Summary
Nous présentons une méthode pour étudier les changements ostéoarthritiques tôt au niveau cellulaire dans le cartilage articulaire en utilisant la microscopie de force atomique (AFM).
Abstract
Les propriétés biomécaniques des cellules et des tissus non seulement régulent leur forme et leur fonction, mais sont également cruciales pour maintenir leur vitalité. Les changements dans l’élasticité peuvent propager ou déclencher l’apparition de maladies majeures comme le cancer ou l’arthrose (arthrose). La microscopie de force atomique (AFM) est apparue comme un outil solide pour caractériser qualitativement et quantitativement les propriétés biomécaniques de structures cibles biologiques spécifiques à l’échelle microscopique, mesurant les forces dans une gamme allant du piconewton au microton. Les propriétés biomécaniques sont d’une importance particulière dans les tissus musculo-squelettiques, qui sont soumis à des niveaux élevés de tension. L’œil de maladie dégénérative du cartilage entraîne la perturbation de la matrice périellulaire (PCM) et le réarrangement spatial des chondrocytes intégrés dans leur matrice extracellulaire (ECM). La perturbation du PCM et de l’ECM a été associée à des changements dans les propriétés biomécaniques du cartilage. Dans la présente étude, nous avons utilisé l’AFM pour quantifier ces changements par rapport aux changements spécifiques de modèle spatial des chondrocytes. À chaque changement de modèle, des changements significatifs dans l’élasticité ont été observés pour le PCM et l’ECM. La mesure de l’élasticité locale permet ainsi de tirer des conclusions directes sur le degré de dégénérescence locale des tissus dans l’œuvre d’oE.
Introduction
Le cartilage articulaire est un tissu aneural vasculaire. Les chondrocytes peu dispersés produisent, organisent et maintiennent une vaste matrice extracellulaire (ECM) dans laquelle elles sont intégrées. En tant que partie distincte et spécialisée de l’ECM, les chondrocytes sont entourés d’une fine couche de matrice spécialisée connue sous le nom de matrice périellulaire (PCM). Le PCM agit comme une interface mécanosensitive de matrice cellulaire1 qui protège les chondrocytes2 et module leur réponse biosynthétique3. Comme décrit précédemment4, dans le cartilage sain, les chondrocytes sont disposés dans des modèles spatiaux spécifiques et distincts qui sont spécifiques pour chaque couche de tissu et l’articulation4,5 et dépendent des mécanismes de chargement mécaniques spécifiques aux articulations6. Ces modèles changent des paires et des cordes dans le cartilage sain aux cordes doubles avec le début de l’arthrose (OA). Avec une progression plus poussée de la maladie, les chondrocytes forment de petits amas, augmentant graduellement en taille à de grands groupes dans l’œil avancé. Une perte complète de n’importe quelle structure organisationnelle et l’induction de l’apoptosis est observée dans l’OA de phase finale. Ainsi, l’arrangement cellulaire de chondrocyte peut être employé comme biomarqueur basé sur l’image pour la progressiond’OA 4.
Les propriétés biomécaniques des cellules et des tissus non seulement régulent leur forme et leur fonction, mais sont également cruciales pour maintenir leur vitalité. Les changements dans l’élasticité peuvent propager ou déclencher l’apparition de maladies majeures comme le cancer ou l’œd de l’œux. La microscopie de force atomique (AFM) est apparue comme un outil puissant pour caractériser qualitativement et quantitativement les propriétés biomécaniques de structures cibles biologiques spécifiques à l’échelle microscopique, mesurant un large éventail de forces, du piconewton au micronewton. L’application principale de l’AFM est de mesurer la topographie de surface et les propriétés mécaniques des échantillons à la résolution du sous-nanomètre7. Le dispositif de mesure se compose de trois composants principaux : 1) Une sonde AFM, qui est une pointe pointue montée sur un porte-à-faux et est utilisée pour l’interaction directe avec la surface de l’échantillon. Lorsque la force est appliquée au porte-à-faux, la déformation de ce dernier se produit selon les propriétés du tissu mesuré. 2) Un système optique qui projette un faisceau laser sur le porte-à-faux, qui est ensuite réfléchi à une unité de détecteur. 3) Un détecteur de photodiode qui attrape la lumière déviée du porte-à-faux. Il convertit les informations reçues concernant la déviation laser par le porte-à-faux en une courbe de force qui peut être analysée.
Ainsi, le principe principal de l’AFM est la détection de la force agissant entre la sonde AFM et la structure cible de l’échantillon. Les courbes de force obtenues décrivent les propriétés mécaniques des structures cibles sur la surface de l’échantillon comme l’élasticité, la distribution de charge, la magnétisation, le stress de rendement et la dynamique élastique de déformation plastique8. Un avantage important de l’AFM par rapport à d’autres techniques d’imagerie est que l’AFM peut être utilisé pour mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes dans les tissus moyens ou dans un état indigène sans endommager le tissu. L’AFM peut fonctionner à la fois dans des conditions liquides ou sèches. Il n’est pas nécessaire de préparer l’échantillon. L’AFM offre la possibilité d’imager un spécimen et de mesurer ses propriétés mécaniques simultanément chez des spécimens proches de conditions physiologiques. Dans la présente étude, nous décrivons une nouvelle approche pour évaluer la progression de l’œuvre d’oE en mesurant l’élasticité du PCM et de l’ECM dans le cartilage articulaire indigène. La corrélation de l’organisation spatiale des chondrocytes avec le degré de dégénérescence locale des tissus fournit une perspective complètement nouvelle pour la détection précoce de l’œux. La pertinence fonctionnelle de ces modèles n’a toutefois pas été évaluée jusqu’à présent. Parce que la fonction principale du cartilage articulaire est la charge portante à faible friction, le tissu doit posséder des propriétés élastiques. L’AFM permet de mesurer non seulement l’élasticité de l’ECM, mais aussi les modèles cellulaires spatiaux intégrés dans leur PCM. La corrélation observée de l’élasticité avec le changement de modèle spatial des chondrocytes est si forte que la mesure de l’élasticité seule peut permettre la stratification de la dégénérescence locale des tissus.
Des moduli élastiques du PCM et de l’ECM ont été évalués en sections minces de 35 m à l’aide d’un système AFM intégré dans un microscope de contraste de phase inversé qui a permis une visualisation simultanée de l’échantillon de cartilage. Ce protocole est basé sur une étude déjà publiée à partir de notre laboratoire9 et décrit spécifiquement comment caractériser l’arrangement spatial des chondrocytes et comment mesurer l’élasticité de leur PCM et ECM associés. Avec chaque changement de modèle des chondrocytes, des changements significatifs dans l’élasticité peuvent également être observés pour le PCM et l’ECM, permettant à cette technique d’être utilisée pour mesurer directement le stade de dégénérescence du cartilage.
Cette approche validée ouvre une nouvelle façon d’évaluer la progression de l’arthrose et les effets thérapeutiques à un stade précoce avant que la dégradation macroscopique des tissus commence réellement à apparaître. L’exécution cohérente des mesures de l’AFM est un processus ardu. Dans le protocole suivant, nous décrivons comment préparer l’échantillon à mesurer par l’AFM, comment effectuer les mesures réelles de l’AFM en commençant par la préparation du porte-à-faux, comment calibrer l’AFM, puis comment effectuer les mesures. Les instructions étape par étape donnent une approche claire et concise pour obtenir des données fiables et fournir des stratégies de base pour le traitement et l’interprétation. La section de discussion décrit également les pièges les plus courants de cette méthode rigoureuse et fournit des conseils utiles de dépannage.
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Protocol
Les échantillons de cartilage humain ont été obtenus auprès de patients subissant une arthroplastie totale du genou dans le département de chirurgie orthopédique de l’hôpital universitaire de Tuebingen, en Allemagne, et de l’hôpital Winghofer, Rottenburg a.N., Allemagne, pour l’OA de phase finale du genou. L’approbation complète des comités d’éthique ministériels, institutionnels et locaux a été obtenue avant le début de l’étude (projet numéro 674/2016BO2). Le consentement éclairé écrit a été reçu de tous les patients avant la participation. Les méthodes ont été mises en œ œ pare-là conformément aux lignes directrices approuvées.
1. Préparation de l’échantillon
- Préparation du cartilage pour la section cryotome
- Pour évaluer les changements dégénératifs dans l’articulation du genou, prenez des échantillons de cartilage articulaires obtenus de la zone de charge-portante des condyles fémoraux après la résection de tissu des patients.
REMARQUE : Les échantillons qui sont étudiés devraient encore contenir au moins une fine couche d’os subchondral pour permettre l’identification claire de l’orientation tissulaire par rapport à la surface intérieure et extérieure, permettant ainsi également une récolte normalisée de tissu de la couche de cartilage la plus haute. Le cartilage peut être utilisé pour les mesures de l’AFM jusqu’à 24 h après la chirurgie. Le tissu peut être stocké dans le milieu d’aigle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco sans sérum avec 2 % (v/v) de pénicilline-streptomycine et 1,2 % (v/v) amphotericine B avant utilisation. Le stockage des échantillons pour plus de 24 h peut causer des artefacts dans les mesures de l’AFM en raison de l’enflure des tissus, cependant. - Couper le cartilage articulaire dans son ensemble de l’os subchondral à l’aide d’un scalpel et ensuite intégrer l’échantillon de cartilage dans le milieu d’intégration soluble dans l’eau sur le bouton cryotome qui gèle sous basse température dans le dispositif cryotome.
REMARQUE : Le milieu congelé stabilise le tissu qu’il enveloppe. Il en résulte également la congélation de l’échantillon de cartilage avec le milieu d’intégration. Lors de la coupe du cartilage de l’os, suivre l’orientation du tissu. Le tissu incorporé pour les cryosections doit être placé de telle sorte que la couche supérieure (c.-à-d. la surface articulaire) du cartilage fait face à la lame. Notez que le tissu doit être entièrement recouvert par le milieu d’intégration.
- Pour évaluer les changements dégénératifs dans l’articulation du genou, prenez des échantillons de cartilage articulaires obtenus de la zone de charge-portante des condyles fémoraux après la résection de tissu des patients.
- Section cryotome du cartilage
- À l’aide d’un cryotome standard, section du tissu à une épaisseur de 35 m de la couche la plus haute (c.-à-d. surface articulaire) du cartilage articulaire qui est incorporé dans le milieu d’intégration soluble dans l’eau congelé.
REMARQUE : Au total, jusqu’à 300 m (ce qui correspond à environ neuf sections) peuvent être sectionnés et utilisés pour les analyses. La limite proposée de 300 m correspond à la profondeur de pénétration visuelle qui peut habituellement être obtenue avec la microscopie de fluorescence dans le cartilage hyaline tel que le cartilage articulaire. Ainsi, il est possible de trier le cartilage en fonction du modèle spatial local prédominant et ensuite de mesurer ces modèles dans les sections correspondantes. - Recueillir les sections sur une glissière en verre et rincer les sections 3x avec du salin tamponné par phosphate (PBS) pour enlever le milieu d’intégration soluble dans l’eau.
- À l’aide d’un cryotome standard, section du tissu à une épaisseur de 35 m de la couche la plus haute (c.-à-d. surface articulaire) du cartilage articulaire qui est incorporé dans le milieu d’intégration soluble dans l’eau congelé.
- Collage de sections de cartilage sur un plat Petri compatible AFM
REMARQUE : Étant donné que l’AFM recueille des données par indentation mécanique sur l’échantillon, les sections doivent être fixées en place pour permettre des mesures précises.- Collez délicatement les sections de 35 m d’épaisseur avec de la colle d’échantillon biocompatible sur des plats de culture tissulaire compatibles avec l’appareil AFM. Pour ce faire, prenez 2 à 3 gouttes de colle et mettez-les sur le plat de culture tissulaire à l’endroit où le bord de la section finira. Maintenant, mettez la section de cartilage sur la colle et lui permettre de coller fermement à la surface du plat de culture de tissu.
REMARQUE : Les sections de 35 m d’épaisseur de cartilage articulaire hyaline ne sont pas très sujettes au curling. Toutefois, si le curling se produit lors de l’enlèvement des échantillons du milieu tampon, assurez-vous que le moins de liquide possible colle aux échantillons. Dès que l’excès d’eau s’est asséché, étendre directement le tissu sur les taches dispersées de colle de sorte qu’il soit fixé à la surface du plat de culture cellulaire. La colle est appliquée en une fine couche seulement sur les bords de l’échantillon et non sur toute la section. Mesurez seulement la partie de l’échantillon qui est loin de la zone collée pour éliminer la possibilité que la colle interfère avec les mesures. - Incuber les sections à température ambiante (RT) pendant 2 minutes pour permettre à la colle et au tissu de se lier correctement. Couvrez ensuite les sections avec le milieu L-15 de Leibovitz sans L-glutamine et sans bicarbonate de sodium afin qu’ils soient entièrement submergés.
REMARQUE : Les mouvements soudains de l’échantillon pendant la fixation ou l’application insuffisante de colle sont des erreurs courantes qui entraînent le détachement du tissu du plat de culture. En outre, l’application du milieu Leibowitz doit être faite d’une manière douce, afin de ne pas détacher l’échantillon de la surface en raison de «ondes» créées par le milieu. - Placer le plat Petri avec les sections collées dans l’incubateur de culture cellulaire standard à 37 oC jusqu’à ce que les mesures soient effectuées.
REMARQUE : Assurez-vous que les sections tissulaires sont stables et ne se détachent pas de la surface du plat de culture tissulaire en effectuant chaque étape lentement.
- Collez délicatement les sections de 35 m d’épaisseur avec de la colle d’échantillon biocompatible sur des plats de culture tissulaire compatibles avec l’appareil AFM. Pour ce faire, prenez 2 à 3 gouttes de colle et mettez-les sur le plat de culture tissulaire à l’endroit où le bord de la section finira. Maintenant, mettez la section de cartilage sur la colle et lui permettre de coller fermement à la surface du plat de culture de tissu.
2. Préparation de cantilever (collage des microsphères)
- Préparation du dispositif AFM et dilution des microsphères
- Placez le porte-à-faux sur le bloc de verre spécifié pour les mesures de l’air, fixez-le avec le ressort et montez le bloc de verre sur la tête de l’AFM.
- Diluer les microsphères dans 100% d’éthanol (100 particules/10 l) et les ultrasons pendant 10 s, de sorte que les microsphères sont séparées et ne s’agglutinent pas.
- Préparation de la configuration pour le collage
- Nettoyez une lame de verre avec 70% d’éthanol et montez-le sur le porte-échantillons de l’appareil AFM.
REMARQUE : Le nettoyage de la glissière empêche les taches de poussière qui pourraient interférer avec le processus de collage de s’accumuler sur la surface de la glissière. - Placer 2 L de la suspension de microsphère au milieu de la glissière et 2 l de colle près de la suspension de microsphère.
REMARQUE : Il est recommandé de placer la suspension et la colle à la microsphère les unes près les unes des autres pour permettre une transition rapide du porte-à-faux entre la colle et les microsphères. Si la transition entre tremper le porte-à-faux dans la colle et entrer en contact avec une microsphère est trop longue, la colle finira par durcir, perdant ainsi ses propriétés adhésives. - Laisser sécher l’éthanol dans la microsphère, en laissant les microsphères en place.
- Nettoyez une lame de verre avec 70% d’éthanol et montez-le sur le porte-échantillons de l’appareil AFM.
- Collage des microsphères sur la pointe du porte-à-faux
- Trempez le porte-à-faux manuellement dans la colle à l’aide du moteur stepper en étapes de 10 m jusqu’à ce que la pointe soit recouverte de colle. Effectuez cette étape rapidement, comme la colle sèche rapidement.
- Rétractez à nouveau le porte-à-faux à 100 m, déplacez-le vers les microsphères et placez la pointe de porte-à-faux directement au-dessus d’une seule microsphère.
- Exécutez une mesure de spectroscopie de force pour tremper la pointe de porte-à-faux sur la microsphère sélectionnée avec les paramètres indiqués dans le tableau 1.
REMARQUE : En exécutant cette étape, une mesure de la surface de la microsphère est utilisée pour établir le contact entre la pointe du porte-à-faux et la microsphère. Le temps de contact relativement long indiqué dans le tableau 1 permet un temps de liaison suffisant entre la colle et la microsphère. La courbe de la distance de force obtenue au cours de cette étape est générée comme sous-produit de coller la microsphère sur la pointe du porte-à-faux et n’est pas traitée pour une analyse plus approfondie. - Une fois qu’une microsphère est fixée au porte-à-faux, rétractez le bloc de verre avec le porte-à-faux monté sur le dessus, puis retirez la tête de l’AFM du microscope. Enfin, démonter le bloc de verre et le porte-à-faux de la tête de l’AFM.
- Incuber le porte-à-faux à 65 oC pendant 2 h et laisser sécher toute la nuit à RT avant de commencer les mesures.
REMARQUE : L’incubation du porte-à-faux améliore les propriétés adhésives de la colle, rendant le cantilever-microsphere-complexe plus stable.
3. Préparation du dispositif AFM pour les mesures
- Ajuster un bloc de verre spécifié pour mesurer dans un environnement liquide sur le support AFM de sorte que la surface supérieure soit droite et parallèle au support de l’AFM.
- À l’aide de pincettes, montez soigneusement le porte-à-faux sélectionné à la surface du bloc de verre, de sorte que la pointe AFM avec la microsphère dépasse le plan optique poli.
REMARQUE : La pointe du porte-à-faux doit dépasser le plan poli afin de pouvoir refléter le laser de l’AFM sur le photodétrô. Soyez très prudent lors de la mise en porte-à-faux sur l’AFM afin de ne pas rayer la surface optique polie du bloc de verre. Gratter le bloc de verre peut entraîner des difficultés à ajuster l’alignement laser et peut interférer avec les mesures ultérieures. - Parce que le porte-à-faux sera soumis à une pression mécanique, il doit être fixé en place. Stabiliser le porte-à-faux sur le bloc de verre en glissant la source métallique dans la rainure du bloc et en serrant le dessus du porte-à-faux avec le ressort à l’aide de pincettes.
- Placez soigneusement le bloc de verre avec le porte-à-faux sur la tête de l’AFM et fixez-le avec le mécanisme de verrouillage intégré. Assurez-vous que le ressort est orienté vers le côté gauche afin que le porte-à-faux soit placé dans la bonne orientation. Montez ensuite la tête de l’AFM avec le porte-à-faux sur l’appareil AFM.
4. Chargement de l’échantillon et étalonnage du porte-à-faux
REMARQUE : Ici, l’étalonnage de l’appareil est effectué en exécutant une courbe de force sur la surface propre du plat Petri rempli du milieu de Leibovitz sans aucun tissu d’échantillon. L’étalonnage peut également être effectué à l’aide d’un plat AFM de contrôle séparé rempli uniquement avec le milieu AFM sans l’échantillon.
- Montage de l’échantillon sur l’appareil AFM
- Placez le plat Petri préparé à l’étape 1.3.3 sur le porte-échantillon AFM.
- Allumez le chauffe-vaisselle Petri et placez-le à 37 oC. Permettre au plat de culture tissulaire d’atteindre une température optimale (c.-à-d. 20 min).
- Placez une feuille protectrice sur la base de l’assemblage de porte-à-faux pour éviter la condensation du milieu dans la tête de l’AFM.
- Étalonnage de l’appareil
- Ouvrez le logiciel(Tableau des Matériaux), suivi de la fenêtre d’alignement laser, et de la fenêtre représentant les paramètres d’approche. Allumez ensuite le moteur de stepper, la lumière laser et la caméra CCD.
- Utilisez la caméra CCD au microscope pour visualiser et identifier le porte-à-faux. À l’aide de la fonction moteur de stepper, abaissez le porte-à-faux en étapes de 100 m jusqu’à ce que le porte-à-faux soit complètement immergé dans le milieu.
REMARQUE : L’assujettis du porte-à-faux dans le liquide est visuellement identifiable par l’intermédiaire de la caméra CCD. Lorsqu’elle brise la surface de l’eau, la pointe du porte-à-faux crée des reflets circulaires facilement perceptibles dans l’eau. - Dirigez le laser sur le dessus du porte-à-faux à l’aide des vis d’ajustement.
REMARQUE : Ne pas sous-vent les vis, car cela endommagera le mécanisme d’alignement laser. Le porte-à-faux est vu d’en bas et le faisceau laser vient d’en haut. - Une fois que le laser est placé sur le porte-à-faux, ajustez le faisceau laser à l’aide de vis dans le dispositif AFM de sorte que le faisceau réfléchi tombe sur le centre du photodétacteur. Continuez à surveiller la position du faisceau laser à l’aide de la fonction d’alignement laser.
REMARQUE : Le détecteur capte la déviation du faisceau laser réfléchi par le porte-à-faux et le convertit en signal électrique. - Après ajustement laser-cantilever, le signal Sum doit être de 1 V ou au-dessus tandis que les déviations latérales et verticales doivent être proches de 0. Si ces valeurs ne sont pas obtenues, ajustez le photodétacteur.
- Obtenir la courbe de force d’étalonnage
- Afin d’atteindre la surface sur le plat AFM pour démarrer les mesures, exécutez une approche scanner avec les paramètres d’approche donnés dans le tableau 2. Une fois le fond du plat de culture tissulaire atteint, rétractez le porte-à-faux par 100 m.
REMARQUE : À ce stade, la sonde est exactement à 100 m au-dessus du fond du plat de culture tissulaire. - Configurez les paramètres RUN et ajustez les paramètres affichés dans le tableau 3. Cliquez sur le bouton RUN pour démarrer une mesure et obtenir une courbe de force-distance d’étalonnage.
REMARQUE : La courbe de force obtenue ici est indiquée dans la figure 1. - Sur la courbe de force-distance d’étalonnage, sélectionnez la région pour un ajustement linéaire de la courbe rétractée dans le logiciel.
REMARQUE : L’ajustement linéaire est fait pour mesurer la sensibilité du porte-à-faux. Une fois l’ajustement linéaire en place, les valeurs seront sauvegardées par le logiciel. La mesure constante de ressort ou le bruit thermique du porte-à-faux est calculé par le logiciel par la suite. - Comme les mesures sont effectuées en milieu moyen à une température de 37 oC, définissez la variable de température à 37 oC dans le logiciel pour imiter les conditions physiologiques aussi étroitement que possible.
REMARQUE : À la fin de l’étalonnage, la déviation verticale est enregistrée et affichée dans l’unité de force, le Newton (N), au lieu des volts (V), qui est l’unité de l’enregistrement original par le détecteur de photodiode.
- Afin d’atteindre la surface sur le plat AFM pour démarrer les mesures, exécutez une approche scanner avec les paramètres d’approche donnés dans le tableau 2. Une fois le fond du plat de culture tissulaire atteint, rétractez le porte-à-faux par 100 m.
5. Caractérisation biomécanique de l’ECM et du PCM en effectuant des mesures d’élasticité via l’AFM
- Identifier les modèles de chondrocyte dans la section du cartilage
- Observez la section du cartilage sous un microscope de contraste de phase intégré dans le système AFM et identifiez les modèles cellulaires spécifiques10 du cartilage articulaire du genou ostéoarthritique : cordes simples (zones saines de tissu), cordes doubles (dégénérescence de tissu de début), petits et grands amas (dégénérescence avancée des tissus). Voir la figure 2A-D.
- Une fois que le modèle spécifique souhaité est identifié, mesurez deux sites par modèle choisi par type de matrice (PCM ou ECM) et effectuez neuf répétitions de mesure sur chaque site de mesure(figure 2E,F). Assurez-vous une taille d’échantillon assez grande pour tenir compte des inexactitudes possibles.
REMARQUE : Pour les mesures de PCM, placez le porte-à-faux à proximité des cellules (comme le montrent les cercles rouges de la figure 2E,F). Afin d’effectuer des mesures de l’ECM, sélectionnez une région sans aucune cellule (indiquée par la zone bleue de la figure 2E,F)et effectuez l’indentation telle que décrite à l’étape 5.2.
- Indentation du site ciblé
- Effectuez une approche suivie d’une rétractation de sorte que le porte-à-faux est positionné à 100 m au-dessus du tissu, qui sera la position de départ pour les mesures ultérieures.
- Concentrez-vous sur le PCM ou l’ECM du modèle à mesurer et fixez la souris d’ordinateur à ce moment-là.
REMARQUE : La souris servira de marqueur visuel pour le site cible de l’indentation. Une fois que la mise au point passe à la pointe de porte-à-faux, les structures tissulaires deviendront indiscernables ou floues. - Maintenant, concentrez-vous sur la sonde et déplacez la pointe de la sonde au point précédemment fixé par la flèche de l’ordinateur. Ensuite, commencez les mesures avec RUN, en utilisant le paramètre de point défini obtenu par étalonnage du porte-à-faux.
REMARQUE : Une courbe de force exemplaire obtenue à partir de la mesure du PCM d’une seule chaîne est indiquée dans la figure supplémentaire 1.
6. Traitement des données
REMARQUE : L’analyse ou la détermination des données du modulus élastique est effectuée à l’aide d’un modèle Hertz tel que décrit précédemment11,12. La forme de l’indenter était sphérique en raison de l’utilisation de microsphères sur la pointe et le rapport du Poisson a été maintenu à 0,5 basé sur la littérature précédente13,14,15.
- Ouvrez le logiciel de traitement des données(Tableau des matériaux) compatible avec les données obtenues à partir de l’appareil AFM.
- Sélectionnez le modèle Hertz dans le logiciel pour le traitement des courbes de la distance de force. Réglez le ratio Poisson à 0,5 et sélectionnez la forme de la pointe comme sphérique et un rayon de pointe de 12,5 m.
- Une fois que tous les paramètres sont ajustés, les résultats sont ajustés, et le modulus du Young est calculé et affiché par le logiciel.
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Representative Results
Le long du modèle physiopathologique des cordes aux cordes doubles, en passant par les petits et enfin les gros groupes, ECM(figure 3A) et PCM(figure 3B)moduli élastique ont diminué de manière significative entre chaque changement de modèle. La seule exception était la différence d’ECM entre les cordes et les cordes doubles (p - 0,072). Les résultats montrent que le ratio ECM/PCM(figure 4B) n’a pas changé de façon significative, alors qu’une diminution marquée des différences absolues d’élasticité entre ECM et PCM a été observée(figure 4A). En outre, les résultats ne montrent aucune association significative concernant le rapport ECM/PCM ou les changements spatiaux cellulaires associés (r - -0,099, p - 0,281).
Figure 1 : Représentation schématique d’une courbe de force-distance en mode de contact AFM. À mesure que la sonde s’approche de la surface, les forces sont trop petites pour donner une déviation mesurable de la pointe au début, laissant ainsi la pointe dans sa position intacte (1). Ensuite, lorsque le porte-à-faux est très proche de l’échantillon, en raison des forces adhésives actives entre la pointe et la sonde, le porte-à-faux s’enclenche rapidement vers l’échantillon (2). Avec la sonde approchant encore plus l’échantillon, la déviation répugnante se heurte alors au mouvement de direction, avec une fonction presque linéaire de hauteur et de déviation jusqu’à ce que la déviation verticale atteigne la valeur relative du point de réglage (3). Lors de la rétractation (4), en plus des forces de déviment de l’abaissement, les forces d’adhésion sont également présentes tandis que le porte-à-faux est rétracté dans l’axe Z de l’échantillon. Comme la sonde AFM est arrachée du contact avec l’échantillon, elle devient d’abord "coincée" avant de pouvoir se desserrer de l’adhérence à l’interface, conduisant même à une courte déviation négative du porte-en-porte, avant d’atteindre à nouveau sa position neutre sans contact avec la sonde (5). L’ampleur de la déviation s’exprime dans la force travaillant sur le porte-à-faux exprimé dans les nanonewtons. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Caractérisation spatiale représentative des chondrocytes et des mesures de l’AFM de la matrice extracellulaire (ECM) et de la matrice péricoellulaire (PCM). (A-D) Caractérisation des motifs cellulaires : cordes (A), double cordes (B), petits amas (C), et gros amas (D). Le moduli élastique du PCM (cercles rouges) et de l’ECM (zone bleue) (E/F) ont été évalués pour les différents modèles cellulaires dans le cartilage ostéoarthritique. Les sites de mesure de l’ECM et du PCM ont été sélectionnés par l’expérimentateur et sont indiqués graphiquement par des croix noires. La pointe de porte-à-faux utilisée pour les mesures est marquée par une étoile blanche. Les barres d’échelle représentent 10 m(A-D), et 100 m (E/F). La figure est adaptée et modifiée de Danalache et al.9. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Comparaison du moduli quantifié de Young de la matrice extracellulaire (ECM) et de la matrice périclulaire (PCM) en fonction de l’organisation moyère spatiale. Avec l’organisation spatiale progressive de chondrocyte spatial, une diminution graduelle de l’élasticité a été notée dans les boxplots pour l’ECM (A) et le PCM (B) (p 'lt; 0.05, 'p 'lt; 0.001). Abréviations: SS: cordes simples, DS: double cordes, SC: petits clusters, BC: grands clusters. Les chiffres sont tirés de Danalache et al.9. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Relation du moduli des Young de la matrice extracellulaire (ECM) et de la matrice périellulaire (PCM) en fonction de l’organisation spatiale cellulaire. Une organisation de chondrocyte spatiale de plus en plus pathologique a été associée à une diminution du moduli des Young pour ECM et PCM (A). Bien que ces changements spatiaux aient eu lieu, le rapport d’élasticité ECM et PCM est resté constant, ne montrant aucun changement significatif (B). Les données sont présentées comme un diagramme de ligne avec une erreur moyenne et standard (A) et des boxplots(B). Abréviations: SS: cordes simples, DS: double cordes, SC: petits clusters, BC: grands clusters. Les chiffres sont tirés de Danalache et al.9. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Courbe de force représentative obtenue par l’indentation de la matrice périellulaire (PCM) d’un modèle de chaîne unique montrant les résultats de l’ajustement (flèche orange) ainsi que le carré moyen résiduel de racine (RMS résiduel ; flèche noire). Les résultats de l’ajustement comprennent le point de contact entre l’échantillon et la pointe, le Modulus du jeune et la ligne de base. Le RMS résiduel affiché ci-dessous décrit la différence entre les données de l’ajustement et de la force, ce qui représente la qualité d’une courbe de force. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
| Tableau 1. Paramètres pour coller une microsphère sur la sonde AFM | |
| Paramètres | Valeur |
| Consigne | 5.0 V |
| Ajuster la ligne de base | 1 |
| Longueur de traction | 90,0 m |
| Mouvement Z | Vitesse constante |
| Étendre la vitesse | 5,0 m/s |
| Prolongation du temps | 18,0 s |
| Temps de contact | 90,0 s |
| Mode de retard | Force constante |
| Taux d’échantillon | 2000 Hz |
Tableau 1. Paramètres pour coller une microsphère sur l’AFM-sonde.
| Tableau 2. Paramètres d’approche | |
| Paramètres d’approche | Valeur |
| Approche IGain | 5.0 Hz |
| Approche PGain | 0.0002 |
| Hauteur cible d’approche | 10,0 m |
| Point d’approche | 5.00 V |
| Ligne de base de l’approche | 0,00 V |
Tableau 2. Paramètres d’approche.
| Tableau 3. Paramètres d’exécution | |
| Paramètres | Valeur |
| Consigne | 1.0 V |
| Ajuster la ligne de base | 1 |
| Longueur de traction | 90,0 m |
| Mouvement Z | Vitesse constante |
| Étendre la vitesse | 5,0 m/s |
| Prolongation du temps | 18,0 s |
| Temps de contact | 0,0 s |
| Mode de retard | Force constante |
| Taux d’échantillon | 2000 Hz |
Tableau 3. Exécuter les paramètres.
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Discussion
En utilisant l’AFM comme une technique nouvelle et puissante pour mesurer les propriétés biomécaniques des matériaux biologiques à un niveau à l’échelle nanométrique, nous avons mesuré les propriétés élastiques de l’ECM et du PCM dans le cartilage articulaire ostéoarthritique humain. Des échantillons de cartilage ont été sélectionnés en fonction de leur modèle spatial prédominant de l’organisation de chondrocyte comme biomarqueur basé sur l’image pour la dégénérescence locale de tissu. Comme prévu, une forte baisse des valeurs d’élasticité de l’ECM et du PCM a été observée le long de la réorganisation du chondrocyte spatial. Ces observations soulignent clairement que les écarts dans l’arrangement spatial des chondrocytes ont été non seulement associés à des changements dans les propriétés élastiques du microenvironnement cellulaire (PCM), mais aussi dans tout le cartilage (ECM). En outre, le ratio ECM/PCM n’a pas montré de changements significatifs malgré les changements robustes dans le moduli élastique de PCM et d’ECM pendant l’OA. Ces résultats indiquent que les changements dans les propriétés mécaniques de l’ECM et du PCM se sont produits de façon unidirectionnelle et en même temps, ce qui pourrait signifier que la nature de la destruction progressive est similaire tant pour le PCM que pour l’ECM. L’initiation et la progression de l’OA déclenchent ainsi une dégradation significative des PCM et des ECM et, en fin de compte, la destruction. Les deux pertes ont été associées à une perte significative des propriétés biomécaniques du cartilage articulaire comme son élasticité, comme le montre la présente étude. Cela met l’accent sur la pertinence fonctionnelle de l’organisation spatiale des chondrocytes comme marqueur pour les propriétés biomécaniques. Inversement, il nous permet d’utiliser des mesures locales d’élasticité pour tirer des conclusions sur les modèles spatiaux localement prédominants et donc la dégénérescence locale des tissus du cartilage.
La microscopie de force atomique (AFM) est apparue comme un outil à haute résolution pour étudier les tissus d’une manière non structive. Il fonctionne en sondant physiquement des échantillons avec un porte-à-faux délicat et souple qui reflète un laser sur un photodiode. Tout changement dans cette réflexion est enregistré et converti en signal électrique. Bien que l’AFM soit un outil puissant pour effectuer des mesures à l’échelle nanométrique, elle ne se fait pas sans ses limites et ses pièges. Particulièrement critique est la préparation de porte-à-faux en collant les microsphères. Dans le contexte de cette méthode, les microsphères sont utilisées pour modifier la profondeur de l’indentation et la pression locale pendant les mesures. L’utilisation de petites microsphères attachées à la pointe de la sonde permet de mesurer les propriétés biomécaniques d’un réseau de fibres plutôt que l’élasticité de la seule fibre lors de l’utilisation de la pointe seule. Il prévient également les lésions tissulaires pendant le processus de mesure. En raison de la nature délicate des capteurs en porte-à-faux, un mode de préparation attentif et prudent doit être mis en place afin d’obtenir des mesures cohérentes et précises. Afin d’éviter que les microsphères ne se détachent de la pointe du capteur, nous recommandons de la colle fraîchement mélangée qui ne fait pas plus d’une semaine. En outre, il est essentiel que la fonctionnalité du capteur place la microsphère au centre de la pointe comme déviation latérale dans la jointère de microsphère se traduit facilement par des mesures incohérentes.
Placer le porte-à-faux sur le bloc de verre et le fixer avec un ressort approprié est un processus délicat et sujet aux erreurs qui a besoin d’une attention méticuleuse et des mains stables. Étant donné que les porte-à-faux sont très susceptibles d’être détruits par des opérateurs non formés, nous vous recommandons d’effectuer plusieurs essais et de pratiquer pour manipuler confortablement les composants facilement cassables de l’AFM.
Un bloc de verre propre est impératif pour calibrer correctement l’appareil et obtenir des mesures fiables. La saleté ou la poussière sur la surface optique du bloc peut empêcher un alignement laser approprié sur le photodétacteur. Par conséquent, si des problèmes pendant l’alignement laser sont rencontrés, laver le bloc de verre avec de l’éthanol une deuxième fois pourrait être nécessaire.
L’analyse des données ou la détermination du modulus élastique peut être effectuée à l’aide du modèle Hertz tel que décrit précédemment11,12. En bref, les données générées par l’indentation sont des parcelles de force sur le mouvement de la pointe de porte-à-faux. Pendant les mesures, le porte-à-faux est déplacé dans la direction de l’échantillon. Cela conduit le porte-à-faux à entrer en contact avec l’échantillon et, par la suite, à sa flexion dans la direction opposée à celle dans laquelle il s’est déplacé à l’origine. Simultanément, une indentation de l’échantillon par une certaine quantité se produit. Afin d’utiliser le modèle Hertz-fit, l’indentation de l’échantillon doit être calculée et ajustée pour isoler le paramètre de flexion du porte-à-faux. Le paramètre décrivant l’échantillon est le rapport de Poisson, qui dépend du matériel étudié. Pour les échantillons biologiques mous, le ratio de Poisson est souvent fixé à 0,515. Comme mentionné ci-dessus, la forme de l’indenter utilisé est pertinente pour le calcul du modulus de Young, car il dicte les extensions qui doivent être faites à l’équation originale de Hertz. Dans le cas de l’expérience décrite, une forme sphérique d’addenter est supposée en raison de l’utilisation des microsphères.
Bien que l’AFM puisse offrir de nouvelles possibilités intéressantes de collecte de données, la cohérence et la fiabilité des données cédées dépendent fortement de l’expérience de l’opérateur respectif. Plusieurs des étapes décrites ci-dessus sont sujettes à l’erreur humaine et exigent de la patience et de la minutie pour les exécuter correctement.
En raison des nombreuses variables sensibles qui peuvent affecter les résultats de mesure, les valeurs de force absolue rapportées dans cette étude ne peuvent pas être généralisées, mais sont plutôt spécifiques pour notre configuration expérimentale. Lors de l’utilisation de cette technique pour évaluer la dégénérescence tissulaire du cartilage, certaines mesures de normalisation sur différents modèles spatiaux doivent d’abord être effectuées pour mettre à l’échelle les résultats des paramètres de mesure expérimentale spécifiques présents. La relation des différents moduli d’élasticité et des modèles spatiaux ne sera cependant pas affectée.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions nos co-auteurs de la publication originale pour leur aide et leur soutien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
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