Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Kartoffelvirus x-baseret microRNA-lyddæmpning (VbMS) i kartoffel.

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

Vi præsenterer en detaljeret protokol for kartoffelvirus X (PVX)-baserede microRNA silencing (VbMS) system til funktionelt karakterisere endogene mikroRNA'er (miRNAs) i kartoffel. Target mimic (TM) molekyler af miRNA af interesse er integreret i PVX vektor og forbigående udtrykt i kartoffel til tavshed målet miRNA eller miRNA familie.

Abstract

Virusbaseret microRNA-lyddæmpning (VbMS) er et hurtigt og effektivt værktøj til funktionel karakterisering af mikroRNA'er (miRNAs) i planter. VbMS-systemet er udviklet og anvendt til forskellige plantearter, herunder Nicotiana benthamiana, tomat, arabidopsis, bomuld og monokotplanter som hvede og majs. Her beskriver vi en detaljeret protokol ved hjælp af PVX-baserede VbMS-vektorer til at lukke munden på endogene miRNA'er i kartoffel. For at nedbryde udtrykket af en bestemt miRNA, mål efterligne (TM) molekyler af miRNA af interesse er designet, integreret i plantevirus vektorer, og udtrykt i kartoffel ved Agrobacterium infiltration at binde direkte til den endogene miRNA af interesse og blokere dens funktion.

Introduction

Plant microRNAs (miRNAs) er karakteriseret som 20-24 nukleotid-lange, atomkodede regulatoriske RNA'er1 og spiller grundlæggende roller i næsten alle aspekter af plantebiologiske processer, herunder vækst og udvikling2,3, fotosyntese og metabolisme4,5,6,7, hormonsyntese og signalering8,9, biotiske og abiotiske reaktioner10, 11,12,13, og næringsstof og energi regulering14,15. De regulatoriske roller plante miRNA'er er godt programmeret og opfyldt typisk på post-transcriptional niveauer ved enten kløvning eller translationelt undertrykke målet mRNAs.

Der er gjort enorme fremskridt i retning af identifikation, transskriptionel profilering og målforudsigelse af miRNA'er i kartoffel16,17,18,19,20,21. Imidlertid har den funktionelle karakterisering af miRNA'er i planter, herunder kartoffel, haltet bagefter andre organismer på grund af manglen på effektive og højgennemløb genetiske tilgange. Det er udfordrende at udføre funktionel analyse af individuelle miRNA ved standard tab-af funktion analyse, fordi de fleste miRNAs tilhører familier med betydelig genetisk redundans22. Derudover kan en enkelt miRNA kontrollere flere målgener23, og flere forskellige miRNA'er kan modulere den samme molekylære vej sammen24,25. Disse egenskaber gør det vanskeligt at karakterisere funktionen af en bestemt miRNA eller en miRNA-familie.

Meget af den funktionelle analyse af miRNA'er har i høj grad været afhængig af gain-of-function tilgange, der har åbenlyse begrænsninger. Den kunstige miRNA (amiRNA) metode udnytter de endogene primære udskrifter (pri-miRNAs) til at producere miRNA'er på et højt niveau, hvilket fører til hæmning af målgenekspression26,27,28,29. Aktiveringsmærkning og miRNA-overekspression ved hjælp af en stærk konstituerende 35S-promotor fører imidlertid ofte til øget udtryk for miRNA'er, der ikke er repræsentative for in vivo-forhold og derfor muligvis ikke afspejler miRNAs' endogene funktion30. Der er udviklet en alternativ tilgang, der involverer ekspression af miRNA-resistente former for målgener, der indeholder urentable mutationer i bindings- og/eller kavalergangsstederne31,32,33. Men denne tilgang kan også potentielt forårsage fejlfortolkning af fænotypen stammer fra miRNA-resistente måltransgene på grund af transgene artefakter. Derfor bør der drages konklusioner af disse gain-of-function-undersøgelser med forsigtighed34. En anden væsentlig begrænsning af de ovenfor beskrevne tilgange er, at de kræver transformation, som er arbejdskrævende og tidskrævende. Desuden gælder de transgeneafhængige tilgange næppe for transform-genstridige plantearter. Derfor er det vigtigt at udvikle en hurtig og effektiv tilgang til tab af funktion for at optrævle miRNA'ernes funktion.

