Denne jernrødoksspekulasjonsmetoden er basert på kapillær elektroforese-induktivt kombinert plasmamassespektrometri med prøvestabling kombinert med kort analyse i ett løp. Metoden analyserer raskt og gir lave grenser for kvantifisering for jernrødoksarter på tvers av et variert utvalg av vev og biofluidprøver.
Dyshomeostase av jernmetabolismen er regnskapset i det patofysiologiske rammeverket av mange sykdommer, inkludert kreft og flere nevrodegenerative tilstander. Overdreven jern resulterer i gratis redoks-aktiv Fe(II) og kan forårsake ødeleggende effekter i cellen som oksidativt stress (OS) og død ved lipidperoksidasjon kjent som ferroptose (FPT). Derfor er kvantitative målinger av jernholdig (Fe(II)) og ferric (Fe(III)) jern i stedet for total Fe-besluttsomhet nøkkelen for nærmere innsikt i disse skadelige prosessene. Siden Fe(II)/(III) bestemmelser kan hindres av raske redoks-tilstandsskift og lave konsentrasjoner i relevante prøver, som cerebrospinalvæske (CSF), bør metoder være tilgjengelige som analyserer raskt og gir lave grenser for kvantifisering (LOQ). Kapillær elektroforese (CE) gir fordelen av rask Fe(II)/Fe(III) separasjon og fungerer uten en stasjonær fase, noe som kan forstyrre redoksbalansen eller forårsake analytt stikker. CE kombinert med induktivt kombinert plasma massespektrometri (ICP-MS) som en detektor gir ytterligere forbedring av deteksjonsfølsomhet og selektivitet. Den presenterte metoden bruker 20 mM HCl som bakgrunnselektrolytt og en spenning på +25 kV. Toppformer og konsentrasjonsdeteksjonsgrenser forbedres ved konduktivitet-pH-stabling. For reduksjon av 56[ArO]+ble ICP-MS operert i drc-modus (Dynamic Reaction Cell) med NH3 som reaksjonsgass. Metoden oppnår en grense for deteksjon (LOD) på 3 μg/ L. På grunn av stabling var høyere injeksjonsvolumer mulig uten å hemme separasjon, men forbedre LOD. Kalibreringer relatert til toppområdet var lineære opp til 150 μg/l. Målepresisjonen var 2,2 % (Fe(III)) til 3,5 % (Fe(II)). Migrasjonstidspresisjonen var <3 % for begge artene, bestemt i 1:2 fortynnede lysater av humane neuroblastomceller (SH-SY5Y). Recovery eksperimenter med standard tillegg viste nøyaktighet på 97% Fe (III) og 105 % Fe (II). I virkelige bioprøver som CSF kan migrasjonstiden variere i henhold til varierende konduktivitet (det vil si saltholdighet). Dermed er toppidentifikasjon bekreftet av standard tillegg.
I dag er det mest tydelig at jernmediert oksidativt stress (OS) spiller en avgjørende rolle i flere lidelser spesielt i nevrodegenerative hjernesykdommer, som Alzheimers og Parkinsons sykdom, samt i kreft1,2,3,4. OS er nært knyttet til tilstanden og balansen til redox-paret Fe(II)/Fe(III). Mens Fe(III) er redoks-inaktiv, genererer Fe(II) kraftig reaktive oksygenarter (ROS) ved å katalysere H2O2 nedbrytning etterfulgt av hydroksylradikal produksjon og membran lipidperoksidasjon5,6. På molekylært nivå er Fe(II)-generert ROS og peroksidiserte fosfolipider et sterkt angrep på integriteten til proteiner, lipider og DNA7,8. Slike skadelige cellulær dysfunksjon ble vist å indusere mitokondriedysfunksjon med redusert ATP-innhold9 og kan til og med utløse en programmert nekrotisk celledød, kjent som ferroptose (FPT)10,11. Kvantitativ Fe(II)/(III) redoksspesifikasjon er derfor av eminent betydning i et bredt spekter av redoksrelaterte lidelser.
Kjemisk spesiasjon er et veletablert verktøy for studiet av sporstoffer biologisk rolle og metabolisme generelt7,8 samt i nevrodegenerative forhold12,13,14,15,16,17. Metoder for Fe-redox-spesifikasjon funnet i litteraturen er vanligvis basert på væskekromatografi (LC) separasjon. Noe av litteraturen bruker induktivt skrevet plasmamassespektrometri (ICP-MS) som et element selektiv detektor. Men i rutinemessig LC-arbeid var det nødvendig med overdreven utrenskningstider mellom løpene. Enda mer problematisk, batch-til-batch-variant av LC-kolonner tvunget re-optimalisering av elution betingelsene etter hver kolonneendring. Disse problemene hindrer høy gjennomstrømning. Ytterligere tid er nødvendig for å få akseptabel pålitelighet og grundig vurdere metoden igjen.
For å omgå disse ulempene, presenteres en metode her for Fe(II) / Fe (III) redoksspesifikasjon basert på kapillær elektroforese induktivt skrevet plasmamassespektrometri (CE-ICP-MS). CE tilbyr ulike fordeler sammenlignet med LC18. Kapillærer har ingen stasjonær fase og er dermed avhengig (nesten) ikke på batchidentitet. Når de blir eldre eller blokkert, erstattes de raskt, og viser vanligvis uendret ytelse. Rense- og rengjøringstrinnene mellom prøvene er effektive og korte, og analysetiden per prøve er også kort.
Den presenterte metoden er pålitelig med gode tall av fortjeneste. Som et bevis på prinsippet brukes metoden på humant dopaminerg neuroblastom (SH-SY5Y) cellelylat, en prøvetype som er viktig i nevrodegenerasjon samt kreftforskning19.
Siden jern spiller en fremtredende rolle i OS-progresjon, og dermed tilrettelegge mitokondrie dysfunksjon eller FTP, en allsidig CE-ICP-MS basert kvantitativ metode for samtidig Fe(II) / Fe (III) spesiasjon er presentert i denne artikkelen, og dens anvendelse er eksemplarisk demonstrert i cellelysater. Metoden gitt kort analysetid og tallene for fortjeneste (LOQ, presisjon, utvinning) er egnet for prøver som er relevante for jern redox spesifikasjon spesielt i nevrodegenerativ og kreft forskning. Sammenlignet med tidligere metoder basert på LC, er denne CE-baserte metoden praktisk talt uavhengig av kolonnepartier og tidligere observerte reproduserbarhetsproblemer etter LC-kolonneendring. Kapillærforberedelse før hvert løp er <4 minutter og analysetid per prøve med moderat saltholdighet opptil 3 min. Bortsett fra molekylladning og størrelse, avhenger migrasjonstiden i CZE av konduktivitet ved prøvepluggen, noe som forårsaker migrasjonstidsvariasjon eller skift når prøvene selv påvirker konduktiviteten betydelig. Slike endringer i migrasjonstiden er godt kjent i kapillær elektroforese. Dette er et CZE-immanent problem, kjent fra litteratur21,22. Standarder og SH-SY5Y cellelyater hadde moderat og homogen ledningsevne. Derfor viste migrasjonstider bare små endringer med god presisjon. For prøver med høy ledningsevne kan imidlertid langvarige migrasjonstider observeres opptil 5 min. Derfor anbefales standardtillegg for klar artsidentifikasjon.
Et kritisk problem i jernrødox-spesifisasjon er artsstabilitet (det vil vil vil at vedlikehold av Fe(II)/(III) likevekt) under prøveforberedelsen8,13. Upassende pH- eller chelating-kjemikalier samt upassende lagringsforhold som oksygen (luft) i kontakt med prøve eller en pause i dypfrosset lagring kan enkelt endre Fe(II)/(III)-balansen. Derfor, for fremstilling av SH-SY5Y cellelylater, ble en lysisbuffer valgt uten chelating kjemikalier, fysiologisk pH, men inert gassoverlegg under prøveforberedelse, i prøvebeholdere og umiddelbar dyp frysing ble brukt for disse prøvene.
I litteraturen kan man finne semi-kvantitative tilnærminger for å overvåke Fe(II). For bedre forståelse av jernets rolle i oksidativt stress utviklet flere forskningsgrupper Fe(II)-spesifikke sonder for å halvkvantitativt overvåke og visualisere avvikende heving av jernholdig jern in vitro. Men viktig å merke seg, slike sonder anser ikke Fe (III) og ikke kvantifisere, men rapportere bare “mer” eller “mindre” Fe (II)). Til dags dato er bare noen få biomarkører tilgjengelige for å bestemme OS og FPT, på grunn av mangel på pålitelige metoder for samtidig å kvantifisere Fe(II) / Fe (III) redoksarter23,24. Å ha dette i tankene, kan den presenterte metoden – som letter rask kvantifisering av begge, Fe(III) og Fe(II) i ett løp – bli et lovende verktøy for å utdype innsikten i jernavhengige molekylære prosesser.
The authors have nothing to disclose.
VV ble støttet av det intramurale forskningsstipendet (Forschungsförderung) ved Universitetets medisinske senter Göttingen og Else Kröner forskningsprogram for Else Kröner-Fresenius-Stiftung.
CE capillary | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
CE system | PrinCe technolgies | 0005.263 | model PrinCe 760 |
Conical Superclear Tubes 15 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
Conical Superclear Tubes 50 ml | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
FeCl3 | Merck | 803945 | |
Fluidflex Silikon HG-Schlauch | ProLiquid | 4001106HG | |
Fused silica capillary OD 360 µm, ID 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
hydrochloric acid, 1 M | Merck | 1101652500 | corrosive |
ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
Luer, 3-way female | BioRad | 7318229 | |
Luer, cone male | neoLab Migge | 2-1895 | |
Luer, male | neoLab Migge | 2-1880 | |
Peakfit peak evaluation software | Systat | PeakFit 4.12 | |
Pt-wire | Carl Roth | 0737.1 | |
PVC tube | ProLiquid | 6000002 | |
RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
Tetramethylammoniumhydroxide, 25 % | Merck | 814748 | corrosive |
TYGON-tube R-3607 | ProLiquid | 3700203A |