Summary
Deze ijzerrorox speciatie methode is gebaseerd op capillaire elektroforese-inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie met monster stapelen in combinatie met korte analyse in een run. De methode analyseert en biedt snel lage limieten van kwantificering voor ijzerredoxsoorten in een breed scala van weefsels en biofluïde monsters.
Abstract
Dyshomeostase van ijzermetabolisme wordt verantwoord in het pathofysiologische kader van tal van ziekten, waaronder kanker en verschillende neurodegeneratieve aandoeningen. Overmatig ijzer resulteert in vrije redox-actieve Fe(II) en kan verwoestende effecten in de cel veroorzaken, zoals oxidatieve stress (OS) en de dood door lipideperoxidatie bekend als ferroptose (FPT). Daarom zijn kwantitatieve metingen van ferro (Fe(II)) en ferric (Fe(III)) ijzer in plaats van totale Fe-bepaling de sleutel voor een beter inzicht in deze schadelijke processen. Aangezien fe(II)/(III)-bepalingen kunnen worden belemmerd door snelle redox-toestandsverschuivingen en lage concentraties in relevante monsters, zoals hersenvocht (CSF), moeten methoden beschikbaar zijn die snel analyseren en lage limieten van kwantificering (LOQ) bieden. Capillaire elektroforese (CE) biedt het voordeel van snelle Fe(II)/Fe(III) scheiding en werkt zonder een stationaire fase, die de redoxbalans zou kunnen verstoren of analyt steken kan veroorzaken. CE in combinatie met inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS) als detector biedt verdere verbetering van de detectiegevoeligheid en selectiviteit. De gepresenteerde methode gebruikt 20 mM HCl als achtergrondelektrolyt en een spanning van +25 kV. Piekvormen en concentratiedetectielimieten worden verbeterd door geleidbaarheids-pH-stapeling. Voor reductie van 56[ArO]+werd ICP-MS in de dynamic reaction cell (DRC) modus met NH3 als reactiegas gebruikt. De methode bereikt een detectielimiet (LOD) van 3 μg/L. Door stapeling waren hogere injectievolumes mogelijk zonder de scheiding te belemmeren, maar de LOD te verbeteren. De kalibraties met betrekking tot het piekgebied waren lineair tot 150 μg/L. De meetprecisie was 2,2% (Fe(III)) tot 3,5% (Fe(II)). Migratietijd precisie was <3% voor beide soorten, bepaald in 1:2 verdunde lysates van menselijke neuroblastoom (SH-SY5Y) cellen. Herstelexperimenten met standaardtoevoe ment toonden nauwkeurigheid van 97% Fe(III) en 105 % Fe(II). In real-life bio-samples zoals CSF kan de migratietijd variëren afhankelijk van verschillende geleidbaarheid (d.w.z. zoutgehalte). Zo wordt piekidentificatie bevestigd door standaardtoevoege.
Introduction
Vandaag de dag is het duidelijkst dat ijzergemedieerde oxidatieve stress (OS) een cruciale rol speelt bij meerdere aandoeningen specifiek bij neurodegeneratieve hersenaandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson en bij kanker1,2,,3,4. OS is nauw verwant aan de staat en het evenwicht van het redox-koppel Fe(II)/Fe(III). Terwijl Fe(III) redox-inactief is, genereert Fe(II) krachtig reactieve zuurstofsoorten (ROS) door de afbraak van H2O2 te katalyseren, gevolgd door hydroxylradicale productie en membraanlipideperoxidatie5,6. Op moleculair niveau zijn Fe(II)-gegenereerde ROS en peroxidized fosfolipiden een sterke aanval op de integriteit van eiwitten, lipiden en DNA7,8. Een dergelijke schadelijke cellulaire disfunctie werd aangetoond dat mitochondriale disfunctie met verminderde ATP-inhoud9 induceren en kan zelfs leiden tot een geprogrammeerde necrotische cel dood, bekend als ferroptose (FPT)10,11. Daarom is kwantitatieve Fe(II)/(III) redox speciatie van eminent belang in een breed spectrum van redoxgerelateerde aandoeningen.
Chemische speciatie is een goed opgezet instrument voor de studie van spoorelementen biologische rol en metabolisme in het algemeen7,8 en in neurodegeneratieve aandoeningen12,13,14,15,16,17. Methoden voor Fe-redox speciatie gevonden in de literatuur zijn meestal gebaseerd op vloeibare chromatografie (LC) scheiding. Sommige van de literatuur gebruiken inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS) als elementselectieve detector. Echter, in routine LC werk, overmatige zuivering tijden nodig waren tussen de runs. Nog problematischer, batch-to-batch variatie van LC kolommen gedwongen re-optimalisatie van de elutie voorwaarden na elke kolom te veranderen. Deze problemen belemmeren de hoge doorvoer. Extra tijd is nodig om aanvaardbare betrouwbaarheid te krijgen en de methode opnieuw grondig te evalueren.
Om deze nadelen te omzeilen, wordt hier een methode gepresenteerd voor Fe(II)/Fe(III) redox speciatie op basis van capillaire elektroforese inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (CE-ICP-MS). CE biedt verschillende voordelen ten opzichte van LC18. Haarvaten hebben geen stationaire fase en zijn dus (bijna) niet afhankelijk van de identiteit van de partij. Wanneer ze verouderd of geblokkeerd zijn, worden ze snel vervangen, met meestal ongewijzigde prestaties. De zuiverings- en reinigingsstappen tussen de monsters zijn effectief en kort en de analysetijd per monster is ook kort.
De gepresenteerde methode is betrouwbaar met goede cijfers van verdienste. Als een proof-of-principle, de methode wordt toegepast op menselijke dopaminerge neuroblastoom (SH-SY5Y) cellysaat, een monster type belangrijk in neurodegeneratie evenals kankeronderzoek19.
Protocol
LET OP: De methode maakt gebruik van zoutzuur (HCl, beginnende verdunningen van ultrapure, concentratie 1 M) en tetramethylammoniumhydroxide (TMAH, beginnende verdunningen van ultrapure, concentratie 25%). Beide stoffen zijn sterk corrosief. Gebruik huid- en oogbescherming.
1. Voorbereiden van elektrolyten
- Bereiding van HCl-elektrolyten: achtergrondelektrolyt (20 mM HCl), uitlaatelektrolyt (5 mM HCl) en terminerend elektrolyt (0,05 mM HCl)
- Bereid 20 mM HCl in een kolf van 100 mL: Pipette 2 mL van 1 M HCl in de kolf, vul tot de markering met ultrazuiver water en schud zachtjes.
- Bereid 5 mM HCl in een kolf van 100 mL: Pipette 500 μL van 1 M HCl in de kolf, vul tot de markering met ultrazuiver water en schud zachtjes.
- Bereid 0,05 mM HCl in twee stappen: Pipette 1 mL van 20 mM HCl in een kolf van 100 mL, en vul vervolgens tot het merk met ultrazuiver water en schud zachtjes. Vervolgens pipet 2,5 mL van de laatste oplossing in een 15 mL conische buis (Tabel van materialen) en voeg 7,5 mL ultrazuiver water, dan zachtjes schudden.
- Voorbereiden van toonaangevende elektrolyt 12% TMAH in een 15 mL conische buis: Pipette 4.8 mL van 25% TMAH in de buis, voeg 5,2 mL ultrazuiver water toe en schud zachtjes.
OPMERKING: De 12% TMAH wordt gebruikt om de capillaire vóór elke run te zuiveren en schoon te maken en als een toonaangevend elektrolyt voor het geïnjecteerde monster).
2. Bereiding en opslag van normen en monsters
- Normen
- Weeg voor Fe(II) 35,61 mg Fe(II)Cl2·4H2O in een kolf van 100 mL en vul tot de 100 mL-markering met ultrazuiver water voor een voorraadconcentratie van 100 mg Fe(II)/L. Schud zachtjes tot volledige ontbinding.
- Weeg voor Fe(III) 29,04 mg Fe(III)Cl3 in een kolf van 100 mL en vul tot de 100 mL-markering met ultrazuiver water voor een concentratie van 100 mg Fe(III)/L. Schud zachtjes tot volledige ontbinding.
- Verdun elke standaardoplossing volgens tabel 1 om de werkstandaardoplossingen voor te bereiden.
LET OP: Na het voorbereiden van de dagelijkse voorraadoplossingen van de 100 mg/L-voorraadoplossing, moet deze bevroren worden opgeslagen. Na de voorbereiding van de dagelijkse normen volgens tabel 1moet de 1 mg/L-voorraadoplossing in 1,5 mL-volumes worden ingedeeld en bevroren (het best zonder lucht links bovenop) in 1,5 mL-buizen worden opgeslagen. Voor elke nieuwe dag wordt één dagelijkse voorraadkap ontdooid voor de voorbereiding van de dagelijkse normen en na gebruik ingetrokken.
| Startconcentratie | Pipettingvolume | Vul met Milli-Q water | Resulterende concentratie | Eindvolume | Gebruik van de oplossing |
| 100 mg/L | 50 μL | 4950 μL | 1 mg/L | 50 mL | Dagelijkse voorraadoplossing |
| 1 mg/L | 200 μL | 1800 μL | 100 μg/L | 2 mL | Standaard |
| 100 μg/L | |||||
| 1 mg/L | 100 μL | 1900 μL | 50 μg/L | 2 mL | Standaard |
| 50 μg/L | |||||
| 1 mg/L | 50 μL | 1950 μL | 25 μg/L | 2 mL | Standaard |
| 25 μg/L | |||||
| 1 mg/L | 25 μL | 1975μL | 12,5 μg/L | 2 mL | Standaard |
| 12,5 μg/l | |||||
| 1 mg/L | 20 μL | 1980μL | 10 μg/L | 2 mL | Standaard |
| 10 μg/L | |||||
| 0 | 2000 μL | 0 μg/L | 2 mL | Lege |
Tabel 1: Pipettingregeling voor de voorbereiding van de normen.
- SH-SY5Y cellysaat
OPMERKING: Het cellysaat (SH-SY5Y) diende als Fe(II)/(III)-relevante bio-matrix om de prestaties en betrouwbaarheid van de methode aan te tonen.- Gebruik lysaat van eerder uitgevoerde experimenten16. Volg deze cellysate voorbereiding het vermijden van pH veranderingen of chemische stoffen die van invloed kunnen zijn redox balans. Gebruik een aangepaste radioimmunoprecipitatietest (RIPA) lysebuffer (PBS pH 7.4; 0,5% natriumdeoxycholaat, 1% NP-40), het vermijden van metalenchelatoren (zoals EDTA), reducerende middelen (zoals DTT, 2-Mercaptoethanol) en anionische oppervlakteactieve detergenten en metaalcomplexerende middelen (zoals SDS) voor het minimaliseren van wijzigingen na de inzameling van de Fe(II)/Fe(III) ratio.
- Werk onder een N2-atmosfeer geremd oxidatie door O2 uit de omgevingslucht en werken op ijs om eventuele autoxidatie te minimaliseren totdat het lysaat werd opgeslagen zo spoedig mogelijk bij -80 °C onder de stikstofatmosfeer.
3. Vaststelling van instrumenten voor afbreking van CE aan ICP-lidstaten
- Stel het capillaire elektroforese-instrument in.
OPMERKING: Voor deze sectie wordt de lezer voornamelijk verwezen naar de handleiding van het betreffende instrument dat in het laboratorium beschikbaar is.- Installeer een capillair met een geschikte lengte om van de inlaatflaubl van het CE-instrument tot de vernevelaar van ICP-MS te reiken. Installeer de capillaire alleen aan de inlaatzijde en leid deze buiten het instrument naar de CE-ICP-MS-interface.
OPMERKING: Voor het afbreken van CE tot ICP-MS werd in dit protocol een 90 cm gesmolten silica capillair (ID 50 μm) geïnstalleerd volgens de algemene instrumentale setupbeschrijving. Meestal zijn capillaire maten van 70−100 cm nodig, afhankelijk van de positie van de instrumenten in het laboratorium. - De-activeer de uitlaatlift van het CE-instrument in de software voor een soepele werking, omdat deze niet in gebruik is wanneer de capillaire buiten naar de CE-ICP-MS-interface wordt geleid.
- Installeer een triggerkabel van CE-instrument trigger-OUT om het ICP-MS-instrument in te triggeren.
- Selecteer posities voor alle benodigde oplossingen (20 mM HCl, 0,05 mM HCl, 12% TMAH), normen en monsters in de sample & solutions rotor van het instrument en definieer hun posities in de instrumentsoftware zoals gebruikelijk (raadpleeg de handleiding van het instrument).
- Selecteer de rotor- en capillaire temperatuur die identiek is bij 20 °C, identiek aan de gecontroleerde laboratoriumtemperatuur.
OPMERKING: Er treedt geen temperatuurgradiënt op aan de capillaire delen binnen en buiten het CE-instrument.
- Installeer een capillair met een geschikte lengte om van de inlaatflaubl van het CE-instrument tot de vernevelaar van ICP-MS te reiken. Installeer de capillaire alleen aan de inlaatzijde en leid deze buiten het instrument naar de CE-ICP-MS-interface.
