Summary
原子間力顕微鏡(AFM)を用いて関節軟骨における細胞レベルにおける変形性関節症の初期変化を調べる方法を紹介する。
Abstract
細胞や組織の生体力学的性質は、その形状や機能を調節するだけでなく、その活力を維持するためにも重要です。弾力性の変化は、癌や変形性関節症(OA)のような主要な疾患の発症を伝播または引き起こす可能性があります。原子間力顕微鏡(AFM)は、ピコニュートンと同じくらい小さい範囲からマイクロニュートンまでの範囲で、特定の生物学的標的構造の生体力学的特性を定量的かつ定量的に特徴付ける強力なツールとして登場しました。生体力学的特性は、高レベルの緊張を受ける筋骨格組織において特別に重要である。軟骨の変性疾患としてのOAは、細胞外マトリックス(ECM)に埋め込まれた軟骨細胞の細胞内マトリックス(PCM)の破壊および空間的再配置をもたらす。PCMおよびECMの破壊は軟骨の生体力学的特性の変化と関連している。本研究では、軟骨細胞の特定の空間パターン変化に関連して、これらの変化を定量化するためにAFMを用いた。各パターン変化に伴い、PCMとECMの両方に対して、弾力性の有意な変化が観察された。局所弾性を測定することで、OAにおける局所組織変性の程度について直接的な結論を導き出すことができます。
Introduction
関節軟骨は血管、神経組織である。まばらに散在した軟骨細胞は、それらが埋め込まれている広大な細胞外マトリックス(ECM)を産生し、組織し、維持する。ECMの明確で特殊な部分として、軟骨細胞は、細胞周囲マトリックス(PCM)として知られている特殊なマトリックスの薄い層に囲まれています。PCM は、軟骨細胞2を保護し、その生合成応答3を調節するメカノイセン症セルマトリックス インターフェース1として機能します。先に説明した4、健康軟骨において、軟骨細胞は、各組織層および関節44、55に特異的であり、関節特異的な機械的負荷機構6に依存する特定の、明確な空間パターンに配置される。これらのパターンは、健康な軟骨のペアと文字列から変形性関節症(OA)の発症を伴う二重弦に変化する。この疾患のさらなる進行に伴い、軟骨細胞は小さなクラスターを形成し、高度なOAでは大きなクラスターに徐々に大きなクラスターのサイズが増加する。組織構造の完全な損失とアポトーシスの誘導は、エンドステージOAで観察されます。これにより、軟骨細胞配列は、OA進行4の画像ベースバイオマーカーとして使用することができる。
細胞や組織の生体力学的性質は、その形状や機能を調節するだけでなく、その活力を維持するためにも重要です。弾力性の変化は、癌やOAのような主要な疾患の発症を伝播または引き起こす可能性があります。原子間力顕微鏡(AFM)は、ピコニュートンからミクロニュートンまで、幅広い力を測定する、特定の生物学的標的構造の生体力学的特性を定量的に定性的に特徴付ける強力なツールとして登場しました。AFMの主な応用は、サブナノメートルの分解能7でサンプルの表面地形と機械的特性を測定することです。測定装置は3つの主要な部品から成っている:1)AFMプローブは、片持ち面に取り付けられた鋭い先端であり、サンプルの表面との直接の相互作用に使用される。カンチレバーに力が加えられると、後者の変形は、測定された組織の特性に従って起こる。2)レーザービームをカンチレバーに投影し、検出器に反射する光学系。3)カンチレバーから偏向した光をキャッチするフォトダイオード検出器。カンチレバーによるレーザー偏向に関する受信情報を、解析可能な力曲線に変換します。
したがって、AFMの主な原理は、AFMプローブとサンプルの標的構造との間で作用する力の検出である。得られた力曲線は、弾性、電荷分布、磁化、降伏応力、弾性塑性変形力学8のようなサンプル表面上のターゲット構造の機械的特性を表す。AFMの他のイメージング技術に対する重要な利点は、AFMが、組織を損傷することなく、ネイティブ状態の培地または組織の生きた細胞の機械的特性を測定するために使用できることです。AFMは液体か乾燥した条件の両方で作動できる。サンプル準備の要件はありません。AFMは、標本を画像化し、生理学的条件に近い標本で同時にその機械的特性を測定する可能性を提供します。本研究では、ネイティブ関節軟骨におけるPCMおよびECMの弾性を測定することによってOAの進行を評価するための新しいアプローチを説明する。軟骨細胞の空間組織と局所組織変性の程度の相関は、OAの早期発見のための全く新しい視点を提供する。しかし、これらのパターンの機能的関連性は、今のところ評価されていません。関節軟骨の主要な機能は低摩擦での耐荷重であるため、組織は弾性特性を有する必要があります。AFMは、ECMの弾力性だけでなく、PCMに埋め込まれた空間セルラーパターンの測定も可能にします。軟骨細胞の空間パターン変化との弾力性の観察された相関関係は非常に強く、弾力性を測定するだけで局所組織変性の成層を可能にする可能性があります。
PCMとECMの弾性率は、軟骨サンプルの同時可視化を可能にする反転相コントラスト顕微鏡に統合されたAFMシステムを使用して、35μm薄いセクションで評価しました。このプロトコルは、我々の研究室9から既に発表された研究に基づいており、具体的には、軟骨細胞の空間的配置を特徴付ける方法と、それらの関連するPCMおよびECMの弾力性を測定する方法を記述する。軟骨細胞のパターン変化のたびに、PCMとECMの両方に対しても大きな弾力性の変化が観察され、この技術を使用して軟骨の変性の段階を直接測定することができます。
この検証されたアプローチは、巨視組織の分解が実際に現れ始める前に、初期段階でOAの進行と治療効果を評価する新しい方法を開きます。AFM測定を一貫して行うことは困難なプロセスです。以下のプロトコルでは、AFMによって測定されるサンプルを調製する方法、カンチレバーの調製から始まる実際のAFM測定を行う方法、AFMを較正する方法、および測定を行う方法について説明する。ステップバイステップの手順は、信頼性の高いデータを取得し、それを処理し、解釈するための基本的な戦略を提供するための明確で簡潔なアプローチを提供します。また、この厳格な方法の最も一般的な落とし穴についても説明し、トラブルシューティングのヒントも紹介します。
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Protocol
ヒト軟骨サンプルは、ドイツの火ビンゲン大学病院整形外科部門と、ドイツのロッテンブルク病院で膝の末期OAに対して全膝関節形成術を受けている患者から得られた。研究開始前に、部門、機関、および地方の倫理委員会の完全な承認を得ました (プロジェクト番号 674/2016BO2).インフォームド・コンセントは、参加前にすべての患者から受け取られました。方法は、承認されたガイドラインに従って行った。
1. サンプル準備
- クライオトーム切片付けのための軟骨の準備
- 膝関節の変性変化を評価するために、患者からの組織切除後の大腿骨顆の荷重帯から得られた関節軟骨サンプルを採取する。
注:調査対象のサンプルには、内側と外側の表面に対する組織の配向を明確に識別できるように、少なくとも軟骨下骨の薄い層が含まれている必要があり、したがって、最上位の軟骨層の標準化された組織収穫も可能にする。軟骨は、手術後24時間までAFM測定に使用することができる。この組織は、使用前に2%(v/v)ペニシリンストレプトマイシンおよび1.2%(v/v)アンホテリシンBを有する無血清無換えのダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)に保存することができる。しかし、24時間以上サンプルを保存すると、組織の腫れによるAFM測定でアーティファクトが発生する可能性があります。 - メスの助けを借りて軟骨下骨から全体として関節軟骨を切断し、その後、クライオトーム装置で低温下で凍結する凍結用ノブに水溶性埋め込み培地に軟骨サンプルを埋め込みます。
注:凍結培地は、それが包む組織を安定させる。また、埋め込み培地と共に軟骨サンプルの凍結をもたらす。骨から軟骨を切断する場合は、組織の向きを追跡します。凍結節のために埋め込まれた組織は、軟骨の最上層(すなわち、関節面)が刃に向かうような方法で配置されなければならない。なお、組織は埋め込み培地で完全に覆われね。
- 膝関節の変性変化を評価するために、患者からの組織切除後の大腿骨顆の荷重帯から得られた関節軟骨サンプルを採取する。
- 軟骨のクライオトーム切片
- 標準的なクライオトームを使用して、凍結水溶性埋め込み培地に埋め込まれている関節軟骨の最上層(すなわち、関節面)から厚さ35μmの組織を切り離す。
