Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

فيروس البطاطا X القائم على إسكات الحمض النووي الريبي الدقيق (VbMS) في البطاطا.

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

نقدم بروتوكولا مفصلا لنظام إسكات الحمض النووي الريبي المصغر (VbMS) القائم على فيروس البطاطس (PVX) لتوصيف الحمض النووي الريبي الداخلي (miRNAs) وظيفيا في البطاطا. يتم دمج جزيئات محاكاة الهدف (TM) من ميرنا ذات الأهمية في ناقل PVX ويتم التعبير عنها بشكل عابر في البطاطا لإسكات عائلة ميرنا أو ميرنا المستهدفة.

Abstract

إن إسكات الحمض النووي الريبي الدقيق القائم على الفيروسات (VbMS) هو أداة سريعة وفعالة لتوصيف وظيفي للرنانات الدقيقة (ميرناس) في النباتات. وقد تم تطوير وتطبيق نظام VbMS لمختلف الأنواع النباتية بما في ذلك نيكوتيانا بنثاميانا والطماطم وأرابيدوس والقطن ونباتات المونوكوت مثل القمح والذرة. هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل باستخدام ناقلات VbMS المستندة إلى PVX لإسكات ميرناس الذاتية في البطاطا. لهدم التعبير عن ميرنا محددة، يتم تصميم جزيئات محاكاة الهدف (TM) من ميرنا من الفائدة، ودمجها في ناقلات الفيروس النباتي، وأعرب في البطاطا عن طريق تسلل Agrobacterium لربط مباشرة إلى ميرنا الذاتية من الفائدة ومنع وظيفتها.

Introduction

وتتميز الرنانات الدقيقة النباتية (ميرناس) بأنها 20-24 النيوكليوتيدات طويلة، الحمض النووي المشفرة RNAs1 وتلعب أدوارا أساسية في كل جانب تقريبا من العمليات البيولوجية النباتية، بما في ذلك النمو والتنمية2،3، التمثيل الضوئي والتمثيل الغذائي4،5،6،7، توليف الهرمونات و signaling8،9، الاستجابات الحيوية والأحيائية10، 11,12,13، وتنظيم المغذيات والطاقة14,15. الأدوار التنظيمية لل ميرناس النبات مبرمجة بشكل جيد ويتم الوفاء بها عادة على مستويات ما بعد النسخ إما عن طريق شق أو قمع الرنانات المستهدفة.

وقد أحرز تقدم هائل نحو تحديد الهوية، والتنميط النسخي، والتنبؤ المستهدف بال ميرناس في البطاطا16,17,18,19,20,21. غير أن التوصيف الوظيفي لل ميرناس في النباتات، بما في ذلك البطاطا، قد تخلف عن الكائنات الحية الأخرى بسبب عدم وجود نهج جينية فعالة وعالية الإنتاجية. من الصعب إجراء تحليل وظيفي ل miRNA الفردية من خلال تحليل فقدان الوظيفة القياسي ، لأن معظم الحمض النووي الريبي ينتمي إلى عائلات لديها تكرار وراثي كبير22. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ل ميرنا واحدة التحكم في الجينات المستهدفة المتعددة23 ويمكن للعديد من ميرناس مختلفة تعديل نفس المسار الجزيئي بشكل تعاوني2425. هذه الخصائص تجعل من الصعب توصيف وظيفة ميرنا محددة أو عائلة ميرنا.

وقد اعتمد الكثير من التحليل الوظيفي لل ميرناس اعتمادا كبيرا على نهج تحقيق مكاسب في الوظائف لها حدود واضحة. وتستغل طريقة ميرنا الاصطناعية (amiRNA) النصوص الأولية الذاتية (pri-miRNAs) لإنتاج الحمض النووي الريبي على مستوى عال، مما يؤدي إلى تثبيط التعبير الجيني المستهدف26,27,28,29. ومع ذلك ، فإن وضع علامات التنشيط والتعبير المفرط عن ميرنا باستخدام مروج قوي مكون ل 35S غالبا ما يؤدي إلى زيادة التعبير عن ميرناس التي لا تمثل في ظروف الجسم الحي وبالتالي قد لا تعكس الوظيفة الذاتية ل miRNAs30. وقد تم تطوير نهج بديل يتضمن التعبير عن أشكال مقاومة للجينات المستهدفة التي تحتوي على طفرات غير قابلة للعمومية في مواقع الربط و / أو الانقسام31,32,33. ولكن هذا النهج يمكن أن يسبب أيضا سوء تفسير النمط الظاهري المستمدة من المتحولين جنسيا الهدف مقاومة ميرنا بسبب التحف المعدلة وراثيا. ولذلك، ينبغي استخلاص استنتاجات من هذه الدراسات المتعلقة بمكاسب الوظائف بحذر34. وثمة قيد رئيسي آخر على النهج المذكورة أعلاه هو أنها تتطلب التحول، وهو يتطلب عمالة كثيفة ويستغرق وقتا طويلا. وعلاوة على ذلك، فإن النهج المعتمدة على التحول لا تكاد تنطبق على الأنواع النباتية المحولة. ولذلك، من الضروري تطوير نهج سريع وفعال لفقدان الوظيفة لكشف وظيفة الميرناس.

لتجاوز الشرط الأساسي لإجراء التحويل، تم إنشاء إسكات الحمض النووي الريبي الدقيق القائم على الفيروسات (VbMS) من خلال الجمع بين استراتيجيات محاكاة الهدف (TM) مع ناقلات مشتقة من الفيروس. في نظام VbMS ، يتم التعبير عن جزيئات TM المصممة اصطناعيا بشكل عابر من العمود الفقري للفيروس ، مما يوفر أداة قوية وعالية الإنتاجية وتوفير الوقت لتشريح وظيفة miRNAs35،36 النباتية الذاتية. تم تطوير VbMS في البداية في N. بنتاميانا والطماطم مع فيروس حشرجة التبغ (TRV)35,36,37 وتم توسيع نطاقه ليشمل أرابيدوسيس والقطن والقمح والذرة باستخدام مختلف أنظمة التعبير عن الفيروسات الأخرى، بما في ذلك فيروس البطاطس X (PVX)38، فيروس فتات أوراق القطن (ClCrV)39، فيروس فسيفساء الخيار (CMV)40,41,42، فيروس فسيفساء القمح الصيني (CWMV)43 ، والشعير شريطية فيروس الفسيفساء (BSMV)44,45.

البطاطا (سولانوم أنبوبي) هو رابع أهم محصول غذائي والمحاصيل غير الcereal الأكثر زراعة على نطاق واسع في العالم أساسا بسبب قيمته الغذائية العالية، وإنتاج الطاقة العالية، ومتطلبات المدخلات منخفضة نسبيا46. العديد من ميزات البطاطا جعلها جذابة dicotyledonous نموذج النبات. وهو محصول متعدد الأضلاع ينتشر بشكل نباتي مع معدل تجاوز عال ، والهتيريوزيجوستي ، والتنوع الوراثي. ومع ذلك، حتى الآن، لا يوجد أي تقرير يميز وظيفة ميرناس في البطاطا باستخدام VbMS. هنا، نقدم استنساخ مستقل الربط (LIC) تكييفها البطاطا PVX القائم على نهج VbMS لتقييم وظيفة ميرناس في نباتات البطاطا38. اخترنا عائلة miR165/166 لتوضيح المقايسة VbMS لأن عائلة miR165/166 وmRNAs المستهدفة والفئة الثالثة homeodomain / ليو سستة (HD-ZIP III) تم وصف عوامل النسخ على نطاق واسع22,47,48. الجينات HD-ZIP III هي المنظمين الرئيسيين لتطوير meristem والقطبية الجهاز، وقمع وظيفة miR165/166 يؤدي إلى زيادة التعبير عن الجينات HD-ZIP III، مما أدى إلى عيوب النمو الجنبي مثل انخفاض الهيمنة apical وأنماط شاذة من قطبية ورقة22،35،38،41 . الأنماط الظاهرية التنموية القابلة للتشقيم بسهولة المرتبطة بإسكات miRNA165/166 تمكن من التقييم الدقيق لفعالية فحص VbMS القائم على PVX.

في هذه الدراسة، ونحن نثبت أن نظام VbMS المستندة إلى PVX يمكن أن تمنع بشكل فعال وظيفة ميرناس في البطاطا. ونظرا لأن نظام إسكات الجينات الناجم عن الفيروسات الكهروضوئية قد أنشئ في عدد من أصناف البطاطا49,50,51,52، فمن المرجح أن يطبق هذا النهج القائم على ال PVX VbMS على مجموعة واسعة من أنواع البطاطا ثنائية الديبلويد والتترابلويد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. زراعة نباتات البطاطا.

  1. نشر في النباتات البطاطا المختبر في أنابيب زراعة (25 × 150 ملم) مع وسائل الإعلام Murashige وسكوغ (MS) بالإضافة إلى فيتامين جامبورغ (MS خليط الملح القاعدي، فيتامين جامبورغ، 30 غرام / لتر السكروز، 3.5 غرام / لتر أجار، pH = 5.7). ضع الأنابيب في غرفة النمو تحت 20-22 درجة مئوية، و16 ساعة ضوء / 8 ساعة من الضوء الداكن، وشدة الضوء 120 ميكرومول /م2∙s1.
    ملاحظة: يطلق النار جديدة والجذور تتطور عادة في 1-2 أسابيع من النباتات. نشر النباتات مع وسائل الإعلام الطازجة MS / Gamborg فيتامين كل شهر.
  2. بعد أربعة أسابيع، زرع النباتات في المختبر في التربة وتنميتها في الدفيئة تحت 20-22 درجة مئوية، 16 ساعة ضوء / 8 ساعة photoperiod الظلام، وكثافة الضوء 120 ميكرومول / m2∙ s1.
    ملاحظة: النباتات ذات الجذور والأوراق المطورة حديثا مناسبة للزراعة. حافظ على رطوبة النباتات المزروعة حديثا لأول 3-4 أيام.

2. بناء ناقلات VbMS.

  1. تصميم واستنساخ جزيئات TM الترادف قصيرة (STTM، الشكل 1)22،53 ل ميرنا من الفائدة.
    ملاحظة: الحصول على تسلسلات ميرنا استنادا إلى البيانات التجريبية أو من قاعدة بيانات miRbase54,55,56,57,58,59. وقد تم وصف تسلسل miR166 المستخدمة في هذه الدراسة سابقا60.
    1. تصميم وحدة TM عن طريق إدراج تسلسل عدم التطابق، عادة 5'-CTA-3'، في تسلسل تكملة عكسية من ميرنا في الموقع المقابلة للنيوكليوتيدات 10-11 من ميرنا.
      ملاحظة: على سبيل المثال، تسلسل ستو-miR160 هو 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61، حيث النيوكليوتيدات 10-11th في جريئة. تسلسل تكملة عكسية (في deoxynucleotides) هو 5'-GGCATACAGGAGCCAGGCA-3 'ويظهر موقع الإدراج انتفاخ عدم التطابق في جريئة. تسلسل جزيء TM (deoxynucleotide) يجب أن يكون 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.
    2. تهيئة التصميم لاستنساخ جزء STTM (الشكل 1). استخدام أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي مع تسلسل فاصل 48-nt كقالب لاستنساخ PCR. يتكون التمهيدي الأمامي من رابط LIC1 (5'CgACgACAAGACCgT-3')، والتسلسل الأمامي لما سبق المصمم لجزيء TM، والتسلسل الجزئي 5 لفواصل 48-nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). التمهيدي العكسي يتكون من رابط LIC2 (5'gAggAgAagAgCCgT-3')، وتسلسل المكمل العكسي لجزيء TM، ومكمل عكسي جزئي لتسلسل 3 من المتباعد 48-nt (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3').
      ملاحظة: تسلسل المسافة 48-NT هو 5'-GTTGTTGTTGTGGTCTAATATATATATTAAGAAGAAGAAGAAT-3'. على سبيل المثال، بالنسبة إلى STTM-miR160، يجب أن يكون التمهيدي الأمامي 5'-CgACgACAAGACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'؛ يجب أن يكون التمهيدي العكسي 5'-gAggAgAagCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTTCTTTAGACCAT-3' (الشكل 1).
    3. تضخيم جزء STTM في حجم 50 ميكرولتر بواسطة PCR باستخدام المركب العالمي المركب 48-nt كقالب وبلمرة الحمض النووي عالية الدقة.
      1. إعداد رد فعل PCR عن طريق خلط 0.5 ميكرولتر من كل التمهيدي (40 ميكرومتر)، 0.5 ميكرولتر من أوليغو المسافة 48-nt (40 ميكرومتر)، 5 ميكرولتر من 10x PCR العازلة، 1 ميكرولتر من خليط dNTP (10 mM لكل منهما)، 0.1 ميكرولتر من بوليمرات الحمض النووي عالية الدقة (10 U/μL)، و 43 ميكرولتر من ddH2O إلى حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر. تنفيذ تضخيم PCR القياسية على النحو التالي: 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 32 دورة من 94 درجة مئوية ل45 s، 60 درجة مئوية ل 45 s و 72 °C لمدة 60 s.
    4. تنقية جزء STTM عن طريق هطول الأمطار الإيثانول. إضافة 2.5 مجلدات من الإيثانول وحجم 1/10 من خلات الصوديوم 3 M (pH = 4.0) لمنتجات PCR. اخلط بقوة واطرد المركزي بسرعة 14,000 × غرام لمدة 10 دقائق. إزالة supernatant وشطف بيليه مع 1 مل من الإيثانول 70٪. جفف الكريات وحلها في 20 ميكرولتر من ddH2O.
      ملاحظة: استخدام التحليل الكهربائي الحمض النووي للتحقق من تضخيم منتجات PCR STTM.
    5. إعداد تفاعل بوليمرات الحمض النووي T4 على الجليد عن طريق خلط 2.5 ميكرولتر من منتج STTM PCR المنقى، 0.5 ميكرولتر من 10x T4 DNA polymerase العازلة، 0.05 ميكرولتر من 1 M dithiothreitol (DTT)، 0.25 ميكروغرام من 100 mM dATP، 0.1 ميكرولتر من بوليمرات الحمض النووي T4 (3 U/μL)، و 1.6 ميكرولتر من ddH2O إلى حجم إجمالي قدره 5 ميكرولتر. وعلاج المنتجات في 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتثبيط البوليمرات الحمض النووي T4.
  2. تحضير بناء VbMS المستندة إلى PVX.
    1. هضم 5 ميكروغرام من PVX-LIC plasmid38 مع 2.5 ميكرولتر من SmaI (20 U/μL) في حجم 100 ميكرولتر.
    2. إضافة حجم متساو من الفينول: الكلوروفورم:ايزوبروبانول (25:24:1، درجة الحموضة = 6.7/8.0) إلى المنتجات المهضومة PVX-LIC وتخلط بقوة. جهاز الطرد المركزي في 14،000 x ز لمدة 10 دقيقة ونقل supernatant إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد. إضافة حجم متساو من الكلوروفورم: ايزوبروبانول (24:1) ودوامة بقوة. جهاز طرد مركزي عند 14,000 × غرام لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: المتجه PVX-LIC يأوي كاسيت LIC للاستنساخ. ويحتوي شريط LIC الخاص بناقل PVX-LIC على جين ccdB وجين مقاوم للكلورامفينيكول ويحتاج إلى الحفاظ عليه / نشره في سلالة الإشريكية القولونية DB3.1 باستخدام وسيط LB يحتوي على كاناميسين (50 ميكروغرام/لتر) وكلورامينيكول (15 ميكروغرام/لتر).
    3. نقل supernatant إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد. إضافة 2.5 كميات من الإيثانول وحجم 1/10 من خلات الصوديوم 3 M (pH = 4.0) وتخلط بقوة. الطرد المركزي في 14،000 × ز لمدة 10 دقيقة وإزالة supernatant.
    4. شطف بيليه مع 1 مل من الإيثانول 70٪ ودوامة بقوة. الطرد المركزي في 14،000 × ز لمدة 10 دقيقة وإزالة supernatant. جفف الكريات وحل البلازميد PVX-LIC المهضوم مع 100 ميكرولتر من ddH2O.
    5. إعداد تفاعل بوليمرات الحمض النووي T4 على الجليد عن طريق خلط 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي الناقل PVX-LIC المهضوم ، 0.5 ميكرولتر من 10x T4 الحمض النووي البوليمر العازلة ، 0.05 ميكرولتر من 1 M DTT، 0.25 ميكرولتر من 100 mM dTTP، و 0.1 ميكرولتر من T4 دي إن ايه بوليمراسي (3 U/μL) في حجم إجمالي قدره 5 ميكرولتر. احتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وعلاج المنتجات في 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة إلى تعطيل بوليمرات الحمض النووي T4.
  3. استنساخ تسلسل STTM في ناقلات PVX-LIC باستخدام رد فعل LIC. اخلط منتجات STTM PCR المعالجة بالبوليميراز الحمض النووي T4 (5 ميكرولتر) وبوليميراز الحمض النووي T4 المعالجة ب PVX-LIC plasmids (5 ميكرولتر). احتضان في 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تبرد إلى 22 درجة مئوية على منحدر من 0.1 درجة مئوية / ثانية، والحفاظ على 22 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام جهاز PCR.
    ملاحظة: تمديد فترة الحضانة إلى ليلة واحدة عند 4 درجات مئوية لتحقيق كفاءة أعلى في استنساخ LIC.
  4. تحويل 5 ميكرولتر من منتجات رد فعل LIC إلى DH5α الإشريكية القولونية وتنمو على لوحة LB تحتوي على 50 ميكروغرام / مل kanamycin62,63. اختيار والتحقق من المستعمرات الإيجابية بواسطة PCR مع التمهيديات الاستنساخ والتمهيدي العالمي لنقل PVX-LIC تليها التسلسل.
    1. تنفيذ PCR مستعمرة مع التمهيدي الأمامي لPVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') في تركيبة مع التمهيدي العكسي لاستنساخ STTM لتحديد استنساخ إيجابية. يجب أن يكون حجم النطاق PCR ~ 300 bp.
      ملاحظة: تحقق من تسلسلات أجزاء STTM بواسطة terminator دورة التسلسل64,65.
  5. عزل البلازميدات PVX-STTM من المستنسخين التحقق من صحة وتحويلها إلى سلالات Agrobacterium GV3101، GV2260، أو EHA10562،63. تحقق من مستعمرات البكتيريا الزراعية بواسطة PCR.
    ملاحظة: تأكيد مستعمرات Agrobacterium بواسطة PCR باستخدام التمهيدي الأمامي ل PVX-LIC والتمهيدي العكسي لاستنساخ STTM.

3. أداء الكهروضوئية المستندة إلى VbMS المقايسة في نباتات البطاطا.

  1. زرع 4 أسابيع من العمر في نباتات البطاطا المختبرية في التربة. ستخضع النباتات المزروعة ل المقايسة VbMS بعد 3-4 أيام.
  2. تلقيح نباتات البطاطا مع Agrobacterium التي تحتوي على البلازميدات PVX-STTM.
    ملاحظة: بالنسبة إلى المقايسة VbMS في البطاطا، يتم إجراء تسلل بوساطة Agrobacterium والتلقيح بالحكة المسواك في وقت واحد.
    1. اختيار وتطعيم المحولات الإيجابية التي تحتوي على ناقلات PVX-STTM إلى 50 مل من LB السائل الذي يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين و 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين. تنمو في حاضنة 28 درجة مئوية في 220 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة حتى OD600 = 1.0.
    2. في الوقت نفسه، خط المستعمرات Agrobacterium إيجابية على ما لا يقل عن اثنين من لوحات LB جديدة تحتوي على 50 ميكروغرام / مل kanamycin و 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين وتنمو في 28 درجة مئوية لمدة يوم واحد. وتشمل ناقلات PVX-LIC38,66 كعنصر تحكم وPVX-GFP67,68 لرصد انتشار الفيروس.
    3. جمع الزراعية البكتيريا السائلة الثقافة عن طريق الطرد المركزي في 3400 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. Resuspend Agrobacterium الخلايا مع حجم متساو من العازلة التسلل (10 M MgCl2، 10 MM MES، و 200 ميكرومتر acetosyringone، درجة الحموضة = 5.6) والتكيف مع OD600 = 1.0. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعة.
    4. التسلل إلى ثقافة Agrobacterium في الجانب abaxial من أوراق موسعة بالكامل مع حقنة إبرة 1 مل.
      1. الوجه وعقد ورقة بيد واحدة، ثم استخدام إصبع واحد لدعم ورقة الصفيحة من الجانب adaxial في موقع التسلل. الحفاظ على حقنة عمودية إلى سطح ورقة مع اليد الأخرى والتسلل إلى ثقافة Agrobacterium في الجانب abaxial من الصفيحة.
    5. كشط ثقافة Agrobacterium من لوحات LB وخدش السطح الجذعي لأول واحد أو اثنين من internodes من نباتات البطاطا المتسللة مع مسواك. خدش بلطف البشرة من الجذعية. تجنب ثقب من خلال الجذعية, التي قد تسبب ضررا بالغا للنباتات.
  3. زراعة النباتات المتسللة في 22 درجة مئوية مع 16 ساعة ضوء / 8 ساعة ضوء الظلام وكثافة الضوء من 120 ميكرومول / م2 ∙ s1 في الدفيئة.
    ملاحظة: تظهر الأنماط الظاهرية الناجمة عن إسكات ميرنا عادة في فترة ما بعد الطمث لمدة أسبوعين إلى أربعة أسابيع (الشكل 2، الشكل 3). عادة ما يستغرق 10-20 يوما للنمط الظاهري VbMS لتظهر بعد التسلل. يعتمد النمط الظاهري ل VbMS على خصائص الحمض النووي الريبي المحدد والجينات المستهدفة وظروف النمو وأصناف البطاطا.

4. إجراء تحليل التعبير.

  1. عندما تظهر الأنماط الظاهرية في 2-4 أسابيع بعد التشكيل، وجمع الأنسجة مثل يطلق النار، وأوراق الشجر، والزهور، أو جذور مع الأنماط الظاهرية من النباتات والأنسجة VbMS من النباتات السيطرة مع مقص. عزل إجمالي الرنانات من الأنسجة التي تم جمعها.
  2. تحقق من جودة الحمض النووي الريبي عن طريق الكهربائي62,63 وتحديد تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق قياس امتصاص OD260 مع مطياف.
  3. استخدام الجذعية حلقة في الوقت الحقيقي النسخ العكسي PCR (RT-PCR) لتحليل التعبير ميرنا.
    1. بالنسبة إلى ال ميرناس محددة، قم بتصميم التمهيدي النسخ العكسي حلقة الجذعية. Stem-loop RT التمهيديات تحتوي على العمود الفقري العالمي 5 'و3 '6-nt تمديد ميرنا محددة. تصميم العمود الفقري العالمي 5 '(5'- GTCTCCTCTGGGGggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') التي تشكل بنية الجذعية حلقة. (يتوافق الحالة العليا مع تسلسل عكسي متكررة والأحرف السفلية إلى منطقة الحلقة).
    2. جزء من تسلسل العمود الفقري 5 'التي تشكل حلقة بمثابة التمهيدي العكسي لتضخيم PCR اللاحقة (تسلسل الخط المائل الغامق في تسلسل العمود الفقري). إضافة تسلسل تمديد 6-NT التي هي عكس مكملة لنهاية 3 'من ميرنا من الفائدة إلى التمهيدي الجذعية حلقة لتوفير خصوصية للنسخ العكسي (الشكل التكميلي 1A).
      ملاحظة: تصميم التمهيدي النسخ العكسي حلقة الجذعية كما هو موضح من قبل تشن وآخرون.69 وإريكا فاركونيي-Gasic وآخرون.70,71,72. على سبيل المثال، تم تصميم التمهيدي النسخ العكسي حلقة الجذعية لSt ستو-miR160 كما 5'-GTCTCCTCTGGTGGGgtccgaggtattcGCACCAGAAGAGCATA-3'. تم تصميم التمهيدي النسخ العكسي حلقة الجذعية للأسرة البطاطا miR165/166 كما 5'-GTCTCCCTCTGGTGGggtccgaggtattcGCAGAAGAGGGGGG (A/G)A-3'. (توفر التسلسلات الكبيرة الجريئة خصوصية النسخ العكسي ل miRNAs محددة).
    3. إعداد رد فعل النسخ العكسي عن طريق خلط 50-200 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي، 1 ميكرولتر من التمهيدي النسخ العكسي للحلقة الجذعية (100 ميكرومتر)، 2 ميكرولتر من 10x العازلة، 0.2 ميكرولتر من مثبط RNase (40 U/μL)، 0.25 ميكرولتر من dNTPs (10 مللي متر لكل منهما)، و 1 ميكرولتر من النسخ العكسي (200 U/μL) على الجليد. إضافة ddH2O خالية من النوى إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر.
    4. إجراء النسخ العكسي باستخدام إجراء النسخ العكسي النابض. احتضان خليط التفاعل النسخ العكسي في 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وإجراء دورة درجة حرارة 30 درجة مئوية لمدة 30 s، 42 °C لمدة 30 s و 50 °C لمدة 1 s، لما مجموعه 60 دورة، وتعطيل النسخ العكسي عن طريق الحضانة في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. لتحليل PCR في الوقت الحقيقي للتعبير ميرنا، تصميم التمهيدي إلى الأمام على أساس تسلسل ميرنا ولكن لا تشمل التسلسلات التي تتداخل مع التمهيدي النسخ العكسي حلقة الجذعية المصممة أعلاه. إضافة ملحق 3-7-NT إلى 5 ' من التمهيدي الأمامي لتحسين الطول ودرجة الحرارة ذوبان، ومحتوى GC (الشكل التكميلي 1).
      ملاحظة: التمهيدي العكسي العالمي هو 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. على سبيل المثال، تم تصميم التمهيدي النسخ العكسي حلقة الجذعية لSt ستو-miR160 كما 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. التمهيدي النسخ العكسي حلقة الجذعية للعائلة miR165/166 هو 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. تسلسل جريئة بمثابة 5 'ملحقات لتحسين التمهيدي. يمكن تصميم التمهيديات النسخ العكسي حلقة الجذعية والتمهيدي PCR في الوقت الحقيقي لميرنا باستخدام أداة تصميم التمهيدي ميرنا73.
  4. توليف cDNAs من mRNAs الهدف بواسطة النسخ العكسي القياسي PCR (RT-PCR). احتضان خليط رد الفعل النسخ العكسي في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة وتعطيل النسخ العكسي عن طريق التدفئة إلى 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: (1) توقع mRNAs الهدف باستخدام البرنامج psRNATarget74 إذا لم تكن معروفة mRNAs الهدف. (2) التمهيدي النسخ العكسي العالمي ل mRNA هو التمهيدي الراسية 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'.
  5. إعداد رد فعل PCR في الوقت الحقيقي لكل من ميرنا من الفائدة ورنا الهدف. مزيج 0.5 ميكرولتر من قالب cDNA، 5 ميكرولتر من 2x في الوقت الحقيقي PCR العازلة مع الأخضر SYBR، 0.05 ميكرولتر من كل التمهيدي إلى الأمام وعكس (40 ميكرومتر)، و 4.4 ميكرولتر من ddH2O في حجم إجمالي قدره 5 ميكروغرام على الجليد.
  6. حضانة في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 3 ق و 60 درجة مئوية لمدة 30 s. إجراء تحليل منحنى ذوبان لاحق على النحو التالي: احتضان في 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، تبرد إلى 60 درجة مئوية على منحدر من 20 درجة مئوية / ثانية، والحفاظ على 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، والحرارة إلى 95 درجة مئوية على منحدر من 0.2 درجة مئوية / ثانية، والحفاظ على 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. تحليل قيم Ct باستخدام أساليب ΔΔCt76,77 ورسم الوسائل مع الأخطاء القياسية.
    ملاحظة: (1) يمكن تصميم التهيئة PCR في الوقت الحقيقي ل mRNAs الهدف كما هو موضح75. (2) البطاطا بوليوبيكيتين 10 الجينات يمكن أن تكون بمثابة مراقبة داخلية للتطبيع في البطاطا. التمهيدي الأمامي للجين البوليبيكيتين 10 البطاطا هو 5'-ATGTTGCCTCTCTGTGTGGTTG-3' والتمهيدي العكسي 5'-TTATTTATTCACAAAACGAGTTCAACC-3'. (3) لتحليل PCR في الوقت الحقيقي، قد التلوث وتشكيل التمهيدي ديمر توليد نتائج إيجابية كاذبة. لمراقبة التضخيم غير المحدد وزيادة مسؤولية تحليل PCR في الوقت الحقيقي ، يوصى بتضمين عناصر التحكم بدون قالب وعكس النسخ لمقايسات PCR في الوقت الفعلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 2 يظهر PVX-STTM165/166 نباتات البطاطا (كاتاهدين) مع النمو خارج الرحم من الأنسجة الورقية من الجانب abaxial من صفح ورقة على طول الأوردة. كما لوحظت أنماط ظاهرة أكثر حدة مثل تشكيل أوراق على شكل بوق. في المقابل، لم يلاحظ أي شذوذ فينوتيبيك في محطات التحكم PVX. وتبين هذه النتائج أن نظام VbMS كان فعالا في قمع وظيفة ميرنا الذاتية في نباتات البطاطا رباعية الأرجل وكان نظام PVX-VbMS أداة جينية قوية لتحديد وظيفة الميرناس المحددة أو أسر ميرنا.

الشكل 3 يظهر PVX-STTM165/166 نباتات البطاطا (Russet بوربانك) مع نمو الأنسجة ورقة خارج الرحم من الجانب abaxial من الصفيحة ورقة على طول الأوردة. وتبين هذه النتائج أن نظام PVX-VbMS يمكن تطبيقه على أنواع البطاطا الأخرى، بما في ذلك أصناف البطاطا الرئيسية.

Figure 1
الشكل 1: مخطط تخطيطي لمتجهات VbMS المستندة إلى PVX وبنية PVX-STTM165/166. LB = T-DNA الحدود اليسرى; RB = T-DNA الحدود اليمنى; 35S = القرنبيط فيروس الفسيفساء 35S المروج; NOST = نوبالين synthase المنهي; RdRP = RNA تعتمد على الحمض النووي الريبي البوليميراز; TGB1 = بروتين كتلة الجينات الثلاثية 1; TGB2 = بروتين كتلة الجينات الثلاثية 2; TGB3 = بروتين كتلة الجينات الثلاثية 3; SgP = PVX المروج الحمض النووي الريبي تحت السن؛ CP = بروتين معطف; LIC كاسيت = ربط مستقلة الاستنساخ كاسيت; 48 NT = 48 نوكليوتيد الكمال الجذعية حلقة الرابط. STTM165/166 يتكون من تسلسل TM جنبا إلى جنب من miR165/166 مفصولة تسلسل وصلة الجذعية حلقة ناقصة 48-nt. يشير رأس السهم الأخضر في المتجه PVX-LIC إلى موقع بدء RNA تحت الوراثي PVX الذي يضم تسلسل STTM. تشير الواصلات الثلاثية ناقص في تسلسل ميرنا إلى مواقع الانقسام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: VbMS من miR165/166 في البطاطا رباعية الأرجل متنوعة Katahdin. الأنماط الظاهرية لنباتات البطاطا (كاتاهدين) التي تعبر عن مكافحة ناقلات PVX أو PVX-STTM165/166. الأسهم الأرجوانية تدل على هياكل الأوراق المتولدة خارج الرحم في عروق الأوراق. يشير رأس السهم البرتقالي إلى هياكل أوراق تشبه البوق. أشرطة = 1 سم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: VbMS من miR165/166 في البطاطا رباعية البلوبيد متنوعة روسيت بوربانك. الأنماط الظاهرية لنباتات البطاطا (Russet Burbank) التي تعبر عن ناقل PVX كمكافحة أو PVX-STTM165/166. الأسهم الأرجوانية تدل على هياكل الأوراق المتولدة خارج الرحم في عروق الأوراق. أشرطة = 1 سم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: الرسوم التخطيطية لتحليل RT-PCR الحلقة الجذعية من ميرناس وتصميم التمهيدي PCR في الوقت الحقيقي. (أ) تحليل حلقة الجذعية RT-PCR من ميرناس. أثناء النسخ العكسي ، بدأ ربط التمهيدي الحلقي الجذعي إلى 3 'ميرنا النسخ العكسي وتم تصنيع cDNA. تم تضخيم منتجات PCR مع التمهيدي إلى الأمام محددة من ميرنا من الفائدة والتمهيدي العكسي العالمي. (ب) تصميم التمهيدي PCR في الوقت الحقيقي. يتم عرض التمهيديات الأمامية والعكسية ل Stu-miR160 وS ستو-miR165/166. تم تصميم التمهيدي الأمامي استنادا إلى تسلسل ميرنا ولكنه لم يتضمن تسلسلات تتداخل مع التمهيدي التصميم للنسخ العكسي للحلقة الجذعية. تمت إضافة ملحق 3-7-nt إلى 5' من التمهيدي الأمامي لضبط الطول ودرجة حرارة الذوبان ومحتوى GC. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن نقدم PVX القائم على نظام إسكات ميرنا لتوصيف وظيفة ميرناس الذاتية في البطاطا من خلال دمج تصميم STTM في ناقلات PVX. أثبت نظام VbMS فعاليته في إسكات miRNA165/166 في البطاطا ، وهي عائلة ميرنا محفوظة للغاية عبر أنواع النباتات.

وقد تم تطوير نهج TM للتدخل في التعبير عن ميرناس على أساس محاكاة الهدف ميرنا الاصطناعية التي تهدف إلى خلق حلقة عدم تطابق في موقع الانقسام المتوقع داخل تسلسل استكمال ميرنا التي تؤدي إلى عزل ميرنا المستهدفة واعتقال نشاطها22,35,78,79 . الاقتران بين جزيئات TM وmRNAs الهدف يمنع وظيفة ميرناس عن طريق هدم مستويات ميرنا محددة أو عائلة ميرنا، مما يؤدي إلى upregulation من mRNAs الهدف. وقد تم تطوير العديد من تقنيات TM لإسكات ميرناس، بما في ذلك محاكاة الهدف ميرنا الذاتية (eTM)79,80، eTM القائم على ميرنا يحاكي (MIMs)35,78, قصيرة جنبا إلى جنب الهدف يحاكي (STTMs)22,53, نهج شرك ميرنا مع TMs متكاملة في 3 'UTR من البروتين الترميز transcripts81, وMRNA SPONGEs تحتوي على مواقع ملزمة ميرنا مع اثنين من عدم التطابق المركزي لاستهداف ميرناس (cmSPs) 82. STTM يتكون من موقعين ملزمة ميرنا مع انتفاخ عدم تطابق 3-NT، مرتبطة بمسافة 48-NT التي تم تحسينها تجريبيا. STTM يؤدي إلى تثبيط كفاءة الهدف miRNAs22,53. وقد تم مؤخرا تطبيق تكنولوجيا STTM بنجاح على تحليل وظيفي واسع النطاق لل ميرناس من مصنع نموذجي Arabidopsis والمحاصيل الرئيسية مثل الأرز والذرة. وأدى ذلك إلى اكتشاف أدوار غير مسبوقة للعديد من الميرناس الذاتية المشاركة في التحكم في الغلة والهرمونات، والتي تحمل وعدا كبيرا في تحسين تربية المحاصيل47. وبناء على هذه المزايا من تصميم STTM، اخترنا STTM ودمجها في ناقلات PVX لتوصيف وظيفي من ميرناس في البطاطا. تجدر الإشارة إلى أن التصاميم المختلفة لجزيئات TM ، مثل cmSPs و MIMs و STTMs ، لها فعالية متغيرة في منع وظيفة miRNAs82 المختلفة. لذلك، قد يساعد استخدام استراتيجيات تصميم TM المختلفة على تحقيق قمع ميرنا أكثر فعالية. قد يحتاج سياق طول وتسلسل الانتفاخ الذي لا مثيل له وكذلك تعديلات النيوكليوتيدات المجاورة لمواقع ربط ميرنا أيضا إلى تحسينه للحصول على نتيجة محددة لإسكات الحمض النووي الريبي(22,36,38,78,83). وعلاوة على ذلك، فإن تصميم جزيئات TM تحت إشراف التنبؤات الحاسوبية جنبا إلى جنب مع التحليل التجريبي من المحتمل أن يؤدي إلى تثبيط أكثر موثوقية من miRNAs84.

وتبين أن نظام VIGS القائم على PVX فعال في إثارة إسكات الحمض النووي الريبي في كل من أنواع السيلانوم ثنائية البروم والتترابلويد المزروعة. يتم حث إسكات الجهازية المستندة إلى PVX والحفاظ عليها في جميع أنحاء الأنسجة فوليار على نباتات البطاطا في المختبر نشر لعدة دورات وعلى microtubers في المختبر ولدت85. وقد أبلغنا مؤخرا أن نظام VIGS القائم على PVX يمكن أن يسكت الجينات ذات الاهتمام في العديد من أصناف البطاطا رباعية الأرجل ، مثل أنسيلا ، آران بايلوت ، ماريوس بارد ، وسيرانا86. ويبقى أن نحدد ما إذا كان تأثير VbMS القائم على PVX يمكن أن ينتقل ويستمر لعدة أجيال من خلال الانتشار النباتي في البطاطا. ولا تزال النهوج المعدلة وراثيا لإدخال جزيئات TM بشكل ثابت في نباتات البطاطا موصى بها عندما يلزم الحفاظ على آثار إسكات الميرناس ذات الأهمية في الأجيال اللاحقة.

وقد تم تحديد العديد من الميرناس المشاركة في نمو البطاطا وتطويرها. وقد سهلت الرنا-seq وتسلسل الجينوم والتنبؤ المعلوماتي الحيوي إلى حد كبير تحديد الحمض النووي الريبي وأهدافها17,19,20,21. حتى الآن، تم تسلسل ثلاثة جينوم البطاطا، بما في ذلك مضاعفة monoploid S. tuberosum المجموعة Phureja استنساخ DM1-3، والأنواع ديبلويد البرية S. commersonii، واستنساخ ديبلويد الأصيل M6 من S. chacoense87،88،89. وحتى الآن، لم يتم وصف سوى عدد محدود من الميرناس البطاطس وظيفيا، في معظم الحالات باستخدام تكنولوجيا TM. على سبيل المثال، يعمل LOCUS T المزهرة (FT) homolog SP6A كإشارة متنقلة للسيطرة على الدرنة في البطاطا ويستهدفها ميرنا، وقمع التعبير عن SP6A (SES)، الذي يتوسط الانقسام الناجم عن الحرارة من النص SP6A90،91. STTM بوساطة الإفراط في التعبير عن SES يمنع نشاط ميرنا SES ويسهل الدرنة حتى في ظل ظروف الحرارة المستمرة91. وأظهرت الضربة القاضية من miR160، ميرنا المشاركة في الاستجابة المناعية، من قبل نهج eTM أن المطلوب miR160 في كل من المقاومة المكتسبة المحلية والنظامية ضد infestans Phytophthora في potato92.

وباستخدام نهج المعلوماتية الحيوية، تم تحديد ثماني أسر فريدة من الميرناس التي تستهدف مستقبلات المناعة المكررة الغنية بالنيوكليوتيدات في البطاطا والطماطم(93). واحدة من الأسر ميرنا، miR482/2118، يستهدف العديد من NLRs التي تمنح مقاومة لمسببات الأمراض المختلفة وقمع miR482/2118 ميرناس الأسرة بوساطة التعبير المعدلة وراثيا من يبني STTM يؤدي إلى تعزيز المقاومة في الطماطم ضد P. infestans وSeringae13 Pseudomonas. وتشير الأدلة المتزايدة إلى أن الحمض النووي الريبي الصغير المنتج في مسببات الأمراض والمضيفين يمكن أن يتنقل بين الكائنين الحيين ويقمع التعبير الجيني لبعضهم البعض بوساطة تدخل الحمض النووي الريبي عبر المملكة94,95,96,97. على سبيل المثال، يمكن أن يحاكي الهدف من sRNAs المشتق من مسببات الأمراض oomycete مسح هذه sRNAs الغازية والحد من العدوى المسببة للأمراض61. وسيكون من المثير للاهتمام دراسة ما إذا كان يمكن استخدام نظام VbMS الحالي لاستهداف الرنانات المشتقة من مسببات الأمراض لتحسين المقاومة في النباتات.

وباختصار، فإن نظام إسكات ال ميرنا القائم على الفيروسات سريع وفعال من حيث التكلفة ويمكن تنفيذه في شكل عالي الإنتاجية. يوفر نظام VbMS القائم على PVX أداة جينية فعالة وقوية لتحديد وظيفة الميرناس المحددة أو عائلات ميرنا والجينات المستهدفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

اي.

Acknowledgments

نشكر الدكتور يول ليو من جامعة تسينغهوا على توفير ناقل PVX-LIC. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق بدء التشغيل من أبحاث تكساس A &؛ M AgriLife ومشروع هاتش TEX0-1-9675 من المعهد الوطني للأغذية والزراعة في وزارة الزراعة الأميركية إلى JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145 (2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -J., Lin, S. -I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614 (2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489 (2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233 (2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714 (2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573 (2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178 (2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277 (2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627 (2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621 (2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500 (2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G. Functional Genomics: Methods and Protocols. Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. , Springer. New York. 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl 1 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl 1 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl 1 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl 1 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , Supplementary Files 20744 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190 (2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , Cold spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553 (1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P. RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. Kodama, H., Komamine, A. , Humana Press. 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12 (2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E. Plant Epigenetics: Methods and Protocols. Kovalchuk, I. , Springer US. 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168 (2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031 (2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28 (2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330 (2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088 (2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189 (2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs - Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

Tags

العلوم البيئية، العدد 159، إسكات الحمض النووي الريبي الدقيق القائم على الفيروس (VbMS)، فيروس البطاطس X (PVX)، ميكرورنا (ميرنا)، محاكاة الهدف (TM)، محاكاة الهدف الترادف القصير (STTMs)، سولانوم أنبوبي
فيروس البطاطا X القائم على إسكات الحمض النووي الريبي الدقيق (VbMS) في البطاطا.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter