यह आयरन रेडॉक्स स्पेसाइजेशन विधि एक रन में लघु विश्लेषण के साथ संयुक्त नमूना स्टैकिंग के साथ केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस-प्रेरक रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित है। विधि जल्दी से विश्लेषण करती है और ऊतकों और बायोफ्लूइड नमूनों की एक विविध श्रृंखला में लोहे के रेडॉक्स प्रजातियों के लिए मात्राकरण की कम सीमा प्रदान करती है।
लौह चयापचय के डिस्होमोस्टेसिस कैंसर और कई न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों सहित कई बीमारियों के पथिकविज्ञानी ढांचे में हिसाब है। अत्यधिक लोहे के परिणामस्वरूप मुफ्त रेडॉक्स-एक्टिव फे (II) होता है और ऑक्सीडेटिव तनाव (ओएस) और लिपिड पेरोक्सिडेशन द्वारा मौत जैसे सेल के भीतर विनाशकारी प्रभाव पैदा कर सकता है जिसे फेरोप्टोसिस (एफपीटी) के नाम से जाना जाता है। इसलिए, कुल Fe-निर्धारण के बजाय फेरस (फे (II)) और फेरिक (एफई (III)) लोहे के मात्रात्मक माप इन हानिकारक प्रक्रियाओं में करीब अंतर्दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि Fe (II)/(III) निर्धारण तेजी से redox-राज्य बदलाव और प्रासंगिक नमूनों में कम सांद्रता, सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (CSF) की तरह द्वारा बाधित किया जा सकता है, तरीकों उपलब्ध होना चाहिए कि जल्दी से विश्लेषण और मात्राकरण (LOQ) की कम सीमा प्रदान करते हैं । केशिलरी इलेक्ट्रोफोरेसिस (सीई) फास्ट फे (II) /Fe (III) जुदाई का लाभ प्रदान करता है और एक स्थिर चरण के बिना काम करता है, जो रेडॉक्स संतुलन में हस्तक्षेप कर सकता है या एनालिट चिपके हुए का कारण बन सकता है। एक डिटेक्टर के रूप में प्रेरक रूप से प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-एमएस) के साथ संयुक्त सीई पता लगाने की संवेदनशीलता और चयनशीलता में और सुधार प्रदान करता है। प्रस्तुत विधि एक पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट और + 25 केवी के वोल्टेज के रूप में 20 mM एचसीएल का उपयोग करता है । पीक आकृतियों और एकाग्रता का पता लगाने की सीमा में चालकता-पीएच-स्टैकिंग द्वारा सुधार किया जाता है। 56[एआरओ]+ कोकम करने के लिए आईसीपी-एमएस को रिएक्शन गैस के रूप में एनएच3 के साथ डायनेमिक रिएक्शन सेल (डीआरसी) मोड में संचालित किया गया था। विधि 3 μg/L का पता लगाने (LOD) की एक सीमा प्राप्त करता है स्टैकिंग के कारण, उच्च इंजेक्शन की मात्रा जुदाई में बाधा के बिना संभव थे, लेकिन LOD में सुधार । पीक क्षेत्र से संबंधित अंशांकन 150 माइक्रोग्राम/एल माप परिशुद्धता 2.2% (Fe (III)) से 3.5% (Fe (II)) तक रैखिक थे। मानव न्यूरोब्लास्टोमा (एसएच-SY5Y) कोशिकाओं के 1:2 पतला lysates में निर्धारित दोनों प्रजातियों के लिए माइग्रेशन समय परिशुद्धता और एलटी;3% था। मानक इसके अलावा के साथ वसूली प्रयोगों 97% Fe (III) और 105% Fe (II) की सटीकता का पता चला। सीएसएफ जैसे वास्तविक जीवन के जैव-नमूनों में, माइग्रेशन का समय अलग-अलग चालकता (यानी लवणता) के अनुसार भिन्न हो सकता है। इस प्रकार, मानक इसके अलावा से चोटी की पहचान की पुष्टि की जाती है।
आज, यह सबसे स्पष्ट है कि लौह-मध्यस्थता ऑक्सीडेटिव तनाव (ओएस) विशेष रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव मस्तिष्क विकारों में कई विकारों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जैसे अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग के साथ-साथ कैंसर1,,2,,3,,4में। ओएस का राज्य और संतुलन से बारीकी से संबंध है- रेडॉक्स-कपल फे (II)/Fe (III)। जबकि फे (III) रेडॉक्स-निष्क्रिय है, Fe (II) शक्तिशाली रूप से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी उत्पादन और झिल्ली लिपिड पेरोक्सिडेशन5,,6से पीछा करने वाले एच2ओ2 अपघटन को उत्प्रेरित करता है। आणविक स्तर पर, फे (II) जनित आरओएस और पेरोक्सीडाइज्ड फॉस्फोलिपिड प्रोटीन, लिपिड और डीएनए7,,8की अखंडता के लिए एक मजबूत हमला है। इसतरह के हानिकारक सेलुलर शिथिलता को कम एटीपी-सामग्री 9 के साथ माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को प्रेरित करने के लिए प्रदर्शित किया गया था और यहां तक कि एक प्रोग्राम किए गए नेिगमी सेल डेथ को भी ट्रिगर कर सकते हैं, जिसे फेरोप्टोसिस (एफपीटी)10, 11,के नाम से जानाजाताहै। इसलिए, रेडॉक्स से संबंधित विकारों के व्यापक स्पेक्ट्रम में मात्रात्मक Fe (II)/(III) रेडॉक्स स्पेकेशन का प्रख्यात महत्व है।
सामान्य 7 , 8 के साथ – साथ न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों 12 , 13 ,14,,,14,,15 ,1516,1617में जैविक भूमिका और चयापचय का पता लगाने के लिए रासायनिक नमूना एक सुस्थापित उपकरण है ।717 साहित्य में पाए जाने वाले फे-रेडॉक्स स्पेकेशन के तरीके आम तौर पर तरल क्रोमेटोग्राफी (एलसी) पृथक्करण पर आधारित होते हैं। साहित्य के कुछ एक तत्व चयनात्मक डिटेक्टर के रूप में प्रेरक रूप से प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-एमएस) युग्मित का उपयोग करें । हालांकि, रूटीन एलसी वर्क में रनों के बीच अत्यधिक शुद्ध समय की जरूरत थी । एलसी कॉलम के और भी अधिक समस्याग्रस्त, बैच-टू-बैच भिन्नता ने प्रत्येक कॉलम परिवर्तन के बाद एल्यूशन स्थितियों का पुनः अनुकूलन करने के लिए मजबूर किया। ये समस्याएं हाई-थ्रूपुट में बाधा बन रही हैं । स्वीकार्य विश्वसनीयता हासिल करने और विधि का फिर से अच्छी तरह से मूल्यांकन करने के लिए अतिरिक्त समय की आवश्यकता होती है।
इन कमियों को दरकिनार करने के लिए, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस के आधार पर फे (II) /Fe (III) रेडॉक्स स्पेकेशन के लिए यहां एक विधि प्रस्तुत की जाती है, जो प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीई-आईसीपी-एमएस) को जोड़ते हुए है। सीई एलसी18की तुलना में विभिन्न लाभ प्रदान करता है । केशिकाओं का कोई स्थिर चरण नहीं होता है और इस प्रकार बैच पहचान पर निर्भर (लगभग) नहीं होता है। जब वृद्ध या अवरुद्ध होते हैं, तो उन्हें जल्दी से बदल दिया जाता है, आमतौर पर अपरिवर्तित प्रदर्शन दिखाता है। नमूनों के बीच शुद्ध और सफाई के कदम प्रभावी और कम हैं, और प्रति नमूना विश्लेषण समय भी कम है।
प्रस्तुत विधि योग्यता के अच्छे आंकड़ों के साथ विश्वसनीय है । सिद्धांत के सबूत के रूप में, विधि मानव डोपामिनेर्गिक न्यूरोब्लास्टोमा (एसएच-SY5Y) सेल lysate, न्यूरोडिजेनरेशन के साथ-साथ कैंसर अनुसंधान19में महत्वपूर्ण एक नमूना प्रकार पर लागू होती है।
चूंकि लोहा ओएस प्रगति में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, इस प्रकार माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन या एफटीपी को सुविधाजनक बनाता है, एक साथ फे (II) /Fe (III) के लिए एक बहुमुखी सीई-आईसीपी-एमएस आधारित मात्रात्मक विधि इस लेख में प्रस्तुत की जाती है और इसके आवेदन को सेल lysates में अनुकरणीय रूप से प्रदर्शित किया जाता है। विधि कम विश्लेषण समय प्रदान की और योग्यता के आंकड़े (LOQ, परिशुद्धता, वसूली) नमूनों के लिए उपयुक्त है विशेष रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव और कैंसर अनुसंधान में लोहे के redox नमूना के लिए प्रासंगिक जा रहा है । एलसी के आधार पर पिछले तरीकों की तुलना में, यह सीई-आधारित विधि व्यावहारिक रूप से कॉलम बैचों से स्वतंत्र है और एलसी-कॉलम परिवर्तन के बाद पहले प्रजनन संबंधी समस्याओं को देखा जाता था। प्रत्येक रन से पहले केशिका तैयारी 3 मिनट तक मध्यम लवणता के साथ प्रति नमूना & 4 मिनट और विश्लेषण समय है। अणु प्रभार और आकार के अलावा, CZE में माइग्रेशन का समय नमूना प्लग पर चालकता पर निर्भर करता है, जो माइग्रेशन समय भिन्नता या बदलाव का कारण बनता है जब नमूने खुद को चालकता को काफी प्रभावित करते हैं। माइग्रेशन समय में इस तरह के बदलाव केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस में अच्छी तरह से जाने जाते हैं। यह एक CZE-अमानवीय समस्या है, जिसे साहित्य21, 22,से जानाजाताहै । मानक और एसएच-SY5Y सेल lysates मध्यम और समरूप चालकता था । नतीजतन, माइग्रेशन टाइम्स ने अच्छी सटीकता के साथ केवल थोड़ा बदलाव दिखाया। उच्च चालकता वाले नमूनों के लिए, हालांकि, लंबे समय तक माइग्रेशन का समय 5 मिनट तक देखा जा सकता है। इसलिए, स्पष्ट प्रजातियों की पहचान के लिए मानक परिवर्धन की सिफारिश की जाती है।
लोहे के रेडॉक्स स्पेकेशन में एक महत्वपूर्ण मुद्दा नमूना तैयार करने केदौरान,प्रजातियों की स्थिरता (यानी, फे (II) /(III) संतुलन का रखरखाव)है। अनुचित पीएच या चेलटिंग रसायनों के साथ-साथ नमूने के संपर्क में ऑक्सीजन (हवा) या गहरे जमे हुए भंडारण में एक ब्रेक जैसे अनुचित भंडारण की स्थिति आसानी से Fe (II) /(III) संतुलन को बदल सकती है । इसलिए, एसएच-SY5Y सेल लाइसेट्स तैयार करने के लिए, किसी भी चेलिंग रसायनों, शारीरिक पीएच के बिना एक लाइसिस बफर चुना गया था, लेकिन नमूना तैयार करने के दौरान निष्क्रिय गैस ओवरले, नमूना कंटेनरों में और तत्काल गहरी ठंड इन नमूनों के लिए लागू किया गया था।
साहित्य में, फे (II) की निगरानी के लिए अर्ध-मात्रात्मक दृष्टिकोण मिल सकते हैं। ऑक्सीडेटिव तनाव में लोहे की भूमिका की बेहतर समझ के लिए, कई अनुसंधान समूहों ने एफई (II) को विकसित किया- विशिष्ट जांच अर्ध-मात्रात्मक रूप से निगरानी और विट्रो में लौह लोहे की गुमराह ऊंचाई की कल्पना करने के लिए। हालांकि, ध्यान देने के लिए महत्वपूर्ण है, इस तरह की जांच Fe (III) पर विचार नहीं है और मात्रा नहीं है, लेकिन रिपोर्ट सिर्फ “अधिक” या “कम” Fe (II)) । आज तक, ओएस और एफपीटी निर्धारित करने के लिए केवल कुछ बायोमार्कर उपलब्ध हैं, जो एक साथ Fe (II) /Fe (III) रेडॉक्स प्रजातियों23, 24,24की मात्रा निर्धारित करने के लिए विश्वसनीय तरीकों की कमी के कारण हैं। इस बात को ध्यान में रखते हुए, प्रस्तुत विधि – एक रन में दोनों, फे (III) और फे (II) के तेजी से मात्राकरण को सुविधाजनक बनाना – लोहे पर निर्भर आणविक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि को गहरा करने के लिए एक आशाजनक उपकरण बन सकता है।
The authors have nothing to disclose.
वीवी को यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर गोटिंगेन के इंट्राम्यूरल रिसर्च ग्रांट (Forschungsförderung) और अन्यक्रांट के ओर से क्रोनर-फ्रेसेनियस-स्टिफतुंग के एंड क्रानर रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था।
CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
FeCl3 | Merck | 803945 | |
Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
PVC tube | ProLiquid | 6000002 | |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % | Merck | 814748 | corrosive |
TYGON-tube R-3607 | ProLiquid | 3700203A |