For at omgå forudsætningen for transformationsproceduren er virusbaseret microRNA-lyddæmpning (VbMS) blevet etableret ved at kombinere mål efterligne (TM) strategier med virus-afledte vektorer. I VbMS-systemet udtrykkes kunstigt designede TM-molekyler forbigående fra en virus rygrad, der tilbyder et kraftfuldt, højt gennemløb og tidsbesparende værktøj til at dissekere funktionen af plante endogene miRNAs35,36. VbMS blev oprindeligt udviklet i N. benthamiana og tomat med tobak rattle virus (TRV)35,36,37 og er blevet udvidet til Arabidopsis, bomuld, hvede og majs ved hjælp af forskellige andre virus udtryk systemer, herunder kartoffel virus X (PVX)38, bomuld blad krølle virus (ClCrV)39, agurk mosaik virus (CMV)40,41,42, kinesisk hvede mosaik virus (CWMV)43 og bygstribemosaikvirus (BSMV)44,45.

Kartoffel (Solanum tuberosum) er den fjerde vigtigste fødevareafgrøde og den mest dyrkede ikke-dødelige afgrøde i verden primært på grund af dens høje næringsværdi, høj energiproduktion og relativt lave inputbehov46. Flere funktioner i kartoffel gør det til en attraktiv dicotyledonous model plante. Det er en vegetativt formeret polyploid afgrøde med høj outcrossing sats, heterozygosity, og genetisk mangfoldighed. Til dato er der dog ingen rapport, der karakteriserer funktionen af miRNA'er i kartoffel ved hjælp af VbMS. Her præsenterer vi en ligation-uafhængig kloning (LIC)-tilpasset kartoffel PVX-baseret VbMS tilgang til at evaluere funktionen af miRNA'er i kartoffelplanter38. Vi valgte miR165/166 familien til at illustrere VbMS assay, fordi miR165/166 familien og deres mål mRNAs og klasse III homeodomain / Leu lynlås (HD-ZIP III) transskription faktorer har været omfattende karakteriseret22,47,48. HS-ZIP III-generne er centrale regulatorer for meristemudvikling og organpolaritet, og undertrykkelse af miR165/166-funktionen fører til øget udtryk for HS-ZIP III-generne, hvilket resulterer i pleotropiske udviklingsdefekter såsom reduceret apikal dominans og afvigende mønstre af bladpolaritet22,35,38,41 . De letbrændte udviklingsfænotyper korreleret med lyddæmpning af miRNA165/166 muliggør en nøjagtig evaluering af effektiviteten af den PVX-baserede VbMS-analyse.

I denne undersøgelse viser vi, at det PVX-baserede VbMS-system effektivt kan blokere funktionen af miRNA'er i kartoffel. Fordi PVX-baserede virus-induceret genhæmning (VIGS) system er blevet etableret i en række kartoffel sorter49,50,51,52, denne PVX-baserede VbMS tilgang kan sandsynligvis anvendes til en bred vifte af diploid og tetraploid kartoffel arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dyrk kartoffelplanter.

  1. Formere in vitro kartoffelplanter i kulturrør (25 x 150 mm) med Murashige og Skoog (MS) medier plus Gamborgs vitamin (MS basal salt blanding, Gamborgs vitamin, 30 g/L saccharose, 3,5 g/L agar, pH = 5,7). Placer rørene i vækstrummet under 20-22 °C, 16 timer lys/8 h mørk fotoperiode og lysintensitet 120 μmol/m2∙s1.
    BEMÆRK: Nye skud og rødder udvikler sig normalt om 1-2 uger fra planter. Former planter med friske MS/Gamborgs vitaminmedier hver måned.
  2. Fire uger senere transplanteres in vitro planter til jorden og dyrkes i et drivhus under 20-22 °C, 16 timer lys/8 h mørk fotoperiode og lysintensitet 120 μmol/m2∙s1.
    BEMÆRK: Planterne med nyudviklede rødder og blade er velegnede til transplantation. Bevar fugt til de frisk transplanterede planter i de første 3-4 dage.

