Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Demir Redoks Türlerinin Nicelleştirilmesi İçin Kapiller Elektroforez-Endüktif Birleştirilmiş Plazma Kütle Spektrometresi (CE-ICP-MS) Kurulumu (Fe(II), Fe(III))

doi: 10.3791/61055 Published: May 4, 2020

Summary

Bu demir redoks speksiyon yöntemi kapiller elektroforez-endüktif plazma kütle spektrometresi ile birleştirilmiş plazma kütle spektrometresi ve numune istifleme ile tek bir vadede kısa analiz ile birlikte dayanmaktadır. Bu yöntem, çeşitli doku lar ve biyosıvı örnekleri arasında demir redoks türleri için hızlı bir şekilde analiz eder ve düşük niceleme limitleri sağlar.

Abstract

Demir metabolizmasının dishomestazisi, kanser ve çeşitli nörodejeneratif durumlar da dahil olmak üzere birçok hastalığın patofizyolojik çerçevesi içinde muhasebelenmiştir. Aşırı demir serbest redoks-aktif Fe (II) ile sonuçlanır ve hücre içinde oksidatif stres (OS) ve ferroptosis (FPT) olarak bilinen lipid peroksidasyonu ile ölüm gibi yıkıcı etkilere neden olabilir. Bu nedenle, toplam Fe tayini yerine demir (Fe(II)) ve ferrik (Fe(III)) demirin nicel ölçümleri bu zararlı süreçlere daha yakın bir bakış açısı nın anahtarıdır. Fe(II)/(III) tayinleri, beyin omurilik sıvısı (BOS) gibi ilgili numunelerde hızlı redoks-durum değişimleri ve düşük konsantrasyonlarla engellenebileceğinden, hızlı analiz yapan ve düşük niceleme (LOQ) limitler sağlayan yöntemler kullanılmalıdır. Kapiller elektroforez (CE) hızlı Fe(II)/Fe(III) ayrımı avantajı sağlar ve sabit bir faz olmadan çalışır, hangi redoks dengesi ile müdahale veya analit yapışmasına neden olabilir. CE, dedektör olarak endüktif birleştirilmiş plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) ile birleşerek algılama hassasiyeti ve seçiciliğinin daha da geliştirilmesini sağlar. Sunulan yöntemde arka plan elektroliti olarak 20 mM HCl ve +25 kV voltaj kullan.) Pik şekiller ve konsantrasyon algılama limitleri iletkenlik-pH-istifleme ile geliştirilmiştir. 56[ArO]+, ICP-MS azaltılması için bir reaksiyon gazı olarak NH3 ile dinamik reaksiyon hücresi (DRC) modunda çalıştırıldı. Yöntem, 3 μg/L algılama (LOD) sınırına ulaşır. Pik alana bağlı kalibrasyonlar 150 g/L'ye kadar doğrusal dı. Ölçüm hassasiyeti %2,2 (Fe(III)) ile %3,5 (Fe(II)) idi. Göç süresi hassasiyeti her iki tür için de %1:2 oranında insan nöroblastomu (SH-SY5Y) hücrelerinin seyreltilmiş lysates'inde saptandı. Standart ilave ile kurtarma deneyleri % 97 Fe(III) ve % 105 Fe(II) doğruluğunu ortaya koymuştur. BOS gibi gerçek yaşamdaki biyo-örneklerde, göç süresi değişen iletkenliğe (yani tuzluluğa) göre değişebilir. Böylece, pik tanımlama standart ekleme ile doğrulanır.

Introduction

Bugün, en çok demir aracılı oksidatif stres (OS) nörodejeneratif beyin bozuklukları özellikle birden fazla bozukluklar önemli bir rol oynadığı açıktır, Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi yanı sıra kanser1,2,3,4. İşletim sistemi, redoks-çift Fe(II)/Fe(III) durumu ve dengesi ile yakından ilişkilidir. Fe(III) redoks-inaktif iken, Fe(II) güçlü reaktif oksijen türleri üretir (ROS) katalize ederek H2O2 ayrışma hidroksil radikal üretim ve membran lipid peroksidasyonu takip5,6. Moleküler düzeyde, Fe(II)-oluşturulan ROS ve peroksidize fosfolipidler proteinlerin bütünlüğü için güçlü bir saldırı vardır, lipidler ve DNA7,8. Bu tür zararlı hücresel disfonksiyon azalmış ATP-içerik 9 ile mitokondriyal disfonksiyon neden gösterilmiştirve hatta programlanmış nekrotik hücre ölümü tetikleyebilir, ferroptoz istiğdrisi olarak bilinen (FPT)10,11. Bu nedenle, kantitatif Fe(II)/(III) redoks sintrasyonu, redoks ile ilişkili bozuklukların geniş bir spektrumda büyük önem taşımaktadır.

Kimyasal türleşme genel olarak iz elementlerbiyolojik rol ve metabolizma çalışması için iyi kurulmuş bir araçtır7,8 yanı sıra nörodejeneratif koşullarda12,13,14,15,16,17. Literatürde bulunan Fe-redoks türezi yöntemleri tipik olarak sıvı kromatografisi (LC) ayrımına dayanır. Literatürde bazı bir element seçici dedektör olarak endüktif birleştirilmiş plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) kullanılır. Ancak, rutin LC çalışmalarında, aşırı tasfiye süreleri çalışır arasında gerekli idi. LC sütunlarının toplu-toplu varyasyonu, her sütun değişikliğinden sonra elüsyon koşullarının yeniden optimizasyonuna zorlanmış olur. Bu sorunlar yüksek iş bilgililiği engelliyor. Kabul edilebilir güvenilirlik kazanmak ve yöntemi yeniden iyice değerlendirmek için ek süre gereklidir.

Bu sakıncaları atlatmak için burada Fe(II)/Fe(III) redoks speksinasyonu için kapiller elektroforez indüktif olarak birleştirilmiş plazma kütle spektrometresi (CE-ICP-MS) üzerine bir yöntem sunulmuştur. CE, LC18'egöre çeşitli avantajlar sunar. Kılcal damarlar sabit faza sahiptir ve bu nedenle toplu kimliğe bağlı değildir (neredeyse) bağlıdır. Yaşlandığında veya engellendiğinde, genellikle değişmeyen performans göstererek hızlı bir şekilde değiştirilirler. Numuneler arasındaki temizleme ve temizleme adımları etkili ve kısadır ve numune başına analiz süresi de kısadır.

Sunulan yöntem liyakat iyi rakamlar ile güvenilirdir. Bir kanıt-of-ilke olarak, yöntem insan dopaminerjik nöroblastom uygulanır (SH-SY5Y) hücre lisat, nörodejenerasyon önemli bir örnek türü yanı sıra kanser araştırma19.

Protocol

DİkKAT: Yöntemhidroklorik asit kullanır (HCl, ultrapure gelen seyreltme başlangıç, konsantrasyon 1 M) ve tetramethylamonniumhidroksit (TMAH, ultrapure gelen seyreltme başlangıç, konsantrasyon% 25). Her iki madde de güçlü aşındırıcı. Cilt ve göz koruması kullanın.

1. Elektrolitlerin hazırlanması

  1. HCl-elektrolitlerin hazırlanması: arka plan elektroliti (20 mM HCl), çıkış elektroliti (5 mM HCl) ve sonlandırıcı elektrolit (0,05 mM HCl)
    1. 100 mL'lik bir şişede 20 mM HCl hazırlayın: Pipet 2 mL 1 M HCl şişenin içine, işareti ultra saf suyla doldurun ve hafifçe çalkalayın.
    2. 100 mL'lik bir şişede 5 mM HCl hazırlayın: Pipet 500 μL 1 M HCl şişenin içine, işareti ultra saf suyla doldurun ve hafifçe çalkalayın.
    3. 0,05 mM HCl'yi iki adımda hazırlayın: Pipet 1 mL 20 mM HCl'lik bir şişeye 100 mL'lik bir şişeye ve ardından işareti ultra saf suyla doldurun ve hafifçe çalkalayın. Daha sonra, pipet 2.5 mL ikinci çözelti 15 mL konik tüp içine(Malzeme Tablosu)ve ultrasaf su 7.5 mL ekleyin, sonra hafifçe sallayın.
  2. 15 mL konik bir tüpte önde gelen elektrolit %12 TMAH hazırlanması: Pipet 4,8 mL %25 TMAH tüpiçine, 5,2 mL ultra saf su ekleyin ve hafifçe çalkalayın.
    NOT: %12'lik TMAH, her çalıştırmadan önce ve enjekte edilen numunenin önünde önde gelen bir elektrolit olarak kılcal damarı temizlemek ve temizlemek için kullanılır.

2. Standartların ve numunelerin hazırlanması ve saklanması

  1. Standart
    1. Fe(II için) 35.61 mg Fe(II)Cl2·4H2O 100 mL'lik bir şişeye tartının ve 100 mg Fe(II)/L stok konsantrasyonu için 100 mL işaretini ultra saf suyla doldurun. Tamamen çözünene kadar hafifçe çalkalayın.
    2. Fe(III için), 100 mL'lik bir şişeye 29.04 mg Fe(III)Cl3 tartın ve 100 mg Fe(III)/L stok konsantrasyonu için 100 mL'lik işareti ultra saf suyla doldurun. Tamamen çözünene kadar hafifçe çalkalayın.
    3. Çalışma standardı çözümleri hazırlamak için her standart çözeltiyi Tablo 1'e göre seyreltin.
      NOT: 100 mg/L stok çözeltisinin günlük stok çözeltileri hazırlandıktan sonra dondurulmuş olarak saklanmalıdır. Günlük standartları Tablo 1'egöre hazırladıktan sonra, 1 mg/L stok çözeltisi 1,5 mL hacime aktarılmalı ve 1,5 mL tüplerde dondurulmuş olarak (en iyisi hava kalmadan) depolanmalıdır. Her yeni gün için, günlük standartların hazırlanması için bir günlük stok kapağı çözülür ve kullanımdan sonra geri çekilir.
Başlangıç konsantrasyonu Pipetleme hacmi Milli-Q suyu ile doldurun Ortaya çıkan konsantrasyon Son ses Çözelti kullanımı
100 mg/L 50 μL 4950 μL 1 mg/L 50 mL Günlük stok çözümü
1 mg/L 200 μL 1800 μL 100 μg/L 2 mL Standart
100 μg/L
1 mg/L 100 μL 1900 μL 50 μg/L 2 mL Standart
50 μg/L
1 mg/L 50 μL 1950 μL 25 μg/L 2 mL Standart
25 μg/L
1 mg/L 25 μL 1975°L 12.5μg/L 2 mL Standart
12,5 μg/l
1 mg/L 20 μL 1980°L 10 μg/L 2 mL Standart
10 μg/L
0 2000 μL 0 μg/L 2 mL Boş

Tablo 1: Standartların hazırlanması için pipetleme şeması.

  1. SH-SY5Y hücre lisat
    NOT: Hücre lisat (SH-SY5Y) Fe(II)/(III)-ilgili biyo-matris olarak yöntemin performansını ve güvenilirliğini göstermek için görev yaptı.
    1. Daha önce çalışan deneylerden lysate kullanın16. Bu hücre lisat preparatına uygulayın ve redoks dengesini etkileyebilecek pH değişikliklerini veya kimyasalları önleyin. Modifiye radyoimmünopreplin atası (RIPA) lysis tamponu kullanın (PBS pH 7.4, %0.5 sodyum deoksizolat, %1 NP-40), metal şelatlardan (EDTA gibi), azaltıcı ajanlardan (DTT, 2-Mercaptoetanol gibi) ve fe(II)/Fe(III) oranının toplama sonrası değişikliklerini minileştirmek için anyonik yüzey aktif deterjanlar ve metal kompleksleyici ajanlardan (SDS gibi) kaçınmak.
    2. N2-atmosfer altında çalışmak ortam havasından O2 tarafından oksidasyon inhibe ve lysate azot atmosferi altında -80 °C'de mümkün olan en kısa sürede depolanana kadar herhangi bir otoksiyonu en aza indirmek için buz üzerinde çalışmak.

3. CE'nin ICP-MS'ye hecelemi için aletlerin ayarlanması

  1. Kılcal elektroforez aletini ayarlayın.
    NOT: Bu bölümde, okuyucu esas olarak laboratuvarda bulunan ilgili cihazın el kitabına atıfta bulunulmaktadır.
    1. CE cihazının giriş şişesinden ICP-MS nebülizörüne ulaşmak için uygun uzunlukta bir kılcal damar kurun. Kılcal damarı yalnızca giriş tarafına takın ve cihazın dışına CE-ICP-MS arabirimine doğru yönlendirin.
      NOT: CE'nin ICP-MS'e hecelenmesi için, bu protokolde genel enstrümantal kurulum açıklamasına göre 90 cm erimiş silika kılcal (ID 50 m) yüklenmiştir. Tipik olarak, laboratuvardaki aletlerin konumuna bağlı olarak 70−100 cm'lik kılcal damar boyutlarına ihtiyaç duyulacaktır.
    2. Kılcal damar CE-ICP-MS arabirimine yönlendirildiğinde kullanılmadığı için, yazılımdaki CE-aletinin çıkış asansörünü sorunsuz çalışma için devre dışı bırakın.
    3. CE-instrument trigger-OUT'tan ICP-MS cihazının tetikleme kablosuna bir tetik kablosu tonuyla tonuyla tonuyla.
    4. Gerekli tüm çözümler için pozisyonları seçin (20 mM HCl, 0,05 mM HCl, %12 TMAH), cihazın numune ve çözüm rotorundaki standartlar ve numuneler ve her zamanki gibi enstrüman yazılımındaki konumlarını tanımlayın (cihazın el kitabına bakın).
    5. Rotor ve kılcal damar sıcaklığını 20 °C'de kontrollü laboratuvar sıcaklığıyla aynı olacak şekilde seçin.
      NOT: CE cihazının içindeki ve dışındaki kılcal parçalara sıcaklık gradyanı oluşmaz.
  2. ICP-MS aracını ayarlama
    1. ICP-MS cihazını günlük enstrümantal standart kurulum ve işlem prosedürlerine göre optimize edin. Üreticinin protokolünü kullanın.
    2. 0,6 mL/dk NH3–akış hızı ve RPq değeri = 0,45 olan DrC gazı olarak NH3 ile dinamik reaksiyon hücresi (DRC) teknolojisini kullanın.
      NOT: Demir türlemi için, bir yöntem 56Fe ile programlanır, en bol Fe izotop (91.754% göreceli bolluk), ancak, ciddi[ 40Ar16O]+ küme müdahale olmak. Standart modda bir quadrupole tabanlı ICP-MS pratikte kör ve bu izotop taşma dedektörü. Yukarıdaki ayarlarla (bkz. adım 3.2.2), düşük taban çizgileri ve yüksek hassasiyet elde edilir (düşük ng/L aralığında düzenli toplam demir tayini LOD elde edilir).
    3. CE-ayırma sırasında keskin ve kısa görünen zirveleri izlemek için 50 ms'de izotop başına bir çalışma süresi ayarını seçin.
    4. ICP-MS yöntemini CE-instrument tarafından tetiklenecek şekilde programla.
  3. CE-ICP-MS arabirimini ayarlama
    NOT: CE-kılcal damarını ICP-MS'e bağlamak için başlıca iki seçenek vardır. Ticari bir arabirim kullanılıyorsa kurulum la ilgili sağlanan açıklamaları izleyin. Bu protokol, değişikliklerden sonra önceki bir yayına dayalı basit, ev yapımı bir arabirim kullanır20. Temel konular, en iyi nebülizasyon için nebülizöre genel akış hızının benimsenmesi dışında kılcal efflux muhtemelen daha az seyreltilmesi ile verimli bir nebülizasyon vardır. Ayrıca, nebülizörden kendi kendini aspirasyonun neden olduğu kılcal damarı ayıran bir emme akışının en aza inmesi ve topraklanmış çıkış elektrotunun kılcal uçlara elektriksel bağlantısı zorunludur.
    1. Nebülizör seçimi
      1. Düşük hacimli püskürtme haznesine sığan düşük kendi kendini uyaran hacimli (örn. 100 μL/dk) eşmerkezli bir bulutsu kullanın.
        NOT: Düşük alım, hala optimize edilmiş nebülizasyondan paralel olarak kılcal damar efflux'ün sadece orta derecede seyreltilmesine neden olur. Çıkış elektrotunun elektrik bağlantısı, çıkış elektrotunun etrafında ve kılcal uç çevresinde elektrolit akışı ile gerçekleştirilir.
      2. Nebülizörün kendi kendini aspirasyon kullanarak ayrıştırıcı yoluyla emmeyi en aza indirin ve akış hızının nebülizör tarafından gerekli olan en uygun değere indirgenmesini kullanın.
      3. Bu ev yapımı arayüzü monte etmek için Tablo 2'den aşağıdaki parçaları hazırlayın.
    2. Basit arabirimin kurulumu
      NOT: Basit arayüz için parça montajının açıklamasını izlemek için Şekil 1'i kullanın. Şekil 1'deki ve aşağıdaki metindeki sayılar Tablo 2'dekisayılara atıfta bulunur.
      1. İki 3 yönlü dişi Luer konektörünü (No. 3) erkek koni Luer Konektörü (No. 4) ile bağlayarak arabirimi monte etmeye başlayın. Alt 3 yönlü Luer çubuğunun sol ucunu erkek konektöre ve bu da üst 3 yönlü Luer'in orta bağlantısına bağlayın.
      2. Pt-tel (No. 7) ve 1 cm silikon tüp (No. 5) üzerinde bir erkek Luer konektörü (No. 2) üzerinde 1 cm tüp (No. 1) koyun. Montajı, Luer tipik vida döndürme ile alt 3 yönlü Luer konektörü (No. 3) orta bağlantısına sabitle.
      3. CE kılcal damarının çıkış ucunun üzerine 1 cm'lik bir tüp (No.1) itin ve ucundan yaklaşık 8-9 cm uzakbir yere yerleştirin.
      4. Bir 1 cm silikon tüp (No. 5) ikinci ve bir erkek Luer konektörü (No. 2) ve meme üzerinde koyun.
      5. Üst 3-way-T konektörü çubuğu ile soldan tüm montaj koyun ve erkek Luer konektörü ve luer tipik vida rotasyonu ile kadın 3 yönlü Luer konektörü (No. 3) sol ucunu düzeltmek.
      6. 25 cm silikon tüpü (No. 5) bir erkek Luer konektörü (No. 2) ve alt 3 yönlü Luer konektörü (No.3) dan çubuğun alt (sağ) ucunda tüm montaj düzeltmek Luer tipik vida rotasyonu.
      7. 1 cm silikon tüpü (No.6) alın ve nebülizörün ucuna 5 mm sıkıca itin, ikinci erkek Luer koni koni konektörü (No. 4) silikon tüpün çıkıntılı kısmına sıkıca takılır.
      8. Yukarıdaki monte arayüz parçasını daha sonra çıkıntılı CE kılcal damarı ile nebülizördeki erkek koniye taşıyın. CE kılcal damarını erkek konisine dikkatlice ve nebülizör kılcal damarın daha geniş bir kısmına, ikincisi daralana kadar yerleştirin. Kılcal damar çıkıntılı uzunluğu uygun seçilmiş olduğu göz önüne alındığında, üst kadın 3 yönlü Luer konektörü şimdi de erkek koni sıkıca uyuyor.
      9. Gerekirse çıkıntılı kılcal damar uzunluğunun uzunluğunu, kendi kendine yapılmış arayüze girerken tüpteki (No. 1) kılcal damarı (ileri/geri) hareket ettirerek düzeltin.
        NOT: Nebülizör kılcal damarın başındaki CE kılcal damarının en uygun konumu çok kritik değildir. Ancak CE kılcal damarını nebülizör kılcal damarının dar kısmına çok yakın itmeyin. Bu, çıkış elektrolit akışını engelleyebilir veya engelleyebilir. Ayrıca, bu çıkış elektrot elektrik bağlantısı kesecek ve CE kılcal yoluyla emme artacak, rahatsız ayrılması ile sonuçlanan. Buna karşılık, ce kılcal uç çok uzak nebülizör kılcal çünkü o zaman keskin ayrılmış zirveleri genişletilir ve çözünürlük kaybolur tutmak yok.
      10. En iyi konumu belirlemek için bir lens kullanın.
        NOT: Şekil 1 (sağ altta) nebülizörün içinde CE-kılcal damarının en uygun pozisyonunu gösterir.

Figure 1
Şekil 1: CE-ICP-MS arabiriminin şeması ve montajı. Şema, basit ve ucuz CE-ICP-MS arabiriminin adım adım montajı için tek parçaları tanımlar. Pencere, nebülizördeki CE-kılcal damarının en uygun konumlandırılmasının fotoğrafını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

№. Bölüm için kullanılan
1 Boru (yeşil-turuncu renk kodu), 2 x ca. 1 cm Luer parçalarında CE kılcal ve çıkış elektrotunu sabitleme ve sıkı tutma
2 Luer, erkek, 3 x, 1.6 mm KIMLIK silikon boru için uygun silikon tüpün çıkış elektrolitine bağlanması ve CE kılcal ve Pt-wire elektrotunun sabitlenmesiiçin yardımcı olarak
3 3-way-Luer, kadın, 2 x Elektrot, kılcal ve aspire çıkış akışını birbirine bağlamak için T-adet
4 Luer koni, erkek, 2 x birbirlerine ve nebülizör için kadın Luers bağlayan
5 Silikon boru, 1,6 mm KIMLIK, 0,8 mm duvar, 2 x 1 cm, 1x ca. 25 cm a) 1cm; ce kılcal damarını arayüze sıkıya bağlıyor,
b) 1cm; pt-wire'ı arayüze bağlama
c) 25 cm; çıkış elektrolit şişesinden arayüze bağlantı
6 Silikon boru, 3 mm kimlik, 1,2 mm duvar, ca.1 cm nebülizör için Luer koni sıkılaştırma
7 Platin tel Çıkış elektrot

Tablo 2: Basit, kendi kendine üretilen CE-ICP-MS arabirimini oluşturmak için parçalar. Sayılar, metindeki Şekil 1 ve açıklamaya da atıfta bulunur.

4. Ölçüm ekihazırlık

NOT: Ölçümden önce kılcal damar temizliği için güçlü alkali solüsyonla (burada: %12 TMAH) temizlenmeli ve arka plan elektroliti ile doldurulmalıdır. Geliştirilmiş ayırma için iletkenlik ve pH degradelerine göre numunenin etrafına bir istifleme arabelleği inşa edilir. Tablo 3, programlanmış yönteme göre alet tarafından otomatik olarak işlenen kılcal damarın ardışık hazırlık adımlarını özetler:

Adım-Hayır Adım Kimyasal Durum
  CE sütununun hazırlanması
Hazırlık 1 Kılcal damar temizliği 12 % TMAH 4 bar, 1 dk.
Hazırlık 2 Arka plan elektroliti ile kapiller arınme 20 mM HCl 4 bar, 1 dk.
Hazırlık 3 İstifleme: önde gelen elektrolit 12 % TMAH 150 mbar, 3 s
Hazırlık 4 Enjeksiyon Örnek 150 mbar, 3 s
Hazırlık 5 İstifleme: elektroliti sonlandırma 0,05 mM HCl 150 mbar, 3 s

Tablo 3: Kapiller hazırlama adımları ölçümden önce. Bu adımlar CE-yönteminde CE-sistem yazılımı ile programlanır ve basınçlı numune enjeksiyonu ve numunenin etrafında bir "istifleme sandviçi" birikmesini içerir.

  1. Tablo 3'teverilen adımları art arda yürüten bir CE yöntemini programlayın.
  2. CE yazılımında bir örnek tablo ve sıra tanımlayın ve bu sırayı da ICP-MS yazılımına kopyalayın.

5. Ölçüm ve veri değerlendirmesi

  1. Yöntemi CE cihazından başlatın. Programlanmış hazım ve kapiller dolgudan sonra, 20 mM HCl içeren giriş şişesi kapiller girişte konumlandırılır pozisyonda olur olmaz ölçüm otomatik olarak başlar. "Başlat tetikleyicisi" ICP-MS'e gönderilir ve fe-izotopların çevrimiçi takibini başlatır.
    NOT: Ayırma da +25 kV'luk bir voltaj kullanır. CE-cihazı ICP-MS'e bağlamak için gerekli olan kılcal damaruzunluğunun uzaması, ayırma süresinin gereksiz yere artmasına neden olur. Bu nedenle, ayırma girişi250 mbar düşük basınç ile desteklenir. Çıkışta kendi kendine emişli elektrolit 5 mM HCl'dir. Toplam analiz orta iletkenlik li numuneler için 3 dakika sürer. ICP-MS yazılımının sinyal penceresinde elektroferogram çalışma sırasında gözlemlenebilir. Her örneğin sonunda, iki veri dosyası otomatik olarak oluşturulur, biri yalnızca dahili veri bankasından enstrüman yazılımından erişilebilir, ikincisi ihracat klasöründe ".xl" veya ".txt" biçiminde, normal kromatografi yazılımından alma işlevi ile erişilebilir.
  2. Dosyaları kromatografi yazılımına aktarmak için ICP-MS aracının yazılım kılavuzuna bakın.

Representative Results

Standartların ölçüleri ve kalibrasyon
Göç süreleri tek standart enjeksiyonlarla açıklığa kavuşturuldu: Fe(III) standardı 118 s göç zamanında, Fe(II) standardı ise 136 s göç zamanında izlendi. Algılama limitleri taban çizgisi gürültüsüne atıfta bulunularak 3σ kriteri kullanılarak hesaplandı ve standart konsantrasyon 50 g/L. LOD(Fe(II) 3.1 μg/L ve LOD(Fe(III) 3.2 g/L. Tepe alanı tabanlı kalibrasyon lod'dan 150 g/L'ye doğrusal olarak hesaplandı. Fe(III)'nin doğrusallığı daha yüksek konsantrasyon için de kanıtlansa da, Fe(II) için kalibrasyon eğrisinin eğimi azaldı. Fe(II)/(III) tayinine uygun biyo-numuneler genellikle fe konsantrasyonu düşük olduğundan, 150 μg/L üst konsantrasyon sınırı yeterli kabul edildi. Daha yüksek konsantrasyon durumunda, numuneler buna göre seyreltilebilir. Pik yükseklik kalibrasyonu 600 g/L'ye kadar kontrol edildi ve test edilen tüm aralıkta doğrusallık gösterildi. Bu Şekil 2'degösterilmiştir.

Figure 2
Şekil 2: Fe(III) ve Fe(II) kalibrasyon eğrileri (tepe yüksekliği). Her iki Fe redoks türünün tepe yüksekliği ile ilgili kalibrasyonlar ca. 161 *X eğimi ile doğrusaldır Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.

SH-SY5Y hücre lisatanalizi
SH-SY5Y hücre lisatının analizi, biraz daha yüksek iletkenlik nedeniyle demir redoks türleri için biraz daha yavaş göç olduğunu gösterdi. Fe(III) göç zamanının 124'ünde, Fe(II) 158 s göç zamanında izlendi. SH-SY5Y hücre lisatında geçiş süresi hassasiyeti Fe(III) için %2, Fe(II) için %3 idi. Bu yöntemkullanılarak yapılan kantitatif Fe(II) ve Fe(III) ölçümleri, Fe(III) konsantrasyonunun 330 μg/L ve Fe(II) konsantrasyonunun 84 μg/L olduğunu ve her ikisinin de 0,25'lik Fe(II)/Fe(III) oranına yol açtığını ortaya koymuştur. İlgili 56Fe-selektif elektrofegram Şekil 3'tegösterilmiştir.

Figure 3
Şekil 3: 56SH-SY5Y hücre lizatının Fe spesifik elektroferogramı. Fe(III) 123 s 58025 cps pik yüksekliğe ulaşan, açıkça 158 s fe(II) ayrılmış, 22800 cps ulaşan bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için buraya tıklayınız izlenir.

Discussion

Demir OS ilerlemesinde önemli bir rol oynadığından, mitokondriyal disfonksiyonu veya FTP'yi kolaylaştırdığından, eşzamanlı Fe(II)/Fe(III) türasyonu için çok yönlü bir CE-ICP-MS bazlı kantitatif yöntem bu makalede sunulmuş ve uygulanması hücre lysates'inde örnek olarak gösterilmiştir. Kısa analiz süresi sağlanan yöntem ve liyakat rakamları (LOQ, hassas, kurtarma) özellikle nörodejeneratif ve kanser araştırmalarında demir redoks sinifi ile ilgili örnekler için uygundur. LC'ye dayalı önceki yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu CE tabanlı yöntem sütun toplu işlerinden ve LC sütun değişikliğinden sonra daha önce gözlenen tekrarlanabilirlik sorunlarından pratikte bağımsızdır. Her çalıştırmadan önce kılcal damar hazırlığı <4 dakika ve numune başına analiz süresi 3 dk'ya kadar orta tuzluluktadır. Molekül yükü ve boyutu dışında, CZE'deki geçiş süresi numune fişinde iletkenliğe bağlıdır ve bu da numunelerin kendileri iletkenliği önemli ölçüde etkilediğinde göç zamanı değişimine veya kaymalara neden olur. Geçiş zamanındaki bu tür değişimler kapiller elektroforezde iyi bilinmektedir. Bu bir CZE-immanent sorun, literatür21bilinen,22. Standartlar ve SH-SY5Y hücre lisatları orta ve homojen iletkenliğe sahipti. Sonuç olarak, geçiş zamanları iyi bir hassasiyetle sadece küçük değişiklikler gösterdi. Ancak iletkenliği yüksek olan numunelerde 5 dakikaya kadar uzun süreli göç süreleri görülebilir. Bu nedenle, standart eklemeler net tür tanımlama için tavsiye edilir.

Demir redoks türasyonunda kritik bir konu tür stabilitesidir (yani, Fe(II)/(III) equilibria'nın bakımı) numune hazırlama sırasında8,13. Uygun olmayan pH veya şelatlı kimyasalların yanı sıra numuneyle temas eden oksijen (hava) veya derin dondurulmuş depolamada bir mola gibi uygun olmayan depolama koşulları Fe(II)/(III) dengesini kolayca değiştirebilir. Bu nedenle, SH-SY5Y hücre lisatlarının hazırlanması için, herhangi bir şelat kimyasalı olmadan bir lysis tamponu seçilmiş, fizyolojik pH, ancak numune hazırlama sırasında inert gaz bindirme, numune kaplarında ve bu numuneler için hemen derin donma uygulanmıştır.

Literatürde Fe(II)'yi izlemek için yarı nicel yaklaşımlar bulunabilir. Demirin oksidatif stresteki rolünün daha iyi anlaşılması için, çeşitli araştırma grupları, demirin in vitro anormal yükselmesini yarı nicel olarak izlemek ve görselleştirmek için Fe(II)'ye özgü problar geliştirdiler. Ancak, önemli not, bu tür problar Fe(III) dikkate almayın ve ölçmek değil, sadece "daha fazla" veya "daha az" Fe(II)) rapor. Bugüne kadar, sadece birkaç biyobelirteçleri işletim sistemi ve FPT belirlemek için kullanılabilir, aynı anda Fe(II)/Fe(III) redoks türleri23,,24ölçmek için güvenilir yöntemlerin eksikliği nedeniyle . Bunu göz önünde bulundurarak, sunulan yöntem - her ikisinin de hızlı bir şekilde ölçülmesini kolaylaştırmak, Fe(III) ve Fe(II) tek bir koşuda - demire bağımlı moleküler süreçlere bakış açısını derinleştirmek için umut verici bir araç haline gelebilir.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

VV, Göttingen Üniversitesi Tıp Merkezi'nin intramural araştırma bursu (Forschungsförderung) ve Else Kröner-Fresenius-Stiftung'un Else Kröner araştırma programı tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CE capillary CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany 105180-25
CE system PrinCe technolgies 0005.263 model PrinCe 760
Conical Superclear Tubes 15 ml Analytics-shop.com by Altmann Analytik PEN0777704
Conical Superclear Tubes 50 ml Analytics-shop.com by Altmann Analytik PEN0777694
FeCl2 * 4H2O Merck 103861
FeCl3 Merck 803945
Fluidflex Silikon HG-Schlauch ProLiquid 4001106HG
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm Chromatographie Service GmbH 105180-25
hydrochloric acid, 1 M Merck 1101652500 corrosive
ICP-MS Perkin Elmer N814003
Luer, 3-way female BioRad 7318229
Luer, cone male neoLab Migge 2-1895
Luer, male neoLab Migge 2-1880
Peakfit peak evaluation software Systat PeakFit 4.12
Pt-wire Carl Roth 0737.1
PVC tube ProLiquid 6000002
RIPA buffer Abcam ab156034
Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % Merck 814748 corrosive
TYGON-tube R-3607 ProLiquid 3700203A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hare, D. J., et al. Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 11, (9), 536-544 (2015).
  2. Ashraf, A., Clark, M., So, P. W. The Aging of Iron Man. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, (2018).
  3. Hare, D. J., Cardoso, B. R., Szymlek-Gay, E. A., Biggs, B. A. Neurological effects of iron supplementation in infancy: finding the balance between health and harm in iron-replete infants. Lancet Child Adolesc Health. 2, (2), 144-156 (2018).
  4. Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: more ore to be mined. Nature Reviews Cancer. 13, (5), 342-355 (2013).
  5. Kehrer, J. P. The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology. 149, (1), 43-50 (2000).
  6. Gaschler, M. M., Stockwell, B. R. Lipid peroxidation in cell death. Biochemical and Biophysical Research Communications. 482, (3), 419-425 (2017).
  7. Michalke, B., Halbach, S., Nischwitz, V. JEM Spotlight: Metal speciation related to neurotoxicity in humans. Journal of Environmental Monitoring. 11, (5), 939-954 (2009).
  8. Solovyev, N., Vinceti, M., Grill, P., Mandrioli, J., Michalke, B. Redox speciation of iron, manganese, and copper in cerebrospinal fluid by strong cation exchange chromatography - sector field inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 973, 25-33 (2017).
  9. Lee, H. J., et al. Effect of excess iron on oxidative stress and gluconeogenesis through hepcidin during mitochondrial dysfunction. Journal of Nutritional Biochemistry. 26, (12), 1414-1423 (2015).
  10. Dixon, S. J., Lemberg, K. M., Lamprecht, M. R., Skouta, R., Zaitsev, E. M., Gleason, C. E., et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, (5), 1060-1072 (2012).
  11. Stockwell, B. R., et al. Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease. Cell. 171, (2), 273-285 (2017).
  12. Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Halbach, S. Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS. Electrophoresis. 28, (9), 1380-1386 (2007).
  13. Fernsebner, K., Zorn, J., Kanawati, B., Walker, A., Michalke, B. Manganese leads to an increase in markers of oxidative stress as well as to a shift in the ratio of Fe(II)/(III) in rat brain tissue. Metallomics. 6, (4), 921-931 (2014).
  14. Neth, K. Manganese: Species Pattern and Mechanisms of Brain Injury. Technical University of Munich, Analytical Food Chemistry. Doctoral Dissertation (2015).
  15. Neth, K., et al. Changes in Brain Metallome/Metabolome Pattern due to a Single i.v. Injection of Manganese in Rats. Plos One. 10, (9), (2015).
  16. Venkataramani, V., et al. Manganese causes neurotoxic iron accumulation via translational repression of Amyloid Precursor Protein (APP) and H-Ferritin. Journal of Neurochemistry. 147, (6), 831-848 (2018).
  17. Willkommen, D., Lucio, M., Schmitt-Kopplin, P., Gazzaz, M., Schroeter, M., Sigaroudi, A., Michalke, B. Species fractionation in a case-control study concerning Parkinson's disease: Cu-amino acids discriminate CSF of PD from controls. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 164-170 (2018).
  18. Thibault, P., Dovichi, N. J. General instrumentation and detection systems including mass spectrometry. Capillary Electrophoresis - Theory and Practice. Camilleri, P. CRC Press. Boca Raton, Boston, New York, Washington D.C., London. 23-89 (1998).
  19. Iliff, J. J., et al. A Paravascular Pathway Facilitates CSF Flow Through the Brain Parenchyma and the Clearance of Interstitial Solutes, Including Amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, (147), (2012).
  20. Michalke, B. Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1050, (1), 69-76 (2004).
  21. Kuhn, R., Hofstetter-Kuhn, S. Capillary electrophoresis: Principles and practice. Springer. Berlin, Heidelberg. (1993).
  22. Michalke, B. Capillary electrophoretic methods for a clear identification of selenoamino acids in complex matrices such as human milk. Journal of Chromatography A. 716, (1-2), 323-329 (1995).
  23. Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, (1-2), 317-331 (2014).
  24. Shimada, K., Hayano, M., Pagano, N. C., Stockwell, B. R. Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity. Cell Chemical Biology. 23, (2), 225-235 (2016).
Demir Redoks Türlerinin Nicelleştirilmesi İçin Kapiller Elektroforez-Endüktif Birleştirilmiş Plazma Kütle Spektrometresi (CE-ICP-MS) Kurulumu (Fe(II), Fe(III))
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Michalke, B., Willkommen, D., Venkataramani, V. Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III)). J. Vis. Exp. (159), e61055, doi:10.3791/61055 (2020).More

Michalke, B., Willkommen, D., Venkataramani, V. Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III)). J. Vis. Exp. (159), e61055, doi:10.3791/61055 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter