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Chemistry

철 레독스 종(Fe(II), Fe(III)의 정량화를 위한 모세관 전기포고증-유도 결합된 혈장 질량 분광법(CE-ICP-MS)의 설정

doi: 10.3791/61055 Published: May 4, 2020

Summary

이 철 레독스 분석 방법은 모세관 전기 포근-유도 결합 된 플라즈마 질량 분광법을 기초로 한 번의 짧은 분석과 결합된 샘플 스태킹을 사용합니다. 이 방법은 다양한 조직 및 생물유체 샘플에서 철 레독스 종에 대한 낮은 정량화를 신속하게 분석하고 제공합니다.

Abstract

철제 대사의 이소모증은 암과 여러 신경 퇴행성 질환을 포함한 수많은 질병의 병리학적 틀에서 설명된다. 과도한 철은 무료 레독스 활성 Fe (II)를 초래하고 산화 스트레스 (OS) 및 페로토시스 (FPT)로 알려진 지질 과산화에 의해 사망과 같은 세포 내에서 파괴적인 효과를 일으킬 수 있습니다. 따라서 총 Fe 결정보다는 철(Fe(II)과 철(Fe(III)의 정량적 측정은 이러한 해로운 공정에 대한 보다 긴밀한 통찰력을 위한 핵심입니다. Fe(II)/(III) 결정은 빠른 레독스-상태 교대와 뇌척수액(CSF)과 같은 관련 샘플의 낮은 농도로 인해 방해가 될 수 있기 때문에, 신속하게 분석하고 낮은 정량화(LOQ)를 제공하는 방법을 사용할 수 있어야 합니다. 모세관 전기 포근 (CE)은 빠른 Fe (II)/Fe (III) 분리의 장점을 제공하고 역골 균형을 방해하거나 분해물을 고집 할 수있는 고정 된 단계없이 작동합니다. 검출기로 유도 결합 된 플라즈마 질량 분석법 (ICP-MS)과 결합 된 CE는 검출 감도 및 선택성을 더욱 향상시킵니다. 제시된 방법은 20mM HCl을 백그라운드 전해질및 +25 kV의 전압으로 사용합니다. 피크 형상 및 농도 검출 한계는 전도도-pH 스태킹에 의해 향상됩니다. 56[ArO]+,ICP-MS의 감소를 위해 NH3을 반응 가스로 동적 반응 세포(DRC) 모드에서 작동하였다. 이 방법은 스태킹으로 인해 3 μg/L의 검출(LOD)의 한계를 달성하고, 분리를 방해하지만 LOD를 개선하지 않고 더 높은 사출 부피가 가능하였다. 피크 영역과 관련된 교정은 최대 150μg/L. 측정 정밀도가 2.2%(Fe(III)에서 3.5%(Fe(II)까지 선형이었다. 이동 시간 정밀도는 인간 신경 모세포종 (SH-SY5Y) 세포의 1:2 희석 용액으로 결정된 두 종 모두에 대해 &3%였다. 표준 첨가를 가진 복구 실험은 97% Fe (III) 및 105 % Fe (II)의 정확도를 밝혔습니다. CSF와 같은 실제 바이오 샘플에서는 이동 시간이 다양한 전도도(즉, 살리니티)에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 피크 식별은 표준 첨가에 의해 확인된다.

Introduction

오늘날, 철 매개 산화 스트레스(OS)가 알츠하이머및 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 뇌 질환뿐만 아니라 암1,2,,33,4에서특히 여러 장애에서 중요한 역할을 한다는 것이 가장 분명합니다., OS는 레독스 커플 Fe(II)/Fe(III)의 상태 및 균형과 밀접한 관련이 있습니다. Fe(III)는 레독스비활성 반면, Fe(II)는 하이드록실 라디칼 생산 및 멤브레인 지질 과산화5,,6에이어 H2O2 분해를 촉매하여 반응성 산소 종(ROS)을 강력하게 생성한다. 분자 수준에서, Fe(II)생성 된 ROS 및 과산화 된 인지질은 단백질, 지질 및 DNA7,,8의무결성에 대한 강한 공격이다. 이러한 해로운 세포 기능 장애는 ATP함량 이 감소로 미토콘드리아 기능 장애를 유도하는 것으로 입증되었으며, 페로포시스(FPT)10,,11로알려진 프로그래밍된 괴사 세포 사멸을 유발할 수도 있다. 따라서, 정량적 Fe(II)/(III) 레독스 분전은 백독스 관련 질환의 광범위한 스펙트럼에서 매우 중요하다.

,화학적 분화는 일반적으로7,8뿐만 아니라 신경퇴행성질환(12,,13,14,,15, 16,,,17)에서미량 원소의 생물학적 역할 및 대사를 연구하기 위한 잘 확립된 도구이다.,17 문헌에서 발견되는 Fe-redox 분화를 위한 방법은 일반적으로 액체 크로마토그래피(LC) 분리를 기반으로 합니다. 일부 문헌은 원소 선택적 검출기로 교제결합된 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)을 사용한다. 그러나 일상적인 LC 작업에서는 실행 사이에 과도한 제거 시간이 필요했습니다. LC 컬럼의 배치 간 변형은 각 열변경 후 용출 조건의 재최적화를 강요했습니다. 이러한 문제는 높은 처리량을 방해하고 있습니다. 허용 가능한 신뢰성을 얻고 방법을 다시 철저히 평가하기 위해서는 추가 시간이 필요합니다.

이러한 단점을 우회하기 위해, 모세관 전기포리스유도 결합된 혈장 질량 분광법(CE-ICP-MS)에 기초한 Fe(II)/Fe(III) 레독스 스펙션을 위한 방법이 여기에 제시된다. CE는 LC18에비해 다양한 장점을 제공합니다. 모세 혈관은 고정 단계가 없으므로 배치 ID가 아닌 (거의) 의존합니다. 숙성 되거나 차단되면 빠르게 교체되어 일반적으로 변경되지 않은 성능을 보여 주게 됩니다. 샘플 간의 제거 및 세척 단계는 효과적이고 짧으며 샘플당 분석 시간도 짧습니다.

제시 된 방법은 장점의 좋은 수치와 신뢰할 수 있습니다. 원리의 증거로서, 이 방법은 인간 도파민성 신경모세포종(SH-SY5Y) 세포 용액에 적용되며, 이는 암연구뿐만아니라 신경변성에서 중요한 샘플 유형이다.

Protocol

주의: 이 방법은 염산(HCl, 초순수, 농도 1M에서 희석) 및 테트라메틸람모늄 하이드록시드(TMAH, 초순수로부터 희석, 농도 25%)를 사용합니다. 두 물질 모두 부식성입니다. 피부와 눈 보호를 사용합니다.

1. 전해질 준비

  1. HCl-전해질 준비: 배경 전해질(20mM HCl), 출구 전해질(5mM HCl) 및 종기 전해질(0.05 mM HCl)
    1. 100mL 플라스크에서 20mM HCl을 준비: 플라스크에 1 M HCl의 파이펫 2 mL, 초순수물로 마크를 채우고 부드럽게 흔들어 주세요.
    2. 100mL 플라스크에서 5mM HCl을 준비: 플라스크에 1 M HCl의 파이펫 500 μL, 초순수물로 마크까지 채우고 부드럽게 흔들어 주세요.
    3. 20mM HCl의 파이펫 1mL을 100mL 플라스크로 한 다음 초순수로 마크까지 채우고 부드럽게 흔들어 두 단계로 0.05 mM HCl을 준비합니다. 이어서, 후자의 용액의 파이펫 2.5 mL은 15mL 원문튜브(재료 표)에넣고 7.5mL의 초순수를 추가한 다음 부드럽게 흔들어 줍니다.
  2. 15mL 원전 튜브에서 선도적인 전해질 12% TMAH 를 준비: 파이프 4.8 mL 25% TMAH를 튜브에 넣고 5.2mL의 초순수수를 추가하고 부드럽게 흔들어 줍니다.
    참고: 12% TMAH는 각 실행 전에 그리고 주입된 견본의 앞에 있는 주요 전해질로 모세관을 제거하고 청소하기 위하여 이용됩니다).

2. 표준 및 시료의 준비 및 저장

  1. 표준
    1. Fe(II)의 경우, 100mL 플라스크에 2+2의35.61 mg의 Fe(II)를 100mL 플라스크로 채우고 100 mg Fe(II)/L 재고 농도를 위해 초순수로 100mL 마크를 채웁니다.2 용해가 완료될 때까지 부드럽게 흔들어 줍니다.
    2. Fe(III)의 경우, 100mL 플라스크에 29.04 mg의 Fe(III)Cl3을 계량하고 100 mg Fe(III)/L 재고 농도를 위해 초순수로 100mL 마크를 채웁니다. 용해가 완료될 때까지 부드럽게 흔들어 줍니다.
    3. 작업 표준 솔루션을 준비하기 위해 표 1에 따라 각 표준 솔루션을 희석합니다.
      참고: 100 mg/L 스톡 솔루션의 일일 재고 솔루션을 준비한 후 후자는 냉동 보관해야 합니다. 표 1에따른 일일 표준을 준비한 후, 1 mg/L 스톡 용액은 1.5mL 볼륨으로 알리인용되어야 하며 1.5mL 튜브에 냉동(상단에 공기가 없는 최강)을 저장해야 합니다. 새로운 날에 대해 일일 기준을 준비하기 위해 일일 주식 한도 를 해동하고 사용 후 철회됩니다.
시작 농도 파이펫팅 볼륨 밀리-Q 물로 채우기 결과 농도 최종 볼륨 솔루션 사용
100 mg/L 50 μL 4950 μL 1 mg/L 50mL 데일리 스톡 솔루션
1 mg/L 200 μL 1800 μL 100 μg/L 2 mL 표준
100 μg/L
1 mg/L 100 μL 1900 μL 50 μg/L 2 mL 표준
50 μg/L
1 mg/L 50 μL 1950 μL 25 μg/L 2 mL 표준
25 μg/L
1 mg/L 25 μL 1975μL 12.5μg/L 2 mL 표준
12.5 μg/l
1 mg/L 20 μL 1980μL 10 μg/L 2 mL 표준
10 μg/L
0 2000 μL 0 μg/L 2 mL

표 1: 표준을 준비하기 위한 파이프팅 방식입니다.

  1. SH-SY5Y 셀 리자테
    참고: 세포 용해물(SH-SY5Y)은 Fe(II)/(III)-관련 바이오 매트릭스로 작용하여 방법의 성능과 신뢰성을 보여주었다.
    1. 이전에 실행 중인 실험16에서lysate를 사용합니다. 이 세포 는 변산화기 균형에 영향을 미칠 수 있는 pH 변경 또는 화학 물질을 방지 하는 준비를 따르십시오. 수정된 방사성면역침전 분석(RIPA) 용해 완충제(PBS pH 7.4) 사용, 0.5% 디옥시콜레이트 나트륨, 1% NP-40), 금속 첼레이터(EDTA 등), 감소제(DTT, 2-메르카포에탄올) 및 음이온 계면활성제 세제 및 금속 복합제(예: SDS)를 피하여 Fe(II)/Fe(FE)의 사후 수집 변경을 최소화합니다.
    2. N2-대기하에서 작업하면 주변 공기로부터O2에 의한 산화를 억제하고 질소 대기 하에서 -80°C에서 가능한 한 빨리 용해될 때까지 자동 화를 최소화하기 위해 얼음에서 작업한다.2

3. ICP-MS에 CE의 하이픈을위한 악기 를 설정

  1. 모세관 전기 포근 기구를 설정합니다.
    참고: 이 섹션의 경우 판독기는 주로 실험실에서 사용할 수 있는 각 계측기의 설명서를 참조합니다.
    1. ICP-MS의 분무기에 CE 기기의 입구 바이알에서 도달하는 적절한 길이의 모세관을 설치합니다. 입구 측에만 모세관을 설치하고 장치 외부로 CE-ICP-MS 인터페이스로 연결합니다.
      참고: ICP-MS에 최면 CE를 위해, 이 프로토콜에서 일반 기악 설정 설명에 따라 90cm 융합 실리카 모세관(ID 50 μm)이 설치되었다. 일반적으로 실험실내 기기의 위치에 따라 70-100cm의 모세관 크기가 필요합니다.
    2. 모세관이 CE-ICP-MS 인터페이스외부로 향할 때 사용되지 않기 때문에 소프트에서 CE 계측기의 콘센트 리프트를 비활성화하여 원활하게 작동합니다.
    3. ICP-MS 계측기의 트리거-IN을 트리거하기 위해 CE 계측기 트리거-OUT에서 트리거 케이블을 설치합니다.
    4. 필요한 모든 솔루션(20mM HCl, 0.05m MM HCl, 12% TMAH), 계측기의 샘플 및 솔루션 로터의 표준 및 샘플에 대한 위치를 선택하고 기기 소프트웨어에서 평소와 같이 위치를 정의합니다(계측기 설명서 참조).
    5. 제어된 실험실 온도와 동일한 것으로, 20°C에서 동일하도록 로터 및 모세혈관 온도를 선택합니다.
      참고: CE 기기 내부 및 외부의 모세관 부품에 대한 온도 그라데이션이 발생하지 않습니다.
  2. ICP-MS 계측기 설정
    1. 매일 기악 표준 설정 및 작동 절차에 따라 ICP-MS 계측기를 최적화합니다. 제조업체의 프로토콜을 사용합니다.
    2. NH3를 DRC 가스로 사용하는 동적 반응 셀(DRC) 기술을 사용하여 0.6mL/min NH3–유량및 RPq 값 = 0.45를 사용합니다.
      참고: 철 분전의 경우, 56Fe로프로그래밍된 방법은 가장 풍부한 Fe 동위원소(91.754%의 상대적 풍부함)로 프로그래밍되지만[40Ar16O]+ 클러스터에서 심각하게 방해되고 있습니다. 표준 모드의 쿼드러폴 기반 ICP-MS는 실질적으로 블라인드이며 이 동위원소에서 오버플로되는 검출기입니다. 위의 설정(단계 3.2.2 참조)을 사용하면 낮은 기준선과 높은 감도가 달성됩니다(낮은 ng/L 범위에서 일반 총 철 결단력 LOD의 경우).
    3. CE 분리 시 날카롭고 짧은 피크를 모니터링할 수 있도록 50ms에서 동위원소당 거주 시간 설정을 선택합니다.
    4. ICP-MS 메서드를 CE 계측기로 트리거 시작하도록 프로그래밍합니다.
  3. CE-ICP-MS 인터페이스 설정
    참고: 주로 CE 모세관을 ICP-MS에 연결하는 두 가지 옵션이 있습니다. 상용 인터페이스를 사용하는 경우 설정에 대한 제공된 설명을 따릅니다. 이 프로토콜은 수정 후 이전 게시를 기반으로 간단하고 수제 인터페이스를 사용합니다.20. 주요 문제는 최고의 분무기를 위한 분무기에 전체 유류량을 채택하는 것을 제외하고 모세관 efflux의 희석이 적은 효율적인 분무기입니다. 또한, 분무기로부터의 자기 포부로 인한 모세관을 분리하여 흡입 흐름의 최소화, 그리고 접지 된 출구 전극의 전기적 연결이 모세관 끝에 필수적이다.
    1. 분무기 선택
      1. 저용량 스프레이 챔버에 맞는 낮은 자기 흡입 부피(예: 100 μL/min)를 사용하는 동심 성무기는
        참고: 낮은 흡수량은 여전히 최적화된 분기화와 평행한 모세관 립룩의 적당한 희석만 발생합니다. 출구 전극의 전기 연결은 출구 전극 주위와 모세관 끝 주위의 전해질 흐름에 의해 수행됩니다.
      2. 분무기의 자기 포부를 사용하여 모세관 분리를 통해 흡입을 최소화하고 분무기가 필요로 하는 최적의 값으로 유량의 채택을 한다.
      3. 표 2에서 다음 부품을 준비하여 이 홈메이드 인터페이스를 장착합니다.
    2. 간단한 인터페이스 설정
      참고: 그림 1을 사용하여 간단한 인터페이스에 대한 부품 장착 설명에 따릅니다. 그림 1과 다음 텍스트의 숫자는 표 2의숫자를 참조합니다.
      1. 두 개의 3방향 여성 Luer 커넥터(3번)와 수컷 원뿔 루어 커넥터(4번)를 연결하여 인터페이스 장착을 시작합니다. 하단 3방향 Luer 막대의 왼쪽 끝을 남성 커넥터에 연결하고 상위 3방향 Luer의 중간 연결에 연결합니다.
      2. Pt-와이어(7번)와 1cm 실리콘 튜브(5번)에 1cm 튜브(No. 1)를 넣고 남성 루어 커넥터(2호)의 노즐을 덮습니다. 어셈블리를 Luer-전형적인 나사 회전으로 하부 3방향 Luer 커넥터(3번)의 중간 연결에 고정합니다.
      3. CE 모세관의 출구 끝에 1cm 튜브(No.1)를 밀어 끝에서 약 8-9cm를 배치합니다.
      4. 후자의 1cm 실리콘 튜브(5번)를 후자에 놓고 남성 루어 커넥터(2번)의 노즐을 넣습니다.
      5. 왼쪽에서 전체 어셈블리를 3way-T 커넥터의 막대를 통과하고 Luer-전형적인 나사 회전에 의해 여성 3방향 Luer 커넥터(3번)의 남성 루어 커넥터와 왼쪽 끝을 고정합니다.
      6. 25cm 실리콘 튜브(5번)를 남성 루어 커넥터(2번)의 노즐에서 수정하고 Luer-전형적인 나사 회전에 의해 하부 3방향 Luer 커넥터(3번)에서 바의 하부(오른쪽) 끝에 전체 어셈블리를 고정합니다.
      7. 1cm 실리콘 튜브(No.6)를 가지고 분무기 의 끝에 5mm를 단단히 밀어 내고 두 번째 남성 루어 콘 커넥터(4번)가 실리콘 튜브의 돌출 부위에 단단히 연결됩니다.
      8. 상기 장착 된 인터페이스 부분을 분무기에서 남성 콘으로 돌출 된 CE 모세관으로 이후에 이동합니다. CE 모세관을 수컷 콘을 통해 신중하게 삽입하고 후자가 좁아질 때까지 분무기 모세관의 넓은 부분을 통해 더 멀리 삽입하십시오. 모세관의 돌출 길이가 적절하게 선택되었다는 점을 감안할 때, 상류 여성 3 방향 Luer 커넥터는 이제 남성 콘에 단단히 맞습니다.
      9. 필요한 경우 돌출 모세관 길이의 길이를 교정하여 자체 제작 인터페이스에 들어가는 튜브(1번)에서 모세관(forward/뒤로)을 이동하여 수정합니다.
        참고: 분무기 모세관의 시작 부분에 있는 CE 모세관의 최적 위치는 너무 중요하지 않습니다. 그러나, 분무기 모세관의 좁은 부분에 너무 가까이 CE 모세관을 밀어하지 마십시오. 이것은 출구 전해질 흐름을 방해하거나 차단할 수 있습니다. 또한, 이것은 출구 전극에 전기 연결을 중단하고 CE 모세관을 통해 흡입을 증가시킬 것이고, 그 결과 방해 분리의 결과. 차례로, 그 때 날카로운 분리된 봉우리가 넓어지고 해상도가 손실될 것이기 때문에 분무기 모세관에서 너무 멀리 CE 모세관 끝을 유지하지 마십시오.
      10. 렌즈를 사용하여 최상의 위치를 식별합니다.
        참고: 도 1(오른쪽 아래)은 분무기 내부의 CE 모세관의 최적의 위치를 나타낸다.

Figure 1
그림 1: CE-ICP-MS 인터페이스의 회로도 및 장착. 회로도는 간단하고 저렴한 CE-ICP-MS 인터페이스의 단계별 장착을 위한 단일 부품을 식별합니다. 창은 분무기에서 CE 모세관의 최적의 위치의 사진을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

아니요. 부분 에 사용
1 튜빙(녹색 오렌지 색 코드), 2 x ca. 1cm Luer 부품의 CE 모세관 및 콘센트 전극고정 및 타이트한 유지
2 루어, 남성, 3 x, 1.6 mm ID 실리콘 튜브에 적합 실리콘 튜브를 전해질에 연결하고 CE 모세관 및 Pt-와이어 전극을 고정하는 데 도움이 됩니다.
3 3-웨이 루어, 여성, 2 x 전극, 모세관 및 흡인 콘센트 흐름을 연결하는 T 피스
4 루어 콘, 남성, 2 x 여성 루어를 서로 연결하고 분무기에 연결
5 실리콘 튜브, 1.6mm ID, 0.8 mm 벽, 2 x 1cm, 1x ca. 25cm a) 1cm; 인터페이스에 CE 모세관을 단단히,
b) 1cm; 인터페이스에 Pt-와이어 를 단단히
c) 25cm; 콘센트 전해질 플라스크에서 인터페이스로 연결
6 실리콘 튜브, 3mm ID, 1.2 mm 벽, ca.1 cm 루어 콘을 분무기로 단단히 고정
7 플래티넘 와이어 콘센트 전극

표 2: 간단한 자체 제작 CE-ICP-MS 인터페이스를 구축하기 위한 부품입니다. 숫자는 그림 1과 텍스트의 설명을 참조합니다.

4. 측정 준비

참고: 측정하기 전에 모세관은 세척을 위해 강력한 알칼리성 용액(여기: 12% TMAH)으로 플러시된 다음 백그라운드 전해질로 채워져야 합니다. 분리개선을 위해 스태킹 버퍼 샌드위치는 전도도 및 pH 그라데이션을 기반으로 샘플을 중심으로 구축됩니다. 표 3은 프로그래밍된 방법에 따라 계측기에서 자동으로 처리되는 모세관의 연속 된 준비 단계를 요약합니다.

스텝 아니오 단계 화학 조건
  CE 열 준비
준비 1 모세관 청소 12 % TMAH 4 바, 1 분.
준비 2 배경 전해질로 모세관 제거 20mM HCl 4 바, 1 분.
준비 3 스태킹: 선도 전해질 12 % TMAH 150 mbar, 3 s
준비 4 사출 샘플 150 mbar, 3 s
준비 5 스태킹: 전해질 종기 0.05 mM HCl 150 mbar, 3 s

표 3: 모세관 준비 단계 측정 전. 이러한 단계는 CE-메서드에서 CE 시스템 소프트웨어로 프로그래밍되며 가압 된 샘플 주입 및 샘플 주위에 "스태킹 샌드위치"의 축적을 포함합니다.

  1. 표 3에주어진 단계를 연속적으로 실행하는 CE 메서드를 프로그래밍합니다.
  2. CE 소프트웨어에서 샘플 테이블 및 시퀀스를 정의하고 이 시퀀스를 ICP-MS 소프트웨어로 복사합니다.

5. 측정 및 데이터 평가

  1. CE 계측기에서 메서드를 시작합니다. 모세관의 프로그래밍 된 준비 및 충전 후, 측정은 20 mM HCl을 포함하는 입구 바이알이 모세관 입구에 있는 즉시 자동으로 시작됩니다. "시작 트리거"는 Fe-동위원소의 온라인 모니터링을 시작하는 ICP-MS로 전송됩니다.
    참고: 분리는 +25 kV의 전압을 사용합니다. CE 계측기를 ICP-MS에 연결하는 데 필요한 모세관의 연장 된 길이는 분리 시간이 불필요하게 증가합니다. 따라서, 분리는 입구에서 250 mbar의 저압에 의해 지원된다. 콘센트에서 자체 흡인 된 전해질은 5 mM HCl입니다. 총 분석은 적당한 전도도를 가진 견본을 위해 3 분 지속됩니다. ICP-MS 소프트웨어의 신호 창에서 전기페로그램은 실행 중에 관찰될 수 있다. 각 샘플의 끝에서 두 개의 데이터 파일이 자동으로 생성되며, 하나는 내부 데이터 뱅크에서 계측 기막 소프트웨어에서만 액세스할 수 있으며, 두 번째 데이터 파일은 일반 크로마토그래피 소프트웨어에서 가져오기 함수에 의해 액세스 가능한 ".xl" 또는 ".txt" 형식으로 내보내기 폴더의 두 번째 파일입니다.
  2. 크로마토그래피 소프트웨어로 파일을 내보내기 위한 ICP-MS 계측기의 소프트웨어 설명서를 참조하십시오.

Representative Results

표준 및 교정 측정
이동 시간은 단일 표준 주사에 의해 해명되었다: Fe(III) 표준은 이동 시간의 118s와 이동 시간의 136s에서 Fe (II) 표준에서 모니터링되었다. 검출의 한계는 기준노이즈를 참조하는 3몰드 기준을 사용하여 계산되었으며, 표준 농도50 μg/L.LOD(II)는 3.1 μg/L 및LOD(III)가 3.2 μg/L.이며, 두 철종에 대한 피크 영역 기반 교정은 LOD에서 150μgg/L로 선형하였다. Fe(III)의 선형성은 더 높은 농도에서도 입증되었지만 Fe(II)의 교정 곡선의 경사가 감소했습니다. Fe(II)/(III) 판정과 관련된 바이오 샘플은 일반적으로 Fe 농도가 낮기 때문에 150 μg/L의 상부 농도 제한이 충분하다고 판단되었다. 농도가 높을 경우, 시료는 그에 따라 희석될 수 있다. 피크 높이 교정은 최대 600μg/L까지 검사되었으며 전체 테스트 범위에 걸쳐 선형성을 보여 주였습니다. 그림 2에표시됩니다.

Figure 2
그림 2: Fe(III) 및 Fe(II)의 교정 곡선(피크 높이). 두 Fe 레독스 종의 피크 높이 관련 교정은 ca. 161 *X의 경사와 선형이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

SH-SY5Y 세포 용해 분석
SH-SY5Y 세포 용액의 분석은 다소 높은 전도성으로 인해 철 레독스 종에 대한 약간 느린 이동을 보였다. Fe(III)는 124s의 마이그레이션 시간, Fe(II)에서 158s의 마이그레이션 시간에 모니터링되었습니다. SH-SY5Y 셀 용액의 이동 시간 정밀도는 Fe(III)의 경우 2%, Fe(II)의 경우 3%였다. 이 방법을 이용한 정량적 Fe(II) 및 Fe(III) 측정은 Fe(III) 농도가 330 μg/L 및 Fe(II) 농도 84 μg/L로 밝혀졌으며, 둘 다 Fe(II)/Fe(III) 비율이 0.25의 비율을 초래하였다. 각각 56개의Fe-선택적 전기페로그램은 도 3에서입증된다.

Figure 3
도 3: SH-SY5Y 셀 용액의 Fe 특이적 전체그램 56개. Fe(III)는 123s에서 모니터링되며, 158s에서 Fe(II)에서 명확하게 분리되어 22800 cps에 도달하여 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

철은 OS 진행에서 중요한 역할을 하기 때문에 미토콘드리아 기능 장애 또는 FTP를 용이하게 하기 때문에, 동시 Fe(II)/Fe(III) 표본을 위한 다목적 CE-ICP-MS 기반 정량적 방법이 이 문서에서 제시되고 그 적용은 세포 리자테에서 예시적으로 입증된다. 짧은 분석 시간과 장점의 수치 (LOQ, 정밀도, 회복)를 제공하는 방법은 특히 신경 퇴행성 및 암 연구에서 철 레독스 스펙션에 적합한 샘플에 적합합니다. LC를 기반으로 한 이전 방법과 비교하여 이 CE 기반 방법은 컬럼 배치와 실질적으로 독립적이며 LC 열 변경 후 이전에 관찰된 재현성 문제입니다. 각 실행 전에 모세관 제제는 <4 분이며 시료당 분석 시간은 최대 3 분까지 적당한 염분입니다. 분자 전하 및 크기 외에도 CZE의 마이그레이션 시간은 샘플 플러그의 전도도에 따라 달라지며, 이는 샘플 자체가 전도도에 상당히 영향을 줄 때 마이그레이션 시간 변화 또는 이동을 일으킵니다. 이동 시간의 이러한 변화는 모세관 전기 포근에서 잘 알려져 있습니다. 이것은 문학21,,22에서알려진 CZE-immanent 문제입니다. 표준 및 SH-SY5Y 세포 용해율은 중등도 및 균질성 전도도를 가졌다. 따라서 마이그레이션 시간은 정밀도가 작은 것으로 나타났습니다. 그러나 전도도가 높은 샘플의 경우 마이그레이션 시간이 최대 5분까지 관찰될 수 있습니다. 따라서 명확한 종 식별을 위해 표준 추가를 권장합니다.

철 레독스 분전에서 중요한 문제점은 샘플 준비8,,13동안 종 안정성(즉, Fe(II)/(III) 평형의 유지보수)이다. 부적절한 pH 또는 킬라팅 화학 물질뿐만 아니라 시료와 접촉하는 산소 (공기)와 같은 부적절한 저장 조건또는 깊은 냉동 저장의 파손은 Fe (II)/(III) 균형을 쉽게 바꿀 수 있습니다. 따라서 SH-SY5Y 세포 용액의 제조를 위해, 용해 버퍼는 어떤 첼레팅 화학 물질, 생리적 pH 없이 선택되었지만, 시료 제조 중 불활성 가스 오버레이, 샘플 용기 및 즉각적인 깊은 동결이 이러한 샘플에 적용되었다.

문헌에서는 Fe(II)를 모니터링하기 위한 반정적 접근법을 찾을 수 있습니다. 산화 스트레스에서 철의 역할에 대한 이해를 향상시키기 위해 여러 연구 그룹은 Fe (II)-특정 프로브를 개발하여 체외에서 철철의 비정상적인 고도를 반 정량적으로 모니터링하고 시각화했습니다. 그러나, 주의 하는 것이 중요 한, 이러한 프로브 Fe (III)를 고려 하지 않습니다 하 고 정량화 하지 않습니다 하지만 그냥 보고 "더" 또는 "적은" Fe (II). 현재까지, 몇 개의 바이오마커만이 OS 및 FPT를 결정할 수 있으며, Fe(II)/Fe(III) 레독스종(23,,24)을동시에 정량화하는 신뢰할 수 있는 방법이 없기 때문이다. 이를 염두에 두고, 제시된 방법은 둘 다, Fe(III) 및 Fe(II)의 빠른 정량화를 한 번에 용이하게 하는 것으로, 철의존 분자 공정에 대한 통찰력을 심화시키는 유망한 도구가 될 수 있다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

VV는 대학 의료 센터 괴팅겐의 교내 연구 보조금 (Forschungsförderung)과 엘크뢰너 - 프레세니우스 - 스티프퉁의 엘크뢰너 연구 프로그램에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CE capillary CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany 105180-25
CE system PrinCe technolgies 0005.263 model PrinCe 760
Conical Superclear Tubes 15 ml Analytics-shop.com by Altmann Analytik PEN0777704
Conical Superclear Tubes 50 ml Analytics-shop.com by Altmann Analytik PEN0777694
FeCl2 * 4H2O Merck 103861
FeCl3 Merck 803945
Fluidflex Silikon HG-Schlauch ProLiquid 4001106HG
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm Chromatographie Service GmbH 105180-25
hydrochloric acid, 1 M Merck 1101652500 corrosive
ICP-MS Perkin Elmer N814003
Luer, 3-way female BioRad 7318229
Luer, cone male neoLab Migge 2-1895
Luer, male neoLab Migge 2-1880
Peakfit peak evaluation software Systat PeakFit 4.12
Pt-wire Carl Roth 0737.1
PVC tube ProLiquid 6000002
RIPA buffer Abcam ab156034
Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % Merck 814748 corrosive
TYGON-tube R-3607 ProLiquid 3700203A

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References

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철 레독스 종(Fe(II), Fe(III)의 정량화를 위한 모세관 전기포고증-유도 결합된 혈장 질량 분광법(CE-ICP-MS)의 설정
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Michalke, B., Willkommen, D., Venkataramani, V. Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III)). J. Vis. Exp. (159), e61055, doi:10.3791/61055 (2020).More

Michalke, B., Willkommen, D., Venkataramani, V. Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III)). J. Vis. Exp. (159), e61055, doi:10.3791/61055 (2020).

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