2. Konstruer VbMS-vektorerne.

  1. Design og klon de korte tandem TM molekyler (STTM, Figur 1)22,53 for miRNA af interesse.
    BEMÆRK: Hent miRNA-sekvenser baseret på eksperimentelle data eller fra miRbasedatabasen54,55,56,57,58,59. Den miR166-sekvens, der anvendes i denne undersøgelse, er tidligere blevet beskrevet60.
    1. TM-modulet designes ved at indsætte en mismatchsekvens, normalt 5'-CTA-3', i den omvendte komplementsekvens af miRNA på det sted, der svarer til miRNA's 10.-11.
      BEMÆRK: For eksempel er Stu-miR160-sekvensen 5'-UGCCUGGCUCUGUAUGCC-3'61, hvor 10.-11. nukleotider er med fed skrift. Den omvendte komplementsekvens (i deoxynukleotider) er 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3', og det uoverensstemmende buleindføringssted vises med fed skrift. TM-molekylesekvensen (deoxynukleotid) skal være 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.
    2. Design primere til kloning af STTM fragment (Figur 1). Brug DNA-oligonukleotider sammen med 48-nt afstandssekvensen som skabelon til PCR-kloning. Den forreste primer består af en LIC1-linker (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), ovenståendes forreste sekvens designet til TM-molekylet og den delvise 5' sekvens af 48-nt afstandsskiltet (5'-GTTGTTGTTGTGTTATGGT-3'). Den omvendte primer består af en LIC2-linker (5'-gAggAgAagCgT-3'), TM-molekylets omvendte komplementsekvens og et delvist omvendt supplement til 3'-sekvensen af 48-nt afstandsskiltet (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3').
      BEMÆRK: 48-nt afstandssekvensen er 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT-3'. For STTM-miR160 skal den forreste primer f.eks. være 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'; den omvendte primer skal være 5'gAggAgAagCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTTAGACCAT-3' (figur 1).
    3. Forstærke STTM fragment i et volumen på 50 μL af PCR ved hjælp af syntetiseret universelle 48-nt afstandsstykker som skabelon og en high fidelity DNA polymerase.
      1. Konfigurer PCR-reaktionen ved at blande 0,5 μL af hver primer (40 μM), 0,5 μL af 48-nt spacer oligo (40 μM), 5 μL af 10x PCR-buffer, 1 μL dNTP-blanding (10 mM hver), 0,1 μL high fidelity DNA polymerase (10 U/μL ) og 43 μL ddH2O til et volumen på i alt 50 μL. Udfør standard PCR-amplificering som følger: 94 °C i 3 min, 32 cyklusser på 94 °C for 45 s, 60 °C for 45 s og 72 °C for 60 s.
    4. Rense STTM fragmentet ved ethanol nedbør. Der tilsættes 2,5 mængder ethanol og 1/10 volumen på 3 M natriumacetat (pH = 4,0) til PCR-produkterne. Bland kraftigt og centrifuge ved 14.000 x g i 10 min. Fjern supernatanten, og skyl pelleten med 1 mL 70% ethanol. Pellet tørres og opløses i 20 μL ddH2O.
      BEMÆRK: Brug DNA-elektroforese til at kontrollere forstærkningen af STTM PCR-produkterne.
    5. Opsætning af T4 DNA-polymerasereaktionen på is ved at blande 2,5 μL renset STTM PCR-produkt 0,5 μL 10x T4 DNA polymerasebuffer, 0,05 μL på 1 M dithiothreitol (DTT), 0,25 μL på 100 mM dATP, 0,1 μL T4 DNA polymerase (3 U/μL) og 1,6 μL ddH2O til et samlet volumen på 5 μL. Inkubere blandingen ved 37 °C i 15 min og behandle produkterne ved 75 °C i 20 min for at inaktivere T4 DNA-polymerase.
  2. Forbered den PVX-baserede VbMS-konstruktion.
    1. Fordøje 5 μg PVX-LIC plasmid38 med 2,5 μL SmaI (20 U/μL) i et volumen på 100 μL.
    2. Der tilsættes en lige stor mængde phenol:chloroform:isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8.0) til de fordøjede PVX-LIC-produkter og blandes kraftigt. Centrifuge ved 14.000 x g i 10 min og overføre supernatant til en ny centrifuge rør. Tilsæt en lige stor mængde chloroform:isopropanol (24:1) og hvirvler kraftigt. Centrifuge ved 14.000 x g i 10 min.
      BEMÆRK: PVX-LIC vektoren huser LIC-kassetten til kloning. LIC-kassetten af PVX-LIC-vektoren indeholder et ccdB-gen og et chloramphenicolresistent gen og skal vedligeholdes/formeres i E. coli-stammen DB3.1 ved hjælp af LB-medium, der indeholder kanamycin (50 μg/L) og chloramphenicol (15 μg/L).
    3. Overfør supernatanten til et nyt centrifugerør. Der tilsættes 2,5 bind ethanol og 1/10 volumen på 3 M natriumacetat (pH = 4,0) og blandes kraftigt. Centrifuge ved 14.000 x g i 10 min og fjern supernatanten.
    4. Skyl pellet med 1 mL 70% ethanol og hvirvler kraftigt. Centrifuge ved 14.000 x g i 10 min og fjern supernatanten. Tør pelleten og opløses den fordøjede PVX-LIC plasmid med 100 μL ddH2O.
    5. Opsætning af T4 DNA polymerasereaktionen på is ved at blande 2,5 μL fordøjet PVX-LIC vektor-DNA 0,5 μL på 10x T4 DNA polymerasebuffer, 0,05 μL på 1 M DTT, 0,25 μL på 100 mM dTTP og 0,1 μL T4 DNA polymerase (3 U/μL) i et samlet volumen på 5 μL. Inkubere blandingen ved 37 °C i 15 min og behandle produkterne ved 75 °C i 20 min til inaktivere T4 DNA-polymerase.
  3. Klon STTM-sekvensen ind i PVX-LIC-vektoren ved hjælp af en LIC-reaktion. Bland de T4 DNA polymerasebehandlede STTM PCR-produkter (5 μL) og de T4 DNA polymerasebehandlede PVX-LIC plasmider (5 μL). Inkuberes ved 70 °C i 5 min, afkøles til 22 °C ved en rampe på 0,1 °C/s, og hold ved 22 °C i 30 min ved hjælp af en PCR-maskine.
    BEMÆRK: Udvid inkubationstiden til natten over ved 4 °C for at opnå større effektivitet af LIC-kloning.
  4. Omdanne 5 μL af LIC reaktionsprodukterne til E. coli DH5α og vokse på en LB plade indeholdende 50 μg/mL kanamycin62,63. Vælg og kontroller positive kolonier af PCR med kloningsgrundere og universel primer til PVX-LIC vektor efterfulgt af sekventering.
    1. Udfør koloni PCR med den forreste primer til PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') i kombination med den omvendte primer til STTM kloning for at identificere positive kloner. Størrelsen af PCR-båndet skal være ~ 300 bp.
      BEMÆRK: Kontroller sekvenserne af STTM-fragmenter efter terminatorcyklussekvens64,65.
  5. Isoler PVX-STTM plasmiderne fra de validerede kloner, og omdan dem til Agrobacteriumstammer GV3101, GV2260 eller EHA10562,63. Kontroller Agrobacterium kolonier af PCR.
    BEMÆRK: Bekræft Agrobacteriumkolonier ved HJÆLP AF den forreste primer til PVX-LIC og den omvendte primer til STTM kloning.

3. Udfør PVX-baserede VbMS assay i kartoffelplanter.

  1. Transplanter 4 uger gamle in vitro kartoffelplanter i jorden. De transplanterede planter vil blive udsat for VbMS assay 3-4 dage senere.
  2. Pod kartoffelplanter med Agrobacterium , der indeholder PVX-STTM plasmid.
    BEMÆRK: Til VbMS-analysen i kartoffel udføres Agrobacterium-medieret infiltration og tandstikker-ridser podning samtidigt.
    1. Pick og pode positive transformanter, der indeholder PVX-STTM vektorer i 50 mL flydende LB indeholder 50 μg/mL kanamycin og 50 μg/mL rifampicin. Vokse i en 28 °C inkubator ved 220 omdr./min i 16 timer indtil OD600 = 1,0.
    2. Samtidig må de positive agrobacteriumkolonier stryges på mindst to nye LB-plader, der indeholder 50 μg/mL kanamycin og 50 μg/mL rifampicin, og vokse ved 28 °C i 1 dag. Medtag PVX-LIC38,66 vektor som en kontrol og PVX-GFP67,68 til at overvåge virus spredning.
    3. Landvindingsvæskekulturen opsamles ved centrifugering ved 3.400 x g i 10 min ved stuetemperatur. Resuspend Agrobacterium celler med en lige stor mængde infiltration buffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES, og 200 μM acetosyringone, pH = 5,6) og justere til OD600 = 1,0. Inkuber ved stuetemperatur i 6 timer.
    4. Infiltrer Agrobacterium-kulturen i abaxialsiden af fuldt udvidede blade med en 1 mL nåleløs sprøjte.
      1. Flip og hold et blad med den ene hånd, og brug derefter en finger til at støtte bladlaminaen fra adaxialsiden på infiltrationsstedet. Hold sprøjten lodret til bladoverfladen med den anden hånd og infiltrere Agrobacterium kultur i abaxial side af lamina.
    5. Skrab Agrobacterium-kulturen fra LB-pladerne og skrab stilkens overflade af de første en eller to internoder af de infiltrerede kartoffelplanter med en tandstikker. Klø forsigtigt stilkens epidermis. Undgå piercing gennem stammen, som kan forårsage alvorlig skade på planterne.
  3. De infiltrerede planter dyrkes ved 22 °C med en 16 timers lys/8 h mørk fotoperiode og lysintensitet på 120 μmol/m2∙ s1 i et drivhus.
    BEMÆRK: Fænotyper forårsaget af miRNA-lyddæmpning vises normalt om 2-4 ugers efterinokumulering (figur 2, figur 3). Det tager typisk 10-20 dage for VbMS fænotypen at blive vist efter infiltration. VbMS-fænotypen afhænger af egenskaberne af de specifikke miRNA og målgener, vækstbetingelser og kartoffelsorter.

4. Udfør udtryksanalyse.

  1. Når fænotyper vises på 2-4 uger efterinokumulering, indsamle væv såsom skud, blade, blomster, eller rødder med fænotyper fra VbMS planter og væv fra kontrolplanter med en saks. Isoler total RNA'er fra det indsamlede væv.
  2. Kontroller RNA-kvaliteten ved elektroforese62,63, og kvantificer RNA-koncentrationen ved at måle OD260-absorbansen med et spektrofotometer.
  3. Brug stem-loop real-time reverse transskription PCR (RT-PCR) til at analysere miRNA udtrykket.
    1. For specifikke miRNAs, designe en stilk-loop omvendt transskription primer. Stem-loop RT primere indeholder en universel 5 'rygrad og en 3 '6-nt udvidelse af en bestemt miRNA. Design en 5' universel rygrad (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3'), der danner en stilk-loop struktur. (Det store og små bogstaver svarer til en omvendt sekvens og det lille tilfælde til løkkeområdet).
    2. En del af 5 'rygrad sekvens, der danner en løkke tjener som den omvendte primer for efterfølgende PCR forstærkning (fed-kursiv sekvens i rygraden sekvens). Tilføj en 6-nt udvidelse sekvens, der er omvendt-komplementære til 3 'ende af miRNA af interesse for stilken-loop primer at give specificitet for omvendt transskription (supplerende figur 1A).
      BEMÆRK: Design stilken-loop omvendt transskription primer som beskrevet af Chen et al.69 og Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. For eksempel er stilken-loop omvendt transskription primer til Stu-miR160 designet som 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'. Stilken-loop omvendt transskription primer til kartoffel miR165/166 familien er designet som 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3'. (De fede store bogstaver sekvenser giver specificiteten af omvendt transskription for specifikke miRNA'er).
    3. Opsætning af den omvendte transskriptionsreaktion ved at blande 50-200 ng af det samlede RNA, 1 μL af stilken-loop omvendt transskription primer (100 μM), 2 μL af 10x buffer, 0,2 μL RNase-hæmmer (40 U/μL), 0,25 μL dNTPs (10 mM hver) og 1 μL omvendt transskriptase (200 U/μL) på is. Der tilsættes nukleasefri ddH2O til et samlet volumen på 20 μL.
    4. Udfør omvendt transskription ved hjælp af den pulserende omvendt transskriptionsprocedure. Inkuberes den omvendte transskriptionsreaktionsblanding ved 16 °C i 30 min, udfør en temperaturcyklus på 30 °C i 30 s, 42 °C i 30 s og 50 °C i 1 s i alt 60 cyklusser, og inaktiver den omvendte transskriptase ved inkubation ved 85 °C i 5 min.
    5. For real-time PCR analyse af miRNA udtryk, designe den forreste primer baseret på miRNA sekvens, men omfatter ikke sekvenser, der overlapper med ovenstående designet stilk-loop omvendt transskription primer. Tilføj en 3-7-nt udvidelse til 5 'af den forreste primer for at optimere længden, smeltetemperaturen og GC-indholdet (supplerende figur 1).
      BEMÆRK: Den universelle omvendt primer er 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. For eksempel er stilken-loop omvendt transskription primer til Stu-miR160 designet som 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. Den stilk-loop omvendt transskription primer for miR165/166 familie er 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3 '. De dristige sekvenser tjener som 5 'udvidelser til primer optimering. Stilken-loop omvendt transskription primere og real-time PCR primere til miRNA kan designes ved hjælp af miRNA Primer Design Tool73.
  4. Syntetisere cDA'er af målet mRNAs af standard omvendt transskription PCR (RT-PCR). Inkuberes den omvendte transskriptionsreaktionsblanding ved 37 °C i 60 min og inaktiver den omvendte transskriptase ved opvarmning til 85 °C i 5 min.
    BEMÆRK: (1) Forudsige mål mRNAs ved hjælp af psRNATarget program74 , hvis målet mRNAs ikke er kendt. (2) Den universelle omvendte transskriptionsgrunder til mRNA er en forankret primer 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVTTTTVN-3'.
  5. Konfigurer pcr-reaktionen i realtid for både miRNA af interesse og mål-mRNA'erne. Bland 0,5 μL skabelon cDNA, 5 μL 2x PCR-buffer i realtid med SYBR grøn, 0,05 μL af hver frem- og omvendt primer (40 μM) og 4,4 μL ddH2O i et samlet volumen på 5 μL på is.
  6. Inkuberes ved 95 °C i 3 min, 40 cyklusser på 95 °C for 3 s og 60 °C i 30 s. Udfør en efterfølgende analyse af smeltekurven som følger: Inkuber ved 95 °C i 15 s, afkøles til 60 °C ved en rampe på 20 °C/s, hold ved 60 °C i 60 s, varm til 95 °C ved en rampe på 0,2 °C/s, og hold ved 95 °C i 15 s. Analyser Ct-værdierne ved hjælp af ΔΔCt-metoderne76,77, og plot midlerne med standardfejl.
    BEMÆRK: (1) Pcr-primere i realtid til mål mRNAs kan designes som beskrevet75. (2) Kartoffel polyubiquitin 10 gen kan tjene som en intern kontrol for normalisering i kartoffel. Den forreste primer til kartoffelpolynquitin 10-genet er 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' og den omvendte primer 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Ved pcr-analyse i realtid kan forurening og primer-dimer-formation give falske positive resultater. For at overvåge uspecifik forstærkning og øge ansvaret for PCR-analyse i realtid anbefales det at medtage kontroller uden skabelon og omvendt transskriptase til PCR-analyser i realtid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 viser PVX-STTM165/166 kartoffelplanter (Katahdin) med ektopisk vækst af bladvæv fra abaxialsiden af bladlamina langs venerne. Mere alvorlige fænotyper såsom trompet-formet bladdannelse er også blevet observeret. I modsætning hertil blev der ikke observeret nogen fænotypisk abnormitet i PVX-kontrolanlæggene. Disse resultater viser, at VbMS-systemet var effektivt til at undertrykke endogene miRNA-funktion i tetraploid kartoffelplanter, og PVX-VbMS-systemet var et robust genetisk værktøj til at bestemme funktionen af specifikke miRNA-familier eller miRNA-familier.

Figur 3 viser PVX-STTM165/166 kartoffelplanter (Russet Burbank) med ektopisk bladvævsvækst fra abaxialsiden af bladlamina langs venerne. Disse resultater viser, at PVX-VbMS-systemet kan anvendes på andre kartoffelarter, herunder en større kartoffelkultivar.

Figure 1
Figur 1: Skemat diagram over PVX-baserede VbMS-vektorer og PVX-STTM165/166-strukturen. LB = T-DNA venstre kant; RB = T-DNA højre kant; 35S = blomkål mosaik virus 35S promotor; NOST = nopaline synthase terminator; RdRP = RNA-afhængig RNA-polymerase; TGB1 = tredobbelt genblokprotein 1; TGB2 = tredobbelt genblokprotein 2; TGB3 = tredobbelt genblokprotein 3; sgP = PVX subgenomic RNA promotor; CP = pelsprotein; LIC Kassette = ligation-uafhængig kloning kassette; 48 nt = 48 nukleotid imperfect stem-loop linker. STTM165/166 består af tandem TM sekvenser af miR165/166 adskilt af en 48-nt ufuldkommen stem-loop linker sekvens. Den grønne pilespids i PVX-LIC-vektoren angiver startstedet for pvx-det undergenomiske RNA, der huser STTM-sekvensen. De tredobbelte minus bindestreger i miRNA-sekvenser angiver kavalergangsstederne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: VbMS af miR165/166 i tetraploid kartoffel sort katahdin. Fænotyper af kartoffelplanterne (Katahdin), der udtrykker PVX vektorkontrol eller PVX-STTM165/166. Magentapile betegner ektopisk genererede bladstrukturer i bladårerne. Den orange pilespids betegner trompetlignende bladstrukturer. Søjler = 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: VbMS af miR165/166 i tetraploid kartoffel sort Russet Burbank. Fænotyper af kartoffelplanterne (Russet Burbank), der udtrykker PVX vektor som kontrol eller PVX-STTM165/166. Magentapile betegner ektopisk genererede bladstrukturer i bladårerne. Søjler = 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Skematiske diagrammer af stem-loop RT-PCR analyse af miRNAs og real-time PCR primer design. (A) Stem-loop RT-PCR analyse af miRNA'er. Under omvendt transskription indledte bindingen af stilken-loop primeren til 3 'miRNA den omvendte transskription, og cDNA blev syntetiseret. PCR-produkter blev forstærket med en specifik fremadrettet primer af miRNA af interesse og den universelle omvendt primer. (B) Pcr primerdesign i realtid. De frem- og omvendte primere til Stu-miR160 og Stu-miR165/166 vises. Den forreste primer blev designet baseret på miRNA sekvens, men omfattede ikke sekvenser, der overlappede med den designede stilk-loop omvendt transskription primer. En 3-7-nt udvidelse blev tilføjet til 5 'af den forreste primer for at justere længden, smeltetemperaturen og GC-indholdet. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer et PVX-baseret miRNA lyddæmpningssystem for at karakterisere funktionen af endogene miRNA'er i kartoffel ved at integrere STTM-designet i PVX-vektoren. VbMS-systemet viste sig at være effektivt til at lukke munden på miRNA165/166 i kartoffel, en meget bevaret miRNA-familie på tværs af plantearter.

TM-tilgangen er udviklet til at forstyrre udtrykket af miRNA'er baseret på en kunstig miRNA-mål efterligner, der er designet til at skabe en mismatch loop på det forventede kavalergangssted inden for miRNA-komplementationssekvensen, der resulterer i binding af målrettet miRNA og anholdelse af dets aktivitet22,35,78,79 . Parringen mellem TM-molekyler og målmilRNA'erne blokerer miRNA'ernes funktion ved at slå ned på niveauerne af en bestemt miRNA- eller miRNA-familie, hvilket fører til upregulation af målmamnaerne. Der er udviklet flere TM-teknologier til lyddæmpning af miRNA'er, herunder endogene miRNA-målsiring (eTM)79,80, eTM-baserede miRNA-efterlignere (MIMs)35,78, kort tandemmål efterligner (STTMs)22,53, en miRNA-lokkeduemetode med TMs integreret i 3' UTR af proteinkodningsudskrifter81 og miRNA SPONGEs, der indeholder miRNA-bindingssteder med to centrale uoverensstemmelser til mål miRNAs (cmSPs) 82. STTM består af to miRNA bindingssteder med en 3-nt mismatch bule, forbundet med en 48-nt afstandsplads, der blev empirisk optimeret. STTM udløser effektiv hæmning af mål miRNAs22,53. STTM-teknologien er for nylig blevet anvendt med succes på en storstilet funktionel analyse af miRNA'er fra modelfabrikken Arabidopsis og større afgrøder som ris og majs. Dette førte til opdagelsen af hidtil usete roller af flere endogene miRNA'er involveret i udbytte og hormonkontrol, som lover store løfter om at forbedre afgrødeavl47. Baseret på disse fordele ved STTM design valgte vi STTM og integrerede det i PVX vektoren til funktionel karakterisering af miRNAs i kartoffel. Det er værd at bemærke, at de forskellige designs af TM-molekyler, såsom cmSPs, MIMs og STTMs, har variable efficacies i at blokere funktionen af forskellige miRNAs82. Derfor, ved hjælp af forskellige TM design strategier kan bidrage til at opnå mere effektiv miRNA undertrykkelse. Længden og sekvensen af den umatchede bule samt nukleotidændringerne ved siden af miRNA-bindingsstederne skal muligvis også optimeres til et bestemt miRNA-lyddæmpningsresultat22,36,38,78,83. Desuden vil design af TM-molekyler under vejledning af beregningsmæssige forudsigelser sammen med eksperimentel analyse sandsynligvis føre til mere pålidelig hæmning af miRNAs84.

Det blev påvist, at pvx-baserede VIGS-system er effektivt til at udløse RNA-lyddæmpning i både diploide og dyrkede tetraploid Solanum-arter. Den PVX-baserede systemiske lyddæmpning induceres og vedligeholdes i hele bladvævet på in vitro-formerede kartoffelplanter i flere cyklusser og på in vitro-genererede mikrorør85. Vi har for nylig rapporteret, at PVX-baserede VIGS-system kan lukke munden på gener af interesse i flere tetraploid kartoffel sorter, såsom Ancilla, Arran Pilot, Marius Bard og Serrana86. Det er endnu ikke fastlagt, om den PVX-baserede VbMS-effekt kan overføres og opretholdes i flere generationer gennem vegetativ formering i kartoffel. Transgene tilgange til at indføre TM-molekyler stabilt i kartoffelplanter anbefales stadig, når lyddæmpningsvirkningerne af miRNA'er af interesse skal opretholdes i de efterfølgende generationer.

Der er identificeret talrige miRNA'er, der er involveret i kartoffelvækst og -udvikling. RNA-seq, genom sekventering, og bioinformatisk forudsigelse har i høj grad lettet identifikation af miRNAs og deres mål17,19,20,21. Hidtil har tre kartoffel genomer blevet sekventeret, herunder en dobbelt monoploid S. tuberosum Group Phureja klon DM1-3, en vild diploid art S. commersonii, og en diploid indavlet klon M6 af S. chacoense87,88,89. Opdateret er kun et begrænset antal kartoffel miRNA'er blevet funktionelt karakteriseret, i de fleste tilfælde ved hjælp af TM-teknologi. For eksempel fungerer den BLOMSTRENDE LOCUS T (FT) homolog SP6A som et mobilsignal til styring af knoldst i kartoffel og er målrettet af en miRNA, der undertrykker udtryk for SP6A (SES), som formidler varmeinduceret kavalergang af SP6A-udskriften90,91. STTM-medieret overekspression af SES blokerer SES miRNA's aktivitet og letter tuberisering selv under kontinuerlige varmeforhold91. Knockdown af miR160, en miRNA involveret i immunrespons, ved eTM-tilgangen viste, at miR160 er påkrævet i både lokal og systemisk erhvervet resistens mod Phytophthora-angreb i kartoffel92.

Ved hjælp af en bioinformatisk tilgang blev otte unikke familier af miRNA'er, der er rettet mod nukleotidbindingssted leucine-rige repeat (NLR) immunreceptorer i kartoffel og tomat, identificeret93. En af miRNA-familierne, miR482/2118, er rettet mod flere NLR'er, der giver resistens over for forskellige patogener og undertrykkelse af miR482/2118-familiens miRNA'er, der er medieret af transgene udtryk for STTM-konstruktioner, fører til øget modstand i tomat mod P. infestans og Pseudomonas syringae13. Stigende beviser tyder på, at små RNA'er produceret i patogener og værter kan rejse mellem de to organismer og undertrykke hinandens genekspression medieret af RNA-interferens på tværs af riget94,95,96,97. For eksempel, mål efterligner af en oomycete patogen-afledte RRNAs kan skyllevæske disse invaderende RNA'er og reducere patogen infektion61. Det ville være interessant at undersøge, om det nuværende VbMS-system kan anvendes til at målrette patogenbaserede RNA'er for at forbedre resistensen i planter.

Sammenfattende er virusbaseret miRNA-lyddæmpningssystem hurtigt og omkostningseffektivt og kan udføres i et format med høj gennemløb. Det PVX-baserede VbMS-system giver et effektivt og robust genetisk værktøj til at bestemme funktionen af specifikke miRNA-familier eller miRNA-familier og målgener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Yule Liu fra Tsinghua University for at give PVX-LIC vektor. Dette arbejde blev støttet af en start-up fond fra Texas A &M AgriLife Research og Hatch Project TEX0-1-9675 fra USDA National Institute of Food and Agriculture til JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145 (2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -J., Lin, S. -I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614 (2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489 (2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233 (2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714 (2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573 (2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178 (2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277 (2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627 (2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621 (2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500 (2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G. Functional Genomics: Methods and Protocols. Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. , Springer. New York. 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl 1 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl 1 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl 1 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl 1 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , Supplementary Files 20744 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190 (2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , Cold spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553 (1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P. RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. Kodama, H., Komamine, A. , Humana Press. 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12 (2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E. Plant Epigenetics: Methods and Protocols. Kovalchuk, I. , Springer US. 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168 (2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031 (2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28 (2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330 (2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088 (2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189 (2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs - Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

Tags

Miljøvidenskab udgave 159 virusbaseret microRNA-lyddæmpning (VbMS) kartoffelvirus X (PVX) microRNA (miRNA) target mimic (TM) kort tandemmål efterligner (STTMs) Solanum tuberosum
Kartoffelvirus x-baseret microRNA-lyddæmpning (VbMS) i kartoffel.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter