Denne jernrødox-speciationsmetode er baseret på kapillær elektroforese-induktivt koblet plasmamassespektrometri med prøvestabling kombineret med kort analyse i ét løb. Metoden analyserer hurtigt og giver lave kvantificeringsgrænser for jernrødox-arter på tværs af en bred vifte af væv og biofluidprøver.
Dyshomeostase af jernmetabolisme er tegnede sig i den patofysiologiske rammer for mange sygdomme, herunder kræft og flere neurodegenerative tilstande. Overdreven jern resulterer i fri redox-aktiv Fe (II) og kan forårsage ødelæggende virkninger i cellen som oxidativstress (OS) og død ved lipidperoxidation kendt som ferroptose (FPT). Derfor er kvantitative målinger af jernholdigt (Fe(II)) og jern (Fe(III)) jern i stedet for total Fe-bestemmelse nøglen til tættere indsigt i disse skadelige processer. Da Fe(II)/(III) bestemmelser kan hæmmes af hurtige redox-state-skift og lave koncentrationer i relevante prøver, som cerebrospinalvæske (CSF), bør der være metoder til rådighed, der hurtigt analyserer og giver lave kvantificeringsgrænser (LOQ). Kapillær elektroforese (CE) giver fordelen ved hurtig Fe(II)/Fe(III) adskillelse og fungerer uden en stationær fase, som kan forstyrre redox-balancen eller forårsage analysandstikning. CE kombineret med induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS) som detektor giver yderligere forbedring af detektionsfølsomheden og selektiviteten. Den præsenterede metode bruger 20 mM HCl som baggrundselelektrolyt og en spænding på +25 kV. Peak former og koncentration detektion grænser er forbedret ved ledningsevne-pH-stabling. For reduktion på 56[ArO]+blev ICP-MS opereret i den dynamiske reaktionscelletilstand (DRC) med NH3 som reaktionsgas. Metoden opnår en detektionsgrænse på 3 μg/L. På grund af stabling var højere injektionsvolumener mulige uden at hæmme adskillelsen, men forbedre LOD. Kalibreringer relateret til toparealet var lineære op til 150 μg/L. Målepræcisionen var 2,2% (Fe(III)) til 3,5% (Fe(II)). Migrationstid præcision var <3% for begge arter, bestemt i 1:2 fortyndet lysates af humane neuroblastom (SH-SY5Y) celler. Genopretningsforsøg med standard tilsætning viste nøjagtighed på 97% Fe(III) og 105 % Fe(II). I virkelige bioprøver som CSF kan migrationstiden variere alt efter varierende ledningsevne (dvs. saltholdighed). Topidentifikation bekræftes således ved standard tilsætning.
I dag er det mest indlysende, at jern-medieret oxidativstress (OS) spiller en afgørende rolle i flere lidelser specifikt i neurodegenerative hjernesygdomme, som Alzheimers og Parkinsons sygdom samt i kræft1,,2,3,4. OS er tæt forbundet med tilstanden og balancen for redox-parret Fe(II)/Fe(III). Mens Fe(III) er redox-inaktiv, genererer Fe(II) kraftigt reaktive iltarter (ROS) ved katalysering H2O2 nedbrydning efterfulgt af hydroxyl radikal produktion og membran lipid peroxidation5,6. På molekylært niveau, Fe (II)-genereret ROS og peroxidiserede fosfolipider er et stærkt angreb på integriteten af proteiner, lipider og DNA7,8. En sådan skadelig cellulær dysfunktion blev påvist at fremkalde mitokondriel dysfunktion med nedsat ATP-indhold9 og kan endda udløse en programmeret nekrotisk celledød, kendt som ferroptosis (FPT)10,11. Derfor er kvantitativ Fe(II)/(III) redox-speciation af stor betydning i et bredt spektrum af rødox-relaterede lidelser.
Kemisk speciation er et veletableret værktøj til undersøgelse af sporstoffer biologiske rolle og stofskifte i almindelighed7,8 samt i neurodegenerative betingelser12,13,14,15,16,17. Metoder til Fe-redox speciation findes i litteraturen er typisk baseret på flydende kromatografi (LC) adskillelse. Noget af litteraturen bruger induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS) som et element selektiv detektor. Men i rutinemæssige LC arbejde, overdreven udrensning gange var nødvendig mellem kørsler. Endnu mere problematisk, batch-til-batch variation af LC kolonner tvunget re-optimering af elution betingelser efter hver kolonne ændring. Disse problemer hæmmer den høje gennemløbshastighed. Der kræves yderligere tid for at opnå acceptabel pålidelighed og grundigt evaluere metoden igen.
For at omgå disse ulemper præsenteres her en metode for Fe(II)/Fe(III) redox speciation baseret på kapillær elektroforese induktivt koblet plasmamassespektrometri (CE-ICP-MS). CE tilbyder forskellige fordele i forhold til LC18. Kapillærer har ingen stationær fase og derfor afhænger (næsten) ikke af batchidentitet. Når de er ældre eller blokeret, udskiftes de hurtigt og viser normalt uændret ydeevne. Udrensningen og rengøringstrinnene mellem prøverne er effektive og korte, og analysetiden pr. prøve er også kort.
Den præsenterede metode er pålidelig med gode merittal. Som en proof-of-princip, metoden anvendes til human dopaminerge neuroblastoma (SH-SY5Y) celle lysate, en prøve type vigtigt i neurodegeneration samt kræftforskning19.
Da jern spiller en fremtrædende rolle i OS progression, hvilket letter mitokondriel dysfunktion eller FTP, en alsidig CE-ICP-MS baseret kvantitativ metode til samtidig Fe (II)/Fe (III) speciation præsenteres i denne artikel, og dens anvendelse er eksemplarisk påvist i celle lysater. Metoden gav kort analysetid, og tallene for fortjeneste (LOQ, præcision, restitution) er velegnede til prøver, der er relevante for jernrødox-speciation specifikt i neurodegenerativ forskning og kræftforskning. Sammenlignet med tidligere metoder baseret på LC er denne CE-baserede metode praktisk taget uafhængig af kolonnebats partier og tidligere observerede reproducerbarhedsproblemer efter LC-kolonneændring. Kapillær forberedelse før hvert løb er <4 minutter og analysetid pr. prøve med moderat saltholdighed op til 3 min. Bortset fra molekyleladning og størrelse afhænger migrationstiden i CZE af ledningsevne ved prøvestikket, hvilket forårsager migrationstidsvariation eller skift, når prøverne selv påvirker ledningsevnen betydeligt. Sådanne ændringer i migrationstiden er velkendte i kapillær elektroforese. Dette er en CZE-immanent problem, kendt fra litteratur21,,22. Standarder og SH-SY5Y cellelysater havde moderat og homogen ledningsevne. Derfor viste migrationstider kun små ændringer med god præcision. For prøver med høj ledningsevne kan der dog observeres længere migrationstider på op til 5 min. Derfor anbefales standard tilføjelser til klar artsidentifikation.
Et kritisk spørgsmål i forbindelse med rødox-præsidation af jern er artsstabilitet (dvs. opretholdelse af Fe(II)/(III) ligevægt) under prøvepræparatet8,13. Uhensigtsmæssige pH- eller chelaterende kemikalier samt uhensigtsmæssige opbevaringsforhold såsom ilt (luft) i kontakt med prøve eller brud på dybfrosset opbevaring kan nemt ændre Fe(II)/(III)-balancen. Til fremstilling af SH-SY5Y-cellelysater blev der derfor valgt en lysisbuffer uden chelaterende kemikalier, fysiologisk pH, men inert gasoverlejring under prøvepræparatet blev der anvendt en lysisbuffer for disse prøver.
I litteraturen kan man finde semi-kvantitative tilgange til at overvåge Fe(II). For bedre forståelse af jern’s rolle i oxidativstress, flere forskergrupper udviklet Fe (II)-specifikke sonder til semi-kvantitativt overvåge og visualisere afvigende højde af jernholdige jern in vitro. Men vigtigt at bemærke, sådanne sonder ikke overveje Fe (III) og ikke kvantificere, men rapporterer bare “mere” eller “mindre” Fe(II)). Til dato er der kun få biomarkører til rådighed til bestemmelse af OS og FPT, fordi der ikke findes pålidelige metoder til samtidig kvantificering af Fe(II)/Fe(III) redox-arterne23,24. Med dette in mente kan den præsenterede metode – der letter hurtig kvantificering af både Fe(III) og Fe(II) i ét løb – blive et lovende redskab til at uddybe indsigten i jernafhængige molekylære processer.
The authors have nothing to disclose.
VV blev støttet af det intramurale forskningstilskud (Forschungsförderung) fra University Medical Center Göttingen og Else Kröners forskningsprogram under Else Kröner-Fresenius-Stiftung.
CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
FeCl3 | Merck | 803945 | |
Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
PVC tube | ProLiquid | 6000002 | |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % | Merck | 814748 | corrosive |
TYGON-tube R-3607 | ProLiquid | 3700203A |