注:合計で、最大300 μm(約9つのセクションに相当)を切り分け、解析に使用することができます。提案された300μmの限界は、関節軟骨のようなヒアリン軟骨の蛍光顕微鏡法で通常得ることができる視覚浸透深度に対応する。これにより、主要な局所空間パターンに従って軟骨を並べ替え、次いで対応するセクションでこれらのパターンを測定することができる。 - ガラススライド上のセクションを収集し、水溶性埋め込み培地を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でセクション3xをすすいでください。
- 標準的なクライオトームを使用して、凍結水溶性埋め込み培地に埋め込まれている関節軟骨の最上層(すなわち、関節面)から厚さ35μmの組織を切り離す。
- AFM互換ペトリ皿への軟骨切片の接着
注: AFM はサンプル上の機械的なインデントによってデータを収集するため、正確な測定を可能にするためにセクションを固定する必要があります。- 35 μmの厚いセクションを、AFMデバイスと互換性のある組織培養皿に生体適合性サンプル接着剤でそっと接着します。これを行うには、接着剤の2〜3滴を取り、セクションの端が終わる場所で組織培養皿の上に置きます。今、接着剤の上に軟骨セクションを置き、それがティッシュ培養皿の表面にしっかりと固執することを可能にします。
注:ヒヤリン関節軟骨の厚さ35μmの部分は、カーリングを起こしやすいものではありません。ただし、バッファー媒体からサンプルを取り除く際にカーリングが発生する場合は、できるだけ少ない液体がサンプルに付着するようにしてください。余分な水が乾燥するとすぐに、細胞培養皿の表面に固定されるように、接着剤の分散されたスポットに組織を直接広げる。接着剤は、薄いレイヤーで、サンプルの端にのみ適用され、セクション全体には適用されません。接着領域から遠い部分のみを測定して、測定に干渉する接着剤の可能性を排除します。 - 接着剤と組織が適切に接着できるように、室温(RT)で2分間切片をインキュベートします。その後、L-グルタミンなしで、完全に水没するように重炭酸ナトリウムなしでライボヴィッツのL-15培地でセクションをカバー.
注:固定中または不十分な接着剤の塗布中にサンプルの突然の動きは、組織が培養皿から剥離する結果となる一般的な間違いです。さらに、ライボウィッツ媒体を適用することは、媒体によって作成された「波」のために表面からサンプルを取り外さないように、穏やかな方法で行われるべきです。 - 測定が行われるまで、標準的な細胞培養インキュベーターに接着されたセクションを含むペトリ皿を37°Cに置きます。
注:各ステップをゆっくりと行うことによって、組織切片が安定しており、組織培養皿の表面から切り離さないようにしてください。
- 35 μmの厚いセクションを、AFMデバイスと互換性のある組織培養皿に生体適合性サンプル接着剤でそっと接着します。これを行うには、接着剤の2〜3滴を取り、セクションの端が終わる場所で組織培養皿の上に置きます。今、接着剤の上に軟骨セクションを置き、それがティッシュ培養皿の表面にしっかりと固執することを可能にします。
2. カンチレバー調製 (微小球を接着)
- AFM デバイスの準備と微小球の希釈
- 空気測定用に指定したガラスブロックに片持ち面を置き、スプリングで固定し、AFMヘッドにガラスブロックを取り付ける。
- マイクロスフィアを100%エタノール(100個の粒子/10 μL)で希釈し、超音波処理を10秒にして、微小球が分離して凝集しないようにします。
- 接着のためのセットアップの準備
- 70%エタノールでガラススライドをクリーニングし、AFMデバイスのサンプルホルダーに取り付けます。
注: スライドのクレンジングにより、接着プロセスを妨げる塵の斑点がスライドの表面に蓄積するのを防ぐことができます。 - スライドの中央にマイクロスフィア懸濁液の2μLを、マイクロスフィアサスペンションの近くに2μLの接着剤を配置します。
注: マイクロスフィアのサスペンションと接着剤を互いに近くに置くと、接着剤と微小球の間で片持ち面をすばやく移行できるようにすることをお勧めします。カンチレバーを接着剤に浸漬して微小球と接触させる間の遷移が長すぎると、接着剤は最終的に硬化し、接着特性を失います。 - エタノール液体をマイクロスフィア懸濁液中で空気乾燥させ、マイクロスフィアを所定の位置に残します。
- 70%エタノールでガラススライドをクリーニングし、AFMデバイスのサンプルホルダーに取り付けます。
- カンチレバー先端の微小球を接着する
- チップが接着剤で覆われるまで、ステッパーモーターの助けを借りて、片持ちレバーを手動で接着剤に浸します。接着剤が速く乾燥するので、このステップを迅速に実行します。
- 片持ち片持ちを再び100 μm引き込み、マイクロスフィアに向かって移動し、片持ちの先端を単一のマイクロスフィアの真上に配置します。
- 力分光法測定を実行して、選択したミクロスフィアにカンチレバーの先端を浸し、表1に示すパラメータを使用します。
注: このステップを実行すると、マイクロスフィアの表面の測定を使用して、片持ち面の先端と微小球との接触を確立します。表1に示す比較的長い接触時間により、接着剤と微小球との間の十分な接合時間が可能となる。この工程で得られた力距離曲線は、カンチレバー先端に微小球を接着する副産物として生成され、さらなる分析のために処理されない。 - ミクロスフェアを片持ちに取り付けたら、片持ち面を上部に取り付けたガラスブロックを引き込み、顕微鏡からAFMヘッドを取り外します。最後に、AFMヘッドからガラスブロックと片持ち面を取り外します。
- 65°Cでカンチレバーを2時間インキュベートし、測定を開始する前にRTで一晩乾燥させます。
注:カンチレバーのインキュベーションは接着剤の接着特性を高め、カンチレバーマイクロスフィア複合体をより安定にします。
3. 測定用のAFMデバイスの準備
- 上面が AFM ホルダーに対して平行になるように、AFM ホルダーの液体環境で測定するために指定されたガラス ブロックを調整します。
- ピンセットの助けを借りて、慎重に、マイクロスフィアとAFM先端が研磨された光学平面の上に突き出るように、ガラスブロックの表面に選択した片持ち体を取り付けます。
注:カンチレバーの先端は、AFMのレーザーを光検出器に反射させるために、磨かれた平面の上に突き出る必要があります。ガラスブロックの研磨光学表面を傷つけないように、AFM上に片持ちレバーを置く際には非常に注意してください。ガラスブロックを傷つけると、レーザーの位置合わせの調整が困難になり、その後の測定に支障をきたす場合があります。 - カンチレバーは機械的圧力の影響を受けるため、所定の位置に固定する必要があります。金属スプリングをブロックの溝にスライドさせ、ピンセットの助けを借りて、スプリングで片持ちの上部をクランプすることによって、ガラスブロックの片持ち面を安定させる。
- ガラスブロックをAFMヘッドに慎重に置き、統合されたロック機構で固定します。ばねが左側に向いているため、片持ちレバーが正しい方向に配置されるようにします。次に、AFMデバイスに片持ち器を取り付けてAFMヘッドを取り付けます。
4. カンチレバーのサンプルとキャリブレーションのロード
注:ここでは、デバイスのキャリブレーションは、サンプル組織なしでライボヴィッツの媒体で満たされたペトリ皿のきれいな表面に力曲線を実行することによって実行されます。キャリブレーションは、試料を含まないAFM培地のみを充填した別の制御AFMディッシュを用いて行うこともできます。
- AFM デバイスへのサンプルの取り付け
- ステップ1.3.3で用意したペトリ皿をAFMサンプルホルダーに置きます。
- ペトリ皿ヒーターをオンにし、37 °Cに設定します。組織培養皿が最適な温度(すなわち、20分)に達することを許可する。
- AFMヘッド内の媒体の凝縮を避けるために、片持ち体アセンブリのベースに保護ホイルを置きます。
- デバイスのキャリブレーション
- ソフトウェア (材料表) を開き、レーザー位置合わせウィンドウ、およびアプローチパラメータ設定を示すウィンドウを開きます。次に、ステッパーモーター、レーザー光、CCDカメラをオンにします。
- 顕微鏡のCCDカメラを使用して、カンチレバーを可視化して識別します。ステッパーモータ機能を使用して、カンチレバーが媒体に完全に沈むまで100 μmのステップでカンチレバーを下げます。
メモ:液体中のカンチレバーの沈み込みは、CCDカメラを介して視覚的に識別可能です。水面を壊すと、片持ち線先端は水中で簡単に目立つ円形の反射を作り出します。 - 調整ねじを使用して、片持ちレバーの上にレーザーを向けます。
注: ネジはレーザーアライメント機構を損傷するので、ねじを巻き戻しません。カンチレバーは下から見て、レーザービームは上から来る。 - レーザーがカンチレバーに配置されたら、反射されたビームが光検出器の中心に落ちるように、AFMデバイスのネジの助けを借りてレーザービームを調整します。レーザーアライメント機能を使用して、レーザー光の位置を監視し続けます。
メモ:検出器は、カンチレバーで反射したレーザービームの偏向を拾い上げ、電気信号に変換します。 - レーザー片持ち面調整の後、Sum信号は1V以上である必要があり、横方向および垂直偏向は0に近くなければなりません。これらの値が得られない場合は、光検出器を調整します。
- 較正力曲線の取得
- 測定を開始するためにAFM皿の表面に到達するために、表2に示したアプローチパラメータを使用してスキャナアプローチを実行します。組織培養皿の底部に達したら、片持ち面を100μm引き込みます。
注:この時点で、プローブはティッシュ培養皿の底からちょうど100 μm上にあります。 - RUNパラメータを設定し、表 3に表示されるパラメータを調整します。[RUN]ボタンをクリックして測定を開始し、キャリブレーション力距離曲線を取得します。
注: ここで得られる力曲線を図 1に示します。 - キャリブレーション力距離曲線で、ソフトウェア内のリニアフィットの領域を選択します。
メモ:直線フィットは、カンチレバーの感度を測定するために行われます。線形フィットが配置されると、値はソフトウェアによって保存されます。ばね定数測定またはカンチレバーの熱ノイズは、その後ソフトウェアによって計算されます。 - 測定は37°Cの温度で媒体で行われるように、できるだけ密接に生理的条件を模倣するようにソフトウェアの37°Cに温度変数を設定します。
注: キャリブレーションの終了までに、垂直偏向が保存され、フォトダイオード検出器による元の登録の単位であるボルト(V)ではなく、力の単位であるニュートン(N)に表示されます。
- 測定を開始するためにAFM皿の表面に到達するために、表2に示したアプローチパラメータを使用してスキャナアプローチを実行します。組織培養皿の底部に達したら、片持ち面を100μm引き込みます。
5. AFMを介した弾性測定によるECMおよびPCMの生体力学的特性解析
- 軟骨部の軟骨細胞パターンの同定
- AFMシステムに組み込まれた位相コントラスト顕微鏡下で軟骨部を観察し、変形性膝関節症の関節軟骨の特定の細胞パターン10を同定する:単一の文字列(健康な組織領域)、二重文字列(組織変性の開始)、小および大きなクラスター(両方の高度な組織変性)。図 2A-Dを参照してください。
- 特定の目的のパターンが特定されたら、マトリックスタイプ(PCMまたはECM)ごとに選択されたパターンごとに2つの部位を測定し、各測定部位で9回の測定繰り返しを行う(図2E,F)。サンプルサイズが不正確な可能性を考慮できるように十分な大きさを確保します。
注: PCM 測定では、セルの近くに片持ちレバーを配置します(図 2E,Fの赤い円で示すように)。ECM の測定を行うために、セルのない領域 (図 2E,Fの青い領域で示されている領域) を選択し、ステップ 5.2 で説明したようにインデントを実行します。
- 対象サイトのインデント
- アプローチを実行し、続いて引き込み、カンチレバーが組織の上に100 μm配置されるようにします。
- 測定するパターンの PCM または ECM に焦点を当て、その時点でコンピューターのマウスを固定します。
注: マウスは、インデントのターゲット サイトのビジュアル マーカーとして機能します。焦点が片持ちの先端に移ると、組織構造は区別がつかないか、またはぼやける。 - 次に、プローブに焦点を合わせ、プローブの先端をコンピュータの矢印で以前に固定された位置に移動します。次に、カンチレバーのキャリブレーションによって得られた設定点パラメータを使用して、RUNで測定を開始する。
注: 単一の文字列の PCM を測定した場合に得られる例示的な力曲線を補足図 1に示します。
6. データ処理
注: 弾性係数のデータ分析または決定は、前に説明した11、,12のように Hertz モデルを使用して実行されます。インテンターの形状は先端の微小球の使用により球状であり、ポアソンの比率は、前の文献13、14、1514,15に基づいて0.5に保たれた。13
- AFM装置から取得したデータと互換性のあるデータ処理ソフトウェア(資料表)を開きます。
- 力距離カーブを処理するソフトウェアで、Hertz モデルを選択します。ポアソン比を0.5に設定し、先端形状を球面、先端半径12.5μmに設定します。
- すべてのパラメータが調整されると、結果が適合され、ヤング率が計算され、ソフトウェアによって表示されます。
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Representative Results
弦から二重弦、小さな、そして最後に大きなクラスタまでの病理学的モデルに沿って、ECM(図3A)とPCM(図3B)の両方が、各パターン変化の間で大幅に減少しました。唯一の例外は、文字列と二重文字列の間の ECM の違いでした (p = 0.072)。結果は、ECM/PCM比(図4B)が有意に変化しなかったことを示し、ECMとPCMの間の弾力性の絶対差の著しい減少は観察された(図4A)。さらに、ECM/PCM比または関連するセルラー空間的変化(r = -0.099、p = 0.281)に関する有意な関連付けを示さない。
図1:AFM接触モードにおける力距離曲線の概略表現プローブが表面に近づくと、力が小さすぎて、最初は先端の測定可能な偏向を与え、したがって先端は邪魔されない位置に残ります(1)。そして、カンチレバーが試料に非常に近い場合、先端とプローブの間で活性な接着力に起因し、カンチレバーは実際にサンプル(2)に向かって素早くスナップする。プローブがサンプルにさらに近づくと、反発的な偏向は方向の動きに対して直面し、垂直偏向が相対的な設定点値(3)に達するまで、高さと偏向のほぼ線形関数を使用します。(4)を後退させると、偏向力の低下に加えて、カンチレバーがサンプルからZ軸に引き込まれる間、接着力も存在する。AFMプローブがサンプルとの接触を取り除くと、まず、界面での接着から緩む前に「スタック」し、カンチレバーの短い負の偏向を招き、プローブ(5)と接触することなく、再び曲げられていない中性位置に到達する。偏向の程度は、ナノニュートンで発現する片持ち体に働く力で表される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:細胞外マトリックス(ECM)および細胞内マトリックス(PCM)の軟骨細胞およびAFM測定の代表的な空間的特徴付け。(A-D)セルラーパターンの特徴:文字列(A)、二重文字列(B)、小さなクラスタ(C)、ビッグクラスタ(D)PCM(赤い円)とECM(青い領域)の弾性率(E/F)は、変形性関節症軟骨における異なる細胞パターンについて評価した。FECMとPCMの測定部位は実験者によって選択され、黒い十字によってグラフィカルに示される。測定に使用される片持ちの先端は白い星によって印が付いている。スケールバーは10 μm(A-D)、100 μm(E/F)を表します。A-DEFこの図は、ダナラチェら9.9この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:空間軟骨細胞組織の関数としての細胞外マトリックス(ECM)と細胞内マトリックス(PCM)の定量化ヤング率の比較。進行性病理学的空間軟骨細胞組織では、ECM(A)およびPCM(B)(*p<0.05、***p<0.001)の両方のボックスプロットで徐々に弾力性の低下が指摘された。B略語: SS: 単一文字列, DS: 二重文字列, SC: 小さなクラスター, BC: 大きなクラスター.数字はダナラチェら9.から取られる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:細胞空間組織の機能としての細胞外マトリックス(ECM)と細胞内マトリックス(PCM)のヤングのモジュライの関係。ますます病理学的空間的軟骨細胞組織は、ECMとPCMの両方に対するヤングのモジュライの減少に関連していた(A)。これらの空間的変化が起こったが、ECMとPCMの弾力性の比率は一定のままで、有意な変化は示さなかった(B)。データは、平均値 ± 標準誤差 (A) と箱ひげ図 (B) を持つ線図として表示されます。略語: SS: 単一文字列, DS: 二重文字列, SC: 小さなクラスター, BC: 大きなクラスター.数字はダナラチェら9.から取られる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:適合結果(オレンジ矢印)と残存根平均平方根(残存RMS;黒矢印)を示す単一の文字列パターンの細胞間マトリックス(PCM)のインデントによって得られる代表的な力曲線。適合結果には、サンプルとチップの間の接触点、ヤング率、ベースラインが含まれます。以下に表示される残差 RMS は、適合と力のデータの差を示し、力曲線の適合の品質を表します。こちらをダウンロードしてください。
| 表 1.AFM-プローブ上の微小球の接着に関するパラメータ | |
| パラメーター | 値 |
| Setpoint | 5.0 V |
| ベースラインを調整する | 1 |
| 引っ張り長さ | 90.0 μm |
| Zムーブメント | 一定の速度 |
| 速度を拡張する | 5.0 μm/秒 |
| 時間を延長する | 18.0 s |
| お問い合わせ時間 | 90.0 s |
| 遅延モード | 一定の力 |
| サンプルレート | 2000 Hz |
表 1.AFMプローブ上の微小球を接着するためのパラメータ。
| 表 2.アプローチパラメータ | |
| アプローチパラメータ | 値 |
| アプローチ IGain | 5.0 Hz |
| アプローチ PGain | 0.0002 |
| アプローチターゲットの高さ | 10.0 μm |
| アプローチのセットポイント | 5.00 V |
| アプローチベースライン | 0.00 V |
表 2.アプローチ パラメータ。
| 表 3.パラメーターの実行 | |
| パラメーター | 値 |
| Setpoint | 1.0 V |
| ベースラインを調整する | 1 |
| 引っ張り長さ | 90.0 μm |
| Zムーブメント | 一定の速度 |
| 速度を拡張する | 5.0 μm/秒 |
| 時間を延長する | 18.0 s |
| お問い合わせ時間 | 0.0 s |
| 遅延モード | 一定の力 |
| サンプルレート | 2000 Hz |
表 3.パラメータを実行します。
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Discussion
AFMをナノスケールレベルで生体材料の生体力学的特性を測定する新しい強力な技術として、ヒト変形性関節関節関節軟骨におけるECMおよびPCMの弾性特性を測定した。軟骨サンプルは、局所組織変性のための画像ベースのバイオマーカーとして軟骨細胞組織のそれらの主要な空間パターンに従って選択した。予想通り、空間軟骨細胞再編成に伴い、ECMとPCMの両方の弾性値の強い低下が見られた。これらの観測は、軟骨細胞の空間的配置における偏差が、細胞微小環境(PCM)の弾性特性の変化だけでなく、軟骨全体(ECM)全体の変化と関連していたことを明確に示している。さらに、ECM/PCM比は、OA中のPCMおよびECMの弾性係数の強い変化にもかかわらず、有意な変化を示さなかった。これらの知見は、ECMとPCMの機械的特性の変化が一方向かつ同時に起こったことを示しており、これは進行性破壊の性質がPCMとECMの両方で類似していることを意味する可能性がある。OA の開始と進行は、PCM および ECM の大幅な低下と最終的な破壊を引き起こします。両損失は、本研究に示すように、その弾性などの関節軟骨の生体力学的特性の有意な損失と関連していた。これは、生体力学的特性のマーカーとしての軟骨細胞の空間的組織の機能的関連性を強調する。逆に、局所的な弾性測定を使用して、局所的に支配的な空間パターン、したがって軟骨の局所組織変性に関する結論を導き出すことができます。
原子間力顕微鏡(AFM)は、非破壊的な方法で組織を研究するための高解像度ツールとして登場しました。これは、フォトダイオードにレーザーを反射する繊細で柔軟な片持ち体を持つサンプルを物理的に探査することによって動作します。この反射の変更は登録され、電気信号に変換されます。AFMはナノスケールの測定を行う強力なツールですが、限界と落とし穴なしには来ません。特に重要なのは、マイクロスフェアを接着することによってカンチレバー調製物です。この方法の文脈では、マイクロスフィアは、測定中にインデント深度と局所圧力を変更するために使用されます。プローブの先端に取り付けられた小さな微小球を使用すると、先端を単独で使用する場合の単繊維の弾力性ではなく、ファイバーネットワークの生体力学的特性を測定できます。それはまた測定プロセスの間にティッシュの損傷を防ぐ。片持ちセンサの繊細な性質により、一貫した正確な測定を得るためには、注意深く慎重な準備モードを確立する必要があります。マイクロスフィアがセンサーの先端から外れないように、1週間以上古くない新しい混合接着剤をお勧めします。さらに、微小球アタッチメントの横偏差が測定に一貫性を持たなくなるので、センサーの機能性が先端の中心にマイクロスフィアを配置することが重要です。
ガラスブロックに片持ちレバーを置き、フィッティングスプリングで固定することは、細心の注意と安定した手を必要とする繊細でエラーが発生しやすいプロセスです。片持ちレバーは訓練を受けていないオペレータによって破壊される可能性が非常に高いため、AFMの簡単に破損しやすいコンポーネントを快適に処理するために、いくつかのテスト実行と練習を行うことをお勧めします。
クリーンガラスブロックは、デバイスを適切に較正し、信頼性の高い測定を得るために不可欠です。ブロックの光学表面の汚れやほこりは、光検出器上の適切なレーザーの位置合わせを妨げる可能性があります。したがって、レーザーアライメント中に問題が発生した場合、ガラスブロックをエタノールで2度目に洗い流す必要があります。
弾性率のデータ分析または決定は、前に説明したHertzモデルを使用して行うことができます11,,12.つまり、インデントによって生成されるデータは、カンチレバー先端の動きに対する力のプロットです。測定の間、カンチレバーはサンプルの方向に動く。これは、カンチレバーがサンプルと接触し、その後、それが最初に移動したものとは反対の方向に曲がることにつながります。同時に、一定量のサンプルのインデントが発生します。Hertz-fit モデルを使用するには、片持ちの曲げパラメータを分離するためにサンプルのインデントを計算し、調整する必要があります。サンプルを説明するパラメータはポアソン比で、調査対象の材料によって異なります。軟質生物学的サンプルの場合、ポアソンの比率は、多くの場合、0.515に設定されています。前述のように、使用されるインテンターの形状は、元のヘルツ方程式に対して行わなければならない拡張を指示するので、ヤング率の計算に関連しています。上記実験の場合、微小球の使用により球面インダンター形状が想定される。
AFM はデータ収集の新しい興味深い可能性を提供する可能性がありますが、結果として得られるデータの一貫性と信頼性は、それぞれのオペレータの経験に大きく依存します。上記の手順のいくつかは、人為的ミスを起こしやすいものであり、それらを適切に実行するために忍耐と細心の注意を必要とします。
測定結果に影響を与える可能性のある多くの敏感な変数のために、この研究で報告された絶対力値は一般化できず、実験的な設定に対してはかなり具体的です。この技術を使用して軟骨の組織変性を評価する場合、まず異なる空間パターンでの正規化測定を行い、結果を特定の実験測定設定にスケーリングする必要があります。ただし、異なる弾性係数と空間パターンの関係は影響を受けません。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
私たちは、彼らの助けとサポートのために元の出版物からの私たちの共同執筆者に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck | A2942 | |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | H000033 | |
| Cantilever | tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| Microspheres | Polysciences | 07313-5 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather | 2023-01 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 |
References
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