- Het ICP-MS-instrument instellen
- Optimaliseer het ICP-MS instrument volgens de dagelijkse instrumentale standaard setup en bedieningsprocedures. Gebruik het protocol van de fabrikant.
- Gebruik dynamische reactieceltechnologie (DRC) met NH3 als DRC-gas, met 0,6 mL/min NH3–flowrate en RPq-waarde = 0,45.
OPMERKING: Voor ijzerspesiatie is een methode geprogrammeerd met 56Fe, de meest voorkomende Fe-isotoop (91,754% relatieve overvloed), maar wordt ernstig verstoord door de [40Ar16O]+ cluster. Een viervoudige ICP-MS in standaardmodus is praktisch blind en de detector in overloop bij deze isotoop. Met de bovenstaande instellingen (zie stap 3.2.2) worden lage basislijnen en hoge gevoeligheid bereikt (voor regelmatige totale ijzerbepaling wordt LOD in het lage ng/L-bereik bereikt). - Kies een verblijfstijdinstelling per isotoop op 50 ms voor het monitoren van zelfs scherpe en kort verschijnende pieken tijdens CE-scheiding.
- Programmeer de ICP-MS methode die door het CE-instrument wordt gestart.
- De CE-ICP-MS-interface instellen
OPMERKING: Er zijn voornamelijk twee opties voor het aansluiten van de CE-capillair op de ICP-MS. Volg de opgegeven beschrijvingen over de installatie als een commerciële interface wordt gebruikt. Dit protocol maakt gebruik van een eenvoudige, zelfgemaakte interface op basis van een eerdere publicatie na wijzigingen20. Belangrijke kwesties zijn een efficiënte verneveling met mogelijk minder verdunning van de capillaire efflux afgezien van de goedkeuring van de totale stroomsnelheid tot vernevelaar voor de beste verneveling. Ook de minimalisering van een zuigstroom door het scheiden van capillair veroorzaakt door de zelf-aspiratie van vernevelaar, en de elektrische verbinding van de geaarde uitlaat elektrode capillaire einde zijn verplicht.- Vernevelaarselectie
- Gebruik een concentrische vernevelaar met een laag zelfpiratievolume (bijvoorbeeld 100 μL/min) dat in een spuitkamer met een laag volume past.
LET OP: De lage opname zal leiden tot slechts matige verdunning van capillaire efflux parallel aan de nog steeds geoptimaliseerde verneveling. De elektroverbinding van de uitlaatelektrode wordt verwezenlijkt door een elektrolytstroom rond de uitlaatelektrode en rond het capillaire eind. - Gebruik de zelfaspiratie van de vernevelaar om de zuigkracht door de scheidende capillaire te minimaliseren en voor de goedkeuring van de stroomsnelheid tot de optimale waarde die de vernevelaar nodig heeft.
- Bereid de volgende onderdelen van tabel 2 voor om deze zelfgemaakte interface te monteren.
- Gebruik een concentrische vernevelaar met een laag zelfpiratievolume (bijvoorbeeld 100 μL/min) dat in een spuitkamer met een laag volume past.
- Installatie van de eenvoudige interface
OPMERKING: Gebruik figuur 1 om de beschrijving van de montage van delen te volgen voor de eenvoudige interface. De getallen in figuur 1 en in de volgende tekst verwijzen naar de getallen in tabel 2.- Begin met het monteren van de interface door de twee 3-weg vrouwelijke Luer-connectors (nr. 3) aan te sluiten met een mannelijke cone Luer-connector (nr. 4). Sluit het linker uiteinde van de onderste 3-weg Luer bar aan op de mannelijke connector en dat aan de middelste verbinding van de bovenste 3-weg Luer.
- Leg een buis van 1 cm (nr. 1) over de Pt-wire (nr. 7) en een 1 cm siliconen buis (nr. 5) over de laatste en het mondstuk van een mannelijke Luer connector (nr. 2). Bevestig de montage op de middelste verbinding van de onderste 3-weg Luer connector (nr. 3) door Luer-typische schroefrotatie.
- Duw een buis van 1 cm (nr.1) over het uitgangseind van de CE-capillaire en plaats deze ongeveer 8-9 cm van het einde.
- Zet een siliconen buis van 1 cm (nr. 5) boven de laatste en het mondstuk van een mannelijke Luer-connector (nr. 2).
- Zet de hele montage van links door de bar van de bovenste 3-way-T connector en bevestig de mannelijke Luer connector en het linkerkant van de vrouwelijke 3-weg Luer connector (nr. 3) door Luer-typische schroef rotatie.
- Bevestig de siliconen buis van 25 cm (nr. 5) aan het mondstuk van een mannelijke Luer-connector (nr. 2) en bevestig de hele montage aan de onderkant (rechts) van de bar van de onderste 3-weg Luer-connector (no.3) door Luer-typische schroefrotatie.
- Neem de siliconen buis van 1 cm (no.6) en duw deze 5 mm strak over het uiteinde van de vernevelaar, terwijl de tweede mannelijke Luer-kegelconnector (nr. 4) stevig in het uitstekende deel van de siliconenbuis is aangesloten.
- Verplaats het bovenbemonteerde interfacedeel vervolgens met de uitstekende CE-capillaire naar de mannelijke kegel bij de vernevelaar. Steek de CE-capillaire voorzichtig door de mannelijke kegel en verder door het bredere deel van de vernevelaar capillaire totdat de laatste wordt smal. Gezien het feit dat de uitstekende lengte van de capillaire voldoende werd gekozen, past de bovenste vrouwelijke 3-weg Luer connector nu ook goed op de mannelijke kegel.
- Corrigeer indien nodig de lengte van de uitstekende capillaire lengte door de capillaire (voorwaarts/achteruit) bij het betreden van de zelfgebouwde interface naar de buis te bewegen.
LET OP: De optimale positie van de CE capillaire aan het begin van de vernevelaar capillaire is niet al te kritisch. Duw de CE-capillaire echter niet te dicht bij het smalle deel van vernevelaarcapillaire. Dit kan de elektrolytstroom van de uitlaat belemmeren of blokkeren. Ook zou dit de elektrische verbinding met de uitlaatelektrode onderbreken en zou de zuigkracht door CE-capillaire verhogen, wat resulteert in een verstoorde scheiding. Houd op zijn beurt het CE-capillaire uiteinde niet te ver weg van vernevelaarcapillaire, omdat dan scherpe gescheiden pieken zouden worden verbreed en resolutie verloren zal gaan. - Gebruik een lens om de beste positie te identificeren.
LET OP: Figuur 1 (rechtsonder) toont de optimale positie van CE-capillair in de vernevelaar.
- Vernevelaarselectie
Figuur 1: Schematisch en montage van de CE-ICP-MS interface. Het schema identificeert de afzonderlijke onderdelen voor stapsgewijze montage van de eenvoudige en goedkope CE-ICP-MS interface. Het venster toont een foto van een optimale positionering van de CE-capillair in de vernevelaar. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| №. | Deel | gebruikt voor |
| 1 | Slang (groen-oranje kleurcode), 2 x ca. 1 cm | ce-capillaire en uitlaatelektrode bij Luer-onderdelen bevestigen en strak houden |
| 2 | Luer, man, 3 x, geschikt voor 1,6 mm ID siliconen buizen | aansluiting van siliconen buis op uitlaat elektrolyt en als hulpmiddel bij de vaststelling van CE capillair en Pt-wire elektrode |
| 3 | 3-way-Luer, vrouwelijk, 2 x | T-stukken om elektrode, capillaire en aangezogen uitlaatstroom aan te sluiten |
| 4 | Luer kegel, man, 2 x | het verbinden van vrouwelijke Luers met elkaar en aan vernevelaar |
| 5 | Siliconen buis, 1,6 mm ID, 0,8 mm muur, 2 x 1 cm, 1x ca. 25 cm | a) 1cm; het inbedichten van CE-capillair aan de interface, b) 1cm; inberinging Pt-wire naar interface c) 25 cm; verbinding van uitlaatelektrolytkolf naar interface |
| 6 | Siliconen buis, 3 mm ID, 1,2 mm muur, ca.1 cm | het dichten van Luer kegel aan vernevelaar |
| 7 | Platina draad | Uitlaatelektrode |
Tabel 2: Onderdelen voor het bouwen van de eenvoudige, self-made CE-ICP-MS interface. De getallen verwijzen ook naar figuur 1 en beschrijving in de tekst.
4. Voorbereiding op de meting
OPMERKING: Vóór de meting moet de capillaire worden gespoeld met een sterke alkalische oplossing (hier: 12% TMAH) voor reiniging en vervolgens gevuld met achtergrondelektrolyt. Voor een betere scheiding wordt rond het monster een stapelbuffer sandwich gebouwd op basis van geleidbaarheid en pH-gradiënten. Tabel 3 bevat een overzicht van de opeenvolgende bereidingsstappen van de capillaire, die automatisch door het instrument worden verwerkt volgens de geprogrammeerde methode:
| Stap-Nee | Stap | Chemische | Voorwaarde |
| Voorbereiding van de CE-kolom | |||
| Prep 1 | Capillaire reiniging | 12 % TMAH | 4 bar, 1 min. |
| Prep 2 | Capillaire zuivering met achtergrondelektrolyt | 20 mM HCl | 4 bar, 1 min. |
| Prep 3 | Stapelen: toonaangevende elektrolyt | 12 % TMAH | 150 mbar, 3 s |
| Prep 4 | Injectie | Monster | 150 mbar, 3 s |
| Prep 5 | Stapelen: het beëindigen van elektrolyt | 0,05 mM HCl | 150 mbar, 3 s |
Tabel 3: Capillaire voorbereidingsstappen vóór de meting. Deze stappen zijn geprogrammeerd met de CE-systeemsoftware in de CE-methode en omvatten onder druk genomen monsterinjectie en de opbouw van een "stapelende sandwich" rond het monster.
- Programmeer een CE-methode, die achtereenvolgens de stappen uitvoert die in tabel 3zijn gegeven.
- Definieer een voorbeeldtabel en volgorde in CE-software en kopieer deze reeks ook in ICP-MS-software.
5. Meet- en gegevensevaluatie
- Start de methode bij CE-instrument. Na het geprogrammeerd prepareren en vullen van de capillaire, begint de meting automatisch zodra de inlaatbladl, met 20 mM HCl, op zijn plaats is bij capillaire inlaat. De "Start-trigger" wordt verzonden naar de ICP-MS, die de on-line monitoring van Fe-isotopen start.
LET OP: De scheiding maakt gebruik van een spanning van +25 kV. De langere lengte van het capillair, dat nodig is om het CE-instrument aan te sluiten op ICP-MS, zorgt ervoor dat de scheidingstijd onnodig wordt verhoogd. Daarom wordt de scheiding ondersteund door een lage druk van 250 mbar bij inlaat. Het zelf aangezogen elektrolyt bij de uitlaat is 5 mM HCl. De totale analyse duurt 3 minuten voor monsters met matige geleidbaarheid. In het signaalvenster van de ICP-MS software kan het elektropherogram tijdens de looppas worden waargenomen. Aan het einde van elk voorbeeld worden automatisch twee gegevensbestanden gegenereerd, één alleen toegankelijk via instrumentsoftware van interne gegevensbank, een tweede in de exportmap als ".xl" of ".txt"-formaat, toegankelijk per importfunctie van reguliere chromatografiesoftware. - Raadpleeg de softwarehandleiding van het ICP-MS-instrument voor het exporteren van de bestanden naar chromatografiesoftware.
Representative Results
Metingen van normen en kalibratie
De migratietijden werden opgehelderd door enkele standaardinjecties: de Fe(III)-norm werd gecontroleerd op 118 s migratietijd en de Fe(II)-norm op 136 s migratietijd. De detectiegrenzen werden berekend aan de hand van 3σ-criterium dat verwijst naar basisruis en een standaardconcentratie van 50 μg/L. LOD(Fe(II) was 3,1 μg/L en LOD(Fe(III) was 3,2 μg/L. Piekgebiedgebaseerde kalibratie voor beide ijzersoorten was lineair van de LOD tot 150 μg/L. Terwijl lineariteit van Fe(III) ook voor hogere concentratie werd bewezen, verminderde de helling van kaliberbepalingskromme voor Fe(II). Een bovenconcentratiegrens van 150 μg/L werd voldoende geacht omdat biomonsters die relevant zijn voor de bepaling van Fe(II/(III) doorgaans een lagere Fe-concentratie hebben. Bij een hogere concentratie kunnen de monsters dienovereenkomstig worden verdund. Piekhoogtekalibratie werd gecontroleerd tot 600 μg/L en toonde lineariteit over het gehele geteste bereik. Dit is te zien in figuur 2.
Figuur 2: Kalibratiecurven (piekhoogte) van Fe(III) en Fe(II). Piekhoogte-gerelateerde kalibraties van beide Fe redox soorten zijn lineair met een helling van ca. 161 * X Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Analyse van SH-SY5Y cellysaat
De analyse van het SH-SY5Y-cellysaat toonde een iets tragere migratie voor ijzerredroxsoorten als gevolg van de iets hogere geleidbaarheid. Fe(III) werd gecontroleerd op 124 s van migratietijd, Fe(II) op 158 s van migratietijd. De precisie van de migratietijd in SH-SY5Y-cellysaat was 2% voor Fe(III) en 3% voor Fe(II). Kwantitatieve Fe(II) en Fe(III) metingen met behulp van deze methode toonden fe(III) concentratie van 330 μg/L en Fe(II) concentratie 84 μg/L aan, beide resulterend in een Fe(II)/Fe(III) ratio van 0,25. Het respectievelijke 56Fe-selectieve elektroferogram wordt aangetoond in figuur 3.
Figuur 3: 56Fe-specifieke elektroferogram van SH-SY5Y cellysaat. Fe(III) wordt gecontroleerd op 123 s bereiken 58025 cps piekhoogte, wordt duidelijk gescheiden van Fe(II) op 158 s, het bereiken van 22800 cps Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Aangezien ijzer een prominente rol speelt in osprogressie, waardoor mitochondriale disfunctie of FTP wordt vergemakkelijkt, wordt in dit artikel een veelzijdige op CE-ICP-MS gebaseerde kwantitatieve methode voor gelijktijdige Fe(II)/Fe(III) speciatie gepresenteerd en wordt de toepassing ervan voorbeeldig aangetoond in cellysates. De methode die korte analysetijd en de cijfers van verdienste (LOQ, precisie, herstel) zijn geschikt voor monsters die relevant zijn voor ijzer redox speciatie specifiek in neurodegeneratief en kankeronderzoek. In vergelijking met eerdere methoden op basis van LC is deze OP DE CE gebaseerde methode vrijwel onafhankelijk van kolombatches en eerder waargenomen reproduceerbaarheidsproblemen na de wijziging van de LC-kolom. Capillaire voorbereiding voor elke run is <4 minuten en analysetijd per monster met een matig zoutgehalte tot 3 min. Afgezien van molecuul lading en grootte, migratie tijd in CZE is afhankelijk van geleidbaarheid bij de steekproef plug, die migratie tijd variatie of verschuivingen veroorzaakt wanneer monsters zelf beïnvloedingsgedrag aanzienlijk. Dergelijke verschuivingen in migratietijd zijn bekend bij capillaire elektroforese. Dit is een CZE-immanent probleem, bekend uit literatuur21,22. Normen en SH-SY5Y cellysates hadden matige en homogene geleidbaarheid. De migratietijden lieten dan ook weinig met goede precisie zien. Voor monsters met een hoge geleidbaarheid kunnen echter langere migratietijden tot 5 min worden waargenomen. Daarom worden standaardtoevoelingen aanbevolen voor een duidelijke identificatie van soorten.
Een kritiek punt bij de speciatie van ijzerredox is de stabiliteit van de soort (d.w.z. het behoud van Fe(II)/(III) evenwichten tijdens monsterbereiding8,13. Ongeschikte pH- of chelaatvormige chemicaliën en ongeschikte opslagomstandigheden zoals zuurstof (lucht) in contact met het monster of een onderbreking in diepgevroren opslag kunnen de Fe(II)/(III)-balans gemakkelijk veranderen. Daarom werd voor de bereiding van SH-SY5Y-cellysates gekozen voor een lysebuffer zonder enige chelaatvormige chemicaliën, fysiologische pH, maar inert gasoverlay tijdens de monsterbereiding, in monstercontainers en onmiddellijke diepvriezen werd voor deze monsters toegepast.
In de literatuur vindt men semi-kwantitatieve benaderingen om Fe(II) te monitoren. Voor een beter begrip van de rol van ijzer in oxidatieve stress ontwikkelden verschillende onderzoeksgroepen Fe(II)-specifieke sondes om de afwijkende hoogte van ferroijzer in vitro semi-kwantitatief te monitoren en te visualiseren. Echter, belangrijk om op te merken, dergelijke sondes niet rekening houden met Fe(III) en niet kwantificeren, maar verslag gewoon "meer" of "minder" Fe(II)). Tot op heden zijn slechts enkele biomarkers beschikbaar om OS en FPT te bepalen, omdat er geen betrouwbare methoden zijn om tegelijkertijd de Fe(II)/Fe(III) redoxsoorten23,24te kwantificeren . Met dit in gedachten kan de gepresenteerde methode - het vergemakkelijken van een snelle kwantificering van beide, Fe(III) en Fe(II) in één keer - een veelbelovend instrument worden om het inzicht in ijzerafhankelijke moleculaire processen te verdiepen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
VV werd gesteund door de intramurale onderzoekstoelage (Forschungsförderung) van het Universitair Medisch Centrum Göttingen en het else Kröner onderzoeksprogramma van Else Kröner-Fresenius-Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
| CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
| Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
| Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
| FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
| FeCl3 | Merck | 803945 | |
| Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
| Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
| hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
| ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
| Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
| Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
| Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
| Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
| Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
| PVC tube | ProLiquid | 6000002 | |
| RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % | Merck | 814748 | corrosive |
| TYGON-tube R-3607 | ProLiquid | 3700203A |
References
- Hare, D. J., et al. Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 11 (9), 536-544 (2015).
- Ashraf, A., Clark, M., So, P. W. The Aging of Iron Man. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, (2018).
- Hare, D. J., Cardoso, B. R., Szymlek-Gay, E. A., Biggs, B. A. Neurological effects of iron supplementation in infancy: finding the balance between health and harm in iron-replete infants. Lancet Child Adolesc Health. 2 (2), 144-156 (2018).
- Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: more ore to be mined. Nature Reviews Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).
- Kehrer, J. P. The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology. 149 (1), 43-50 (2000).
- Gaschler, M. M., Stockwell, B. R. Lipid peroxidation in cell death. Biochemical and Biophysical Research Communications. 482 (3), 419-425 (2017).
- Michalke, B., Halbach, S., Nischwitz, V. JEM Spotlight: Metal speciation related to neurotoxicity in humans. Journal of Environmental Monitoring. 11 (5), 939-954 (2009).
- Solovyev, N., Vinceti, M., Grill, P., Mandrioli, J., Michalke, B. Redox speciation of iron, manganese, and copper in cerebrospinal fluid by strong cation exchange chromatography - sector field inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 973, 25-33 (2017).
- Lee, H. J., et al. Effect of excess iron on oxidative stress and gluconeogenesis through hepcidin during mitochondrial dysfunction. Journal of Nutritional Biochemistry. 26 (12), 1414-1423 (2015).
- Dixon, S. J., Lemberg, K. M., Lamprecht, M. R., Skouta, R., Zaitsev, E. M., Gleason, C. E., et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149 (5), 1060-1072 (2012).
- Stockwell, B. R., et al. Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell. 171 (2), 273-285 (2017).
- Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Halbach, S. Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS. Electrophoresis. 28 (9), 1380-1386 (2007).
- Fernsebner, K., Zorn, J., Kanawati, B., Walker, A., Michalke, B. Manganese leads to an increase in markers of oxidative stress as well as to a shift in the ratio of Fe(II)/(III) in rat brain tissue. Metallomics. 6 (4), 921-931 (2014).
- Neth, K. Manganese: Species Pattern and Mechanisms of Brain Injury. , Technical University of Munich, Analytical Food Chemistry. Doctoral Dissertation (2015).
- Neth, K., et al. Changes in Brain Metallome/Metabolome Pattern due to a Single i.v. Injection of Manganese in Rats. Plos One. 10 (9), (2015).
- Venkataramani, V., et al. Manganese causes neurotoxic iron accumulation via translational repression of Amyloid Precursor Protein (APP) and H-Ferritin. Journal of Neurochemistry. 147 (6), 831-848 (2018).
- Willkommen, D., Lucio, M., Schmitt-Kopplin, P., Gazzaz, M., Schroeter, M., Sigaroudi, A., Michalke, B. Species fractionation in a case-control study concerning Parkinson's disease: Cu-amino acids discriminate CSF of PD from controls. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 164-170 (2018).
- Thibault, P., Dovichi, N. J. General instrumentation and detection systems including mass spectrometry. Capillary Electrophoresis - Theory and Practice. Camilleri, P. , CRC Press. Boca Raton, Boston, New York, Washington D.C., London. 23-89 (1998).
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular Pathway Facilitates CSF Flow Through the Brain Parenchyma and the Clearance of Interstitial Solutes, Including Amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Michalke, B. Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1050 (1), 69-76 (2004).
- Kuhn, R., Hofstetter-Kuhn, S. Capillary electrophoresis: Principles and practice. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1993).
- Michalke, B. Capillary electrophoretic methods for a clear identification of selenoamino acids in complex matrices such as human milk. Journal of Chromatography A. 716 (1-2), 323-329 (1995).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156 (1-2), 317-331 (2014).
- Shimada, K., Hayano, M., Pagano, N. C., Stockwell, B. R. Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity. Cell Chemical Biology. 23 (2), 225-235 (2016).
