Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Aardappelvirus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Aardappel.

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

We presenteren een gedetailleerd protocol voor het op aardappelvirus X (PVX) gebaseerde microRNA-uitschakelingssysteem (VbMS) om endogene microRNA's (miRNA's) in aardappelen functioneel te karakteriseren. Target mimic (TM) moleculen van miRNA van belang worden geïntegreerd in de PVX-vector en tijdelijk uitgedrukt in aardappel om de doel miRNA- of miRNA-familie tot zwijgen te brengen.

Abstract

Virusgebaseerde microRNA-uitschakeling (VbMS) is een snel en efficiënt hulpmiddel voor functionele karakterisering van microRNA's (miRNA's) in planten. Het VbMS-systeem is ontwikkeld en toegepast voor verschillende plantensoorten, waaronder Nicotiana benthamiana, tomaat, Arabidopsis, katoen en eenzaadlobbige planten zoals tarwe en maïs. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol met pvx-gebaseerde VbMS-vectoren om endogene miRNA's in aardappel het zwijgen op te leggen. Om de expressie van een specifiek miRNA neer te halen, worden doel-mimic (TM) moleculen van miRNA van belang ontworpen, geïntegreerd in plantenvirusvectoren en uitgedrukt in aardappel door Agrobacterium-infiltratie om rechtstreeks te binden aan het endogene miRNA van belang en de functie ervan te blokkeren.

Introduction

Plant microRNA's (miRNA's) worden gekenmerkt als 20-24 nucleotide-lange, nucleair gecodeerde regulerende RNA's1 en spelen een fundamentele rol in bijna elk aspect van plantbiologische processen, waaronder groei en ontwikkeling2,3, fotosynthese en metabolisme4,5,6,7, hormoonsynthese en signalering8,9, biotische en abiotische reacties10, 11,12,13, en nutriënten- en energieregulatie14,15. De regulerende rollen van miRNA's van planten zijn goed geprogrammeerd en worden meestal vervuld op posttranscriptieniveau door de doel-mRNA's te splitsen of translationeel te onderdrukken.

Er is enorme vooruitgang geboekt op het gebied van identificatie, transcriptionele profilering en doelvoorspelling van miRNA's in aardappel16,17,18,19,20,21. De functionele karakterisering van miRNA's in planten, waaronder aardappelen, is echter achtergebleven bij andere organismen vanwege het gebrek aan efficiënte en high-throughput genetische benaderingen. Het is een uitdaging om functionele analyse van individueel miRNA uit te voeren door standaard analyse van functieverlies, omdat de meeste miRNA's behoren tot families met een aanzienlijke genetische redundantie22. Bovendien kan een enkel miRNA meerdere doelgenen23 aansturen en kunnen verschillende miRNA's dezelfde moleculaire route gezamenlijk moduleren24,25. Deze eigenschappen maken het moeilijk om de functie van een specifiek miRNA of een miRNA-familie te karakteriseren.

Veel van de functionele analyse van miRNA's is sterk afhankelijk van gain-of-function-benaderingen met duidelijke beperkingen. De kunstmatige miRNA (amiRNA) methode maakt gebruik van de endogene primaire transcripten (pri-miRNA's) om miRNA's op een hoog niveau te produceren, wat leidt tot remming van doelgenexpressie26,27,28,29. Activatietags en miRNA-overexpressie met behulp van een sterke constitutieve 35S-promotor leiden echter vaak tot verhoogde expressie van miRNA's die niet representatief zijn voor in vivo omstandigheden en daarom mogelijk niet de endogene functie van miRNA's weerspiegelen30. Er is een alternatieve benadering ontwikkeld met expressie van miRNA-resistente vormen van doelgenen die onreine mutaties in de bindings- en/of splitsingsplaatsen bevatten31,32,33. Maar deze benadering kan mogelijk ook leiden tot een verkeerde interpretatie van het fenotype afgeleid van het miRNA-resistente doeltransgen als gevolg van transgene artefacten. Daarom moeten conclusies uit deze gain-of-function studies met de nodige voorzichtigheid worden getrokken34. Een andere belangrijke beperking van de hierboven beschreven benaderingen is dat ze transformatie vereisen, wat arbeidsintensief en tijdrovend is. Bovendien zijn de transgene-afhankelijke benaderingen nauwelijks toepasbaar voor transformatie-recalcitrante plantensoorten. Daarom is het essentieel om een snelle en efficiënte functieverliesbenadering te ontwikkelen om de functie van miRNA's te ontrafelen.

Om de voorwaarde van de transformatieprocedure te omzeilen, is virusgebaseerde microRNA-silencing (VbMS) vastgesteld door de doelmimiek (TM) -strategieën te combineren met van virussen afgeleide vectoren. In het VbMS-systeem worden kunstmatig ontworpen TM-moleculen tijdelijk uitgedrukt vanuit een virusbackbone, wat een krachtig, snel doorvoer- en tijdbesparend hulpmiddel biedt om de functie van plantaardige endogene miRNA's te ontleden35,36. VbMS werd aanvankelijk ontwikkeld in N. benthamiana en tomaat met het tabaksratelvirus (TRV)35,36,37 en is uitgebreid naar Arabidopsis, katoen, tarwe en maïs met behulp van verschillende andere virusexpressiesystemen, waaronder aardappelvirus X (PVX)38, katoenbladkremplaatvirus (ClCrV)39, komkommermozaïekvirus (CMV)40,41,42, Chinees tarwemozaïekvirus (CWMV)43 , en gerststreepmozaïekvirus (BSMV)44,45.

Aardappel (Solanum tuberosum) is het vierde belangrijkste voedselgewas en het meest geteelde niet-biologische gewas ter wereld, voornamelijk vanwege de hoge voedingswaarde, hoge energieproductie en relatief lage inputvereisten46. Verschillende kenmerken van aardappel maken het een aantrekkelijke tweezaadlobbige modelplant. Het is een vegetatief vermeerderd polyploïde gewas met een hoge uitsteeksnelheid, heterozygositeit en genetische diversiteit. Tot op heden is er echter geen rapport dat de functie van miRNA's in aardappelen met VbMS karakteriseert. Hier presenteren we een ligatie-onafhankelijke kloon (LIC)-aangepaste aardappel PVX-gebaseerde VbMS-benadering om de functie van miRNA's in aardappelplanten te evalueren38. We selecteerden de miR165/166-familie om de VbMS-test te illustreren omdat de miR165/166-familie en hun doel-mRNA's en klasse III homeodomain / Leu-rits (HD-ZIP III) transcriptiefactoren uitgebreid zijn gekarakteriseerd22,47,48. De HD-ZIP III-genen zijn belangrijke regulatoren van meristeemontwikkeling en orgaanpolariteit, en onderdrukking van de miR165/166-functie leidt tot een verhoogde expressie van de HD-ZIP III-genen, wat resulteert in pleotrope ontwikkelingsdefecten zoals verminderde apicale dominantie en afwijkende patronen van bladpolariteit22,35,38,41 . De gemakkelijk verschroeibare ontwikkelingsfenotypen gecorreleerd met het uitschakelen van miRNA165/166 maken een nauwkeurige evaluatie van de effectiviteit van de PVX-gebaseerde VbMS-test mogelijk.

In deze studie tonen we aan dat het PVX-gebaseerde VbMS-systeem de functie van miRNA's in aardappel effectief kan blokkeren. Omdat het PVX-gebaseerde virus-geïnduceerde gen-uitschakelingssysteem (VIGS) is vastgesteld in een aantal aardappelrassen49,50,51,52, kan deze OP PVX gebaseerde VbMS-benadering waarschijnlijk worden toegepast op een breed scala aan diploïde en tetraploïde aardappelsoorten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kweek aardappelplanten.

  1. Vermeerder in vitro aardappelplanten in kweekbuizen (25 x 150 mm) met Murashige en Skoog (MS) media plus Gamborg's vitamine (MS basaal zoutmengsel, Gamborg's vitamine, 30 g/L sucrose, 3,5 g/L agar, pH = 5,7). Plaats de buizen in de groeiruimte onder 20-22 °C, 16 uur licht/8 uur donkere fotoperiode en lichtintensiteit 120 μmol/m2∙s1.
    OPMERKING: Nieuwe scheuten en wortels ontwikkelen zich normaal gesproken binnen 1-2 weken van planten. Vermeerder planten elke maand met verse MS/Gamborg's vitaminemedia.
  2. Vier weken later, transplanteer in vitro planten in de grond en kweek ze in een kas onder 20-22 °C, 16 h licht / 8 h donkere fotoperiode en lichtintensiteit 120 μmol / m2 ∙ s1.
    LET OP: De planten met nieuw ontwikkelde wortels en bladeren zijn geschikt om te verplanten. Houd de eerste 3-4 dagen vocht vast voor de vers verplante planten.

2. Construeer de VbMS-vectoren.

  1. Ontwerp en kloon de korte tandem TM-moleculen (STTM, Figuur 1)22,53 voor het miRNA van belang.
    OPMERKING: Verkrijg miRNA-sequenties op basis van experimentele gegevens of uit de miRbase-database54,55,56,57,58,59. De miR166-sequentie die in deze studie wordt gebruikt, is eerder beschreven60.
    1. Ontwerp de TM-module door een mismatch-sequentie, normaal gesproken 5'-CTA-3', in de omgekeerde complementsequentie van miRNA in te voegen op de plaats die overeenkomt met de 10e-11e nucleotiden van het miRNA.
      OPMERKING: De Stu-miR160-reeks is bijvoorbeeld 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, waarbij de 10e-11e nucleotiden vetgedrukt zijn. De omgekeerde complementsequentie (in deoxynucleotiden) is 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' en de mismatch-uitstulpingsinbrengingsplaats wordt vetgedrukt weergegeven. De TM-molecuulsequentie (deoxynucleotide) moet 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3' zijn.
    2. Ontwerpprimers voor het klonen van het STTM-fragment (figuur 1). Gebruik DNA-oligonucleotiden met de 48-nt spacersequentie als sjabloon voor PCR-klonen. De voorwaartse primer bestaat uit een LIC1-linker (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), de voorwaartse sequentie van het bovenstaande ontworpen voor TM-molecuul, en de partiële 5'-sequentie van de 48-nt spacer (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). De reverse primer bestaat uit een LIC2-linker (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), de omgekeerde complementsequentie van het TM-molecuul en een partieel omgekeerd complement op de 3'-sequentie van de 48-nt spacer (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3').
      OPMERKING: De 48-nt spacersequentie is 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAATGGTCTAAAGAAGAAGAAT-3'. Voor STTM-miR160 moet de voorwaartse primer bijvoorbeeld 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3" zijn; de omgekeerde primer moet 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' zijn (figuur 1).
    3. Versterk het STTM-fragment in een volume van 50 μL door PCR met behulp van de gesynthetiseerde universele 48-nt spacer als sjabloon en een high-fidelity DNA-polymerase.
      1. Stel de PCR-reactie in door 0,5 μL van elke primer (40 μM), 0,5 μL 48-nt spacer oligo (40 μM), 5 μL van 10x PCR-buffer, 1 μL dNTP-mengsel (10 mM elk), 0,1 μL high-fidelity DNA-polymerase (10 U/μL) en 43 μL ddH2O tot een totaal volume van 50 μL te mengen. Voer standaard PCR-ampl als volgt uit: 94 °C gedurende 3 minuten, 32 cycli van 94 °C gedurende 45 s, 60 °C gedurende 45 s en 72 °C gedurende 60 s.
    4. Zuiver het STTM-fragment door ethanolprecipitatie. Voeg 2,5 volume ethanol en 1/10 volume 3 M natriumacetaat (pH = 4,0) toe aan de PCR-producten. Meng krachtig en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 14.000 x g . Verwijder het supernatant en spoel de pellet af met 1 ml 70% ethanol. Droog de pellet en los deze op in 20 μL ddH2O.
      OPMERKING: Gebruik DNA-elektroforese om de versterking van de STTM PCR-producten te controleren.
    5. Stel de T4 DNA-polymerasereactie op ijs in door 2,5 μL gezuiverd STTM PCR-product, 0,5 μL 10x T4 DNA-polymerasebuffer, 0,05 μL 1 M dithiothreitol (DTT), 0,25 μL 100 mM dATP, 0,1 μL T4 DNA-polymerase (3 U/μL) en 1,6 μL ddH2O te mengen tot een totaal volume van 5 μL. Incubateer het mengsel bij 37 °C gedurende 15 min, en behandel de producten bij 75 °C gedurende 20 minuten om het T4 DNA-polymerase te inactiveren.
  2. Bereid de PVX-gebaseerde VbMS-constructie voor.
    1. Verteer 5 μg PVX-LIC plasmide38 met 2,5 μL SmaI (20 U/μL) in een volume van 100 μL.
    2. Voeg een gelijk volume fenol:chloroform:isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8,0) toe aan de verteerde PVX-LIC producten en meng krachtig. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 14.000 x g en breng het supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis. Voeg een gelijk volume chloroform:isopropanol (24:1) en vortex krachtig toe. Centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 10 minuten.
      OPMERKING: De PVX-LIC-vector herbergt de LIC-cassette voor klonen. De LIC-cassette van PVX-LIC vector bevat een ccdB-gen en een chlooramfenicol-resistent gen en moet worden onderhouden /vermeerderd in de E. coli-stam DB3.1 met behulp van LB-medium dat kanamycine (50 μg / L) en chlooramfenicol (15 μg / L) bevat.
    3. Breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis. Voeg 2,5 volume ethanol en 1/10 volume 3 M natriumacetaat (pH = 4,0) toe en meng krachtig. Centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
    4. Spoel de pellet met 1 ml 70% ethanol en vortex krachtig af. Centrifugeer bij 14.000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Droog de pellet en los het verteerde PVX-LIC plasmide op met 100 μL ddH2O.
    5. Stel de T4 DNA-polymerasereactie op ijs in door 2,5 μL verteerd PVX-LIC vector DNA, 0,5 μL 10x T4 DNA polymerasebuffer, 0,05 μL 1 M DTT, 0,25 μL 100 mM dTTP en 0,1 μL T4 DNA-polymerase (3 E/μL) te mengen in een totaal volume van 5 μL. Incubeer het mengsel bij 37 °C gedurende 15 minuten en behandel de producten bij 75 °C gedurende 20 minuten tot 20 minuten tot inactiveer het T4 DNA polymerase.
  3. Kloon de STTM-sequentie in de PVX-LIC-vector met behulp van een LIC-reactie. Meng de met T4 DNA polymerase behandelde STTM PCR-producten (5 μL) en de met T4 DNA polymerase behandelde PVX-LIC plasmiden (5 μL). Incubeer bij 70 °C gedurende 5 minuten, koel af tot 22 °C bij een helling van 0,1 °C/s en houd gedurende 30 minuten op 22 °C met behulp van een PCR-machine.
    OPMERKING: Verleng de incubatietijd tot 's nachts bij 4 °C om een hogere efficiëntie van LIC-klonen te bereiken.
  4. Transformeer 5 μL van de LIC-reactieproducten in de E. coli DH5α en groei op een LB-plaat met 50 μg/ml kanamycine62,63. Kies en verifieer positieve kolonies door PCR met de kloonprimers en universele primer voor de PVX-LIC-vector gevolgd door sequencing.
    1. Voer kolonie PCR uit met de voorwaartse primer voor PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') in combinatie met de omgekeerde primer voor STTM-klonen om positieve klonen te identificeren. De grootte van de PCR-band moet ~ 300 bp zijn.
      OPMERKING: Controleer de sequenties van STTM-fragmenten door terminatorcyclussequencing64,65.
  5. Isoleer de PVX-STTM plasmiden uit de gevalideerde klonen en transformeer ze in Agrobacterium stammen GV3101, GV2260 of EHA10562,63. Controleer Agrobacterium kolonies door PCR.
    OPMERKING: Bevestig Agrobacterium-kolonies met PCR met behulp van de voorwaartse primer voor PVX-LIC en de omgekeerde primer voor STTM-klonen.

3. Voer PVX-gebaseerde VbMS-test uit in aardappelplanten.

  1. Transplanteer 4 weken oude in vitro aardappelplanten in de grond. De getransplanteerde planten worden 3-4 dagen later onderworpen aan vbms-test.
  2. Ent aardappelplanten met Agrobacterium die de PVX-STTM plasmiden bevat.
    OPMERKING: Voor de VbMS-test in aardappel worden agrobacterium-gemedieerde infiltratie en tandenstokerkrabinenting gelijktijdig uitgevoerd.
    1. Kies en ent positieve transformanten die PVX-STTM-vectoren bevatten in 50 ml vloeibare LB met 50 μg / ml kanamycine en 50 μg / ml rifampicine. Kweek in een incubator van 28 °C bij 220 rpm gedurende 16 uur tot OD600 = 1,0.
    2. Streep tegelijkertijd de positieve Agrobacterium-kolonies op ten minste twee nieuwe LB-platen met 50 μg / ml kanamycine en 50 μg / ml rifampicine en groei gedurende 1 dag bij 28 ° C. Voeg de PVX-LIC38,66-vector toe als controle en PVX-GFP67,68 om de verspreiding van het virus te controleren.
    3. Verzamel de agrobacterium vloeibare cultuur door centrifugering bij 3.400 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Resuspend Agrobacterium-cellen met een gelijk volume infiltratiebuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES en 200 μM acetosyringon, pH = 5,6) en pas aan OD600 = 1,0. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 6 uur.
    4. Infiltreer de Agrobacterium-cultuur in de abaxiale kant van volledig geëxpandeerde bladeren met een naaldloze spuit van 1 ml.
      1. Draai om en houd een blad met één hand vast en gebruik vervolgens één vinger om de bladlamina vanaf de adaxiale kant op de infiltratieplaats te ondersteunen. Houd de spuit met de andere hand verticaal op het bladoppervlak en infiltreer de Agrobacterium-cultuur in de abaxiale kant van lamina.
    5. Schraap de Agrobacterium-cultuur van de LB-platen en kras met een tandenstoker het stengeloppervlak van de eerste één of twee internodes van de geïnfiltreerde aardappelplanten. Krab voorzichtig aan de opperhuid van de stengel. Vermijd piercings door de stengel, wat ernstige schade aan de planten kan veroorzaken.
  3. Kweek de geïnfiltreerde planten bij 22 °C met een 16 h licht/8 h donkere fotoperiode en lichtintensiteit van 120 μmol/m2∙ s1 in een kas.
    OPMERKING: Fenotypen veroorzaakt door miRNA-uitschakeling verschijnen meestal binnen 2-4 weken na deinoculatie (figuur 2, figuur 3). Het duurt meestal 10-20 dagen voordat het VbMS-fenotype na infiltratie verschijnt. Het VbMS-fenotype is afhankelijk van de eigenschappen van het specifieke miRNA en doelgenen, groeiomstandigheden en aardappelrassen.

4. Voer expressieanalyse uit.

  1. Wanneer fenotypen verschijnen op 2-4 weken na deinoculatie, verzamel weefsels zoals scheuten, bladeren, bloemen of wortels met fenotypen van de VbMS-planten en weefsels van de controleplanten met een schaar. Isoleer totale RNA's uit de verzamelde weefsels.
  2. Controleer de RNA-kwaliteit door elektroforese62,63 en kwantificeer de RNA-concentratie door de OD260-absorptie te meten met een spectrofotometer.
  3. Gebruik stem-loop real-time reverse transcription PCR (RT-PCR) om de miRNA-expressie te analyseren.
    1. Ontwerp voor specifieke miRNA's een stem-loop reverse transcription primer. Stem-loop RT primers bevatten een universele 5' backbone en een 3' 6-nt extensie van een specifiek miRNA. Ontwerp een 5' universele backbone (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') die een steel-loop structuur vormt. (De hoofdletter komt overeen met een omgekeerd herhaalde reeks en de kleine letter met het lusgebied).
    2. Een deel van de 5'-backbonesequentie die een lus vormt, dient als de omgekeerde primer voor daaropvolgende PCR-versterking (vet-cursieve sequentie in de backbone-sequentie). Voeg een 6-nt extensiesequentie toe die omgekeerd complementair is aan het 3'-uiteinde van het miRNA van belang voor de stam-loop primer om specificiteit te bieden voor omgekeerde transcriptie (aanvullende figuur 1A).
      OPMERKING: Ontwerp de stem-loop reverse transcription primer zoals beschreven door Chen et al.69 en Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. De stem-loop reverse transcription primer voor Stu-miR160 is bijvoorbeeld ontworpen als 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'. De steel-loop reverse transcription primer voor de aardappel miR165/166 familie is ontworpen als 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3'. (De vetgedrukte hoofdletters geven de specificiteit van omgekeerde transcriptie voor specifieke miRNA's).
    3. Stel de omgekeerde transcriptiereactie in door 50-200 ng totaal RNA, 1 μL van de stem-loop reverse transcriptieprimer (100 μM), 2 μL van 10x buffer, 0,2 μL RNase-remmer (40 U/μL), 0,25 μL dNTPs (10 mM elk) en 1 μL reverse transcriptase (200 U/μL) op ijs te mengen. Voeg nucleasevrije ddH2O toe aan een totaal volume van 20 μL.
    4. Voer reverse transcriptie uit met behulp van de gepulste reverse transcriptie procedure. Incubeer het omgekeerde transcriptiereactiemengsel bij 16 °C gedurende 30 minuten, voer een temperatuurcyclus uit van 30 °C gedurende 30 s, 42 °C gedurende 30 s en 50 °C gedurende 1 s, gedurende in totaal 60 cycli, en inactiveer het omgekeerde transcriptase door incubatie bij 85 °C gedurende 5 minuten.
    5. Voor real-time PCR-analyse van miRNA-expressie ontwerpt u de voorwaartse primer op basis van de miRNA-sequentie, maar bevat u geen sequenties die overlappen met de hierboven ontworpen stem-loop reverse transcription primer. Voeg een 3-7-nt extensie toe aan de 5 ' van de voorwaartse primer om de lengte, smelttemperatuur en GC-inhoud te optimaliseren (aanvullende figuur 1).
      OPMERKING: De universele omgekeerde primer is 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. De stem-loop reverse transcription primer voor Stu-miR160 is bijvoorbeeld ontworpen als 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. De stem-loop reverse transcription primer voor de miR165/166 familie is 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. De vetgedrukte sequenties dienen als 5 '-extensies voor primeroptimalisatie. De stem-loop reverse transcription primers en de real-time PCR primers voor miRNA kunnen worden ontworpen met behulp van de miRNA Primer Design Tool73.
  4. Synthetiseer cDNA's van de doelmRNA's door standaard reverse transcription PCR (RT-PCR). Incubeer het omgekeerde transcriptiereactiemengsel bij 37 °C gedurende 60 minuten en inactiveer het omgekeerde transcriptase door verhitting tot 85 °C gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: (1) Voorspel doel-mRNA's met behulp van het psRNATarget-programma74 als de doel-mRNA's niet bekend zijn. (2) De universele reverse transcriptieprimer voor mRNA is een verankerde primer 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
  5. Stel de real-time PCR-reactie in voor zowel het miRNA van belang als de doel-mRNA's. Meng 0,5 μL sjabloon cDNA, 5 μL 2x real-time PCR-buffer met SYBR groen, 0,05 μL van elke voorwaartse en achterwaartse primer (40 μM) en 4,4 μL ddH2O in een totaal volume van 5 μL op ijs.
  6. Incubeer bij 95 °C gedurende 3 minuten, 40 cycli van 95 °C gedurende 3 s en 60 °C gedurende 30 s. Voer vervolgens als volgt een smeltcurveanalyse uit: Incubeer bij 95 °C gedurende 15 s, koel af tot 60 °C bij een helling van 20 °C/s, houd gedurende 60 s bij 60 °C, verwarm tot 95 °C bij een helling van 0,2 °C/s en houd gedurende 15 s op 95 °C. Analyseer de Ct-waarden met behulp van de ΔΔCt-methoden76,77 en zet de middelen uit met standaardfouten.
    OPMERKING: (1) De real-time PCR-primers voor doel-mRNA's kunnen worden ontworpen zoals beschreven75. (2) Aardappelpolyubiquitine 10-gen kan dienen als een interne controle voor normalisatie in aardappel. De voorwaartse primer voor het aardappelpolyubiquitine 10-gen is 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' en de omgekeerde primer 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Voor real-time PCR-analyse kunnen verontreiniging en vorming van primer-dimeer vals-positieve resultaten opleveren. Om niet-specifieke versterking te bewaken en de aansprakelijkheid van real-time PCR-analyse te vergroten, wordt aanbevolen om controles zonder sjabloon en reverse transcriptase op te nemen voor real-time PCR-assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 2 toont de PVX-STTM165/166 aardappelplanten (Katahdin) met ectopische groei van bladweefsels vanaf de abaxiale kant van bladlamina langs de aderen. Meer ernstige fenotypen zoals trompetvormige bladvorming zijn ook waargenomen. Daarentegen werd geen fenotypische afwijking waargenomen in de PVX-controlefabrieken. Deze resultaten tonen aan dat het VbMS-systeem effectief was in het onderdrukken van de endogene miRNA-functie in tetraploïde aardappelplanten en het PVX-VbMS-systeem was een robuust genetisch hulpmiddel om de functie van specifieke miRNA's of miRNA-families te bepalen.

Figuur 3 toont de PVX-STTM165/166 aardappelplanten (Russet Burbank) met ectopische bladweefselgroei vanaf de abaxiale kant van de bladlammina langs de aderen. Deze resultaten laten zien dat het PVX-VbMS-systeem kan worden toegepast op andere aardappelsoorten, waaronder een grote aardappelcultivar.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch diagram van PVX-gebaseerde VbMS-vectoren en de PVX-STTM165/166-structuur. LB = T-DNA linkerrand; RB = T-DNA rechterrand; 35S = bloemkoolmozaïekvirus 35S promotor; NOST = nopaline synthase terminator; RdRP = RNA-afhankelijk RNA-polymerase; TGB1 = triple genblok eiwit 1; TGB2 = triple gene block protein 2; TGB3 = triple gene block protein 3; sgP = PVX subgenomische RNA promotor; CP = vachteiwit; LIC Cassette = ligatie-onafhankelijke klooncassette; 48 nt = 48 nucleotide imperfect stem-loop linker. STTM165/166 bestaat uit tandem TM-sequenties van miR165/166 gescheiden door een 48-nt imperfecte steel-loop linkersequentie. De groene pijlpunt in de PVX-LIC-vector geeft de beginplaats aan van het PVX-subgenomische RNA dat de STTM-sequentie herbergt. De drievoudige min-koppeltekens in miRNA-sequenties geven de splitsingsplaatsen aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: VbMS van miR165/166 in het tetraploïde aardappelras Katahdin. Fenotypen van de aardappelplanten (Katahdin) die de PVX-vectorcontrole of PVX-STTM165/166 tot expressie brengen. Magenta pijlen duiden op ectopisch gegenereerde bladstructuren in de bladnerven. De oranje pijlpunt duidt op trompetachtige bladstructuren. Balken = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: VbMS van miR165/166 in het tetraploïde aardappelras Russet Burbank. Fenotypen van de aardappelplanten (Russet Burbank) die PVX-vector tot expressie brengen als controle of PVX-STTM165/166. Magenta pijlen duiden op ectopisch gegenereerde bladstructuren in de bladnerven. Balken = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Schematische diagrammen van stam-loop RT-PCR-analyse van miRNA's en real-time PCR-primerontwerp. (A) Stem-loop RT-PCR-analyse van miRNA's. Tijdens reverse transcriptie initieerde de binding van de stem-loop primer aan het 3' miRNA de reverse transcriptie en werd cDNA gesynthetiseerd. PCR-producten werden versterkt met een specifieke forward primer van het miRNA van belang en de universele reverse primer. (B) Real-time PCR primer ontwerp. De voorwaartse en achterwaartse primers voor Stu-miR160 en Stu-miR165/166 worden getoond. De voorwaartse primer was ontworpen op basis van de miRNA-sequentie, maar bevatte geen sequenties die overlapten met de ontworpen stem-loop reverse transcription primer. Een 3-7-nt extensie werd toegevoegd aan de 5 'van de voorwaartse primer om de lengte, smelttemperatuur en GC-inhoud aan te passen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We presenteren een pvx-gebaseerd miRNA-uitschakelingssysteem om de functie van endogene miRNA's in aardappel te karakteriseren door het STTM-ontwerp te integreren in de PVX-vector. Het VbMS-systeem bleek effectief te zijn in het uitschakelen van miRNA165/166 in aardappel, een sterk geconserveerde miRNA-familie voor alle plantensoorten.

De TM-benadering is ontwikkeld om te interfereren met de expressie van miRNA's op basis van een kunstmatige miRNA-doelmimiek die is ontworpen om een mismatch-lus te creëren op de verwachte splitsingsplaats binnen de miRNA-complementatiesequentie die resulteert in sekwestratie van gericht miRNA en arrestatie van zijn activiteit22,35,78,79 . De koppeling tussen TM-moleculen en de doel-miRNA's blokkeert de functie van de miRNA's door de niveaus van een specifiek miRNA of een miRNA-familie neer te halen, wat leidt tot upregulatie van de doel-mRNA's. Er zijn verschillende TM-technologieën ontwikkeld voor het uitschakelen van miRNA's, waaronder endogene miRNA-doelmimicry (eTM)79,80, eTM-gebaseerde miRNA-mimics (MIMs)35,78, korte tandemdoelmimics (STTM's)22,53, een miRNA-lokbenadering met TM's geïntegreerd in de 3' UTR van eiwitcoderende transcripten81, en miRNA-SPONGE's die miRNA-bindingsplaatsen bevatten met twee centrale mismatches met doel-miRNA's (cmSP's) 82. STTM bestaat uit twee miRNA-bindingsplaatsen met een 3-nt mismatch-uitstulping, verbonden door een 48-nt spacer die empirisch is geoptimaliseerd. STTM activeert efficiënte remming van doel-miRNA's22,53. De STTM-technologie is onlangs met succes toegepast op een grootschalige functionele analyse van miRNA's van de modelplant Arabidopsis en belangrijke gewassen zoals rijst en maïs. Dit leidde tot de ontdekking van ongekende rollen van verschillende endogene miRNA's die betrokken zijn bij opbrengst- en hormooncontrole, wat veelbelovend is bij het verbeteren van gewasveredeling47. Op basis van deze voordelen van STTM-ontwerp hebben we STTM gekozen en geïntegreerd in de PVX-vector voor functionele karakterisering van miRNA's in aardappel. Het is vermeldenswaard dat de verschillende ontwerpen van TM-moleculen, zoals cmSP's, MIMs en STTM's, variabele werkzaamheid hebben bij het blokkeren van de functie van verschillende miRNA's82. Daarom kan het gebruik van verschillende TM-ontwerpstrategieën helpen om effectievere miRNA-onderdrukking te bereiken. De lengte en sequentiecontext van de ongeëvenaarde uitstulping en de nucleotideveranderingen grenzend aan de miRNA-bindingsplaatsen moeten mogelijk ook worden geoptimaliseerd voor een specifieke miRNA-uitschakelingsuitkomst22,36,38,78,83. Bovendien zal het ontwerp van TM-moleculen onder begeleiding van computationele voorspellingen samen met experimentele analyse waarschijnlijk leiden tot een betrouwbaardere remming van miRNA's84.

Er werd aangetoond dat het op PVX gebaseerde VIGS-systeem effectief is in het activeren van RNA-uitschakeling in zowel diploïde als gekweekte tetraploïde Solanum-soorten. De op PVX gebaseerde systemische uitschakeling wordt geïnduceerd en gehandhaafd in de bladweefsels op in vitro vermeerderde aardappelplanten gedurende verschillende cycli en op in vitro gegenereerde microtubers85. We hebben onlangs gemeld dat het op PVX gebaseerde VIGS-systeem genen van belang kan maken in verschillende tetraploïde aardappelcultivars, zoals Ancilla, Arran Pilot, Marius Bard en Serrana86. Het moet nog worden bepaald of het op PVX gebaseerde VbMS-effect meerdere generaties kan worden overgedragen en volgehouden door vegetatieve vermeerdering in aardappelen. Transgene benaderingen om TM-moleculen stabiel in aardappelplanten te introduceren, worden nog steeds aanbevolen wanneer de dempende effecten van miRNA's van belang in de volgende generaties moeten worden gehandhaafd.

Er zijn talloze miRNA's geïdentificeerd die betrokken zijn bij de groei en ontwikkeling van aardappelen. RNA-seq, genoomsequencing en bioinformatische voorspelling hebben de identificatie van miRNA's en hun doelen aanzienlijk vergemakkelijkt17,19,20,21. Tot nu toe zijn drie aardappelgenomen gesequenced, waaronder een verdubbelde monoploïde S. tuberosum Group Phureja-kloon DM1-3, een wilde diploïde soort S. commersonii en een diploïde inteeltkloon M6 van S. chacoense87,88,89. Tot op heden is slechts een beperkt aantal aardappel-miRNA's functioneel gekarakteriseerd, in de meeste gevallen met behulp van TM-technologie. De FLOWERING LOCUS T (FT) homoloog SP6A fungeert bijvoorbeeld als een mobiel signaal om de tuberisatie in aardappel te regelen en wordt het doelwit van een miRNA, dat de expressie van SP6A (SES) onderdrukt, die warmte-geïnduceerde splitsing van het SP6A-transcript bemiddelt90,91. STTM-gemedieerde overexpressie van SES blokkeert de activiteit van SES-miRNA en vergemakkelijkt tuberisatie, zelfs onder continue hitteomstandigheden91. Knockdown van miR160, een miRNA dat betrokken is bij immuunrespons, door de eTM-benadering toonde aan dat miR160 vereist is in zowel lokale als systemisch verworven resistentie tegen Phytophthora infestans in aardappel92.

Met behulp van een bioinformatische benadering werden acht unieke families van miRNA's geïdentificeerd die zich richten op nucleotidebindingsplaats leucine-rijke herhaling (NLR) immuunreceptoren in aardappel en tomaat93. Een van de miRNA-families, miR482/2118, richt zich op verschillende NLR's die resistentie tegen verschillende pathogenen verlenen en onderdrukking van de miR482/2118-familie miRNA's gemedieerd door transgene expressie van STTM-constructies leidt tot verhoogde resistentie in tomaat tegen P. infestans en Pseudomonas syringae13. Toenemend bewijs suggereert dat kleine RNA's geproduceerd in pathogenen en gastheren tussen de twee organismen kunnen reizen en elkaars genexpressie kunnen onderdrukken, gemedieerd door cross-kingdom RNA-interferentie94,95,96,97. Doelwit-nabootsingen van een van oomycete pathogeen afgeleide sRNA's kunnen bijvoorbeeld deze binnendringende sRNA's opruimen en pathogene infectie verminderen61. Het zou interessant zijn om te onderzoeken of het huidige VbMS-systeem kan worden gebruikt om pathogene afgeleide sRNA's aan te pakken om de resistentie in planten te verbeteren.

Kortom, het virusgebaseerde miRNA-uitschakelingssysteem is snel en kosteneffectief en kan worden uitgevoerd in een formaat met hoge doorvoer. Het op PVX gebaseerde VbMS-systeem biedt een efficiënt en robuust genetisch hulpmiddel om de functie van specifieke miRNA's of miRNA-families en de doelgenen te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen.

Acknowledgments

We bedanken Dr. Yule Liu van de Tsinghua University voor het leveren van de PVX-LIC vector. Dit werk werd ondersteund door een start-up fonds van het Texas A & M AgriLife Research en het Hatch Project TEX0-1-9675 van USDA National Institute of Food and Agriculture naar JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145 (2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -J., Lin, S. -I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614 (2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489 (2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233 (2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714 (2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573 (2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178 (2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277 (2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627 (2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621 (2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500 (2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G. Functional Genomics: Methods and Protocols. Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. , Springer. New York. 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl 1 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl 1 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl 1 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl 1 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , Supplementary Files 20744 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190 (2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , Cold spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553 (1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P. RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. Kodama, H., Komamine, A. , Humana Press. 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12 (2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E. Plant Epigenetics: Methods and Protocols. Kovalchuk, I. , Springer US. 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168 (2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031 (2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28 (2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330 (2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088 (2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189 (2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs - Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

Tags

Environmental Sciences virus-based microRNA silencing (VbMS) potato virus X (PVX) microRNA (miRNA) target mimic (TM) short tandem target mimics (STTMs) Solanum tuberosum
Aardappelvirus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Aardappel.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter