Summary
Bu yöntem, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) RNA örneklerinden elde edilebilen sıra verilerinin kalitesini ve miktarını artırmaya yönelik adımları açıklar. FFPE-RNA örneklerinin kalitesini daha doğru değerlendirmek, sıralama kitaplıkları hazırlamak ve FFPE-RNA örneklerinden elde edilen verileri analiz etmek için metodolojiyi tanımlıyoruz.
Abstract
RNA dizilimi (RNA-seq) ile gen ekspresyonu analizi, çeşitli hastalıkların temelinin mekanistik olarak anlaşılmasına ve direnç ve/veya duyarlılık mekanizmalarına yol açabilecek klinik örneklere benzersiz içgörüler sağlar. Ancak klinik örneklerde doku morfolojisini korumak için en yaygın yöntemi temsil eden FFPE dokuları gen ekspresyonu profilanalizi için en iyi kaynaklar değildir. Bu tür örneklerden elde edilen RNA genellikle bozulmuş, parçalanmış ve kimyasal olarak değiştirilmiştir, bu da alt optimal sıralama kitaplıklarına yol açar. Buna karşılık, bu gen ekspresyon analizi ve mutasyon keşfi için güvenilir olmayabilir düşük kaliteli dizi verileri üretir. FFPE örneklerinden en iyi şekilde yararlanabilmek ve düşük kaliteli numunelerden mümkün olan en iyi verileri elde etmek için, deneysel tasarım planlarken, sıralama kitaplıklarını hazırlarken ve veri analizi sırasında bazı önlemler almak önemlidir. Bu, kesin örnek kalite denetimi (QC) için uygun ölçümlerin kullanımını, sıralama kitaplığı oluşturma sırasında çeşitli adımlar için en iyi yöntemleri tanımlamayı ve dikkatli kitaplık QC'sini içerir. Buna ek olarak, rna-seq verilerindeki yapıları belirlemek, kontaminasyonve düşük kaliteli okumaları filtrelemek, gen kapsamının tekdüzeliğini değerlendirmek ve biyolojik çoğaltmalar arasında gen ekspresyonu profillerinin tekrarlanabilirliğini ölçmek için doğru yazılım araçları ve parametrelerinin uygulanması çok önemlidir. Bu adımlar, çok heterojen RNA örneklerinin profillemesi için yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirlik sağlayabilir. Burada örnek QC, kütüphane hazırlama ve QC, sıralama ve ffpe-RNA dokularından elde edilen düşük kaliteli RNA elde edilen yararlı veri miktarını artırmak için yardımcı olabilir veri analizi için çeşitli adımları açıklar.
Introduction
Yeni nesil sıralama yaklaşımlarının kullanımı, çeşitli örnek türlerinden bilgi hazinesi elde etmemizi sağlamıştır. Ancak, eski ve kötü korunmuş örnekler, dizi verileri oluşturmanın yaygın olarak kullanılan yöntemleri için kullanılamaz durumda kalır ve genellikle iyi kurulmuş protokollerde değişiklik yapılmasını gerektirir. FFPE dokuları klinik örnekler1,2,3için yaygın olarak kullanılan böyle bir örnek tipi temsil eder. FFPE koruma doku morfolojisi korurken, FFPE dokularda nükleik asitler genellikle hasar ve bozulma geniş bir yelpazede sergileyen, zor çeşitli bozuklukların altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında önemli anlayışlara yol açabilir genomik bilgi almak için yapım.
RNA dizilimi ile oluşturulan gen ekspresyonu verileri genellikle hastalık ve direnç mekanizmalarının incelenmesinde etkilidir ve DNA mutasyon analizini tamamlar. Ancak, RNA bozulmaya daha duyarlıdır, ffpe dokulardan doğru gen ekspresyonu verileri oluşturmak için daha zor hale. Ayrıca, sıralamanın geniş kullanılabilirliği ve karşılanabilirliği nispeten yeni olduğundan, eski numuneler genellikle RNA bütünlüğünü korumak için gerekli koşullarda depolanmadı. FFPE örnekleri için bazı sorunlar parafin gömme nedeniyle RNA bozulması, parçalanma veya sıralama için gerekli enzimatik süreçlere kırılmaya yol açan RNA kimyasal modifikasyon, ve poli-A kuyrukları kaybı, ters transkript için bir astar olarak oligo-dT uygulanabilirliğini sınırlayan4. Bir diğer zorluk da FFPE numunelerinin optimal olmayan koşullarda işlenmesi/depolanmasıdır, bu da dokularda RNA gibi labile moleküllerinin daha da bozulmasına yol açabilir5. Bu, özellikle rna dizilimi ile gen ekspresyonu analizinin numuneler için beklenmediğinin bir zamanda toplanmış olabilecek eski numuneler için geçerlidir. Tüm bunlar, yararlı dizi verileri oluşturmak için kullanılabilir çıkarılan RNA'nın kalitesinin ve miktarının düşmesine yol açar. Başarının düşük olasılığı, sıralamanın yüksek maliyetiyle birleştiğinde, birçok araştırmacıyı potansiyel olarak yararlı FFPE örneklerinden gen ekspresyonu verilerini oluşturmaya ve analiz etmeye çalışmaktan caydırmıştır. Son yıllarda yapılan bazı çalışmalar ffpe dokularının gen ekspresyonu analizi2,6,7,,8,9için kullanılabilirliğini göstermiştir, daha az ve/veya daha yeni örnekler için de olsa.
Bir fizibilite çalışması olarak, Gözetim, Epidemiyoloji ve Son Sonuçlar (SEER) rna sekanslama ve gen ekspresyonu analizi için kanser kayıt larından üç Artık Doku Depolarından FFPE tümör doku örneklerinden elde edilen RNA'yıkullandık 10. Klinik patoloji laboratuvarlarından temin edilen yüksek dereceli yumurtalık seröz adenosinomlarından FFPE dokuları RNA ekstraksiyonundan önce değişen koşullarda 7-32 yaş ları arasında saklandı. Çünkü çoğu durumda bu bloklar gelecekte herhangi bir hassas genetik analiz beklentisi olmadan yıllardır farklı sitelerde saklanmış, nükleik asitleri korumak için çok fazla özen alınmamıştı. Böylece, örneklerin çoğu düşük kaliteli RNA sergiledi, örneklerin büyük bir kısmı bakteri ile kontamine. Bununla birlikte, gen ölçümü yapabildik, gen kapsamının tekdüzeliğini ve sürekliliğini ölçebildik ve tekrarlanabilirliği ölçmek için biyolojik kopyalar arasında Pearson korelasyon analizini yaptık. Anahtar imza gen paneli bir dizi dayanarak, biz Kanser Genom Atlası (TCGA) verileri ile çalışmamızda örnekleri karşılaştırıldığında ve örneklerin yaklaşık% 60 karşılaştırılabilir gen ekspresyonu profilleri11olduğunu doğruladı. Çeşitli QC sonuçları ve örnek meta veriler arasındaki korelasyona dayanarak, kullanılabilir dizi verileri11oluşturma olasılığı daha yüksek olan örnekleri tanımlamak için iyi tahmin değerine sahip anahtar QC ölçümleri belirledik.
Burada FFPE-RNA kalite değerlendirmesi için kullanılan metodolojiyi, çıkarılan RNA örneklerinden başlayarak sıralama kitaplıklarının oluşumunu ve sıralama verilerinin biyoinformatik analizini açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. RNA miktar ve kalite değerlendirmesi
- FFPE örneklerini önceden tanımlanmış kriterlere göre seçin ve uygun bir yöntemle RNA ayıklayın (örneğin, FFPE-çekirdekli asit ekstraksiyon kiti, Malzeme Tablosu).
NOT: FFPE-RNA ekstraksiyonu için çok az doku ile çalışabilen ve kaliteli RNA12,13,,14çıkarabilen yeni mikrodiseksiyon yöntemleri de dahil olmak üzere birçok farklı yöntem mevcuttur. - RNA'nın bütünlüğünü her aşamada korumak için azami özen verilmelidir. Buna RNase içermeyen deiyoniste suile çalışmak, RNase içermeyen plastik eşyalar kullanmak ve RNase dekontaminasyon reaktifleriyle FFPE bloklarıyla temas eden tüm cihazların temizlenmesi dahildir.
- RNA her zaman dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır ve işleme sırasında bozulmayı en aza indirmek için aksi belirtilmedikçe buzda tutulmalıdır.
- Yeterli malzeme varsa, FFPE bloğundaki birden fazla bölgeden RNA ayıklayın ve mümkün olduğunca çok örnekten biyolojik kopyalar oluşturun. Yeterli RNA verime sahip örneklerin bazıları için, çıkarılan RNA'yı teknik çoğaltma olarak işlemek üzere ikiye bölün.
- Mümkünse, büyük olasılıkla RNA bozulmasına yol açacaktır tekrarlanan işleme ve donma-çözülme döngüleri önlemek için QC (yani, bir QC aliquot) için ekstraksiyon sonra ayrı ayrı örnek küçük bir miktar toplamak.
- Üreticinin talimatlarına göre RNA'nın (tercihen QC aliquot'dan) kalitesini bir RNA QC sistemi (örneğin, RNA Nano çip, Malzeme Tablosu)kullanarak Çalıştırarak kontrol edin.
- 200 nt (DV200)veya 100 nt (DV100)boyutundan büyük parçaların yüzdesi olarak DV200 ve DV100 değerlerini hesaplayarak örneklerdeki RNA parçalarının dağılımını (örneğin, Bioanalyzer 2100 Expert yazılımını kullanarak) analiz edin.
- DV200 ve DV100arasında, verilen örnek kümesi için daha büyük bir değer dağılımına sahip olan ölçütü tanımlayın ve numunelerin bozulma derecesine göre gruplandırmak için bunu seçin.
NOT: Daha sağlam RNA moleküllerine (yani yüksek DV200 değerlerine, tümü veya çoğu DV200 > %40) olan numune kümeleri için DV200'ün yararlı bir QC ölçümü olması olasıdır. Ancak, daha bozulmuş transkriptlere (yani düşük DV200 değerlerine, tümü veya çoğu DV200 < %40) olan örnek kümeler için DV100'ün yararlı olma olasılığı daha yüksektir. - QC ölçümlerine göre, DV100 < %40'ı olan örnekleri tanımlayın. Bu derece bozulma yararlı sıralama veri11oluşturmak için büyük olasılıkla olduğundan, bu tür örneklerin işlenmesini önlemek için tavsiye edilir. Bu tür numuneler için yedek ler varsa, kaliteleri ideal olarak yalnızca DV100 > %50 olan numuneleri içerecek şekilde kontrol edilmelidir.
2. Kütüphane hazırlama sıralaması
- Bölüm 1'de değerlendirilen örneklerin kalitesine bağlı olarak, sıralama kitaplıklarını oluşturmak için uygun bir yöntem tanımlayın.
- Çok düşük bozulma ve yüksek DV200 değerlerine sahip numune kümeleri için mRNA sıralama (örn. poliadenlated transkriptlerin yakalanması), hedeflenen RNA dizilemesi (yani, belirli ilgi genleri için yakalama problarının kullanımı), RNA ekzom sıralama (yani, kodlama transkripsiyonu için zenginleştirmek için yakalama problarının kullanımı) veya toplam RNA sıralaması (örneğin, riboso RMALNA'dan risorpopülasyonunun tümrna örneklerini çıkardıktan sonra transkripsiyon için rasgele astarların kullanılması). Ancak, sabitleme işleminin çıkarılan RNA'da önyargıya yol açabilir. Böylece, yakalama yaklaşımları yüksek DV200 değerleri ile bile, her durumda iyi çalışmayabilir.
- Örnek set, yüksek bozulmaya sahip numuneler içeriyorsa (DV200 < %30), transkriptlerin belirli bölgelerinin yakalanmasına bağlı olmayan toplam Bir RNA kitaplık hazırlama yöntemini kullanın, çünkü bu belirli bölgeler bozulmuş örneklerde eksik olabilir. CDNA üretimi için rasgele astarkullanımı, kullanılabilir RNA'nın son kitaplıkta daha yüksek temsiledilmesine yol açar ve bu nedenle FFPE-RNA örnekleri için daha uygundur.
- Yüksek bozulmaya sahip numune kümeleri için ribozomal RNA tükenmesi için RNaseH tabanlı yöntemler kullanın. Bunlar rRNA'ya özgü DNA problarının rRNA'ya bağlandığı, çift iplikli moleküllerin RNaseH tarafından sindirildiği ve kalan probların DNase tarafından temizlendiği yöntemlerdir (örn. NEBNext rRNA tükenme kiti, Malzeme Tablosu). Bu yöntemler, diğer bazıyöntemler8daha bozulmuş örnekler için daha iyi çalışır.
- Sıralama kitaplıkları oluşturmak için, daha bozulmuş RNA 'ya (DV100 < %60) sahip örnekler için daha yüksek giriş miktarları (mümkünse) kullanın. Oldukça kaliteli RNA örnekleri ise (DV100 > %60) daha düşük giriş miktarlarında bile iyi dizi verileri verebilir (FFPE-RNA ile bu protokol için en düşük test ~20 ng idi), daha bozulmuş RNA için (DV100 < %60), daha yüksek giriş miktarlarıyla başlamak daha iyidir (örn. >100 ng).
NOT: Yeterli sayıda (örn. >500 ng) örnek varsa, gerekirse kitaplık hazırlamasını tekrarlamak için numunenin en az yarısını kaydetmenız tavsiye edilir. Düşük giriş örnekleri (örneğin, <100 ng) için, genellikle tüm miktarı kullanmak ve yeterli çeşitlilikbir kütüphane oluşturmak daha iyidir. - Yüksek bozulmaya sahip örneklerden toplam RNA seq kitaplıkları oluşturmak için uygun bir kütüphane hazırlama kiti seçtikten sonra (örneğin, Illumina için NEBNext Ultra II RNA Kütüphane Hazırlık Kiti, Bkz. Malzeme Tablosu),kütüphaneleri oluşturmak için üreticinin yönergelerini izleyin.
NOT: Kitaplık hazırlama sırasında, bozulmuş numuneler için RNA parçalanma adımını atlamak ve ilk iplikçik cDNA sentezi için rasgele astarların kullanılmasını sağlamak önemlidir. - Verimliliği ve hızı artırmak için, özellikle düşük girişli numuneler için, boncuk bazlı arınma ve boyut seçimi adımları için güçlü sabit mıknatıslara sahip uygun manyetik raflar kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Adaptör ligatlı DNA PCR zenginleştirme için, kütüphane moleküllerinin gereksiz çoğaltılması kaçınarak maksimum temsil sağlamak için giriş DNA miktarına göre amplifikasyon döngüleri sayısını ayarlayın. Düşük girişli FFPE-RNA örnekleri (<100 ng) için 16-18 amplifikasyon döngüsü önerirken, yüksek giriş örnekleri (1.000 ng) genellikle 12-14 ramplasyon turunda yeterli kitaplık miktarı üretir.
- PcR amplifikasyon ve üreticinin talimatlarına göre temizleme yi takiben, kütüphane konsantrasyonu ve molekül dağılımını uygun bir platformda analiz ederek kütüphane kalitesini değerlendirin (örneğin, Agilent Bioanalyzer DNA Chip, bkz. Malzeme Tablosu). Astar tepeli (~80 bp) veya adaptör-dimer tepeli (~128 bp) olan numuneler için, bu zirveleri kaldırmak için temizlemeyi tekrarlayın.
- Her kitaplık için ortalama kitaplık boyutunu hesaplayın (örneğin, Bioanalyzer 2100 Expert yazılımını kullanarak).
3. Sıralama kütüphanesi QC
- Kütüphanelerin aşırı astar ve adaptör-dimer içermeyen ve sonraki sıralama için yeterli konsantrasyona sahip olduğu tespit edildikten sonra, qPCR ile daha fazla quantitate.
NOT: Küme oluşturmanın kitaplık konsantrasyonuna karşı hassasiyeti nedeniyle, hatalı sıralamanın düşük performans veya aşırı yüklemeden kaynaklanan hatalı sıralama yı önlemek için doğru niceleme hayati önem taşır. Nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) yöntemleri, aşırı kümeleme ile sonuçlanmadan Illumina platformlarında küme yoğunluğunu artırmak için yararlıdır. QPCR yöntemi, tüm kütüphane moleküllerinin nitel ve/veya nicel analizine dayanan yöntemlerden (örn. Agilent Bioanalyzer) daha hassastır, çünkü akış hücresinde kümeler oluşturacak her iki uçta da bağdaştırıcı dizileri bulunan şablonları ölçer. Ancak, sonuçların standart bir eğriyle karşılaştırılabilmesi için tüm örneklere boyut düzeltmesi uygulandığından kitaplık boyutu önceden bilinmelidir.
DİkKAT: QPCR yaparken laboratuvar önlükleri ve eldivenler her zaman giyilmelidir ve prosedür üreticinin talimatlarına uygun olarak biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.- Uygun bir kit (örneğin, Illumina kütüphaneleri için KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix, Library Quantification kitinin bir parçası, Malzeme Tablosu'nabakınız) kullanarak hata önleme için her örnek için üç kopyaiçeren bir 96 kuyu plakası ayarlayın, standartlar, pozitif kontrol (örneğin, PhiX kontrolü, Bkz. Malzeme Tablosu)ve şablon kontrolü (NTC) olmadan. NTC DNA kütüphanesi olmadan qPCR karışımıdır. Pozitif kontrol bilinen konsantrasyon ve parça boyutu ile herhangi bir kütüphane olabilir.
- Satıcı protokolünden sonra standartların en az altı seyreltme hazırlayın.
- Tüm bileşenleri (yani, qPCR ana karışımı, kütüphaneler, standartlar) ekledikten sonra, sızdırmazlık filmi ile plakayı kaplayın ve filmin plakayla eşit ve güvenli bir şekilde temas etmesini sağlamak için bir squeegee kullanın.
- Girdap ve en az 1 dakika için 1.500 rpm plaka aşağı spin. Görsel kuyuların dibinde hava kabarcıkları olduğundan emin olmak için plakayı inceleyin.
- Üreticinin önerdiği ayarları kullanarak plakayı termal döngüye (örn. CFX96 Dokunmatik Sistem, bkz. Malzeme Tablosu)ayarlayın.
- Çalıştırılan klasörü veri çözümlemesi için erişilebilen bir yere kaydedin.
- Veri analizi sırasında eğimin -3,1 ile -3,6 aralığında olup olmadığını, verimliliğin %90'dan %110'a ve R2'nin (standart eğri için elde edilen korelasyon katsayısı) 0,98'den az olmadığını kontrol edin.
- Uygun bir kit (örneğin, Illumina kütüphaneleri için KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix, Library Quantification kitinin bir parçası, Malzeme Tablosu'nabakınız) kullanarak hata önleme için her örnek için üç kopyaiçeren bir 96 kuyu plakası ayarlayın, standartlar, pozitif kontrol (örneğin, PhiX kontrolü, Bkz. Malzeme Tablosu)ve şablon kontrolü (NTC) olmadan. NTC DNA kütüphanesi olmadan qPCR karışımıdır. Pozitif kontrol bilinen konsantrasyon ve parça boyutu ile herhangi bir kütüphane olabilir.
- Havuzlama: Sıralamaya hazır kütüphanelerin qPCR konsantrasyonu alındıktan sonra, örnek başına gerekli sıralama okuma sayısına ve enstrümanın sıralama çıktısına bağlı olarak, kütüphanelerin her birinin havuz equimolar tutarları.
- Havuzların QC 'si: 3.1 adımda açıklandığı gibi aynı protokolü takiben qPCR ile kütüphane havuzlarını tekrar quantitate.
4. Sıralama
- Çalışma parametrelerine bağlı olarak, sıralama reaktif kitlerini çekin ve kullanım kılavuzunu izleyerek eritin. Illumina araçları üzerinde sıralama için tüm kullanım kılavuzlarının en son sürümleri için Illumina web sitesini kontrol edin.
- Reaktiflerin tamamen çözülmüş olduğundan emin olun ve reaktiftepsisini 4 °C'ye yerleştirin. Reaktifler çözüldükten sonra en geç 2 saat içinde koşmaya başlanmalıdır. Bunu yapmamak çalışma sonuçlarının kalitesini etkileyebilir.
- Reaktifleri karıştırmak için kartuş5x ters ve yavaşça hava kabarcıkları azaltmak için tezgah dokunun.
- 30 dakika oda sıcaklığında bir kenara unwrapped akış hücre paketi ayarlayın.
- Akış hücre paketini aç ve akış hücresinin cam yüzeyini tüy bırakmayan bir alkol mendili ile temizleyin. Bardağı düşük tiftikli laboratuvar dokusuyla kurutun.
- Illumina "Deney Yöneticisi" uygulamasını açın. "Örnek Sayfa Oluştur" seçeneğini seçin, ardından Sequencer'ı seçin ve "Sonraki" seçeneğini tıklayın.
- Örnek sayfayı Illumina sequencer ölçütlerine (örneğin, Illumina Deney Yöneticisi, yazılım kılavuzu) temel alınıp yükleyin.
- İstemlerde, reaktif kiti barkodunda tarar ve çalıştır Kurulum Parametrelerini girin (örn. tek bir indekslenmiş PE 75 döngüsü çalışması için 76-8-76girin).
- Sıralayıcı kullanım kılavuzu önerisine göre kütüphane havuzunu denatüre ve seyreltin (örneğin, Illumina'dan NextSeq 500 Sistem kılavuzu, bkz. Malzeme Tablosu).
- PhiX kontrol kitaplığını (Bkz. Malzeme Tablosu)uygun konsantrasyona (örneğin, NextSeq için 1,8 pM) denatüre ve seyreltin.
- %1 PhiX kontrol hacmi oranı elde etmek için örnek kitaplığı ve PhiX denetimini karıştırın.
- Denatüre ve seyreltilmiş numuneyi belirlenen rezervuardaki reaktif kartuşu içine yükleyin.
- Akış hücresini, tampon kartuşu ve reaktif kartuşu'nu yükleyin.
- Çalışma parametrelerinin sistem kontrolünden geçmesini sağlamak için otomatik bir denetim ve gözden geçirme gerçekleştirin.
- Otomatik denetim tamamlandığında, sıralama çalışmasına başlamak için Başlat'ı seçin.
5. Veri analizi ve kalite değerlendirmesi
NOT: Tipik bir RNA-seq veri analizi iş akışı(Şekil 1)önişleme ve QC, genom ve post hizalama QC, gen ve transkript nicelleştirme, örnek korelasyon analizi, farklı örnek gruplar arasında diferansiyel analiz, tedavi koşulları ve gen seti zenginleştirme ve yol analizi içerir.
RNA-seq verileri, gen profillemenin doğruluğunu etkileyebilecek ve hatalı sonuçlara yol açabilecek kalite sorunları olabilir. Bu nedenle, kalite, kontaminasyon, kapsama alanı önyargı sıralama ve eserlerin diğer kaynakları için ilk QC kontrolleri çok önemlidir. Burada açıklanan iş akışına benzer bir RNA-Seq QC ardışık hattı uygulamak, yapıları algılamak ve akış aşağı çözümlemeden önce filtreleme veya düzeltme uygulamak için önerilir.
- Ön
NOT: Bu demultiplexing içerir, sıralı okuma kalitesinin değerlendirilmesi, GC içeriği, sıralama adaptörleri varlığı, overrepresented k-mers, ve PCR çoğaltılmış okuma. Bu bilgiler sıralama hatalarını, PCR yapılarını veya kontaminasyonu algılamaya yardımcı olur.- Demultiplex Illumina sıralama illumina yazılım aracı bcl2fastq2 örnek levha tanımlanan her örnek için ham FASTQ dosyaları oluşturmak için kullanarak çalıştırın. Barkod çakışması yoksa sıralama hatalarını tolere etmek için örnek dizin barkodlarında bir uyumsuzluk olmasına izin verin.
- Sıralama okumalarında herhangi bir kalite veya anormallikleri tespit etmek için ham FASTQ dosyaları üzerinde kalite kontrolü gerçekleştirmek için FASTQC15 yazılım aracını çalıştırın.
- Adaptör ve düşük kaliteli bazlar kırpma için, Cutadapt16 veya Trimmomatic17 yazılım araçlarını kullanarak sıralama bağdaştırıcılarını ve düşük kaliteli üsleri kırpın. Kesilmiş okumaları çift uçlu fastq dosyalarına kaydedin.
- Kontaminasyon ekranı
- Diğer türler ile olası çapraz kontaminasyon tespit etmek için18 FASTQ_screençalıştırın.
- Kirleyen türlerin taksonomlarını belirlemek için Kraken219'un miniKraken'ini çalıştırın.
- Referans genomve post hizalama QC hizalama
- Kesilmiş okumalar STAR hizalayıcı20kullanılarak bir referans genom dizisine (GRCh Build hg19 veya hg38) hizalanabilir. Birleştirilmiş transkript hizalama kılavuzu için Gencode ek açıklama GTF dosyasını uygulayın. Yeni splice kavşaklara karşı duyarlılığı artırmak için STAR 2-pass çalıştırılması tavsiye edilir. İkinci geçişte, tüm okumalar açıklamalı gen ve transkriptler ve ilk geçişten yeni kavşaklar kullanılarak yeniden eşlenecektir.
- Hizalama sonrası QC gerçekleştirin.
- Örneklerdeki benzersiz veya çoğaltılmayan okuma miktarını belirleyerek kitaplık karmaşıklığını değerlendirmek için Picard'ın21İşaret kopyalarını çalıştırın.
- Kodlama, intronic, intergenik, UTR bölgeleri ve gen gövdesi kapsama alanlarını haritalamak için Picard'ın CollectRnaSeqMetrics programını çalıştırın.
- RSeQC22'yi okuma çiftinin iç mesafesini belirlemek için çalıştırın, CDS eksonları, 5'UTR, 3'UTR, intron, TSS_up_1kb, TSS_up_5kb, TSS_up_10kb, TES_down_1kb, TES_down_5kb, TES_down_10kb, GC içeriğini okuyun, bağlantı doygunluğu ve kitaplık iplikçik bilgileri arasında dağıtımı okuyun.
- HTML formatındatoplu bir rapor oluşturmak için çoklu QC23 çalıştırın.
- Gen niceleme ve düzeltme analizi
- RSEM24'u, genler ve transkriptler üzerindeki normal okuma sayısının yanı sıra ham sayımı elde etmek için çalıştırın. RPKM (milyon okuma başına ekson modelinin kilobaz başına okuma), FPKM (milyon eşlenen okuma başına ekson modelinin kilobaz başına parçaları) ve TPM (milyonda transkript) gibi okuma sayısı ölçümü en sık bildirilen RNA-seq gen ifade değerleridir. Gürültülü bir eşiğin altında ifade edilen genler (TPM < 1 veya ham sayım <5 gibi) filtrelenebilir.
- HTSeq-count veya featureCounts gibi programları kullanarak her transkript dizilerine eşlenen okumaların ham sayısını toplamak için transkript niceliği gerçekleştirin.
- Toplu iş efektlerini belirlemek ve verilen veri kümesi25'inkalite haritasını değerlendirmek için Bir R komut dosyası kullanarak Temel Bileşenler Analizini (PCA) çalıştırın. Farklı ölçümler arasındaki Pearson korelasyon kullanılarak örnek korelasyon analizi yapılabilir.
- Diferansiyel gen ekspresyonu analizi
- Program edgeR26,,27 ve/veya limma-Voom28'i kullanarak örnek koşullar arasında gen diferansiyel analizi ni yapın ve TPM, TMM, DESeqveya UpperQuartilegibi normalleştirme yöntemlerini kullanın. TMM
- Karşılaştırma için iki deglistesi kümesi ni çağırmak ve algılama hassasiyetini ve doğruluğunu artırmak için son DEG'leri almak için en az iki diferansiyel analiz yazılımı aracı çalıştırması önerilir.
- Gen seti zenginleştirme ve yol analizi
- DeGs'lerin biyolojik koşullar arasında istatistiksel olarak anlamlı, uyumlu farklılıklar gösterip gösteremesini belirlemek için farklı ifade edilmiş genlerin (DEGs) listesinin ölçümüne göre transkriptlerin sıralamasına göre 29 , 30 gen seti zenginleştirme analizi (GSEA)29,30 gerçekleştirin.
- Gene Ontology31, DAVID32,33, veya diğer kullanılabilir yazılım araçları gibi kaynakları kullanarak işlev analizi gerçekleştirin.33
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan metodoloji, 7-32 yıl boyunca çeşitli koşullarda saklanan 67 FFPE numunesine uygulanmıştır (ortanca numune depolama süresi 17,5 yıl idi). Burada sunulan veri seti ve analiz sonuçları daha önce tanımlanmış ve Zhao ve ark.11'deyayınlanmıştır. Daha önce açıklandığı gibi örnek kalitesinin kontrol edilmesinde (örneğin, Şekil 2'dekiörnek izler), DV 100'ün DV200'den daha kullanışlı olduğu bulunmuştur, çünkü yüksek oranda bozulmuş RNA örnekleri için daha küçük parça boyutlarının oranını doğru bir şekilde ölçmek daha duyarlıdır.200
Verilen örnek kümesinde, örneklerin %10'dan azı (67'nin 7'si) Illumina34tarafından tavsiye edildiği üzere %30'luk DV200'ün üzerindeydi. Örneklerin yaklaşık %26'sı (67'nin 19'u) DV100 > %60 'ı (yani, iyi sıralı veri üretme olasılığı daha yüksek), %40 (67'nin 27'si) DV100 için %40-60 aralığındaydı (yani kabul edilebilir, ancak iyi sıralı veri üretme olasılığı daha düşüktür) ve yaklaşık %10'u (67'nin 7'si) DV 100&%40 (yani, iyi sonuç verisi oluşturma olasılığı çok düşüktür).100 67 örneğin 14'ü için yazılım DV değerlerini belirleyemedi. Tablo 1, farklı DV100 kategorilerinde bulunan örnekler için QC ölçümlerinin bir özetini gösterir. Tüm 67 örnek için ayrıntılı QC analizi ve veri korelasyon için lütfen Zhao ve ark.11'ebakın.
Örnek lemdeki yüksek bozulma derecesi göz önüne alındığında, 'toplam RNA' kitaplık hazırlama yöntemi seçilmiş ve Illumina için NEBNext Ultra II RNA Kütüphane Hazırlık Kiti(Malzeme Tablosu)kullanılarak sıralama kütüphaneleri hazırlanmıştır. Sıralama kitaplıklarının yüksek dereceli örnekleme bozulmasına rağmen temsilini iyileştirmek için, kütüphane hazırlama için girdi olarak mümkün olan en fazla RNA miktarı (mevcut olduğunda 1.000 ng) kullanılmıştır. Ayrıca, FFPE-RNA örneklerinin yüksek bozulması rRNA tükenme yöntemini gerekli kıldı, çünkü bozulmuş transkriptlerin mRNA yakalaması için poli-A kuyrukları olmaması olasıydı. Ribozomal RNA'nın belirli problara hibridizasyon ve RNaseH kullanılarak melezleştirilmiş transkriptlerin sindirimi ile tükenmesinin ardından, geri kalan transkriptler rastgele astarlar kullanılarak cDNA'ya dönüştürüldü. Alt giriş örneklerinden hazırlanan kütüphaneler için boyut seçimi de önlendi. Son kitaplıkların örnek izleri Şekil 3'tegösterilmiştir.
Yüksek oranda bozulmuş FFPE örnekleri tümör örneklerinde gen ekspresyonu profilleme için büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu nedenle, doğru biyoinformatik analiz yöntemleri ve yazılım araçları nın uygulanması, gen niceliğinin yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için veri kümelerinde bulunan yapıları veya anormallikleri tespit etmek için çok önemlidir. Bu çalışmada kullanılan yazılım araçları Ek Tablo'dalistelenmiştir. Verilen örnek lem kümesinde, Şekil 4'tegösterilen bazı örnek ölçümlerle sıralama ve kütüphane kalite değerlendirmesi gerçekleştirdik. Ham fastq dosya sıralama kalitesi ve örnek adaptör içeriğine genel bir bakış sırasıyla Şekil 4A ve Şekil 4B'degösterilmiştir. Fastqc ekran, Şekil 4C'degösterildiği gibi numunelerde bakteriyel ve fare kontaminasyonu gibi kontaminasyonun saptandırılabiliyor. Verilen örnek setinde, 67 numunenin 41'inde %5-48 bakteriyel kontaminasyon, altı örnekte ise %4-11 fare kontaminasyonu vardı(Şekil 4C). STAR hizalama sonuçları(Şekil 4D)referans genomuna eşlenen okumaların oranını, referans genomuna benzersiz bir şekilde eşlenen okumaların yüzdesini ve birden fazla loci ile eşlenmemiş veya haritalandırılmayan okumaların oranını gösterdi. Picard CollectRNAStatistics hizalama dosyalarında bulunan yüzde mRNA, intronic ve intergenik bazları belirlemek için kullanılmıştır(Şekil 4E). Gen ve transkriptler üzerinde okuma kapsamının tekdüzeliğini değerlendirmek için, 5' UTR'den 3' UTR'ye ölçeklenmiş tüm genlerin her nükleotit pozisyonunu kapsayan okuma yüzdesini ölçen bir gen gövdesi kapsama alanı oluşturmak için Picard yazılım aracını kullandık. Şekil 4F, bazı bozulmuş kütüphanelerin 3' önyargısına sahip olduğunu ve burada daha fazla okumanın 5'in sonuna göre 3' sonuna daha yakın eşlenediğini göstermektedir.
FFPE örnekleri genellikle numune depolama, RNA çıkarma veya numune işleme sırasında değişken bozulma nedeniyle ortaya çıkabilecek gen ekspresyonu profillerinde büyük değişkenliğe sahiptir. Altta yatan desenleri ortaya çıkarmak ve örnekler arasındaki varyasyon ve korelasyonölçmek için uygun istatistiksel yöntemler kullanmak önemlidir. 67 FFPE numunesinin bir alt kümesinden altı çift biyolojik kopya için Ana Bileşen Analizi (PCA) uyguladık. PCA çizimi, toplam varyasyonun %26'sının birinci ana bileşen tarafından, %19'unun ise ikinci ve üçüncü bileşenlerin biraraya gelmesiyle yakalandığını göstermiştir(Şekil 5). Altı kopya çifti arasında, iki çift çoğaltma, kopya çiftleri arasındaki gen ekspresyonu değerlerini karşılaştırırken son dört örnekten (0,7-0,8 arasındaki korelasyon değerleri) göre daha yüksek varyasyonlara (0,22'nin altındaki korelasyonlar) sahipti. Çoğaltmalar aynı FFPE bloklarından kesilen iki farklı doku buklesinden RNA çıkarılarak oluşturulduğundan, doku yaşı buradaki yüksek varyansta bir faktör değildi ve büyük olasılıkla farklı miktarda bakteriyel kontaminasyondan (%1-55) kaynaklandı. yanı sıra farklı mRNA içeriği (2-3 kat fark) çoğaltmalar arasında. Ekstraksiyon sonrası mRNA bozulmasının rasgeleliği de benzer kökenli örnekler arasındaki daha yüksek varyansa katkıda bulunabilir.
Şekil 1: RNaseq analizi iş akışı. Akış şeması, ön işleme, kalite değerlendirmesi, referansharitalama, gen nicelemesi ve farklı örneklem grupları arasındaki diferansiyel analiz için analiz adımlarını açıklar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Örnek Biyoanalizör altı farklı FFPE-RNA örneğinin izleri. Yatay eksen moleküler ağırlığı (bp) ve floresan birimlerini (FU) gösterir ve dikey eksen farklı büyüklükteki parçaların konsantrasyonu gösterir. RNA Bütünlük Numaraları (RIN), DV200 (yani, parçaların yüzdesi >200 bp) ve DV100 (yani, parçaların yüzdesi >100 bp) değerleri her profilde gösterilir. Her profilde 25 bp tepe moleküler ağırlık belirteci gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Örnek Biyoanalizör dört farklı örnekten hazırlanan son kütüphanelerin izleri. Yatay eksen, dikey eksendeki molekül ağırlığını (bp) ve floresan birimlerini (FU) gösterir ve farklı büyüklükteki parçaların konsantrasyonuna işaret eder. Alt (35 bp veya 50 bp) ve üst (10.380 bp) marker zirveleri sırasıyla yeşil ve mor olarak etiketlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Qc sonuçlarının ön işlenmesi için örnek çoklu QC raporu. (A) Tüm sıralamanın Q30 tabanlarının yüzdelerini gösteren çizgi grafiği her örnekte okur. (B) Ham fastq dosyalarında adaptör içeriği sıralama. (C) Kontaminasyon ekranı yakından eşleşen türleri kontrol etmek için. (D) Genom haritalama istatistikleri. (E) Gencode gen ek inedayalı dağılım okuyun. (F) Gen gövdesi/transkript kapsamı Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Örnek grup konkordatosu göstermek için örnek PCA analizi. Biyolojik kopyalar için PCA analizi. PcA çizim örnekleri ilk iki ana bileşenleri üzerine projeksiyonları kullanarak iki boyutlu çizilmiş. Biyolojik kopyalar aynı renkte gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnek sayısı | Lib prep için Ortanca Giriş (ng) | Ortanca RIN | Ortanca DV200 | Ortanca DV100 | Ortanca Lib boyutu (bp) | Ortanca Lib verimi (ng) | Ortanca Lib Molarity (nM) | Ortanca Numune depolama süresi (Yıllar) | Ortanca % kontaminasyon | Ortanca Gen Sayısı | |
| DV100 <%40 | 7 | 237.6 | 2.5 | 6 | 34 | 445 | 24.5 | 7 | 22 | 27.4 | 14,759 |
| DV100 40-60% | 27 | 1000 | 2.5 | 12 | 51 | 408 | 19.8 | 5.9 | 18 | 9.9 | 10,202 |
| DV100 >%60 | 19 | 1000 | 2.3 | 26 | 73 | 355 | 84.9 | 24 | 13 | 3.2 | 9,993 |
Tablo 1: Örnek kümesi QC ölçümlerinin özeti. Tablo, dv100 değerlerine göre gruplanan örneklerin QC ölçümlerini gösterir. Her gruptaki örnek sayısı listelenir ve her bir metrik için ortanca değerler gösterilir.
Ek Tablo: Analiz yazılım araçları, parametreler ve yazılım başvurusu. Tablo, RNA-seq analizinin her adımında kullanılan analiz yazılım araçlarını ve parametrelerini listeler. Yazılım aracı başvuruları tabloda listelenir. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntem FFPE-RNA örneklerinden iyi sıralı veri elde etmek için gereken ana adımları özetlemektedir. Bu yöntemle göz önünde bulundurulması gereken başlıca noktalar şunlardır: (1) Numune işleme ve donma ve çözülme döngüleri en aza indirilerek ekstraksiyondan sonra RNA'nın mümkün olduğunca iyi korunduğundan emin olun. Ayrı QC aliquots çok yararlıdır. (2) Verilen örnek kümesi için en iyi olan QC metrik kullanın. RIN değerleri ve DV200 genellikle bozulmuş numuneler için yararlı değildir ve DV100 belirli bir numune kümesindeki kaliteyi değerlendirmek için tercih edilen metrik olabilir. (3) Daha bozulmuş numuneler için, yüksek örnek girişi kullanmak en iyisidir. Daha yüksek girdi miktarları, son kitaplıkta daha iyi çeşitlilik ve daha düşük yinelemeye yol açarak veri kalitesinin artmasına yol açar. FFPE-RNA örneklerindeki tüm RNA enzimatik proseslerde yüksek bozulma ve kırılma nedeniyle kullanılabilir olmadığından, bu etkiler FFPE-RNA'da taze dondurulmuş RNA'ya göre daha belirgindir. (4) Oligo-dT veya belirli dizilerin astar olarak kullanılmasının aksine ters transkripsiyon adımı için rasgele astar kullanın. Belirli problar kümesi tüm ilgi verici transkriptler için mümkün olduğunca çok sırayı kapsayamadığı sürece, rasgele astarlar, maksimum sayıda transkriptin (veya bunların parçalarının) cDNA'ya dönüştürülmesini sağlamak için güvenli bir bahistir. Bu nedenle, toplam RNA kitaplık hazırlama yöntemleri, poli-A kuyruklarının varlığına dayanan mRNA yöntemlerine göre bozulmuş örnekler için daha yararlıdır. (5) Kütüphanelerin nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) ile doğru bir şekilde ölçülmesi, sıralayıcıların düşük performansveya aşırı yüklenmesinden kaçınmak için önemlidir. (6) RNA'nın potansiyel kontaminasyonunu RNA-Seq QC protokollerinin standart posta sıralamasının bir parçası olarak değerlendirin. FfPE numuneleri depolama koşulları ve numune hazırlama prosedürleri nedeniyle bakteriyel kontaminasyon ve genomik DNA kontaminasyonu yaygındır. Yabancı türlerle kontamine olmuş numuneler, kontaminasyonun kapsamına bağlı olarak sıralama kapsamını boşa harcayabilir. Buna ek olarak, iç kontaminasyon eksik rRNA tükenmesi kaynaklanabilir, rRNA'lar için okuma haritalama yüksek bir yüzdesi yol açan. DNase sindirim sırasında verimsiz genomik DNA çıkarılması transkript yanlış pozitif ifade algılama veya transkript hatalı de novo montaj yol açabilir. Kütüphane hazırlama sırasında ortaya çıkan adaptör kontaminasyonu, çok kısa RNA parçalarına sahip yüksek oranda bozulmuş RNA'lar için de yaygın bir sorundur. Kontaminasyon gen ve transkript profilleme doğruluğunu etkileyebilir ve yanlış keşfe yol açabilir. Bu nedenle, numune veya kitaplık hazırlama adımları sırasında kontaminasyon kaynaklarını doğru bir şekilde tanımlamak ve mümkünse kontaminasyonu kaldırmak veya veri işleme adımı sırasında kirletici okumaları filtrelemek önemlidir. (7) Kötü kalite ve düşük mRNA içerik örneklerini tespit etmek için ön işleme ve hizalama sonrası kalite kontrolü önemlidir. Bu numuneler daha ileri analizlerden çıkarılmalıdır. Düşük gen sayımları üreten örneklerden alınan gen ekspresyonu verileri, zayıf kapsama alanı dikkatli kullanılmalıdır. (8) Veri tekrarlanabilirliğini sağlamak için numune varyans ve korelasyon ölçmek için biyolojik çoğaltmalar dahil etmek iyi bir uygulamadır.
FFPE örnekleri çok sayıda hastalık için çok değerli bir kaynak tır. Bu tür örneklerden güvenilir sıralı bilgi elde etme becerisi, çeşitli bozuklukların, direncin ve duyarlılığın arkasındaki moleküler mekanizmaları anlamaya yönelik pek çok çalışmaya yardımcı olacaktır. Bu tür örneklerden çıkarılan RNA'nın sık lıkla en uygun olmayan kalitesinin dayattığı sınırlamalar bu tür çabaları engellese de, burada açıklanan adımlar bu sınırlamaları bir dereceye kadar azaltmaya ve güvenilir gen ekspresyonu bilgilerini elde etmek için FFPE-RNA'dan en iyi şekilde yararlanmak için bize yardımcı ol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu çalışma Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından finanse edilmiştir. Leidos Biyomedikal Araştırma, Inc tamamen NIH tarafından finanse edilmektedir Frederick Ulusal Kanser Araştırma Laboratuvarı için operasyon ve teknik destek yüklenici. Çeşitli yazarlar (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) Leidos Biyomedikal Araştırma, Inc bağlı, ancak tüm yazarlar tamamen ulusal kanser enstitüsü tarafından yazarların maaşları ve araştırma malzemeleri de dahil olmak üzere finanse edilmektedir. Leidos Biyomedikal Araştırma, Inc yazarlar (YZ, MM, KT, YL, JS, BT) veya çalışma için malzeme için maaş vermedi, ne de çalışma tasarımı, veri toplama, analiz, karar yayınlamak veya el yazması hazırlanmasında herhangi bir rolü yoktu.
Acknowledgments
Biz Dr Danielle Carrick için müteşekkiriz (Kanser Kontrol ve Nüfus Bilimleri Bölümü, Ulusal Kanser Enstitüsü) sürekli yardım için, özellikle bu çalışmanın başlatılması için, örnekleri bize sağlayan, ve veri analizi sırasında yararlı öneriler için. Biz içtenlikle örnek hazırlama ve sıralama sırasında yardım için Frederick Ulusal Kanser Araştırma Laboratuvarı'nda CCR Sıralama Tesisi tüm üyelerine teşekkür, örnek QC yardım için özellikle Brenda Ho, oksana Almanca kütüphane QC, Tatyana Smirnova sıralayıcılar çalıştırmak için. Ayrıca Tsai-wei Shen ve Ashley Walton Sıralama Tesisi Biyoinformatik Grubu'nda veri analizi ve RNA-seq boru hattı uygulaması ile yardımcı olmak için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca CCBR ve NCBR'ye RNaseq analiz boru hattı ve en iyi uygulamaların geliştirilmesi ile ilgili yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Agilent DNA 7500 Kit | Agilent | 5067-1506 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | |
| CFX96 Touch System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Library Quantification kit v2-Illumina | KapaBiosystems | KK4824 | |
| NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7765S | https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit |
| NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) | New England Biolabs | E6310L | |
| NextSeq 500 Sequencing System | Illumina | SY-415-1001 | NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf |
| NextSeq PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3002 | |
| NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS) | Illumina | 20024907 | |
| 10X Genomics Magnetic Separator | 10X Genomics | 120250 | |
| Rotator Multimixer | VWR | 13916-822 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
| Sequencing reagent kit | Illumina | 20024907 | |
| Flow cell package | Illumina | 20024907 | |
| Buffer cartridge and the reagent cartridge | Illumina | 20024907 | |
| Sodium hydroxide solution (0.2N) | Millipore Sigma | SX0607D-6 | |
| TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0 | Fisher Scientific | 50-151-871 |
References
- Carrick, D. M., et al. Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue. PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).
- Hedegaard, J., et al. Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue. PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).
- Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA quality from FFPE samples. PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).
- Esteve-Codina, A., et al. A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples. PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).
- Vukmirovic, M., et al. Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Sinicropi, D., et al. Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue. PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).
- Altekruse, S. F., et al. SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).
- Zhao, Y., et al. Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas. PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma. Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).
- Wimmer, I., et al. Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples. Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).
- Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2019).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/ (2019).
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), 46 (2014).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Broad Institute. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2019).
- Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Li, B., Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
- Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data. BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).
- McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Mootha, V. K., et al. PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes. Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).
- Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina. , Available from: https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf (2016).
