Summary
Questo metodo descrive i passaggi per migliorare la qualità e la quantità dei dati di sequenza che possono essere ottenuti da campioni di RNA incorporati in paraffina fissata alla formalina (FFPE). Descriviamo la metodologia per valutare in modo più accurato la qualità dei campioni di FFPE-RNA, preparare le librerie di sequenziamento e analizzare i dati provenienti da campioni DI FFPE-RNA.
Abstract
L'analisi dell'espressione genica mediante il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) consente informazioni uniche su campioni clinici che possono potenzialmente portare a una comprensione meccanicistica della base di varie malattie, nonché ai meccanismi di resistenza e/o suscettibilità. Tuttavia, i tessuti FFPE, che rappresentano il metodo più comune per preservare la morfologia dei tessuti nei campioni clinici, non sono le migliori fonti per l'analisi della profilazione dell'espressione genica. L'RNA ottenuto da tali campioni è spesso degradato, frammentato e modificato chimicamente, il che porta a librerie di sequenziamento non ottimali. A loro volta, questi generano dati di sequenza di scarsa qualità che potrebbero non essere affidabili per l'analisi dell'espressione genica e la scoperta della mutazione. Al fine di sfruttare al meglio i campioni FFPE e ottenere i migliori dati possibili da campioni di bassa qualità, è importante prendere alcune precauzioni durante la pianificazione della progettazione sperimentale, la preparazione delle librerie di sequenziamento e durante l'analisi dei dati. Ciò include l'uso di metriche appropriate per un controllo qualità di esempio preciso (QC), l'identificazione dei metodi migliori per i vari passaggi durante la generazione della libreria di sequenziamento e un'attenta libreria QC. Inoltre, l'applicazione di strumenti software e parametri corretti per l'analisi dei dati di sequenza è fondamentale per identificare gli artefatti nei dati RNA-seq, filtrare la contaminazione e leggere di bassa qualità, valutare l'uniformità della copertura genica e misurare la riproducibilità dei profili di espressione genica tra le repliche biologiche. Questi passaggi possono garantire un'elevata precisione e riproducibilità per la profilazione di campioni di RNA molto eterogenei. Qui descriviamo i vari passaggi per il QC di esempio, la preparazione della libreria e il QC, il sequenziamento e l'analisi dei dati che possono contribuire ad aumentare la quantità di dati utili ottenuti da RNA di bassa qualità, come quello ottenuto dai tessuti FFPE-RNA.
Introduction
L'uso di approcci di sequenziamento di nuova generazione ci ha permesso di ottenere una grande quantità di informazioni da vari tipi di campioni. Tuttavia, i campioni vecchi e mal conservati rimangono inutilizzabili per i metodi comunemente utilizzati per generare dati di sequenza e spesso richiedono modifiche a protocolli consolidati. I tessuti FFPE rappresentano un tale tipo di campione che è stato ampiamente utilizzato per i campioni clinici1,2,3. Mentre la conservazione FFPE mantiene la morfologia dei tessuti, gli acidi nucleici nei tessuti FFPE di solito presentano una vasta gamma di danni e degradazione, rendendo difficile recuperare le informazioni genomiche che possono portare a importanti intuizioni sui meccanismi molecolari alla base di vari disturbi.
I dati sull'espressione genica generati dal sequenziamento dell'RNA sono spesso fondamentali per studiare i meccanismi di malattia e resistenza e integrano l'analisi della mutazione del DNA. Tuttavia, l'RNA è più suscettibile alla degradazione, il che rende più difficile generare dati accurati sull'espressione genica dai tessuti FFPE. Inoltre, poiché l'ampia disponibilità e convenienza del sequenziamento è relativamente recente, gli esemplari più vecchi spesso non sono stati immagazzinati nelle condizioni necessarie per preservare l'integrità dell'RNA. Alcuni dei problemi per i campioni di FFPE includono la degradazione dell'RNA a causa dell'incorporamento in paraffina, la modifica chimica dell'RNA che porta alla frammentazione o alla refrattanza ai processi enzimatici necessari per il sequenziamento e la perdita delle code poli-A, limitando l'applicabilità dell'oligo-dT come primer per la tranciatura inversa4. Un'altra sfida è la manipolazione/archiviazione di campioni di FFPE in condizioni non ottimali, che può portare a un'ulteriore degradazione delle molecole labili come l'RNA nei tessuti5. Ciò è particolarmente rilevante per i campioni più vecchi che potrebbero essere stati raccolti in un momento in cui l'analisi dell'espressione genica mediante il sequenziamento dell'RNA non era prevista per i campioni. Tutto ciò porta a una diminuzione della qualità e della quantità dell'RNA estratto disponibili per la generazione di dati di sequenza utili. La bassa probabilità di successo, combinata con l'alto costo del sequenziamento, ha dissuaso molti ricercatori dal cercare di generare e analizzare i dati dell'espressione genica da campioni FFPE potenzialmente utili. Alcuni studi negli ultimi anni hanno dimostrato l'usabilità dei tessuti FFPE per l'analisi dell'espressione genica2,6,7,8,9, anche se per meno campioni e/o più recenti.
Come studio di fattibilità, abbiamo utilizzato l'RNA estratto da campioni di tessuto tumorale FFPE da tre repository di tessuti residui da registri di sorveglianza, epidemiologia e risultati finali (SEER) per il sequenziamento dell'RNA e l'analisi dell'espressione genica10. Procurati da laboratori di patologia clinica, i tessuti FFPE da adenocarcinomi sigillanti ovarici di alta qualità sono stati conservati da 7 a 32 anni in condizioni variabili prima dell'estrazione dell'RNA. Poiché nella maggior parte dei casi questi blocchi erano stati immagazzinati in siti diversi per anni senza l'aspettativa di alcuna analisi genetica sensibile in futuro, non era stata prestata molta attenzione per preservare gli acidi nucleici. Così, la maggior parte dei campioni esibivano RNA di scarsa qualità, con una grande percentuale di campioni contaminati da batteri. Tuttavia, siamo stati in grado di eseguire la quantificazione genica, misurare l'uniformità e la continuità della copertura genica ed eseguire l'analisi della correlazione di Pearson tra repliche biologiche per misurare la riproducibilità. Sulla base di una serie di pannelli genetici chiave, abbiamo confrontato i campioni nel nostro studio con i dati di The Cancer Genome Atlas (TCGA) e abbiamo confermato che circa il 60% dei campioni aveva profili di espressione genica comparabili11. In base alla correlazione tra vari risultati QC e metadati di esempio, abbiamo identificato le metriche chiave di Controllo qualità che hanno un buon valore predittivo per identificare i campioni che hanno maggiori probabilità di generare dati di sequenza utilizzabili11.
Qui descriviamo la metodologia utilizzata per la valutazione della qualità FFPE-RNA, la generazione di librerie di sequenziamento a partire da campioni di RNA estratti e l'analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento.
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Protocol
1. Quantità di RNA e valutazione della qualità
- Selezionare i campioni FFPE in base a criteri predefiniti ed estrarre l'RNA utilizzando un metodo appropriato (ad esempio, kit di estrazione acido FFPE-nuclei, tabella dei materiali).
NOTA: Ci sono diversi metodi disponibili per l'estrazione FFPE-RNA, tra cui i metodi di microdissezione più recenti che possono funzionare con pochissimi tessuti ed estrarre RNA di buona qualità12,13,14. - La massima attenzione deve essere presa per preservare l'integrità dell'RNA in tutte le fasi. Ciò include la collaborazione con l'acqua deionizzata libera da RNase, l'utilizzo di plastica senza RNase e la pulizia di tutti gli strumenti che entrano in contatto con i blocchi FFPE con reagenti di decontaminazione RNase.
- L'RNA deve sempre essere maneggiato con attenzione e tenuto nel ghiaccio, salvo diversa specifica per ridurre al minimo la degradazione durante la manipolazione.
- Se è disponibile abbastanza materiale, estrarre l'RNA da più di una regione nel blocco FFPE per generare repliche biologiche dal maggior numero possibile di campioni. Per alcuni dei campioni con un'ampia resa dell'RNA, dividere l'RNA estratto in due per elaborarlo come repliche tecniche.
- Se possibile, raccogliere una piccola quantità di campione separatamente dopo l'estrazione per il QC (cioè un QC) per evitare ripetuti cicli di manipolazione e congelamento del campione che probabilmente porteranno alla degradazione dell'RNA.
- Controllare la qualità dell'RNA (preferibilmente dal QC) eseguendolo su un sistema RNA QC (ad esempio, il sistema Agilent Bioanalyzer utilizzando un chip RNA Nano, Table of Materials) secondo le istruzioni del produttore.
- Analizzare la distribuzione dei frammenti di RNA nei campioni (ad esempio, utilizzando il software Bioanalyzer 2100 Expert) calcolando i valori DV200 e DV100 come percentuale di frammenti di dimensioni superiori a 200 nt (DV200) o 100 nt (DV100).
- Tra DV200 e DV100, identificare la metrica con una maggiore diffusione dei valori per il set di campioni specificato e selezionarla per raggruppare i campioni in base al loro grado di intattabilità.
NOTA: per i set di campioni con molecole di RNA più intatte (ad esempio, valori dV200 elevati, tutti o la maggior parte con DV200 > 40%), DV200 è probabilmente un'utile metrica QC. Tuttavia, per i set di campioni con trascrizioni più degradate (ad esempio, valori DV200 bassi, tutti o la maggior parte con DV200 < 40%), DV100 è più probabile che sia utile. - In base alle metriche Di Controllo/InBase, identificare i campioni con DV100 < 40%. Poiché è molto probabile che questo grado di degradazione non generi dati di sequenziamento utili11, è consigliabile evitare l'elaborazione di tali campioni. Se sono disponibili sostituzioni per tali campioni, la loro qualità deve essere controllata in modo da includere idealmente solo i campioni con DV100 > 50%.
2. Preparazione della libreria di sequenziamento
- In base alla qualità dei campioni valutati nella sezione 1, identificare un metodo appropriato per la generazione delle librerie di sequenziamento.
- Per set di campioni con valori di dV 200 molto bassi e dV200 elevati, utilizzare il sequenziamento dell'mRNA (cioè la cattura di trascrizioni poliadenilate), il sequenziamento mirato dell'RNA (cioè, l'uso di sonde di cattura per specifici geni di interesse, il sequenziamento dell'esoma dell'RNA (cioè l'uso di sonde di cattura per arricchire per il trascrittoma codificante) o il sequenziamento totale dell'RNA (cioè l'uso di primer casuali per la trascrizione inversa per sequenziare l'intera popolazione di RNA dopo aver rimosso l'RNA ribosomico dai campioni). Tuttavia, è importante notare che il processo di fissazione può introdurre pregiudizi nell'RNA estratto. Pertanto, gli approcci di acquisizione potrebbero non funzionare bene in tutti i casi, anche con valori DV200 elevati.
- Se il set di campioni include campioni ad alta degradazione (DV200 < 30%), utilizzare un metodo di preparazione della libreria RNA totale e non uno che dipende dall'acquisizione di aree specifiche delle trascrizioni, poiché tali aree specifiche potrebbero mancare nei campioni degradati. L'uso di primer casuali per la generazione di cDNA porta a una maggiore rappresentazione dell'RNA utilizzabile nella libreria finale, ed è, quindi, più adatto per i campioni di FFPE-RNA.
- Per l'esaurimento dell'RNA ribosomico per set di campioni ad alta degradazione, utilizzare metodi basati su RNaseH. Questi sono metodi in cui le sonde dna specifiche del rRNA si legano al rRNA, le molecole a doppio filamento vengono digerite da RNaseH e le sonde rimanenti vengono ripulite da DNase (ad esempio, kit di deplezione rRNA NEBNext, Tabella dei materiali). Questi metodi funzionano meglio per i campioni degradati rispetto ad altri metodi8.
- Per la generazione di librerie di sequenziamento, utilizzare quantità di input più elevate (se possibile) per campioni con RNA più degradato (DV100 < 60%). Mentre i campioni con RNA di qualità ragionevolmente buona (DV100 > 60%) può produrre buoni dati di sequenza anche a quantità di ingresso inferiori (il più basso testato per questo protocollo con FFPE-RNA è stato di 20 ng), per un RNA più degradato (DV100 < 60%), è meglio iniziare con quantità di ingresso più elevate (ad esempio, >100 ng).
NOTA: Se è disponibile un campione sufficiente (ad esempio, >500 ng), si consiglia di salvare almeno la metà del campione per ripetere la preparazione della libreria, se necessario. Per i campioni di input bassi (ad esempio, <100 ng), è in genere preferibile utilizzare l'intera quantità e generare una libreria di sufficiente diversità. - Dopo aver selezionato un kit di preparazione della libreria adatto per la generazione di librerie di seq di RNA totali da campioni ad alta degradazione (ad esempio, NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit per Illumina, vedere Tabella dei materiali), seguire le istruzioni del produttore per generare le librerie.
NOTA: Durante la preparazione della libreria, è importante saltare la fase di frammentazione dell'RNA per i campioni degradati e garantire l'uso di primer casuali per la sintesi cDNA del primo filamento. - Per migliorare l'efficienza e la velocità, in particolare per i campioni a basso input, utilizzare rack magnetici appropriati con forti magneti fissi per la purificazione basata sul tallone e le fasi di selezione delle dimensioni (vedere Tabella dei materiali).
- Per l'arricchimento PCR del DNA ligato dell'adattatore, regolare il numero di cicli di amplificazione in base alla quantità di DNA di input per garantire la massima rappresentazione evitando inutili duplicazioni delle molecole della libreria. Per i campioni FFPE-RNA a basso input (<100 ng), si consigliano 16-18 cicli di amplificazione, mentre i campioni di input elevati (1.000 ng) di solito generano quantità sufficienti di libreria in 12-14 cicli di amplificazione.
- Seguendo l'amplificazione e la pulizia della PCR in base alle istruzioni del produttore, valuta la qualità della libreria analizzando la concentrazione della libreria e la distribuzione delle molecole su una piattaforma appropriata (ad esempio, Agilent Bioanalyzer DNA Chip, vedi Tabella dei materiali). Per i campioni con picchi di primer (80 bp) o picchi adapter-dimer (128 bp), ripetere la pulizia per rimuovere tali picchi.
- Calcolare la dimensione media della libreria per ogni libreria (ad esempio, utilizzando il software Bioanalyzer 2100 Expert).
3. Sequenziamento libreria QC
- Una volta che è stato accertato che le librerie sono prive di primer in eccesso e adattatori-dimer e hanno una concentrazione sufficiente per il successivo sequenziamento, quantificano ulteriormente da qPCR.
NOTA: a causa della sensibilità della generazione di cluster verso la concentrazione della libreria, una quantificazione accurata è fondamentale per evitare che il sequenziamento costoso esegua una sottoperformance o un sovraccarico. I metodi di PCR (qPCR) in tempo reale sono utili per migliorare la densità dei cluster sulle piattaforme Illumina senza comportare un superamento eccessivo. Il metodo qPCR è più preciso e più sensibile rispetto ai metodi basati sull'analisi qualitativa e/o quantitativa di tutte le molecole della libreria (ad esempio, Agilent Bioanalyzer), perché misura i modelli che hanno entrambe le sequenze di adattatori su entrambe le estremità che formeranno cluster sulla cella di flusso. Le dimensioni della libreria devono tuttavia essere note in anticipo come correzione delle dimensioni deve essere applicata a tutti i campioni in modo che i risultati possano essere confrontati con una curva standard.
NPE': I cappotti e i guanti da laboratorio devono essere sempre indossati quando si esegue qPCR e la procedura deve essere eseguita in un armadietto di biosicurezza seguendo le istruzioni del produttore.- Impostare una piastra di 96 pozze con tre repliche per ogni campione per la prevenzione degli errori utilizzando un kit adatto (ad esempio, KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix per le librerie Illumina, una parte del kit di quantificazione della libreria, vedere Tabella dei materiali), insieme agli standard, un controllo positivo (ad esempio, un controllo PhiX, vedere Tabella dei materiali) e un controllo senza modello (NTC). Il NTC è qPCR mix senza libreria di DNA. Il controllo positivo può essere qualsiasi libreria con concentrazione nota e dimensione del frammento.
- Preparare un minimo di sei diluizioni degli standard seguendo il protocollo del fornitore.
- Dopo aver aggiunto tutti i componenti (ad esempio, qPCR master mix, librerie, standard), coprire la piastra con pellicola di sigillazione e utilizzare uno squeegee per garantire che la pellicola faccia un contatto uniforme e sicuro con la piastra.
- Vorticare e girare verso il basso la piastra a 1.500 rpm per almeno 1 min. Ispezionare visivamente la piastra per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria sul fondo dei pozzi.
- Impostare la piastra sul ciclore termico (ad esempio CFX96 Touch System, vedere Table of Materials) utilizzando le impostazioni consigliate dal produttore.
- Salvare la cartella di esecuzione in cui è possibile accedervi per l'analisi dei dati.
- Durante l'analisi dei dati, verificare che la pendenza sia compresa tra -3,1 e -3,6, efficienza dal 90% al 110% e R2 (coefficiente di correlazione ottenuto per la curva standard) non inferiore a 0,98.
- Impostare una piastra di 96 pozze con tre repliche per ogni campione per la prevenzione degli errori utilizzando un kit adatto (ad esempio, KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix per le librerie Illumina, una parte del kit di quantificazione della libreria, vedere Tabella dei materiali), insieme agli standard, un controllo positivo (ad esempio, un controllo PhiX, vedere Tabella dei materiali) e un controllo senza modello (NTC). Il NTC è qPCR mix senza libreria di DNA. Il controllo positivo può essere qualsiasi libreria con concentrazione nota e dimensione del frammento.
- Pooling: Una volta ottenuta la concentrazione qPCR delle librerie pronte per la sequenziamento, si accumulano quantità di equimolar di ciascuna delle librerie, a seconda del numero di letture di sequenziamento richieste per campione e dell'output di sequenziamento dello strumento.
- QC dei pool: Quantitate i pool di librerie nuovamente da qPCR seguendo lo stesso protocollo descritto nel passaggio 3.1.
4. Sequenziamento
- A seconda dei parametri di esecuzione, estrarre i kit di reagente di sequenziamento e scongelarli seguendo la guida utente. Si prega di controllare il sito Web Illumina per le ultime versioni di tutte le guide utente per la sequenza su strumenti Illumina.
- Assicurarsi che i reagenti siano completamente sconlorosi e posizionare il vassoio dei reagenti a 4 gradi centigradi. La corsa dovrebbe essere avviata entro e non oltre 2 h dopo che i reagenti sono stati scongelate. Non facendo che potrebbe influenzare la qualità dei risultati di esecuzione.
- Invertire la cartuccia 5x per mescolare i reagenti e toccare delicatamente sul banco per ridurre le bolle d'aria.
- Mettere da parte il pacchetto della cella di flusso non avvolto a temperatura ambiente per 30 min.
- Srotolare il pacchetto della cella di flusso e pulire la superficie di vetro della cella di flusso con una pulizia dell'alcool senza lafote. Asciugare il vetro con un tessuto da laboratorio a bassa lanella.
- Aprire l'applicazione Illumina "Experiment Manager". Scegli "Crea foglio di esempio", quindi scegli Sequencer e fai clic su "Avanti".
- Creare e caricare il foglio di esempio in base ai criteri del sequenziatore Illumina (ad esempio, Illumina Experiment Manager, guida software).
- Quando richiesto, eseguire la scansione nel codice a barre del kit di reagenti e immettere i parametri di impostazione dell'esecuzione (ad esempio, per una singola esecuzione del ciclo PE 75 indicizzata, immettere 76-8-76).
- Denatura e diluire il pool di librerie in base alla raccomandazione della guida utente del sequencer (ad esempio, NextSeq 500 System guide di Illumina, vedere Tabella dei materiali).
- Denatura e diluire la libreria di controllo PhiX (vedi Tabella dei materiali) alla concentrazione appropriata (ad esempio, 1,8 pM per NextSeq).
- Mescolare la libreria di campioni e il controllo PhiX per ottenere un rapporto di volume di controllo PhiX dell'1%.
- Caricare il campione denaturato e diluito nella cartuccia del reagente nel serbatoio designato.
- Caricare la cella di flusso, la cartuccia del buffer e la cartuccia del reagente.
- Eseguire un controllo e una revisione automatizzati per assicurarsi che i parametri di esecuzione superino il controllo del sistema.
- Al termine del controllo automatico, selezionare Avvia per avviare l'esecuzione della sequenza.
5. Analisi dei dati e valutazione della qualità
NOTA: un tipico flusso di lavoro di analisi dei dati dell'RNA -seq (Figura 1) include la pre-elaborazione e il QC, l'allineamento al genoma e il QC post-allineamento, la quantificazione genica e trascrizione, l'analisi della correlazione dei campioni, l'analisi differenziale tra diversi gruppi di campioni, le condizioni di trattamento e l'arricchimento dei geni e l'analisi del percorso.
I dati dell'RNA-seq possono avere problemi di qualità che possono influenzare l'accuratezza della profilazione genica e portare a conclusioni errate. Pertanto, i controlli QC iniziali per la qualità di sequenziamento, contaminazione, distorsione della sequenza e altre fonti di artefatti sono molto importanti. L'applicazione di una pipeline RNA-Seq QC simile al flusso di lavoro descritto di seguito è consigliata per rilevare gli artefatti e applicare il filtraggio o la correzione prima dell'analisi a valle.
- Preelaborazione
NOTA: questo include il demultiplexing, la valutazione della qualità di lettura della sequenza, il contenuto GC, la presenza di adattatori di sequenza, k-mer sovrarappresentati e letture duplicate PCR. Queste informazioni consentono di rilevare errori di sequenza, artefatti PCR o contaminazione.- Demultiplex Illumina sequencing viene eseguito utilizzando lo strumento software Illumina bcl2fastq2 per generare file FASTQ non elaborati per ogni campione definito nel foglio campione. Consentire una mancata corrispondenza nei codici a barre dell'indice di esempio per tollerare errori di sequenza in caso di mancata collisione del codice a barre.
- Eseguire lo strumento software FASTQC15 per eseguire un controllo di qualità sui file FASTQ non elaborati per rilevare eventuali scarse qualità o anomalie nelle letture di sequenziamento.
- Per il taglio di adattatori e basi di bassa qualità, tagliare gli adattatori di sequenziamento e le basi di bassa qualità utilizzando gli strumenti software Cutadapt16 o Trimmomatic17. Salvare le letture tagliate nei file fastq a coppie.
- Schermo di contaminazione
- Eseguire FASTQ_screen18 per rilevare possibili contaminazioni incrociate con altre specie.
- Eseguire miniKraken di Kraken219 per identificare le tassonomie delle specie contaminanti.
- Allineamento al genoma di riferimento e QC post-allineamento
- Le letture tagliate possono essere allineate a una sequenza genomica di riferimento (GRCh Build hg19 o hg38) utilizzando l'aligner STAR20. Applicare il file GTF di annotazione Gencode per guidare l'allineamento della trascrizione con giunzione. Si consiglia di eseguire STAR 2-pass per aumentare la sensibilità alle nuove giunzioni di giunzione. Nel secondo passaggio, tutte le letture saranno rimappate utilizzando geni annotati e trascrizioni e nuove giunzioni dal primo passaggio.
- Eseguire il Controllo di controllo post-allineamento.
- Eseguire I21MarkDuplicates di Picard per valutare la complessità della libreria determinando la quantità di letture univoche o non duplicate negli esempi.
- Esegui il programma CollectRnaSeqMetrics di Picard per raccogliere percentuali di mappatura su code, regioni introniche, intergeniche, UTR e copertura genica del corpo.
- Eseguire RSeQC22 per determinare la distanza interna della coppia di lettura, la distribuzione di lettura tra gli esoni CDS, 5'UTR, 3'UTR, intron, TSS_up_1kb, TSS_up_5kb, TSS_up_10kb, TES_down_1kb, TES_down_5kb, TES_down_10kb, leggere il contenuto GC, la saturazione della giunzione e le informazioni sul filamento della libreria.
- Eseguire multi-QC23 per generare un report aggregato in formato HTML.
- Analisi della quantificazione e della correzione genica
- Eseguire RSEM24 per ottenere il conteggio delle materie prime e il conteggio di lettura normalizzato su geni e trascrizioni. La misurazione del conteggio delle letture come RPKM (letture per chilobase di modello esonizzato per milione di letture), FPKM (frammenti per kilobase di modelli di exon per milione di letture mappate) e TPM (trascrizioni per milione) sono i valori di espressione genica RNA-seq più frequentemente segnalati. I geni espressi al di sotto di una soglia rumorosa (ad esempio TPM < 1 o conteggio non elaborato <5) possono essere filtrati.
- Eseguire la quantificazione della trascrizione per aggregare i conteggi non elaborati delle letture mappate a ogni sequenza di trascrizioni utilizzando programmi come HTSeq-count o featureCounts.
- Eseguire Principal Components Analysis (PCA) utilizzando uno script R per determinare gli effetti batch e valutare una mappa di qualità del set di dati specificato25. L'analisi della correlazione dei campioni può essere effettuata utilizzando la correlazione di Pearson tra diverse metriche.
- Analisi dell'espressione genica differenziale
- Eseguire l'analisi differenziale genica tra le condizioni del campione utilizzando il programma edgeR26,27 e/o limma-Voom28 e utilizzare metodi di normalizzazione tra cui TPM, TMM, DESeqo UpperQuartile.
- Si consiglia di eseguire almeno due strumenti software di analisi differenziale per chiamare due set di elenchi DEG per il confronto e ottenere i DEG finali per migliorare la sensibilità e l'accuratezza del rilevamento.
- Arricchimento dei set genici e analisi del percorso
- Eseguire Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)29,30 in base alla classificazione delle trascrizioni in base a una misurazione dell'elenco dei geni espressi in modo differenziale (DEG) per determinare se i DEG mostrano differenze statisticamente significative e concordanti tra le condizioni biologiche.
- Eseguire l'analisi delle funzioni utilizzando risorse quali Gene Ontology31, DAVID32,33o altri strumenti software disponibili.
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Representative Results
La metodologia descritta in precedenza è stata applicata a 67 campioni di FFPE che erano stati conservati in una varietà di condizioni diverse per 7-32 anni (il tempo di conservazione dei campioni mediani era di 17,5 anni). I dati del set di dati e dell'analisi qui presentati sono stati descritti in precedenza e pubblicati in. Per controllare la qualità del campione come descritto in precedenza (ad esempio, le tracce di esempio nella figura 2),DV100 è risultato più utile di DV200 perché è più sensibile misurare con precisione la proporzione di dimensioni di frammenti più piccole per campioni di RNA altamente degradati.
Nel set di campioni specificato, meno del 10% dei campioni (7 di 67) erano al di sopra del DV200 tagliato del 30%, come raccomandato da Illumina34. Circa il 26% dei campioni (19 su 67) aveva un DV100 > Il 60% (cioè una maggiore probabilità di generare dati di buona sequenza), il 40% (27 su 67) era compreso nell'intervallo 40-60% per DV100 (cioè accettabile, ma con una minore probabilità di generare dati di buona sequenza) e circa il 10% (7 su 67) aveva un DV100 di <40% (cioè, molto basso di una buona probabilità di dati di sequenza). Per 14 di 67 campioni, il software non è stato in grado di determinare i valori DV. La tabella 1 mostra un riepilogo delle metriche QC per i campioni in diverse categorie DV100. Per l'analisi dettagliata del QC e la correlazione dei dati11per tutti i 67 campioni, si prega di consultare .
Dato l'elevato grado di degradazione nel set di campioni, è stato scelto un metodo di preparazione della libreria "RNA totale" e le librerie di sequenziamento sono state preparate utilizzando il kit di preparazione della libreria dell'RNA NEBNext Ultra II per Illumina (Tabella dei materiali). Al fine di migliorare la rappresentazione delle librerie di sequenziamento nonostante l'elevato grado di degradazione del campione, la quantità massima possibile di RNA (1.000 ng quando disponibile) è stata utilizzata come input per la preparazione della libreria. Inoltre, l'elevata degradazione dei campioni di FFPE-RNA ha richiesto il metodo di deplezione dell'rRNA, perché le trascrizioni degradate erano probabilmente prive delle code poli-A per la cattura dell'mRNA. Dopo l'esaurimento dell'RNA ribosomico mediante l'ibridazione a sonde specifiche e la digestione delle trascrizioni ibridate usando RNaseH, le trascrizioni rimanenti sono state convertite in cDNA utilizzando primer casuali. La selezione delle dimensioni è stata evitata anche per le librerie preparate da campioni di input più bassi. Le tracce di esempio delle librerie finali sono mostrate nella Figura 3.
I campioni FFPE altamente degradati rappresentano una grande sfida per la profilazione dell'espressione genica nei campioni tumorali. Pertanto, l'applicazione di metodi e strumenti software corretti per l'analisi bioinformatica è fondamentale per rilevare artefatti o anomalie nei set di dati al modo di garantire un'elevata precisione e riproducibilità della quantificazione genica. Gli strumenti software utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella supplementari. Nel set di esempi specificato è stata eseguita la sequenza e la valutazione della qualità della libreria, con alcune metriche di esempio illustrate nella Figura 4. Una panoramica della qualità della sequenza di file fastq non elaborata e del contenuto dell'adattatore di esempio è illustrata rispettivamente nella Figura 4A e nella Figura 4B. Schermata Fastqc può aiutare a rilevare la contaminazione, come la contaminazione batterica e del topo, nei campioni come mostrato nella Figura 4C. Nel set di campioni specificato, 41 campioni su 67 avevano una contaminazione batterica del 5%-48% e sei campioni avevano una contaminazione del topo del 4%-11% (Figura 4C). I risultati dell'allineamento STAR (Figura 4D) mostravano la percentuale di letture mappate al genoma di riferimento, la percentuale di letture mappate in modo univoco al genoma di riferimento e la percentuale di letture non mappate o mappate a più loci. Picard CollectRNAStatistics è stato utilizzato per determinare la percentuale di basi mRNA, intronica e intergenica presenti nei file di allineamento (Figura 4E). Per valutare l'uniformità della copertura delle letture su geni e trascrizioni, abbiamo usato lo strumento software Picard per generare un grafico di copertura del corpo genico, che misura la percentuale di letture che coprono ogni posizione nucleotide di tutti i geni scalati in bidoni da 5o UTR a 3 ore UTR. La figura 4F mostra che alcune librerie degradate avevano un pregiudizio di 3', in cui più letture sono mappate più vicino alla fine che all'estremità 5'.
I campioni FFPE di solito hanno una grande variabilità nei profili di espressione genica che può sorgere a causa della degradazione variabile durante l'archiviazione del campione, l'estrazione dell'RNA o l'elaborazione del campione. È importante utilizzare metodi statistici appropriati per scoprire i modelli sottostanti e misurare la variazione e la correlazione tra i campioni. Abbiamo applicato Principal Component Analysis (PCA) per sei coppie di repliche biologiche da un sottoinsieme dei 67 campioni di FFPE. Un grafico PCA ha mostrato che il 26% della variazione totale è stato catturato dalla prima componente principale e il 19% dal secondo e terzo componente combinati (Figura 5). Tra le sei coppie di repliche, due coppie di repliche avevano variazioni più elevate (correlazioni inferiori a 0,22) rispetto agli ultimi quattro campioni (valori di correlazione tra 0,7-0,8) quando si confrontavano i valori dell'espressione genica tra le coppie di replica. Poiché le repliche sono state generate estraendo RNA da due diversi riccioli di tessuto tagliati dagli stessi blocchi FFPE, l'età dei tessuti non è stata un fattore nella varianza più alta qui, ed è stata probabilmente causata dalla diversa quantità di contaminazione batterica (1%-55%) così come diversi contenuti di mRNA (2-3 differenza di piega) tra le repliche. La casualità della degradazione dell'mRNA dopo l'estrazione potrebbe anche contribuire alla maggiore varianza tra campioni di origine simile.
Figura 1: flusso di lavoro di analisi RNaseq. Il diagramma di flusso descrive le fasi di analisi per la pre-elaborazione, la valutazione della qualità, la mappatura al riferimento, la quantificazione genica e l'analisi differenziale tra diversi gruppi campione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempi di tracce di bioanalyzer di sei diversi campioni di FFPE-RNA. L'asse orizzontale denota il peso molecolare (bp) e le unità di fluorescenza (FU) e l'asse verticale mostra la concentrazione di frammenti di diverse dimensioni. I valori RNA Integrity Numbers (RIN), DV200 (cioè percentuale di frammenti >200 bp) e DV100 (ovvero, percentuale di frammenti >100 bp) sono indicati in ogni profilo. Un picco di 25 bp in ogni profilo indica il marcatore di peso molecolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempi di tracce di bioanalyzer di librerie finali preparate da quattro campioni diversi. L'asse orizzontale denota il peso molecolare (bp) e le unità di fluorescenza (FU) sull'asse verticale indicano la concentrazione di frammenti di dimensioni diverse. I picchi dei marcatori inferiore (35 bp o 50 bp) e superiore (10.380 bp) sono etichettati rispettivamente in verde e viola. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esempio di report multi-QC per la pre-elaborazione dei risultati del controllo di controllo di accesso rapido. (A) Grafico a linee che mostra le percentuali di basi Q30 di tutte le letture di sequenziamento in ogni campione. (B) Sequenziamento del contenuto dell'adattatore in file fastq non elaborati. (C) Schermata di contaminazione per controllare le specie strettamente corrispondenti. (D) Statistiche di mappatura del genoma. (E) Distribuzione in lettura basata sull'annotazione genica Gencode. (F) Copertura corpo/trascrizione gene Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 5: Esempio di analisi PCA per mostrare la concordanza del gruppo di esempio. Analisi PCA per repliche biologiche. Il grafico PCA con campioni tracciati in due dimensioni utilizzando le loro proiezioni sui primi due componenti principali. Le repliche biologiche sono mostrate nello stesso colore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Numero di campioni | Ingresso mediano per la preparazione lib (ng) | RIN mediano | Mediana DV200 | Mediana DV100 | Dimensione Mediana Lib (bp) | Resa Mediana Lib (ng) | Mediana Lib Molarity (nM) | Tempo di conservazione mediano degli spettri (anni) | Mediana % contaminazione | Conteggio dei gene mediani | |
| DV100 <40% | 7 | 237.6 | 2.5 | 6 | 34 | 445 | 24.5 | 7 | 22 | 27.4 | 14,759 |
| DV100 40-60% | 27 | 1000 | 2.5 | 12 | 51 | 408 | 19.8 | 5.9 | 18 | 9.9 | 10,202 |
| DV100 >60% | 19 | 1000 | 2.3 | 26 | 73 | 355 | 84.9 | 24 | 13 | 3.2 | 9,993 |
Tabella 1: riepilogo delle metriche QC dei set di campioni. La tabella mostra le metriche QC dei campioni, raggruppate in base ai loro valori DV100. Viene elencato il numero di campioni in ogni gruppo e vengono visualizzati i valori mediani per ogni metrica.
Tabella supplementare: strumenti software di analisi, parametri e riferimenti software. La tabella elenca gli strumenti software di analisi e i parametri utilizzati in ogni fase dell'analisi RNA-seq. I riferimenti degli strumenti software sono elencati nella tabella. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Il metodo descritto qui descrive i passaggi principali necessari per ottenere buoni dati di sequenza da campioni di FFPE-RNA. I punti principali da considerare con questo metodo sono: (1) Assicurarsi che l'RNA sia preservato al meglio dopo l'estrazione riducendo al minimo la manipolazione del campione e il congelamento e lo scongelamento dei cicli. Aliquote QC separate sono molto utili. (2) Utilizzare una metrica QC che è migliore per il set di campioni specificato. I valori RIN e DV200 spesso non sono utili per i campioni degradati e DV100 può essere la metrica di scelta per valutare la qualità in un determinato set di campioni. (3) Per i campioni più degradati, è meglio usare un input di campione elevato. Importi di input più elevati portano a una migliore diversità e a una minore duplicazione nella libreria finale, con conseguente miglioramento della qualità dei dati. Poiché non tutti i campioni di RNA in FFPE-RNA sono utilizzabili a causa dell'elevata degradazione e della refratbilità ai processi enzimatici, questi effetti sono più pronunciati nell'RNA FFPE rispetto all'RNA congelato fresco. (4) Utilizzare l'innesco casuale per la fase di trascrizione inversa in contrapposizione all'uso di oligo-dT o sequenze specifiche come primer. A meno che il set di sonde specifiche non sia in grado di coprire la maggior sequenza possibile per tutte le trascrizioni di interesse, i primer casuali sono una scommessa sicura per garantire la conversione di un numero massimo di trascrizioni (o frammenti di essi) in cDNA. Pertanto, i metodi di preparazione della libreria DI RNA totale sono più utili per i campioni degradati rispetto ai metodi mRNA, che si basano sulla presenza di code poli-A. (5) La quantificazione accurata delle librerie da parte di PCR quantitativo in tempo reale (qPCR) è importante per evitare sottoprestazioni o sovraccarico dei sequencer. (6) Valutare la potenziale contaminazione dell'RNA come parte dei protocolli standard di RNA-Seq QC post sequenziamento. La contaminazione batterica e la contaminazione genomica del DNA sono comuni per i campioni FFPE a causa delle condizioni di conservazione e delle procedure di preparazione dei campioni. I campioni contaminati da specie estranee possono sprecare copertura di sequenziamento, a seconda dell'entità della contaminazione. Inoltre, la contaminazione interna può derivare da un esaurimento incompleto dell'rRNA, che porta ad un'alta percentuale di letture che si adattano ai rRNA. La rimozione inefficiente del DNA genomico durante la digestione di DNase potrebbe portare al rilevamento di false espressioni positive di trascrizioni o all'assemblaggio erroneo de novo delle trascrizioni. La contaminazione dell'adattatore introdotta durante la preparazione della libreria è anche un problema comune per gli RNA altamente degradati con frammenti di RNA molto brevi. La contaminazione può influenzare l'accuratezza della profilatura genica e trascrizione e portare a false scoperte. Pertanto, è importante identificare con precisione le fonti di contaminazione e rimuovere la contaminazione, se possibile, durante le fasi di preparazione del campione o della libreria, oppure filtrare le letture contaminanti durante la fase di elaborazione dei dati. 7 La pre-elaborazione e il controllo della qualità post-allineamento sono importanti per rilevare campioni di qualità di scarsa qualità e basso contenuto di mRNA. Tali campioni dovrebbero essere eliminati da ulteriori analisi. I dati sull'espressione genica di campioni che generano conteggi genici bassi, una scarsa copertura dovrebbero essere usati con cautela. (8) È buona norma includere repliche biologiche al fine di misurare la varianza e la correlazione dei campioni per garantire la riproducibilità dei dati.
I campioni FFPE rappresentano una risorsa molto preziosa per un gran numero di malattie. La capacità di ottenere informazioni di sequenza affidabili da tali campioni aiuterebbe molti studi volti a comprendere i meccanismi molecolari alla base di vari disturbi, resistenza e suscettibilità. Anche se i limiti imposti dalla qualità spesso non ottimale dell'RNA estratto da tali campioni ostacolano tali sforzi, i passaggi qui descritti aiutano a mitigare tali limitazioni in una certa misura e ci permettono di sfruttare al meglio l'RNA FFPE per ottenere informazioni affidabili sull'espressione genica.
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Disclosures
Questo lavoro è stato finanziato dal National Cancer Institute (NCI), National Institutes of Health (NIH). è l'appaltatore delle operazioni e del supporto tecnico del Frederick National Laboratory for Cancer Research, interamente finanziato dalla NIH. Diversi autori (Yz, MM, KT, YL, JS, BT) sono affiliati a Leidos Biomedical Research, Inc., ma tutti gli autori sono completamente finanziati dall'Istituto Nazionale per il Cancro, compresi gli stipendi degli autori e i materiali di ricerca. non ha fornito stipendio agli autori (Yz, MM, KT, YL, JS, BT) o materiale per lo studio, né ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta di dati, nell'analisi, nella pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.
Acknowledgments
Siamo grati alla Dott.ssa Danielle Carrick (Division of Cancer Control and Population Sciences, National Cancer Institute) per l'aiuto continuo, in particolare per l'introduzione di questo studio, fornendoci i campioni e per suggerimenti utili durante l'analisi dei dati. Ringraziamo sinceramente tutti i membri del CCR Sequencing Facility presso il Frederick National Laboratory for Cancer Research per il loro aiuto durante la preparazione del campione e il sequenziamento, in particolare Brenda Ho per l'assistenza nel campione QC, Oksana German per la biblioteca QC, Tatyana Smirnova per l'esecuzione dei sequencer. Vorremmo anche ringraziare Tsai-wei Shen e Ashley Walton presso Sequencing Facility Bioinformatics Group per aver contribuito con l'analisi dei dati e l'implementazione della pipeline RNA-seq. Ringraziamo anche CCBR e NCBR per assistenza con la pipeline di analisi RNaseq e lo sviluppo di best practice.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Agilent DNA 7500 Kit | Agilent | 5067-1506 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | |
| CFX96 Touch System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Library Quantification kit v2-Illumina | KapaBiosystems | KK4824 | |
| NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7765S | https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit |
| NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) | New England Biolabs | E6310L | |
| NextSeq 500 Sequencing System | Illumina | SY-415-1001 | NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf |
| NextSeq PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3002 | |
| NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS) | Illumina | 20024907 | |
| 10X Genomics Magnetic Separator | 10X Genomics | 120250 | |
| Rotator Multimixer | VWR | 13916-822 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
| Sequencing reagent kit | Illumina | 20024907 | |
| Flow cell package | Illumina | 20024907 | |
| Buffer cartridge and the reagent cartridge | Illumina | 20024907 | |
| Sodium hydroxide solution (0.2N) | Millipore Sigma | SX0607D-6 | |
| TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0 | Fisher Scientific | 50-151-871 |
References
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