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Chemistry

आयरन रेडॉक्स प्रजाति (Fe(II), Fe (III) के क्वांटिफिकेशन के लिए केपिलरी इलेक्ट्रोफोरेसिस-प्रेरक रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीई-आईसीपी-एमएस) का सेटअप

doi: 10.3791/61055 Published: May 4, 2020

Summary

यह आयरन रेडॉक्स स्पेसाइजेशन विधि एक रन में लघु विश्लेषण के साथ संयुक्त नमूना स्टैकिंग के साथ केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस-प्रेरक रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित है। विधि जल्दी से विश्लेषण करती है और ऊतकों और बायोफ्लूइड नमूनों की एक विविध श्रृंखला में लोहे के रेडॉक्स प्रजातियों के लिए मात्राकरण की कम सीमा प्रदान करती है।

Abstract

लौह चयापचय के डिस्होमोस्टेसिस कैंसर और कई न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों सहित कई बीमारियों के पथिकविज्ञानी ढांचे में हिसाब है। अत्यधिक लोहे के परिणामस्वरूप मुफ्त रेडॉक्स-एक्टिव फे (II) होता है और ऑक्सीडेटिव तनाव (ओएस) और लिपिड पेरोक्सिडेशन द्वारा मौत जैसे सेल के भीतर विनाशकारी प्रभाव पैदा कर सकता है जिसे फेरोप्टोसिस (एफपीटी) के नाम से जाना जाता है। इसलिए, कुल Fe-निर्धारण के बजाय फेरस (फे (II)) और फेरिक (एफई (III)) लोहे के मात्रात्मक माप इन हानिकारक प्रक्रियाओं में करीब अंतर्दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि Fe (II)/(III) निर्धारण तेजी से redox-राज्य बदलाव और प्रासंगिक नमूनों में कम सांद्रता, सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (CSF) की तरह द्वारा बाधित किया जा सकता है, तरीकों उपलब्ध होना चाहिए कि जल्दी से विश्लेषण और मात्राकरण (LOQ) की कम सीमा प्रदान करते हैं । केशिलरी इलेक्ट्रोफोरेसिस (सीई) फास्ट फे (II) /Fe (III) जुदाई का लाभ प्रदान करता है और एक स्थिर चरण के बिना काम करता है, जो रेडॉक्स संतुलन में हस्तक्षेप कर सकता है या एनालिट चिपके हुए का कारण बन सकता है। एक डिटेक्टर के रूप में प्रेरक रूप से प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-एमएस) के साथ संयुक्त सीई पता लगाने की संवेदनशीलता और चयनशीलता में और सुधार प्रदान करता है। प्रस्तुत विधि एक पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट और + 25 केवी के वोल्टेज के रूप में 20 mM एचसीएल का उपयोग करता है । पीक आकृतियों और एकाग्रता का पता लगाने की सीमा में चालकता-पीएच-स्टैकिंग द्वारा सुधार किया जाता है। 56[एआरओ]+ कोकम करने के लिए आईसीपी-एमएस को रिएक्शन गैस के रूप में एनएच3 के साथ डायनेमिक रिएक्शन सेल (डीआरसी) मोड में संचालित किया गया था। विधि 3 μg/L का पता लगाने (LOD) की एक सीमा प्राप्त करता है स्टैकिंग के कारण, उच्च इंजेक्शन की मात्रा जुदाई में बाधा के बिना संभव थे, लेकिन LOD में सुधार । पीक क्षेत्र से संबंधित अंशांकन 150 माइक्रोग्राम/एल माप परिशुद्धता 2.2% (Fe (III)) से 3.5% (Fe (II)) तक रैखिक थे। मानव न्यूरोब्लास्टोमा (एसएच-SY5Y) कोशिकाओं के 1:2 पतला lysates में निर्धारित दोनों प्रजातियों के लिए माइग्रेशन समय परिशुद्धता और एलटी;3% था। मानक इसके अलावा के साथ वसूली प्रयोगों 97% Fe (III) और 105% Fe (II) की सटीकता का पता चला। सीएसएफ जैसे वास्तविक जीवन के जैव-नमूनों में, माइग्रेशन का समय अलग-अलग चालकता (यानी लवणता) के अनुसार भिन्न हो सकता है। इस प्रकार, मानक इसके अलावा से चोटी की पहचान की पुष्टि की जाती है।

Introduction

आज, यह सबसे स्पष्ट है कि लौह-मध्यस्थता ऑक्सीडेटिव तनाव (ओएस) विशेष रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव मस्तिष्क विकारों में कई विकारों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जैसे अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग के साथ-साथ कैंसर1,,2,,3,,4में। ओएस का राज्य और संतुलन से बारीकी से संबंध है- रेडॉक्स-कपल फे (II)/Fe (III)। जबकि फे (III) रेडॉक्स-निष्क्रिय है, Fe (II) शक्तिशाली रूप से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी उत्पादन और झिल्ली लिपिड पेरोक्सिडेशन5,,6से पीछा करने वाले एच22 अपघटन को उत्प्रेरित करता है। आणविक स्तर पर, फे (II) जनित आरओएस और पेरोक्सीडाइज्ड फॉस्फोलिपिड प्रोटीन, लिपिड और डीएनए7,,8की अखंडता के लिए एक मजबूत हमला है। इसतरह के हानिकारक सेलुलर शिथिलता को कम एटीपी-सामग्री 9 के साथ माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को प्रेरित करने के लिए प्रदर्शित किया गया था और यहां तक कि एक प्रोग्राम किए गए नेिगमी सेल डेथ को भी ट्रिगर कर सकते हैं, जिसे फेरोप्टोसिस (एफपीटी)10, 11,के नाम से जानाजाताहै। इसलिए, रेडॉक्स से संबंधित विकारों के व्यापक स्पेक्ट्रम में मात्रात्मक Fe (II)/(III) रेडॉक्स स्पेकेशन का प्रख्यात महत्व है।

सामान्य 7 , 8 के साथ - साथ न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों 12 , 13 ,14,,,14,,15 ,1516,1617में जैविक भूमिका और चयापचय का पता लगाने के लिए रासायनिक नमूना एक सुस्थापित उपकरण है ।717 साहित्य में पाए जाने वाले फे-रेडॉक्स स्पेकेशन के तरीके आम तौर पर तरल क्रोमेटोग्राफी (एलसी) पृथक्करण पर आधारित होते हैं। साहित्य के कुछ एक तत्व चयनात्मक डिटेक्टर के रूप में प्रेरक रूप से प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-एमएस) युग्मित का उपयोग करें । हालांकि, रूटीन एलसी वर्क में रनों के बीच अत्यधिक शुद्ध समय की जरूरत थी । एलसी कॉलम के और भी अधिक समस्याग्रस्त, बैच-टू-बैच भिन्नता ने प्रत्येक कॉलम परिवर्तन के बाद एल्यूशन स्थितियों का पुनः अनुकूलन करने के लिए मजबूर किया। ये समस्याएं हाई-थ्रूपुट में बाधा बन रही हैं । स्वीकार्य विश्वसनीयता हासिल करने और विधि का फिर से अच्छी तरह से मूल्यांकन करने के लिए अतिरिक्त समय की आवश्यकता होती है।

इन कमियों को दरकिनार करने के लिए, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस के आधार पर फे (II) /Fe (III) रेडॉक्स स्पेकेशन के लिए यहां एक विधि प्रस्तुत की जाती है, जो प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीई-आईसीपी-एमएस) को जोड़ते हुए है। सीई एलसी18की तुलना में विभिन्न लाभ प्रदान करता है । केशिकाओं का कोई स्थिर चरण नहीं होता है और इस प्रकार बैच पहचान पर निर्भर (लगभग) नहीं होता है। जब वृद्ध या अवरुद्ध होते हैं, तो उन्हें जल्दी से बदल दिया जाता है, आमतौर पर अपरिवर्तित प्रदर्शन दिखाता है। नमूनों के बीच शुद्ध और सफाई के कदम प्रभावी और कम हैं, और प्रति नमूना विश्लेषण समय भी कम है।

प्रस्तुत विधि योग्यता के अच्छे आंकड़ों के साथ विश्वसनीय है । सिद्धांत के सबूत के रूप में, विधि मानव डोपामिनेर्गिक न्यूरोब्लास्टोमा (एसएच-SY5Y) सेल lysate, न्यूरोडिजेनरेशन के साथ-साथ कैंसर अनुसंधान19में महत्वपूर्ण एक नमूना प्रकार पर लागू होती है।

Protocol

सावधानी: विधि हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल, अल्ट्रापुरे, एकाग्रता 1 एम) और टेट्रामेथिलम्मोनियमहाइड्रोक्साइड (टीएमएएच, अल्ट्रापुरे, एकाग्रता 25% से कमजोर पड़ने की शुरुआत) से कमजोर करने का उपयोग करती है। दोनों पदार्थ दृढ़ता से संक्षारक हैं। त्वचा और आंखों की सुरक्षा का प्रयोग करें।

1. इलेक्ट्रोलाइट्स तैयार करना

  1. एचसीएल-इलेक्ट्रोलाइट्स तैयार करना: पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट (20 mm HCl), आउटलेट इलेक्ट्रोलाइट (5 mM HCl) और इलेक्ट्रोलाइट (0.05 mM HCl) को समाप्त करना
    1. 100 एमएल फ्लास्क में 20 एमसीएम एचसीएल तैयार करें: 1 एम एचसीएल के पिपेट 2 एमएल को फ्लास्क में, अल्ट्रापुरे पानी से निशान तक भरें और धीरे-धीरे हिलाएं।
    2. 100 एमएल फ्लास्क में 5 एमएमएम एचसीएल तैयार करें: फ्लास्क में 1 एम एचसीएल के पिपेट 500 माइक्रोन, अल्ट्रापुरे पानी से निशान तक भरें और धीरे-धीरे हिलाएं।
    3. दो चरणों में 0.05 mM एचसीएल तैयार करें: 20 एमएल एचसीएल के पिपेट 1 एमएल फ्लास्क में, और फिर अल्ट्रापुरे पानी के साथ निशान तक भरें और धीरे-धीरे हिलाएं। इसके बाद, बाद के समाधान के पिपेट 2.5 एमएल को 15 एमएल शंकुनली (सामग्री की तालिका)में और अल्ट्रापुरे पानी के 7.5 एमएल जोड़ें, फिर धीरे-धीरे हिलाएं।
  2. 15 एमएल शंकु नली में अग्रणी इलेक्ट्रोलाइट 12% टीएमए की तैयारी: पाइपेट 4.8 एमएल 25% टीएमएएम ट्यूब में, अल्ट्रापुरे पानी का 5.2 एमएल जोड़ें और धीरे-धीरे हिलाएं।
    नोट: 12% TMAH शुद्ध और प्रत्येक रन से पहले केशिका साफ करने के लिए और इंजेक्शन नमूने के सामने एक प्रमुख इलेक्ट्रोलाइट के रूप में प्रयोग किया जाता है) ।

2. मानकों और नमूनों की तैयारी और भंडारण

  1. मानकों
    1. Fe (II) के लिए, 100 मिलीग्राम फे (II) /L स्टॉक एकाग्रता के लिए अल्ट्रापुरे पानी के साथ 100 मिलीग्राम के निशान तक भरने के लिए 35.61 मिलीग्राम Fe (II) सीएल2· 4H2O का वजन करें। पूर्ण विघटन तक धीरे से हिलाएं।
    2. Fe (III) के लिए, 100 मिलीग्राम फ्लास्क में 29.04 मिलीग्राम फे (III) सीएल3 का वजन करें और 100 मिलीग्राम फे (III) /एल स्टॉक एकाग्रता के लिए अल्ट्रापुरे पानी के साथ 100 एमएल के निशान तक भरें। पूर्ण विघटन तक धीरे से हिलाएं।
    3. काम मानक समाधान तैयार करने के लिए तालिका 1 के अनुसार प्रत्येक मानक समाधान को पतला करें।
      नोट: १०० मिलीग्राम/एल स्टॉक समाधान से दैनिक स्टॉक समाधान तैयार करने के बाद, बाद जमे हुए संग्रहीत किया जाना चाहिए । तालिका 1के अनुसार दैनिक मानकों को तैयार करने के बाद, 1 मिलीग्राम/एल स्टॉक समाधान को 1.5 एमएल वॉल्यूम में अलीको उद्धृत किया जाना चाहिए और 1.5 एमएल ट्यूबों में जमे हुए (शीर्ष पर कोई हवा नहीं बची हुई हवा के साथ सबसे अच्छा) संग्रहीत किया जाना चाहिए। प्रत्येक नए दिन के लिए, एक दैनिक स्टॉक कैप दैनिक मानकों की तैयारी के लिए गल जाता है और उपयोग के बाद वापस ले लिया जाता है।
एकाग्रता शुरू करना पाइपिंग वॉल्यूम मिल्ली-क्यू पानी से भरें जिसके परिणामस्वरूप एकाग्रता अंतिम मात्रा समाधान का उपयोग
100 मिलीग्राम/एल 50 माइक्रोन 4950 माइक्रोल 1 मिलीग्राम/एल 50 एमएल दैनिक स्टॉक समाधान
1 मिलीग्राम/एल 200 माइक्रोल 1800 माइक्रोल 100 μg/L 2 एमएल मानक
100 μg/L
1 मिलीग्राम/एल 100 माइक्रोल 1900 माइक्रोल 50 μg/L 2 एमएल मानक
50 μg/L
1 मिलीग्राम/एल 50 माइक्रोन 1950 माइक्रोल 25 μg/L 2 एमएल मानक
25 μg/L
1 मिलीग्राम/एल 25 माइक्रोन 1975μL 12.5μg/L 2 एमएल मानक
12.5 माइक्रोग्राम/एल
1 मिलीग्राम/एल 20 माइक्रोन 1980μL 10 μg/L 2 एमएल मानक
10 μg/L
0 2000 माइक्रोल 0 μg/L 2 एमएल रिक्त

तालिका 1: मानकों को तैयार करने के लिए पाइपिंग योजना।

  1. एसएच-SY5Y सेल lysate
    नोट: सेल lysate (SH-SY5Y) ने विधि के प्रदर्शन और विश्वसनीयता को दिखाने के लिए Fe (II)/(III)-प्रासंगिक बायो मैट्रिक्स के रूप में कार्य किया ।
    1. पहले से चल रहे प्रयोगों से lysate का उपयोगकरें 16. पीएच परिवर्तन या रसायनों से बचने के लिए इस सेल को lysate तैयारी का पालन करें जो रेडॉक्स संतुलन को प्रभावित कर सकता है। एक संशोधित रेडियोइम्यूनोप्रिपिटेशन परख (RIPA) लाइसिस बफर (पीबीएस पीएच 7.4, का उपयोग करें 0.5% सोडियम डेऑक्सीकोटल, 1% एनपी-40), धातु चेलेटर्स (जैसे ईडीटीए) से बचना, एजेंटों (जैसे डीटीटी, 2-मर्कैप्टोथेनॉल) और एनियोनिक सर्फेक्टेंट डिटर्जेंट और धातु परिसर एजेंट (जैसे एसडीएस) को एफई (II) /Fe (III) अनुपात के संग्रह के बाद परिवर्तन को कम करने के लिए कम करना।
    2. एन2-वायुमंडल के तहत काम परिवेशी हवा से ओ2 द्वारा ऑक्सीकरण को रोकता है और नाइट्रोजन वातावरण के तहत -80 डिग्री सेल्सियस पर जितनी जल्दी हो सके lysate संग्रहीत होने तक किसी भी ऑटोक्सिडेशन को कम करने के लिए बर्फ पर काम करता है।

3. सीई से आईसीपी-एमएस के हाइफेनेशन के लिए उपकरणों की स्थापना

  1. केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण स्थापित करें।
    नोट: इस खंड के लिए, पाठक मुख्य रूप से प्रयोगशाला में उपलब्ध संबंधित उपकरण के मैनुअल के लिए भेजा जाता है।
    1. सीई उपकरण के इनलेट शीशी से आईसीपी-एमएस के नेबुलाइजर तक पहुंचने के लिए उपयुक्त लंबाई के साथ एक केशिका स्थापित करें। केवल इनलेट साइड पर केशिका स्थापित करें और इसे सीई-आईसीपी-एमएस इंटरफेस की ओर उपकरण के बाहर ले जाएं।
      नोट: आईसीपी-एमएस के लिए सीई को हाइफेनेट करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में सामान्य वाद्य सेटअप विवरण के अनुसार 90 सेमी फ्यूज्ड सिलिका केशिका (आईडी 50 माइक्रोन) स्थापित किया गया था। आमतौर पर, प्रयोगशाला में उपकरणों की स्थिति के आधार पर 70−100 सेमी के केशिका आकार की आवश्यकता होगी।
    2. चिकनी संचालन के लिए सॉफ्टवेयर में सीई-इंस्ट्रूमेंट के आउटलेट लिफ्ट को डी-एक्टिवेट करें क्योंकि यह उपयोग में नहीं है जब केशिका को सीई-आईसीपी-एमएस इंटरफेस के बाहर निर्देशित किया जाता है।
    3. आईसीपी-एमएस इंस्ट्रूमेंट के ट्रिगर-इन के लिए सीई-इंस्ट्रूमेंट ट्रिगर-आउट से ट्रिगर केबल स्थापित करें।
    4. सभी आवश्यक समाधानों (20 mM HCl, 0.05 mM HCl, 12% TMAH), मानकों और उपकरण के नमूने और समाधान रोटर में नमूने के लिए पदों का चयन करें और हमेशा की तरह साधन सॉफ्टवेयर में अपनी स्थिति को परिभाषित (साधन के मैनुअल को देखें) ।
    5. नियंत्रित प्रयोगशाला तापमान के समान होने के रूप में 20 डिग्री सेल्सियस पर समान होने के लिए रोटर और केशिका तापमान का चयन करें।
      नोट: सीई उपकरण के अंदर और बाहर केशिका भागों के लिए कोई तापमान ढाल नहीं होता है।
  2. आईसीपी-एमएस इंस्ट्रूमेंट स्थापित करें
    1. दैनिक वाद्य मानक सेटअप और संचालन प्रक्रियाओं के अनुसार आईसीपी-एमएस उपकरण का अनुकूलन करें। निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
    2. 0.6 एमएल/न्यूनतम एनएच3 -फ्लोरेट और आरपीक्यू वैल्यू = 0.45 के साथ एनएच3के साथ डायनेमिक रिएक्शन सेल (डीआरसी) तकनीक का उपयोग करें।
      नोट: लोहे के धब्बे के लिए, एक विधि 56Fe के साथ प्रोग्राम की जाती है, जो सबसे प्रचुर मात्रा में फे आइसोटोप (91.754% सापेक्ष बहुतायत) है, हालांकि,[40एआर16ओ]+ क्लस्टर से गंभीर रूप से हस्तक्षेप किया जा रहा है। मानक मोड में एक क्वाड्रपोल आधारित आईसीपी-एमएस व्यावहारिक रूप से अंधा है और इस आइसोटोप पर ओवरफ्लो में डिटेक्टर है। ऊपर सेटिंग्स के साथ (चरण 3.2.2 देखें), कम बेसलाइन और उच्च संवेदनशीलता हासिल की जाती है (कम एनजी/एल रेंज में नियमित रूप से कुल लौह निर्धारण LOD के लिए प्राप्त किया जाता है)।
    3. सीई-सेपरेशन के दौरान भी तेज और कम दिखने वाली चोटियों की निगरानी के लिए 50 एमएस पर प्रति आइसोटोप एक निवास समय सेटिंग चुनें।
    4. सीई-इंस्ट्रूमेंट द्वारा ट्रिगर-शुरू किए जाने वाले आईसीपी-एमएस विधि को प्रोग्राम करें।
  3. सीई-आईसीपी-एमएस इंटरफेस सेट करें
    नोट: सीई-केशिका को आईसीपी-एमएस से जोड़ने के लिए मुख्य रूप से दो विकल्प हैं। यदि वाणिज्यिक इंटरफ़ेस का उपयोग किया जाता है तो सेटअप के बारे में प्रदान किए गए विवरणों का पालन करें। यह प्रोटोकॉल संशोधनों के बाद पिछले प्रकाशन के आधार पर एक सरल, घर का बना इंटरफेस का उपयोग करता है20. प्रमुख मुद्दे एक कुशल नेबुलाइजेशन हैं, जिसमें संभवतः केशिका के कम कमजोर पड़ने के साथ समग्र प्रवाह को अपनाने से लेकर सर्वश्रेष्ठ नेबुलाइजेशन के लिए नेबुलाइजर तक है। इसके अलावा, नेबुलाइजर से आत्म-आकांक्षा के कारण केशिका को अलग करने के माध्यम से एक सक्शन प्रवाह का न्यूनतमीकरण, और ग्राउंडेड आउटलेट इलेक्ट्रोड का विद्युत कनेक्शन केशिका अंत तक अनिवार्य है।
    1. नेबुलाइजर चयन
      1. कम आत्म-एस्पिरेटिंग वॉल्यूम (जैसे, 100 μL/min) के साथ एक गाढ़ा नेबुलाइजर का उपयोग करें जो कम मात्रा वाले स्प्रे कक्ष में फिट बैठता है।
        नोट: कम तेज अभी भी अनुकूलित नेबुलाइजेशन से समानांतर केशिका efflux के केवल मध्यम कमजोर पड़ने का कारण होगा । आउटलेट इलेक्ट्रोड का विद्युत कनेक्शन आउटलेट इलेक्ट्रोड के चारों ओर और केशिका अंत के आसपास इलेक्ट्रोलाइट प्रवाह द्वारा पूरा किया जाता है।
      2. अलग केशिका के माध्यम से चूषण को कम करने और नेबुलाइजर द्वारा आवश्यक इष्टतम मूल्य के लिए प्रवाह दर को अपनाने के लिए नेबुलाइजर की आत्म-आकांक्षा का उपयोग करें।
      3. इस घर में बने इंटरफेस को माउंट करने के लिए टेबल 2 से निम्नलिखित भागों को तैयार करें।
    2. सरल इंटरफेस का सेटअप
      नोट: सरल इंटरफ़ेस के लिए भाग बढ़ते के विवरण का पालन करने के लिए चित्रा 1 का उपयोग करें। चित्रा 1 में संख्या और निम्नलिखित पाठ में तालिका 2में संख्याओं का उल्लेख है।
      1. दो 3 तरह की महिला Luer कनेक्टर (नंबर 3) एक पुरुष शंकु Luer कनेक्टर (नंबर 4) के साथ कनेक्ट करके इंटरफेस बढ़ते शुरू करो । पुरुष कनेक्टर के लिए निचले 3 तरह Luer बार के बाएं छोर कनेक्ट और ऊपरी 3 तरह Luer के मध्य कनेक्शन के लिए ।
      2. पीटी-वायर (नंबर 7) के ऊपर 1 सेमी ट्यूब (नंबर 1) और बाद के एक पर 1 सेमी सिलिकॉन ट्यूब (नंबर 5) और एक पुरुष लूयर कनेक्टर (नंबर 2) के नोजल रखो । ल्यूयर-ठेठ स्क्रू रोटेशन द्वारा निचले 3-वे लुएर कनेक्टर (नंबर 3) के मध्य कनेक्शन के लिए असेंबली को ठीक करें।
      3. सीई केशिका के आउटलेट अंत पर 1 सेमी ट्यूब (नंबर 1) पुश करें और इसे अंत से लगभग 8-9 सेमी रखें।
      4. बाद के एक और एक पुरुष Luer कनेक्टर (नंबर 2) के नोजल पर एक 1 सेमी सिलिकॉन ट्यूब (नंबर 5) रखो ।
      5. ऊपरी 3-वे-टी कनेक्टर के बार के माध्यम से बाईं ओर से पूरी असेंबली रखो और पुरुष Luer कनेक्टर और महिला 3 के बाएं छोर-तरह Luer कनेक्टर (नंबर 3) Luer-ठेठ पेंच रोटेशन द्वारा ठीक ।
      6. एक पुरुष Luer कनेक्टर (नंबर 2) के नोजल पर 25 सेमी सिलिकॉन ट्यूब (नंबर 5) को ठीक करें और लुएर-ठेठ स्क्रू रोटेशन द्वारा निचले 3-वे लुयर कनेक्टर (नंबर 3) से बार के निचले (दाएं) छोर पर पूरी असेंबली को ठीक करें।
      7. 1 सेमी सिलिकॉन ट्यूब (नंबर 6) लें और इसे नेबुलाइजर के अंत में 5 मिमी कसकर पुश करें जबकि दूसरा पुरुष ल्यूयर शंकु कनेक्टर (नंबर 4) सिलिकॉन ट्यूब के फैला हुआ हिस्सा में कसकर प्लग किया जाता है।
      8. उपरोक्त घुड़सवार इंटरफ़ेस भाग को बाद में नेबुलाइजर में पुरुष शंकु के लिए फैला हुआ सीई केशिका के साथ ले जाएं। पुरुष शंकु के माध्यम से सीई केशिका को ध्यान से डालें और आगे नेबुलाइजर के केशिका के व्यापक हिस्से के माध्यम से जब तक कि बाद में संकीर्ण न हो जाए। यह देखते हुए कि केशिका की फैला हुआ लंबाई उपयुक्त चुना गया था, ऊपरी महिला 3-तरह से Luer कनेक्टर अब भी पुरुष शंकु के लिए कसकर फिट बैठता है ।
      9. यदि आवश्यक हो तो फैला हुआ केशिका लंबाई की लंबाई को सही करें, ट्यूब (नंबर 1) पर केशिका (आगे/पिछड़ा) ले जाकर जहां स्वयं निर्मित इंटरफ़ेस में प्रवेश करते हैं।
        नोट: नेबुलाइजर केशिका की शुरुआत में सीई केशिका की इष्टतम स्थिति बहुत महत्वपूर्ण नहीं है। हालांकि, सीई केशिका को नेबुलाइजर के संकीर्ण हिस्से के बहुत करीब न धकेलें। यह आउटलेट इलेक्ट्रोलाइट प्रवाह में बाधा या ब्लॉक कर सकता है। इसके अलावा, यह आउटलेट इलेक्ट्रोड के लिए बिजली के कनेक्शन में बाधा और सीई केशिका के माध्यम से चूषण में वृद्धि होगी, परेशान जुदाई में जिसके परिणामस्वरूप । बदले में, सीई केशिका अंत को नेबुलाइजर केशिका से बहुत दूर न रखें क्योंकि तब से तेज अलग चोटियों को विस्तृत किया जाएगा और संकल्प खो जाएगा।
      10. सबसे अच्छी स्थिति की पहचान करने के लिए लेंस का उपयोग करें।
        नोट: चित्रा 1 (नीचे सही) नेबुलाइजर के अंदर सीई-केशिका की इष्टतम स्थिति दिखाता है।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध और सीई-आईसीपी-एमएस इंटरफेस के बढ़ते । योजनाबद्ध सरल और सस्ते सीई-आईसीपी-एमएस इंटरफेस के स्टेपवाइज बढ़ते के लिए एकल भागों की पहचान करता है। खिड़की नेबुलाइजर में सीई-केशिलरी की इष्टतम स्थिति की एक तस्वीर दिखाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नहीं. भाग के लिए इस्तेमाल किया
1 ट्यूबिंग (हरा-नारंगी रंग कोड), 2 एक्स सीए 1 सेमी Luer-भागों में CE केशिका और आउटलेट इलेक्ट्रोड फिक्सिंग और तंग रखते हुए
2 Luer, पुरुष, 3 x, 1.6 मिमी आईडी सिलिकॉन ट्यूबिंग के लिए उपयुक्त इलेक्ट्रोलाइट आउटलेट के लिए सिलिकॉन ट्यूब का कनेक्शन और सीई केशिका और पीटी-वायर इलेक्ट्रोड को ठीक करने के लिए सहायता के रूप में
3 3-रास्ता-Luer, महिला, 2 एक्स इलेक्ट्रोड, केशिका और एस्पिरेटेड आउटलेट प्रवाह को जोड़ने के लिए टी-पीस
4 लूयर शंकु, पुरुष, 2 एक्स महिला Luers को एक दूसरे से जोड़ना और नेबुलाइजर के लिए
5 सिलिकॉन ट्यूब, 1.6 मिमी आईडी, 0.8 मिमी दीवार, 2 x 1 सेमी, 1x सीए. 25 सेमी क) 1 सेमी; इंटरफ़ेस के लिए सीई केशिका को कसना,
ख) 1 सेमी; इंटरफ़ेस के लिए पीटी-वायर को कसना
ग) 25 सेमी; आउटलेट इलेक्ट्रोलाइट फ्लास्क से इंटरफेस तक कनेक्शन
6 सिलिकॉन ट्यूब, 3 मिमी आईडी, 1.2 मिमी दीवार, ca.1 सेमी नेबुलाइजर को कसने वाले लूर शंकु
7 प्लेटिनम तार आउटलेट इलेक्ट्रोड

तालिका 2: सरल, स्व-निर्मित सीई-आईसीपी-एमएस इंटरफेस के निर्माण के लिए पार्ट्स। संख्या भी चित्रा 1 और पाठ में विवरण को देखें ।

4. माप के लिए तैयारी

नोट: माप से पहले, केशिका को सफाई के लिए मजबूत क्षारीय समाधान (यहां: 12% TMAH) के साथ निकाल दिया जाना चाहिए और फिर पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट से भरा जाना चाहिए। बेहतर पृथक्करण के लिए एक स्टैकिंग बफर सैंडविच चालकता और पीएच ग्रेडिएंट के आधार पर नमूने के आसपास बनाया गया है। तालिका 3 केशिका के लगातार तैयारी चरणों को संक्षेप में प्रस्तुत करता है, जिन्हें प्रोग्राम की गई विधि के अनुसार उपकरण द्वारा स्वचालित रूप से संसाधित किया जाता है:

स्टेप-नहीं चरण रासायनिक हालत
  सीई कॉलम की तैयारी
तैयारी 1 केशिका सफाई 12% TMAH 4 बार, 1 मिनट।
तैयारी 2 बैकग्राउंड इलेक्ट्रोलाइट के साथ केशिका शुद्ध 20 एमएमएल एचसीएल 4 बार, 1 मिनट।
तैयारी 3 स्टैकिंग: अग्रणी इलेक्ट्रोलाइट 12% TMAH 150 mbar, 3 एस
तैयारी 4 इंजेक्शन नमूना 150 mbar, 3 एस
तैयारी 5 स्टैकिंग: इलेक्ट्रोलाइट को समाप्त करना 0.05 एमएमएल एचसीएल 150 mbar, 3 एस

तालिका 3: माप से पहले केशिका तैयारी कदम। इन चरणों को सीई-विधि में सीई-सिस्टम सॉफ्टवेयर के साथ प्रोग्राम किया जाता है और इसमें दबाव वाले नमूना इंजेक्शन और नमूने के चारों ओर "स्टैकिंग सैंडविच" का निर्माण शामिल है।

  1. एक सीई विधि प्रोग्राम करें, जो तालिका 3में दिए गए चरणों को लगातार निष्पादित कर रही है।
  2. सीई सॉफ्टवेयर में एक नमूना तालिका और अनुक्रम को परिभाषित करें और इस अनुक्रम को आईसीपी-एमएस सॉफ्टवेयर में भी कॉपी करें।

5. माप और डेटा मूल्यांकन

  1. सीई इंस्ट्रूमेंट पर विधि शुरू करें। प्रोग्राम की गई तैयारी और केशिका को भरने के बाद, माप स्वचालित रूप से शुरू होता है जैसे ही इनलेट शीशी, जिसमें 20 एमएल एचसीएल होता है, केशिका इनलेट में स्थिति में होता है। "स्टार्ट-ट्रिगर" आईसीपी-एमएस को भेजा जाता है, जो फे-आइसोटोप की ऑन-लाइन निगरानी शुरू करता है।
    नोट: जुदाई +25 केवी के वोल्टेज का उपयोग करता है। सीई-इंस्ट्रूमेंट को आईसीपी-एमएस से जोड़ने के लिए आवश्यक केशिका की विस्तारित लंबाई, अलगाव के समय को अनावश्यक रूप से बढ़ाने का कारण बनती है । इसलिए, अलग इनलेट पर 250 mbar के कम दबाव से समर्थित है। आउटलेट पर स्व-एस्पिरेटेड इलेक्ट्रोलाइट 5 एमएमएल एचसीएल है। कुल विश्लेषण मध्यम चालकता वाले नमूनों के लिए 3 मिनट तक रहता है। आईसीपी-एमएस सॉफ्टवेयर की सिग्नल विंडो में इलेक्ट्रोफेरोग्राम को रन के दौरान देखा जा सकता है। प्रत्येक नमूने के अंत में, दो डेटा फ़ाइलें स्वचालित रूप से उत्पन्न होती हैं, एक केवल आंतरिक डेटा बैंक से इंस्ट्रूमेंट सॉफ्टवेयर से सुलभ होती है, निर्यात फ़ोल्डर में एक दूसरा ".xl" या ".txt" प्रारूप, नियमित क्रोमेटोग्राफी सॉफ्टवेयर से आयात कार्य द्वारा सुलभ होता है।
  2. फाइलों को क्रोमेटोग्राफी सॉफ्टवेयर में निर्यात करने के लिए आईसीपी-एमएस इंस्ट्रूमेंट के सॉफ्टवेयर मैनुअल को देखें।

Representative Results

मानकों और अंशांकन की माप
माइग्रेशन समय एकल मानक इंजेक्शन द्वारा स्पष्ट किया गया था: Fe (III) मानक माइग्रेशन समय के 118 एस और माइग्रेशन समय के 136 एस पर फे (II) मानक पर निगरानी की गई थी। आधारभूत शोर की चर्चा करते हुए 3σ मापदंड का उपयोग करके पता लगाने की सीमा की गणना की गई थी और ५० μg/L. LOD(FE(II) की एक मानक एकाग्रता ३.१ μg/L और LOD(Fe(III) ३.२ μg/L. पीक क्षेत्र आधारित दोनों लौह प्रजातियों के लिए अंशांकन LOD से १५० μg/L के लिए रैखिक था । जबकि एफई (III) की रैखिकता उच्च एकाग्रता के लिए भी साबित हुई थी, फे (II) के लिए अंशांकन वक्र की ढलान कम हो गई। १५० μg/L की एक ऊपरी एकाग्रता सीमा के बाद से पर्याप्त माना जाता था जैव Fe (II) /(III) दृढ़ संकल्प के लिए प्रासंगिक नमूनों आम तौर पर कम Fe एकाग्रता है । उच्च एकाग्रता के मामले में, नमूनों को तदनुसार पतला किया जा सकता है। पीक-हाइट अंशांकन ६०० μg/L तक की जांच की गई और पूरी परीक्षण सीमा पर रैखिकता दिखाई गई । यह चित्र 2में दिखाया गया है ।

Figure 2
चित्रा 2: फे (III) और फे (II) के अंशांकन घटता (पीक ऊंचाई) । दोनों Fe redox प्रजातियों के पीक ऊंचाई से संबंधित अंशांकन सीए की ढलान के साथ रैखिक हैं । १६१ * एक्स कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एसएच-SY5Y सेल lysate का विश्लेषण
एसएच-SY5Y सेल lysate के विश्लेषण में कुछ हद तक उच्च चालकता के कारण लोहे के रेडॉक्स प्रजातियों के लिए थोड़ा धीमा प्रवास दिखाया गया । Fe (III) माइग्रेशन समय के 124 एस पर निगरानी की गई थी, एफई (II) माइग्रेशन समय के 158 एस पर। एसएच-SY5Y सेल में माइग्रेशन टाइम प्रिसिजन फे (III) के लिए 2% और फे (II) के लिए 3% था। मात्रात्मक Fe (II) और Fe (III) माप इस विधि का उपयोग करते हुए 330 माइक्रोग्राम/एल और फे (II) एकाग्रता 84 माइक्रोग्राम/एल की फीव (III) एकाग्रता का पता चला, दोनों के परिणामस्वरूप 0.25 का Fe (II) /Fe (III) अनुपात होता है। संबंधित 56फे-चयनात्मक इलेक्ट्रोफेरोग्राम चित्र 3में प्रदर्शित किया गया है।

Figure 3
चित्रा 3: एसएच-SY5Y सेल के 56Fe-विशिष्ट इलेक्ट्रोफेरोग्राम lysate। Fe (III) पर नजर रखी जाती है 123 एस 58025 सीपीएस पीक हाइट तक पहुंचने, 158 एस पर एफई (II) से स्पष्ट रूप से अलग किया जा रहा है, 22800 सीपीएस तक पहुंचने कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

चूंकि लोहा ओएस प्रगति में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, इस प्रकार माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन या एफटीपी को सुविधाजनक बनाता है, एक साथ फे (II) /Fe (III) के लिए एक बहुमुखी सीई-आईसीपी-एमएस आधारित मात्रात्मक विधि इस लेख में प्रस्तुत की जाती है और इसके आवेदन को सेल lysates में अनुकरणीय रूप से प्रदर्शित किया जाता है। विधि कम विश्लेषण समय प्रदान की और योग्यता के आंकड़े (LOQ, परिशुद्धता, वसूली) नमूनों के लिए उपयुक्त है विशेष रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव और कैंसर अनुसंधान में लोहे के redox नमूना के लिए प्रासंगिक जा रहा है । एलसी के आधार पर पिछले तरीकों की तुलना में, यह सीई-आधारित विधि व्यावहारिक रूप से कॉलम बैचों से स्वतंत्र है और एलसी-कॉलम परिवर्तन के बाद पहले प्रजनन संबंधी समस्याओं को देखा जाता था। प्रत्येक रन से पहले केशिका तैयारी 3 मिनट तक मध्यम लवणता के साथ प्रति नमूना & 4 मिनट और विश्लेषण समय है। अणु प्रभार और आकार के अलावा, CZE में माइग्रेशन का समय नमूना प्लग पर चालकता पर निर्भर करता है, जो माइग्रेशन समय भिन्नता या बदलाव का कारण बनता है जब नमूने खुद को चालकता को काफी प्रभावित करते हैं। माइग्रेशन समय में इस तरह के बदलाव केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस में अच्छी तरह से जाने जाते हैं। यह एक CZE-अमानवीय समस्या है, जिसे साहित्य21, 22,से जानाजाताहै । मानक और एसएच-SY5Y सेल lysates मध्यम और समरूप चालकता था । नतीजतन, माइग्रेशन टाइम्स ने अच्छी सटीकता के साथ केवल थोड़ा बदलाव दिखाया। उच्च चालकता वाले नमूनों के लिए, हालांकि, लंबे समय तक माइग्रेशन का समय 5 मिनट तक देखा जा सकता है। इसलिए, स्पष्ट प्रजातियों की पहचान के लिए मानक परिवर्धन की सिफारिश की जाती है।

लोहे के रेडॉक्स स्पेकेशन में एक महत्वपूर्ण मुद्दा नमूना तैयार करने केदौरान,प्रजातियों की स्थिरता (यानी, फे (II) /(III) संतुलन का रखरखाव)है। अनुचित पीएच या चेलटिंग रसायनों के साथ-साथ नमूने के संपर्क में ऑक्सीजन (हवा) या गहरे जमे हुए भंडारण में एक ब्रेक जैसे अनुचित भंडारण की स्थिति आसानी से Fe (II) /(III) संतुलन को बदल सकती है । इसलिए, एसएच-SY5Y सेल लाइसेट्स तैयार करने के लिए, किसी भी चेलिंग रसायनों, शारीरिक पीएच के बिना एक लाइसिस बफर चुना गया था, लेकिन नमूना तैयार करने के दौरान निष्क्रिय गैस ओवरले, नमूना कंटेनरों में और तत्काल गहरी ठंड इन नमूनों के लिए लागू किया गया था।

साहित्य में, फे (II) की निगरानी के लिए अर्ध-मात्रात्मक दृष्टिकोण मिल सकते हैं। ऑक्सीडेटिव तनाव में लोहे की भूमिका की बेहतर समझ के लिए, कई अनुसंधान समूहों ने एफई (II) को विकसित किया- विशिष्ट जांच अर्ध-मात्रात्मक रूप से निगरानी और विट्रो में लौह लोहे की गुमराह ऊंचाई की कल्पना करने के लिए। हालांकि, ध्यान देने के लिए महत्वपूर्ण है, इस तरह की जांच Fe (III) पर विचार नहीं है और मात्रा नहीं है, लेकिन रिपोर्ट सिर्फ "अधिक" या "कम" Fe (II)) । आज तक, ओएस और एफपीटी निर्धारित करने के लिए केवल कुछ बायोमार्कर उपलब्ध हैं, जो एक साथ Fe (II) /Fe (III) रेडॉक्स प्रजातियों23, 24,24की मात्रा निर्धारित करने के लिए विश्वसनीय तरीकों की कमी के कारण हैं। इस बात को ध्यान में रखते हुए, प्रस्तुत विधि - एक रन में दोनों, फे (III) और फे (II) के तेजी से मात्राकरण को सुविधाजनक बनाना - लोहे पर निर्भर आणविक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि को गहरा करने के लिए एक आशाजनक उपकरण बन सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

वीवी को यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर गोटिंगेन के इंट्राम्यूरल रिसर्च ग्रांट (Forschungsförderung) और अन्यक्रांट के ओर से क्रोनर-फ्रेसेनियस-स्टिफतुंग के एंड क्रानर रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CE capillary CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany 105180-25
CE system PrinCe technolgies 0005.263 model PrinCe 760
Conical Superclear Tubes 15 ml Analytics-shop.com by Altmann Analytik PEN0777704
Conical Superclear Tubes 50 ml Analytics-shop.com by Altmann Analytik PEN0777694
FeCl2 * 4H2O Merck 103861
FeCl3 Merck 803945
Fluidflex Silikon HG-Schlauch ProLiquid 4001106HG
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm Chromatographie Service GmbH 105180-25
hydrochloric acid, 1 M Merck 1101652500 corrosive
ICP-MS Perkin Elmer N814003
Luer, 3-way female BioRad 7318229
Luer, cone male neoLab Migge 2-1895
Luer, male neoLab Migge 2-1880
Peakfit peak evaluation software Systat PeakFit 4.12
Pt-wire Carl Roth 0737.1
PVC tube ProLiquid 6000002
RIPA buffer Abcam ab156034
Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % Merck 814748 corrosive
TYGON-tube R-3607 ProLiquid 3700203A

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References

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आयरन रेडॉक्स प्रजाति (Fe(II), Fe (III) के क्वांटिफिकेशन के लिए केपिलरी इलेक्ट्रोफोरेसिस-प्रेरक रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीई-आईसीपी-एमएस) का सेटअप
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Michalke, B., Willkommen, D., Venkataramani, V. Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III)). J. Vis. Exp. (159), e61055, doi:10.3791/61055 (2020).More

Michalke, B., Willkommen, D., Venkataramani, V. Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III)). J. Vis. Exp. (159), e61055, doi:10.3791/61055 (2020).

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