Summary
We presenteren een methode om vroege artroseveranderingen op cellulair niveau in gewrichtskraakbeen te onderzoeken met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM).
Abstract
Biomechanische eigenschappen van cellen en weefsels regelen niet alleen hun vorm en functie, maar zijn ook cruciaal voor het behoud van hun vitaliteit. Veranderingen in elasticiteit kunnen zich voortplanten of het begin van belangrijke ziekten zoals kanker of artrose (OA) veroorzaken. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) is uitgegroeid tot een sterk instrument om de biomechanische eigenschappen van specifieke biologische doelstructuren op microscopische schaal kwalitatief en kwantitatief te karakteriseren, meetkrachten in een bereik van zo klein als de piconewton tot de micronewton. Biomechanische eigenschappen zijn van bijzonder belang in spier- en skeletweefsels, die worden blootgesteld aan hoge niveaus van spanning. OA als een degeneratieve ziekte van het kraakbeen resulteert in de verstoring van de pericellulaire matrix (PCM) en de ruimtelijke herschikking van de chondrocyten ingebed in hun extracellulaire matrix (ECM). Verstoring in PCM en ECM is geassocieerd met veranderingen in de biomechanische eigenschappen van kraakbeen. In deze studie gebruikten we de AFM om deze veranderingen te kwantificeren in relatie tot de specifieke ruimtelijke patroonveranderingen van de chondrocyten. Bij elke patroonwijziging werden significante veranderingen in elasticiteit waargenomen voor zowel het PCM als de ECM. Het meten van de lokale elasticiteit maakt het dus mogelijk om directe conclusies te trekken over de mate van lokale weefseldegeneratie in OA.
Introduction
Gewrichtskraakbeen is een avasculair, aneural weefsel. Dunverspreide chondrocyten produceren, organiseren en onderhouden een expansieve extracellulaire matrix (ECM) waarin ze zijn ingebed. Als een duidelijk en gespecialiseerd onderdeel van de ECM, zijn chondrocyten omgeven door een dunne laag van gespecialiseerde matrix bekend als de pericellulaire matrix (PCM). De PCM fungeert als een mechanogevoelige cel-matrix interface1 die de chondrocyten2 beschermt en hun biosynthetische responsmoduleert 3. Zoals eerder beschreven4, in gezond kraakbeen, zijn de chondrocyten gerangschikt in specifieke, verschillende ruimtelijke patronen die specifiek zijn voor elke weefsellaag en gewricht4,5 en zijn afhankelijk van gewrichtsspecifieke mechanische laadmechanismen6. Deze patronen veranderen van paren en snaren in gezond kraakbeen tot dubbele snaren met het begin van artrose (OA). Met verdere progressie van de ziekte vormen de chondrocyten kleine clusters, die geleidelijk in omvang toenemen tot grote clusters in geavanceerde OA. Een volledig verlies van een organisatiestructuur en inductie van apoptose wordt waargenomen in eindfase OA. Zo kan chondrocyte cellulaire regeling worden gebruikt als een beeldgebaseerde biomarker voor OA progressie4.
Biomechanische eigenschappen van cellen en weefsels regelen niet alleen hun vorm en functie, maar zijn ook cruciaal voor het behoud van hun vitaliteit. Veranderingen in elasticiteit kunnen zich voortplanten of leiden tot het begin van belangrijke ziekten zoals kanker of OA. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) is uitgegroeid tot een krachtig instrument om de biomechanische eigenschappen van specifieke biologische doelstructuren op microscopische schaal, meten van een breed scala aan kracht, van piconewton tot de micronewton, kwalitatief en kwantitatief te karakteriseren. De belangrijkste toepassing van de AFM is het meten van de oppervlaktetopografie en mechanische eigenschappen van monsters bij subnanometer resolutie7. Het meetapparaat bestaat uit drie hoofdcomponenten: 1) Een AFM-sonde, die een scherpe punt is die op een cantilever is gemonteerd en wordt gebruikt voor de directe interactie met het oppervlak van het monster. Wanneer kracht wordt toegepast op de cantilever, treedt vervorming van de laatste op volgens de eigenschappen van het gemeten weefsel. 2) Een optisch systeem dat een laserstraal projecteert op de cantilever, die vervolgens wordt gereflecteerd op een detectoreenheid. 3) Een fotodiode detector die het licht afbuigen van de cantilever vangt. Het zet de ontvangen informatie over de laser afbuiging door de cantilever in een kracht curve die kan worden geanalyseerd.
Het belangrijkste principe van de AFM is dus de detectie van de kracht tussen de AFM-sonde en de doelstructuur van het monster. De verkregen krachtkrommen beschrijven de mechanische eigenschappen van de doelstructuren op het monsteroppervlak, zoals elasticiteit, ladingsverdeling, magnetisatie, opbrengstspanning en elastische plastische vervormingsdynamiek8. Een belangrijk voordeel van de AFM ten opzichte van andere beeldvormingstechnieken is dat de AFM kan worden gebruikt om de mechanische eigenschappen van levende cellen in medium of weefsels in een inheemse staat te meten zonder het weefsel te beschadigen. AFM kan zowel in vloeibare als droge omstandigheden werken. Er is geen vereiste voor de voorbereiding van de monsters. DE AFM biedt de mogelijkheid om een monster in beeld te brengen en tegelijkertijd zijn mechanische eigenschappen te meten in monsters die in de buurt van fysiologische omstandigheden zijn. In deze studie beschrijven we een nieuwe benadering om OA-progressie te beoordelen door de elasticiteit van het PCM en de ECM in inheems gewrichtskraakbeen te meten. De correlatie van ruimtelijke organisatie van chondrocyten met de mate van lokale weefseldegeneratie biedt een compleet nieuw perspectief voor vroege detectie van OA. De functionele relevantie van deze patronen is echter nog niet geëvalueerd. Omdat de belangrijkste functie van gewrichtskraakbeen dragend is bij lage wrijving, moet het weefsel elastische eigenschappen hebben. AFM maakt het meten van niet alleen de elasticiteit van de ECM, maar ook van de ruimtelijke cellulaire patronen ingebed in hun PCM. De waargenomen correlatie van elasticiteit met ruimtelijke patroonverandering van de chondrocyten is zo sterk dat alleen al het meten van elasticiteit stratificatie van lokale weefseldegeneratie mogelijk kan zijn.
Elastische moduli van de PCM en ECM werden beoordeeld in 35 μm-dunne secties met behulp van een AFM-systeem geïntegreerd in een omgekeerde fase contrast microscoop die gelijktijdige visualisatie van het kraakbeen monster toegestaan. Dit protocol is gebaseerd op een studie die al is gepubliceerd vanuit ons laboratorium9 en beschrijft specifiek hoe de ruimtelijke ordening van de chondrocyten kan worden gekarakteriseerd en hoe de elasticiteit van hun bijbehorende PCM en ECM kan worden gemeten. Bij elke patroonverandering van de chondrocyten kunnen ook significante veranderingen in elasticiteit worden waargenomen voor zowel het PCM als de ECM, waardoor deze techniek kan worden gebruikt om het stadium van degeneratie van het kraakbeen direct te meten.
Deze gevalideerde aanpak opent een nieuwe manier om OA-progressie en therapeutische effecten in een vroeg stadium te evalueren voordat macroscopische weefselafbraak daadwerkelijk begint te verschijnen. Consequent AFM-metingen uitvoeren is een moeizaam proces. In het volgende protocol beschrijven we hoe het monster kan worden gemeten door de AFM, hoe de werkelijke AFM-metingen worden uitgevoerd te beginnen met de voorbereiding van de cantilever, hoe de AFM te kalibreren en vervolgens hoe de metingen uit te voeren. Stapsgewijze instructies geven een duidelijke en beknopte aanpak om betrouwbare gegevens te verkrijgen en basisstrategieën te bieden voor de verwerking en interpretatie ervan. De discussie sectie beschrijft ook de meest voorkomende valkuilen van deze rigoureuze methode en biedt nuttige tips voor het oplossen van problemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De menselijke kraakbeenmonsters werden verkregen van patiënten die totale kniearthroplastie ondergingen in de afdeling Orthopedische Chirurgie van het Universitair Ziekenhuis van Tuebingen, Duitsland, en het Winghofer-ziekenhuis, Rottenburg a.N., Duitsland, voor eindfase OA van de knie. Volledige departementale, institutionele en lokale ethische commissie goedkeuring werden verkregen vóór aanvang van de studie (projectnummer 674/2016BO2). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd ontvangen van alle patiënten voor deelname. De methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtsnoeren.
1. Bereiding van de monsters
- Het kraakbeen voorbereiden op cryotome-sectie
- Om degeneratieve veranderingen in het kniegewricht te evalueren, neem gewrichtskraakbeenmonsters verkregen uit de dragende zone van de dijbeencondyles na weefselresectie van de patiënten.
OPMERKING: Monsters die worden onderzocht, moeten nog steeds ten minste een dunne laag subchondralis bevatten om een duidelijke identificatie van de weefseloriëntatie ten opzichte van het binnen- en buitenoppervlak mogelijk te maken, waardoor ook een gestandaardiseerde weefseloogst van de bovenste kraakbeenlaag mogelijk is. Het kraakbeen kan tot 24 uur na de operatie worden gebruikt voor AFM-metingen. Het weefsel kan worden opgeslagen in serumvrije Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 2% (v/v) penicilline-streptomycine en 1,2% (v/v) amphotericine B voorafgaand aan gebruik. Het opslaan van de monsters voor meer dan 24 uur kan artefacten veroorzaken in de AFM-metingen als gevolg van weefselzwelling, echter. - Snijd het gewrichtskraakbeen als geheel uit het subchondrale bot met behulp van een scalpel en sluit daarna het kraakbeenmonster in in wateroplosbaar inbeddingsmedium op de cryotoomknop die bevriest bij lage temperatuur in het cryotoomapparaat.
OPMERKING: Het bevroren medium stabiliseert het weefsel dat het omhult. Het resulteert ook in het bevriezen van het kraakbeen monster samen met de inbedding medium. Bij het snijden van het kraakbeen van het bot, bijhouden van de oriëntatie van het weefsel. Het weefsel dat voor de cryosecties is ingebed, moet zodanig worden geplaatst dat de bovenste laag (d.w.z. articulaire oppervlakte) van het kraakbeen naar het blad kijkt. Houd er rekening mee dat het weefsel volledig moet worden afgedekt door het inbeddingsmedium.
- Om degeneratieve veranderingen in het kniegewricht te evalueren, neem gewrichtskraakbeenmonsters verkregen uit de dragende zone van de dijbeencondyles na weefselresectie van de patiënten.
- Cryotome-doorsnede van het kraakbeen
- Met behulp van een standaard cryotoom, sectie het weefsel op een dikte van 35 μm van de bovenste laag (dat wil zeggen, gewrichtsoppervlak) van het gewrichtskraakbeen dat is ingebed in de bevroren water oplosbare inbedding medium.
LET OP: In totaal kan tot 300 μm (wat overeenkomt met ongeveer negen secties) worden doorsneden en gebruikt voor de analyses. De voorgestelde limiet van 300 μm komt overeen met de visuele penetratiediepte die meestal kan worden verkregen met fluorescentiemicroscopie in hyalinekraakbeen zoals gewrichtskraakbeen. Zo is het mogelijk om kraakbeen te sorteren volgens het overheersende lokale ruimtelijke patroon en deze patronen vervolgens te meten in de overeenkomstige secties. - Verzamel de secties op een glazen glijbaan en spoel de secties 3x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om het in water oplosbare inbeddingsmedium te verwijderen.
- Met behulp van een standaard cryotoom, sectie het weefsel op een dikte van 35 μm van de bovenste laag (dat wil zeggen, gewrichtsoppervlak) van het gewrichtskraakbeen dat is ingebed in de bevroren water oplosbare inbedding medium.
- Lijmen van kraakbeensecties op een door de AFM compatibel petrischaaltje
LET OP: Omdat de AFM gegevens verzamelt door mechanische inspringing op het monster, moeten de secties worden bevestigd om nauwkeurige metingen mogelijk te maken.- Lijm de 35 μm dikke delen voorzichtig met biocompatibele monsterlijm op weefselkweekgerechten die compatibel zijn met het AFM-apparaat. Om dit te doen, neem 2−3 druppels van de lijm en leg ze op de weefselkweek schotel op de plaats waar de rand van de sectie zal eindigen. Nu zet het kraakbeen sectie op de lijm en laat het stevig vasthouden aan het oppervlak van het weefsel kweekschotel.
OPMERKING: De 35 μm dikke delen hyaline gewrichtskraakbeen zijn niet erg gevoelig voor curling. Als er echter curling optreedt bij het verwijderen van de monsters uit het buffermedium, zorg er dan voor dat er zo weinig mogelijk vloeistof aan de monsters kleeft. Zodra het overtollige water is opgedroogd, direct verspreid het weefsel op de verspreide plekken van lijm, zodat het wordt bevestigd aan het oppervlak van de cel cultuur schotel. De lijm wordt alleen in een dunne laag aangebracht aan de randen van het monster en niet op de hele sectie. Meet alleen dat deel van het monster dat ver van het gelijmde gebied ligt om de mogelijkheid te elimineren dat de lijm de metingen verstoort. - Incubeer de secties bij kamertemperatuur (RT) gedurende 2 min om de lijm en het weefsel goed te kunnen hechten. Bedek vervolgens de secties met Leibovitz's L-15 medium zonder L-glutamine en zonder natriumbicarbonaat, zodat ze volledig onder water staan.
OPMERKING: Plotselinge bewegingen van het monster tijdens fixatie of onvoldoende lijmtoepassing zijn veel voorkomende fouten die resulteren in de onthechting van het weefsel van de kweekschaal. Bovendien moet het toepassen van het Leibowitz-medium op een zachte manier worden gedaan, om het monster niet los te maken van het oppervlak als gevolg van "golven" die door het medium zijn gemaakt. - Plaats de petrischaal met de gelijmde secties in de standaard celkweekcouveuse op 37 °C totdat metingen zijn uitgevoerd.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de weefselsecties stabiel zijn en niet loskomen van het oppervlak van de weefselkweekschaal door elke stap langzaam uit te voeren.
- Lijm de 35 μm dikke delen voorzichtig met biocompatibele monsterlijm op weefselkweekgerechten die compatibel zijn met het AFM-apparaat. Om dit te doen, neem 2−3 druppels van de lijm en leg ze op de weefselkweek schotel op de plaats waar de rand van de sectie zal eindigen. Nu zet het kraakbeen sectie op de lijm en laat het stevig vasthouden aan het oppervlak van het weefsel kweekschotel.
2. Cantilever preparaat (lijmen van de microsferen)
- Voorbereiding van het AFM-apparaat en het verdunnen van de microsferen
- Plaats de cantilever op het glasblok dat is opgegeven voor luchtmetingen, bevestig het met de veer en monteer het glasblok op de AFM-kop.
- Verdun de microsferen in 100% ethanol (100 deeltjes/10 μL) en ultrasoon gedurende 10 s, zodat de microsferen worden gescheiden en niet samenklonteren.
- Het voorbereiden van de setup voor het lijmen
- Maak een glazen schuif met 70% ethanol schoon en monteer deze op de monsterhouder op het AFM-apparaat.
OPMERKING: Voorkomt de reiniging van de glijbaan dat stofdeeltjes die het lijmproces kunnen verstoren, zich ophopen op het oppervlak van de glijbaan. - Plaats 2 μL van de microsfeersuspensie in het midden van de dia en 2 μL lijm in de buurt van de microsfeersuspensie.
OPMERKING: Het plaatsen van de microsfeer suspensie en lijm dicht bij elkaar wordt aanbevolen om een snelle overgang van de cantilever tussen de lijm en de microsferen mogelijk te maken. Als de overgang tussen het onderdompelen van de cantilever in de lijm en het maken van contact met een microsfeer te lang is, zal de lijm uiteindelijk uitharden, waardoor zijn kleefeigenschappen verloren gaan. - Laat de ethanolvloeistof in de microsfeersvering luchtdroog, waardoor de microsferen op hun plaats blijven.
- Maak een glazen schuif met 70% ethanol schoon en monteer deze op de monsterhouder op het AFM-apparaat.
- Lijmen van de microsferen op de cantilever tip
- Dompel de cantilever handmatig in de lijm met behulp van de stepper motor in stappen van 10 μm totdat de punt is bedekt met lijm. Voer deze stap snel uit, want de lijm droogt snel.
- Trek de cantilever weer met 100 μm in, beweeg het naar de microsferen en plaats de cantilevertip direct boven een enkele microsfeer.
- Voer een krachtspectroscopiemeting uit om de uitkragende tip op de geselecteerde microsfeer te dompelen met de parameters in tabel 1.
OPMERKING: Door deze stap uit te voeren, wordt een meting van het oppervlak van de microsfeer gebruikt om contact te leggen tussen de tip van de cantilever en de microsfeer. De relatief lange contacttijd in tabel 1 zorgt voor voldoende hechtingstijd tussen de lijm en de microsfeer. De krachtafstandscurve die tijdens deze stap wordt verkregen, wordt gegenereerd als een bijproduct van het lijmen van de microsfeer op de cantilevertip en wordt niet verwerkt voor verdere analyse. - Zodra een microsfeer is bevestigd aan de cantilever, trek het glazen blok met de cantilever gemonteerd op de top en verwijder vervolgens de AFM hoofd uit de microscoop. Tot slot, unmount het glazen blok en cantilever van de AFM hoofd.
- Incubeer de cantilever bij 65 °C gedurende 2 uur en laat het 's nachts drogen bij RT voordat met de metingen wordt begonnen.
OPMERKING: Incubatie van de cantilever verbetert de lijmlijmeigenschappen, waardoor het cantilever-microsfeercomplex stabieler wordt.
3. Voorbereiding van het AFM-apparaat voor metingen
- Pas een glasblok aan dat is opgegeven voor het meten in een vloeibare omgeving op de AFM-houder, zodat het bovenoppervlak recht en parallel is aan de AFM-houder.
- Met behulp van pincet monteer je de geselecteerde cantilever voorzichtig op het oppervlak van het glasblok, zodat de AFM-tip met de microsfeer over het gepolijste optische vlak uitsteekt.
LET OP: De tip van de cantilever moet over het gepolijste vlak uitsteken om de laser van de AFM op de fotodetector te kunnen weergeven. Wees zeer voorzichtig bij het plaatsen van de cantilever op de AFM om niet te krassen op het gepolijste optische oppervlak van het glazen blok. Krassen op het glasblok kunnen leiden tot problemen bij het aanpassen van de laseruitlijning en kunnen de daaropvolgende metingen verstoren. - Omdat de cantilever zal worden onderworpen aan mechanische druk, moet het worden vastgesteld op zijn plaats. Stabiliseer de cantilever op het glasblok door de metalen veer in de groef van het blok te schuiven en de bovenkant van de cantilever met de veer met behulp van pincet vast te klemmen.
- Plaats het glasblok voorzichtig met de cantilever op het AFM-hoofd en zet het vast met het geïntegreerde vergrendelingsmechanisme. Zorg ervoor dat de veer naar de linkerkant gericht is, zodat de cantilever in de juiste richting wordt geplaatst. Monteer vervolgens het AFM-hoofd met de cantilever op het AFM-apparaat.
4. Het monster laden en de kalibratie van de cantilever
OPMERKING: Hier wordt kalibratie van het apparaat uitgevoerd door een krachtcurve uit te voeren op het schone oppervlak van de petrischaal gevuld met leibovitz's medium zonder monsterweefsel. Kalibratie kan ook worden uitgevoerd met behulp van een aparte controle AFM schotel gevuld alleen met de AFM medium zonder het monster.
- Het monster op het AFM-apparaat monteren
- Plaats het petrischaaltje bereid in stap 1.3.3 op de AFM-monsterhouder.
- Zet de petrischaalverwarming aan en zet deze op 37 °C. Laat de weefselkweekschaal een optimale temperatuur bereiken (d.w.z. 20 min).
- Plaats een beschermende folie op de basis van de cantilever assemblage om de condensatie van medium in de AFM kop te voorkomen.
- Kalibratie van het apparaat
- Open de software (Tabel van materialen), gevolgd door de laser uitlijning venster, en het venster met de aanpak parameter instellingen. Schakel vervolgens de steppermotor, het laserlicht en de CCD-camera in.
- Gebruik de CCD-camera op de microscoop om de cantilever te visualiseren en te identificeren. Met behulp van de stepper motor functie, laat de cantilever in 100 μm stappen totdat de cantilever volledig is ondergedompeld in het medium.
OPMERKING: Het onderdompelen van de cantilever in de vloeistof is visueel herkenbaar via de CCD-camera. Wanneer het wateroppervlak breekt, zorgt de uitkragende punt voor gemakkelijk merkbare cirkelvormige reflecties in het water. - Richt de laser op de top van de cantilever met behulp van de verstelschroeven.
LET OP: Overspoel de schroeven niet, omdat dit het laseruitlijningsmechanisme beschadigt. De cantilever wordt van onderen bekeken en de laserstraal komt van bovenaf. - Zodra de laser op de cantilever is geplaatst, past u de laserstraal aan met behulp van schroeven in het AFM-apparaat, zodat de gereflecteerde straal op het midden van de fotodetector valt. Houd de positie van de laserstraal in de gaten met behulp van de laseruitlijningsfunctie.
LET OP: De detector pikt de afbuiging van de laserstraal op die door de cantilever wordt gereflecteerd en zet deze om in een elektrisch signaal. - Na laser-cantilever aanpassing, moet het somsignaal 1 V of hoger zijn terwijl de zijdelingse en verticale afbuigingen dicht bij 0 moeten zijn. Als deze waarden niet worden verkregen, past u de fotodetector aan.
- Het verkrijgen van de kalibratiekrachtcurve
- Om het oppervlak op de AFM-schotel te bereiken om de metingen te starten, voert u een scanner nadering uit met de naderingsparameters in tabel 2. Zodra de bodem van de weefselkweekschotel is bereikt, trekt u de cantilever met 100 μm in.
OPMERKING: Op dit punt is de sonde precies 100 μm boven vanaf de onderkant van de weefselkweekschaal. - Stel de RUN-parameters in en pas de parameters in tabel 3aan . Klik op de run-knop om een meting te starten en een kalibratieforceafstandcurve te verkrijgen.
OPMERKING: De hier verkregen krachtcurve wordt weergegeven in figuur 1. - Selecteer op de kalibratiecurve de curve voor de kalibratievan de sterkteafstand voor een lineaire pasvorm van de ingetrokken curve in de software.
LET OP: De lineaire pasvorm wordt gedaan om de gevoeligheid van de cantilever te meten. Zodra de lineaire pasvorm op zijn plaats is, worden de waarden opgeslagen door de software. De veerconstante meting of het thermische geluid van de cantilever wordt achteraf door de software berekend. - Aangezien de metingen in medium worden uitgevoerd bij een temperatuur van 37 °C, stelt u de temperatuurvariabele in op 37 °C in de software om fysiologische omstandigheden zo nauwkeurig mogelijk na te bootsen.
OPMERKING: Tegen het einde van de kalibratie wordt de verticale afbuiging opgeslagen en weergegeven in de krachteenheid, de Newton (N), in plaats van volt (V), de eenheid van de oorspronkelijke registratie door de fotodiodedetector.
- Om het oppervlak op de AFM-schotel te bereiken om de metingen te starten, voert u een scanner nadering uit met de naderingsparameters in tabel 2. Zodra de bodem van de weefselkweekschotel is bereikt, trekt u de cantilever met 100 μm in.
5. Biomechanische karakterisering van de ECM en PCM door het uitvoeren van elasticiteitsmetingen via AFM
- Het identificeren van de chondrocyte patronen in het kraakbeen sectie
- Observeer de kraakbeensectie onder een fasecontrastmicroscoop geïntegreerd in het AFM-systeem en identificeer de specifieke cellulaire patronen10 van gewrichtskraakbeen van de artroseknie: enkele snaren (gezonde weefselgebieden), dubbele snaren (beginnende weefseldegeneratie), kleine en grote clusters (beide geavanceerde weefseldegeneratie). Zie figuur 2A-D.
- Zodra het specifieke gewenste patroon is geïdentificeerd, meet u twee locaties per gekozen patroon per matrixtype (PCM of ECM) en voert u negen meetherhalingen uit op elke meetlocatie(figuur 2E,F). Zorg voor een steekproefgrootte die groot genoeg is om mogelijke onjuistheden te verklaren.
OPMERKING: Voor de PCM-metingen plaatst u de cantilever in de nabijheid van de cellen (zoals blijkt uit de rode cirkels in figuur 2E, F). Om metingen van de ECM uit te voeren, selecteert u een gebied zonder cellen (weergegeven door het blauwe gebied in figuur 2E,F)en voert u de inkeping uit zoals beschreven in stap 5.2.
- Inspringing van de beoogde site
- Voer een aanpak uit gevolgd door een intrekking, zodat de cantilever 100 μm boven het weefsel wordt geplaatst, wat de startpositie is voor de volgende metingen.
- Focus op de PCM of ECM van het te meten patroon en bevestig de computermuis op dat moment.
OPMERKING: De muis zal dienen als een visuele markering voor de doellocatie van inspringing. Zodra de focus verschuift naar de cantilever tip, zullen de weefselstructuren niet te onderscheiden of wazig. - Richt u nu op de sonde en verplaats de punt van de sonde naar het punt dat eerder door de computerpijl was vastgesteld. Start vervolgens de metingen met RUN, met behulp van de parameter setpoint verkregen door kalibratie van de cantilever.
OPMERKING: Een voorbeeldige krachtcurve verkregen uit het meten van de PCM van een enkele snaar wordt weergegeven in Aanvullende figuur 1.
6. Gegevensverwerking
OPMERKING: De gegevensanalyse of bepaling van de elastische modulus wordt uitgevoerd met behulp van een Hertz-model zoals eerder beschreven11,12. De vorm van de inspringer was bolvormig door het gebruik van microsferen op de punt en de ratio van de Poisson werd op 0,5 gehouden op basis van eerdere literatuur13,14,15.
- Open de dataprocessing software (Tabel van materialen) compatibel met de gegevens verkregen van de AFM-apparaat.
- Selecteer het Hertz-model in de software voor het verwerken van de force-distance curves. Stel de Poisson-verhouding in op 0,5 en selecteer de tipvorm als bolvormig en een tipradius van 12,5 μm.
- Zodra alle parameters zijn aangepast, worden de resultaten gemonteerd en worden de modulus van de Young berekend en weergegeven door de software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Langs het fysiopathologische model van snaren tot dubbele snaren, tot kleine en uiteindelijk tot grote clusters, daalden zowel ECM (Figuur 3A) als PCM (Figuur 3B) elastische moduli aanzienlijk tussen elke patroonverandering. De enige uitzondering was het verschil in ECM tussen snaren en dubbele snaren (p = 0,072). Uit de resultaten blijkt dat de ECM/PCM-ratio (figuur 4B) niet significant is veranderd, terwijl een duidelijke daling van de absolute verschillen in elasticiteit tussen ECM en PCM werd waargenomen (figuur 4A). Bovendien tonen de resultaten geen significante associatie met betrekking tot de ECM/PCM-verhouding of de bijbehorende cellulaire ruimtelijke veranderingen (r = -0,099, p = 0,281).
Figuur 1: Schematische weergave van een force-distance curve in de AFM-contactmodus. Als de sonde het oppervlak nadert, zijn de krachten te klein om eerst een meetbare afbuiging van de punt te geven, waardoor de punt in zijn ongestoorde positie blijft (1). Dan, wanneer de cantilever is zeer dicht bij het monster, als gevolg van kleefkrachten actief tussen de tip en de sonde, de cantilever eigenlijk snel snaps in de richting van het monster (2). Met de sonde verder naderen van het monster, de weerzinwekkende afbuiging dan gezichten tegen de beweging van de richting, met een bijna lineaire functie van hoogte en afbuiging totdat de verticale afbuiging bereikt de relatieve set point waarde (3). Bij het intrekken (4) zijn naast de verlagende afbuigingskrachten ook hechtingskrachten aanwezig, terwijl de cantilever in de Z-as uit het monster wordt teruggetrokken. Als de AFM-sonde wordt getrokken uit het contact met het monster, het eerste krijgt "stuck" voordat het in staat is om los te komen van de hechting op de interface, zelfs wat leidt tot een korte negatieve afbuiging van de cantilever, voordat opnieuw het bereiken van zijn ongebogen neutrale positie zonder contact met de sonde (5). De mate van afbuiging wordt uitgedrukt in de kracht die werkt aan de cantilever uitgedrukt in nanonewtons. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve ruimtelijke karakterisering van chondrocyten en AFM-metingen van de extracellulaire matrix (ECM) en pericellulaire matrix (PCM). (A-D) Karakterisering van de cellulaire patronen: tekenreeksen (A), dubbele snaren (B), kleine clusters (C) en grote clusters (D). De elastische moduli van de PCM (rode cirkels) en ECM (blauw gebied) (E/F) werden beoordeeld op de verschillende cellulaire patronen in artrose kraakbeen. Meetlocaties voor de ECM en PCM zijn geselecteerd door de experimentator en grafisch aangegeven door zwarte kruizen. De cantilever tip die wordt gebruikt voor de metingen wordt gekenmerkt door een witte ster. Schaalbalken vertegenwoordigen 10 μm (A-D) en 100 μm (E/F). Het cijfer is aangepast en gewijzigd van Danalache et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van de gekwantificeerde Young's moduli van de extracellulaire matrix (ECM) en de pericellulaire matrix (PCM) als functie van ruimtelijke chondrocyte organisatie. Bij progressieve pathologische ruimtelijke chondrocyteorganisatie werd een geleidelijke afname van de elasticiteit opgemerkt in de boxplots voor zowel de ECM (A) als de PCM (B) (*p < 0,05, ***p < 0,001). Afkortingen: SS: single strings, DS: double strings, SC: small clusters, BC: big clusters. De cijfers zijn afkomstig van Danalache et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Relatie van de Young's moduli van de extracellulaire matrix (ECM) en de pericellulaire matrix (PCM) als functie van cellulaire ruimtelijke organisatie. Een steeds pathologischer ruimtelijke chondrocyte organisatie werd geassocieerd met een afname van moduli van de Young's voor zowel ECM als PCM(A). Hoewel deze ruimtelijke veranderingen plaatsvonden, bleef de verhouding van de elasticiteit van ECM en PCM constant, zonder significante veranderingen(B). De gegevens worden gepresenteerd als een lijndiagram met gemiddelde ± standaardfout(A) en boxplots (B). Afkortingen: SS: single strings, DS: double strings, SC: small clusters, BC: big clusters. De cijfers zijn afkomstig van Danalache et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Representatieve krachtcurve verkregen door inspringing van de pericellulaire matrix (PCM) van een enkel snaarpatroon met de pasvormresultaten (oranje pijl) en het resterende wortelgemiddelde vierkant (rest-RMS; zwarte pijl). De fit resultaten omvatten het contactpunt tussen monster en tip, de Young's Modulus, en de baseline. De resterende RMS hieronder beschrijft het verschil tussen de pasvorm en de kracht gegevens, waardoor de kwaliteit van een kracht curve fit. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
| Tabel 1. Parameters voor het lijmen van een microsfeer op de AFM-sonde | |
| Parameters | Waarde |
| Setpoint | 5.0 V |
| Basislijn aanpassen | 1 |
| Treklengte | 90,0 μm |
| Z-beweging | Constante snelheid |
| De snelheid verlengen | 5,0 μm/s |
| Verleng de tijd | 18,0 s |
| Contacttijd | 90,0 s |
| Vertragingsmodus | Constante kracht |
| Voorbeeldsnelheid | 2000 Hz |
Tabel 1. Parameters voor het lijmen van een microsfeer op de AFM-sonde.
| Tabel 2. Naderingsparameters | |
| Benaderingsparameters | Waarde |
| Aanpak IGain | 5,0 Hz |
| Aanpak PGain | 0.0002 |
| Doelhoogte benaderen | 10,0 μm |
| Setpoint benaderen | 5.00 V |
| Basislijn voor aanpak | 0,00 V |
Tabel 2. Nader parameters.
| Tabel 3. Parameters uitvoeren | |
| Parameters | Waarde |
| Setpoint | 1.0 V |
| Basislijn aanpassen | 1 |
| Treklengte | 90,0 μm |
| Z-beweging | Constante snelheid |
| De snelheid verlengen | 5,0 μm/s |
| Verleng de tijd | 18,0 s |
| Contacttijd | 0,0 s |
| Vertragingsmodus | Constante kracht |
| Voorbeeldsnelheid | 2000 Hz |
Tabel 3. Parameters uitvoeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van AFM als een nieuwe en krachtige techniek om de biomechanische eigenschappen van biologische materialen op nanoschaalniveau te meten, maten we de elastische eigenschappen van de ECM en PCM in menselijk artrose articulair kraakbeen. Kraakbeenmonsters werden geselecteerd op basis van hun overheersende ruimtelijke patroon van de chondrocyteorganisatie als een op afbeeldingen gebaseerde biomarker voor lokale weefseldegeneratie. Zoals verwacht werd een sterke daling van de waarde van elasticiteit van zowel ECM als PCM waargenomen langs ruimtelijke chondrocyte reorganisatie. Deze waarnemingen wijzen duidelijk op dat de afwijkingen in de ruimtelijke ordening van chondrocyten niet alleen geassocieerd werden met veranderingen in de elastische eigenschappen van de cellulaire micro-omgeving (PCM), maar ook in het hele kraakbeen (ECM). Bovendien vertoonde de ECM/PCM-ratio geen significante veranderingen, ondanks de robuuste veranderingen in de elastische moduli van PCM en ECM tijdens OA. Uit deze bevindingen blijkt dat de veranderingen in de mechanische eigenschappen van de ECM en het PCM unidirectioneel en tegelijkertijd plaatsvonden, hetgeen zou kunnen betekenen dat de aard van de progressieve vernietiging vergelijkbaar is voor zowel het PCM als de ECM. OA initiatie en progressie leidt dus tot aanzienlijke PCM en ECM degradatie en uiteindelijk vernietiging. Beide verliezen werden geassocieerd met een aanzienlijk verlies van biomechanische eigenschappen van het gewrichtskraakbeen, zoals de elasticiteit, zoals blijkt uit de huidige studie. Dit benadrukt de functionele relevantie van de ruimtelijke organisatie van chondrocyten als marker voor biomechanische eigenschappen. Omgekeerd stelt het ons in staat om lokale elasticiteitsmetingen te gebruiken om conclusies te trekken over de lokaal overheersende ruimtelijke patronen en dus de lokale weefseldegeneratie van het kraakbeen.
Atoomkrachtmicroscopie (AFM) is een instrument met hoge resolutie om weefsels op een niet-destructieve manier te bestuderen. Het werkt door fysiek indringende monsters met een delicate en plooibare cantilever dat een laser reflecteert op een fotodiode. Eventuele wijzigingen in deze reflectie worden geregistreerd en omgezet in een elektrisch signaal. Hoewel de AFM een krachtig instrument is om nanoschaalmetingen uit te voeren, komt het niet zonder zijn beperkingen en valkuilen. Vooral cruciaal is de cantilever voorbereiding door het lijmen van de microsferen. In het kader van deze methode worden microsferen gebruikt om de inspringingsdiepte en lokale druk tijdens metingen te wijzigen. Met behulp van kleine microsferen aan de punt van de sonde kan de meting van de biomechanische eigenschappen van een glasvezelnetwerk in plaats van de elasticiteit van enkele vezels bij het gebruik van de tip alleen. Het voorkomt ook weefselschade tijdens het meetproces. Vanwege het delicate karakter van de cantilever sensoren, moet een attente en zorgvuldige wijze van voorbereiding worden vastgesteld om consistente en nauwkeurige metingen te verkrijgen. Om te voorkomen dat de microsferen loskomen van de punt van de sensor, raden we vers gemengde lijm aan die niet ouder is dan een week. Bovendien is het essentieel voor de functionaliteit van de sensor om de microsfeer in het midden van de punt te plaatsen, omdat laterale afwijking in microsfeer-gehechtheid gemakkelijk resulteert in inconsistente metingen.
Het plaatsen van de cantilever op het glasblok en de bevestiging ervan met een passende veer is een delicaat en foutgevoelig proces dat nauwgezette aandacht en stabiele handen nodig heeft. Omdat cantilevers zeer waarschijnlijk worden vernietigd door ongetrainde operators, raden we aan om verschillende testruns uit te voeren en te oefenen om de gemakkelijk breekbare onderdelen van de AFM comfortabel te hanteren.
Een schoon glasblok is noodzakelijk om het apparaat goed te kalibreren en betrouwbare metingen te verkrijgen. Vuil of stof op het optische oppervlak van het blok kan een goede laseruitlijning op de fotodetector voorkomen. Daarom, als problemen tijdens de laser uitlijning worden aangetroffen, wassen van het glas blok met ethanol een tweede keer nodig zou kunnen zijn.
Gegevensanalyse of bepaling van de elastische modulus kan worden uitgevoerd met behulp van het Hertz-model zoals eerder beschreven11,12. Kortom, de gegevens gegenereerd door inspringing zijn percelen van kracht over de beweging van de cantilever tip. Tijdens de metingen wordt de cantilever in de richting van het monster verplaatst. Dit leidt tot de cantilever die contact maakt met het monster en vervolgens tot het buigen in de tegenovergestelde richting van de monster waarin het oorspronkelijk bewoog. Tegelijkertijd treedt een inspringing van het monster met een bepaalde hoeveelheid op. Om het Hertz-fit model te kunnen gebruiken, moet de inspringing van het monster worden berekend en aangepast om de cantilever buigparameter te isoleren. De parameter die het monster beschrijft is de verhouding van Poisson, die afhankelijk is van het onderzochte materiaal. Voor zachte biologische monsters is de verhouding van Poisson vaak ingesteld op 0,515. Zoals hierboven vermeld, is de vorm van de gebruikte inspringer relevant voor de berekening van Young's modulus, omdat het de extensies dicteert die moeten worden gemaakt om de oorspronkelijke Hertz-vergelijking. In het geval van het beschreven experiment wordt een bolvormige inspringvorm aangenomen vanwege het gebruik van microsferen.
Hoewel de AFM nieuwe en interessante mogelijkheden kan bieden om gegevens te verzamelen, zijn de consistentie en betrouwbaarheid van de opgebrachte gegevens sterk afhankelijk van de ervaring van de betreffende operator. Een aantal van de hierboven beschreven stappen zijn gevoelig voor menselijke fouten en vereisen geduld en nauwgezetheid om ze goed uit te voeren.
Vanwege de vele gevoelige variabelen die de meetresultaten kunnen beïnvloeden, kunnen de in deze studie gerapporteerde absolute krachtwaarden niet worden gegeneraliseerd, maar zijn ze eerder specifiek voor onze experimentele opstelling. Bij het gebruik van deze techniek om de weefseldegeneratie van kraakbeen te evalueren, moeten eerst enkele normaliserende metingen op verschillende ruimtelijke patronen worden uitgevoerd om de resultaten te schalen naar de specifieke experimentele meetinstellingen die aanwezig zijn. De relatie van de verschillende elasticiteit moduli en de ruimtelijke patronen zal echter niet worden beïnvloed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken onze co-auteurs van de oorspronkelijke publicatie voor hun hulp en steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
- Guilak, F., et al. The pericellular matrix as a transducer of biomechanical and biochemical signals in articular cartilage. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 498-512 (2006).
- Peters, H. C., et al. The protective role of the pericellular matrix in chondrocyte apoptosis. Tissue Engineering Part A. 17 (15-16), 2017-2024 (2011).
- Larson, C. M., Kelley, S. S., Blackwood, A. D., Banes, A. J., Lee, G. M. Retention of the native chondrocyte pericellular matrix results in significantly improved matrix production. Matrix Biology. 21 (4), 349-359 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis Rheumatology. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Maver, U., Velnar, T., Gaberšček, M., Planinšek, O., Finšgar, M. Recent progressive use of atomic force microscopy in biomedical applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 80, 96-111 (2016).
- Polini, A., Yang, F. Physicochemical characterization of nanofiber composites. Nanofiber Composites for Biomedical Applications. Ramalingam, M., Ramakrishna, S. , Woodhead Publishing. Cambridge, UK. 97-115 (2017).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thambyah, A., Nather, A., Goh, J. Mechanical properties of articular cartilage covered by the meniscus. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 580-588 (2006).
- Choi, A. P., Zheng, Y. P. Estimation of Young's modulus and Poisson's ratio of soft tissue from indentation using two different-sized indentors: finite element analysis of the finite deformation effect. Medical Biological Engineering Computing. 43 (2), 258-264 (2005).
- Jin, H., Lewis, J. L. Determination of Poisson's ratio of articular cartilage by indentation using different-sized indenters. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (2), 138-145 (2004).
