM som en ny og kraftig teknikk for å måle de biomekaniske egenskapene til biologiske materialer på nanoskalanivå, målte vi de elastiske egenskapene til ECM og PCM i menneskelig osteoartritisk leddbrusk. Bruskprøver ble valgt i henhold til deres dominerende romlige mønster av chondrocyte organisasjon som en bildebasert biomarkør for lokal vevdegenerasjon. Som forventet ble det observert en sterk nedgang i verdiene av elastisitet en både ECM og PCM sammen med romlig kontrocyttomorganisering. Disse observasjonene understreker tydelig at avvikene i romlig arrangement av kondrocytter ikke bare var forbundet med endringer i de elastiske egenskapene til det cellulære mikromiljøet (PCM), men også gjennom hele brusk (ECM). Videre viste ECM / PCM-forholdet ingen vesentlige endringer til tross for de robuste endringene i den elastiske modulien til PCM og ECM under OA. Disse funnene indikerer at endringene i de mekaniske egenskapene til ECM og PCM skjedde enveis og samtidig, noe som kan bety at arten av progressiv ødeleggelse er lik for både PCM og ECM. OA initiering og progresjon utløser dermed betydelig PCM og ECM nedbrytning og til slutt ødeleggelse. Begge tapene var forbundet med et betydelig tap av biomekaniske egenskaper av leddbrusk som sin elastisitet, som vist i den nåværende studien. Dette understreker den funksjonelle relevansen av den romlige organiseringen av kondrocytter som en markør for biomekaniske egenskaper. Omvendt tillater det oss å bruke lokale elastisitetsmålinger for å trekke konklusjoner om de lokalt dominerende romlige mønstrene og dermed den lokale vevdegenerasjonen av brusk.
Atomkraftmikroskopi (AFM) har dukket opp som et høyoppløselig verktøy for å studere vev på en ikke-destruktiv måte. Den opererer ved fysisk sondering prøver med en delikat og smidig cantilever som gjenspeiler en laser på en fotodiode. Eventuelle endringer i denne refleksjonen registreres og konverteres til et elektrisk signal. Mens AFM er et kraftig verktøy for å gjennomføre nanoskalamålinger, kommer det ikke uten begrensninger og fallgruver. Spesielt kritisk er cantilever forberedelse ved å lime mikrosfærene. I sammenheng med denne metoden brukes mikrosfærer til å endre innrykksdybden og lokalt trykk under målinger. Ved hjelp av små mikrosfærer festet til spissen av sonden gjør det mulig å måle de biomekaniske egenskapene til et fibernettverk i stedet for elastisiteten til enkeltfiber når du bruker spissen alene. Det forhindrer også vevsskader under måleprosessen. På grunn av den delikate naturen til cantilever-sensorene, må det etableres en oppmerksom og forsiktig forberedelsesmåte for å oppnå konsistente og nøyaktige målinger. For å hindre at mikrosfærene løsner fra sensorens spiss, anbefaler vi ferskblandet lim som ikke er eldre enn en uke. Videre er det viktig for sensorens funksjonalitet å plassere mikrosfæren ved spissens senter, da sideavvik i mikrosfærevedlegg lett resulterer i inkonsekvente målinger.
Å plassere cantilever på glassblokken og feste den med en passende fjær er en delikat og feilutsatt prosess som trenger omhyggelig oppmerksomhet og stødige hender. Fordi cantilevers er svært sannsynlig å bli ødelagt av utrente operatører, anbefaler vi å gjennomføre flere testkjøringer og praksis for å komfortabelt håndtere AFM lett knuselige komponenter.
En ren glassblokk er viktig for å kalibrere enheten på riktig måte og oppnå pålitelige målinger. Smuss eller støv på blokkens optiske overflate kan forhindre riktig laserjustering på fotodetektoren. Derfor, hvis problemer under laserjustering en gang oppstår, kan det være nødvendig å vaske av glassblokken med etanol en gang til.
Dataanalyse eller bestemmelse av elastisk modulus kan utføres ved hjelp av Hertz-modellen som beskrevet tidligere11,12. Kort sagt, dataene som genereres av innrykk er tomter av makt over bevegelse av cantilever tips. Under målingene flyttes cantilever i retning av prøven. Dette fører til at cantilever tar kontakt med prøven og deretter til sin bøying i retning motsatt av den der den opprinnelig flyttet. Samtidig oppstår en innrykk av prøven med en viss mengde. For å kunne bruke Hertz-fit-modellen må prøvens innrykk beregnes og justeres for å isolere den cantilever bøyeparameteren. Parameteren som beskriver prøven er Poissons forhold, som avhenger av materialet som undersøkes. For myke biologiske prøver er Poissons forhold ofte satt til 0,515. Som nevnt ovenfor er formen på den brukte innrykket relevant for beregningen av Youngs modulus, da den dikterer utvidelsene som må gjøres til den opprinnelige Hertz-ligningen. I tilfelle av det beskrevne eksperimentet antas en sfærisk innrykksform på grunn av bruk av mikrosfærer.
Mens AFM kan tilby nye og interessante muligheter for å samle inn data, avhenger konsistensen og påliteligheten til de gitte dataene sterkt av opplevelsen til den respektive operatøren. Flere av trinnene som er skissert ovenfor er utsatt for menneskelige feil og krever tålmodighet og omhyggelighet for å utføre dem riktig.
På grunn av de mange sensitive variablene som kan påvirke måleresultatene, kan de absolutte kraftverdiene som rapporteres i denne studien ikke generaliseres, men er ganske spesifikke for vårt eksperimentelle oppsett. Når du bruker denne teknikken til å evaluere vevdegenerasjon av brusk, må noen normaliseringsmålinger på forskjellige romlige mønstre først utføres for å skalere resultatene til de spesifikke eksperimentelle måleinnstillingene som finnes. Forholdet mellom de forskjellige elastisitetsmodulene og de romlige mønstrene vil imidlertid ikke bli påvirket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker våre medforfattere fra den opprinnelige publikasjonen for deres hjelp og støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. Ramalingam, M., Ramakrishna, S. , Woodhead Publishing. Cambridge, UK. 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
