צינור סולנום, scientific video journal" />

Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה.

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור וירוס תפוחי אדמה X (PVX)מבוסס microRNA השתקת מערכת (VbMS) כדי לאפיין פונקציונלית microRNAs אנדוגני (miRNAs) בתפוח אדמה. מולקולות חיקוי מטרה (TM) של miRNA של עניין משולבות בווקטור PVX ומתבטאות באופן חולף בתפוח אדמה כדי להשתיק את משפחת ה- miRNA או miRNA היעד.

Abstract

השתקת מיקרו-רנ"א מבוססת וירוסים (VbMS) היא כלי מהיר ויעיל לאפיון פונקציונלי של מיקרו-רנ"א (miRNAs) בצמחים. מערכת VbMS פותחה ויישמה עבור מיני צמחים שונים כולל ניקוטיאנה בנתמיאנה, עגבניות, Arabidopsis, כותנה, וצמחי מונוקוט כגון חיטה ותירס. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט באמצעות וקטורים VbMS מבוססי PVX כדי להשתיק miRNAs אנדוגני בתפוח אדמה. כדי להפיל את הביטוי של miRNA ספציפי, מולקולות חיקוי יעד (TM) של miRNA של עניין מתוכננים, משולבים בווקטורים וירוס הצמח, ובא לידי ביטוי תפוח אדמה על ידי חדירת אגרובקטריום להיקשר ישירות miRNA אנדוגני של עניין ולחסום את הפונקציה שלה.

Introduction

מיקרו-רנ"א צמחיים (miRNAs) מאופיינים כ-RNAs רגולטוריים באורך 20-24 נוקלאוטידים, המקודדים לגרעין1 וממלאים תפקידים בסיסיים כמעט בכל היבט של תהליכים ביולוגיים צמחיים, כולל צמיחה ופיתוח2,3, פוטוסינתזה וחילוף חומרים4,5,6,7, סינתזת הורמונים ותגובות איתות8,9, ביוטיות ואביוטיות10, 11,12,13, ורגולציה תזונתית ואנרגיה14,15. התפקידים הרגולטוריים של miRNAs צמח מתוכנתים היטב וממולמים בדרך כלל ברמות שלאחר שעתוק על ידי בקעה או דיכוי תרגום של mRNAs היעד.

חלה התקדמות עצומה לקראת זיהוי, פרופיל תמלול וחיזוי יעד של miRNAs בתפוחי אדמה 16,17,18,19,20,21. עם זאת, האפיון התפקודי של miRNAs בצמחים, כולל תפוחי אדמה, מפגר אחרי אורגניזמים אחרים בשל היעדר גישות גנטיות יעילות ובעלות תפוקה גבוהה. זה מאתגר לבצע ניתוח פונקציונלי של miRNA בודדים על ידי ניתוח סטנדרטי של אובדן תפקוד, כי רוב miRNAs שייכים למשפחות עם יתירות גנטית ניכרת22. בנוסף, miRNA יחיד יכול לשלוט גנים יעד מרובים23 וכמה miRNAs שונים יכול לווסת את אותו מסלול מולקולרי בשיתוף פעולה24,25. מאפיינים אלה מקשים על אפיון הפונקציה של miRNA ספציפי או משפחת miRNA.

חלק גדול מהניתוח התפקודי של miRNAs הסתמך במידה רבה על גישות של רווח-של-פונקציה שיש להם מגבלות ברורות. שיטת ה-miRNA המלאכותית (amiRNA) מנצלת את התמלילים העיקריים האנדוגניים (pri-miRNAs) כדי לייצר miRNAs ברמה גבוהה, מה שמוביל לעיכוב ביטוי גן היעד26,27,28,29. עם זאת, תיוג הפעלה וביטוי יתר של miRNA באמצעות מקדם 35S מרכיב חזק מובילים לעתים קרובות לביטוי מוגבר של miRNAs שאינם מייצגים תנאי vivo ולכן לא יכול לשקף את הפונקציה אנדוגני של miRNAs30. פותחה גישה חלופית הכוללת ביטוי של צורות עמידות בפני miRNA של גנים המשמשים כמטרה המכילים מוטציות טמאות באתרי הכריכה ו/או המחשוף31,32,33. אבל גישה זו יכולה גם לגרום לפרשנות שגויה של הפנוטיפ הנגזר מהטרנסג'ן היעד העמיד בפני miRNA עקב חפצים מהונדסים. לכן, מסקנות אלה מחקרים של רווח של פונקציה צריך להסיק בזהירות34. מגבלה מרכזית נוספת של הגישות המתוארות לעיל היא שהן דורשות טרנספורמציה, שהיא עבודה עתירת עבודה וגוזלת זמן רב. יתר על כן, הגישות התלויות בטרנסג'ן אינן ישימות כמעט ללא שינוי עבור מיני צמחים סרבנים. לכן, חיוני לפתח גישה מהירה ויעילה של אובדן תפקוד כדי לפענח את הפונקציה של miRNAs.

כדי לעקוף את תנאי מוקדם של הליך הטרנספורמציה, השתקת מיקרורנ"א מבוססת וירוסים (VbMS) הוקמה על ידי שילוב אסטרטגיות חיקוי היעד (TM) עם וקטורים שמקורם בווירוסים. במערכת VbMS, מולקולות TM שתוכננו באופן מלאכותי מתבטאות באופן חולף מעמוד השדרה של וירוסים, ומציעות כלי רב עוצמה, בעל תפוקה גבוהה וחוסך זמן כדי לנתח את הפונקציה של miRNAs35,36 אנדוגני צמחי. VbMS פותחה בתחילה ב- N. benthamiana ועגבניות עם נגיף רעשן הטבק (TRV)35,36,37 והורחבה לערבידופסיס, כותנה, חיטה ותירס באמצעות מערכות שונות אחרות לביטוי וירוסים, כולל וירוס תפוחי האדמה X (PVX)38, וירוס קמט עלה כותנה (ClCrV)39, וירוס פסיפס מלפפונים (CMV)40,41,42, וירוס פסיפס חיטה סיני (CWMV)43 ווירוס פסיפס פסים שעורה (BSMV)44,45.,

תפוח אדמה (Solanum tuberosum) הוא יבול המזון הרביעי בחשיבותו והיבול הנפוץ ביותר בעולם בעיקר בגלל ערכו התזונתי הגבוה, ייצור אנרגיה גבוהה ודרישות קלט נמוכות יחסית46. מספר תכונות של תפוחי אדמה להפוך אותו צמח מודל dicotyledonous אטרקטיבי. זהו יבול פוליפלואידי שהופצה על ידי צמחייה עם קצב שפיכות גבוה, הטרוזיגוסיות ומגוון גנטי. עם זאת, עד כה, אין דו"ח המאפיין את הפונקציה של miRNAs בתפוח אדמה באמצעות VbMS. כאן, אנו מציגים גישה של שיבוט עצמאי לקשירה (LIC) מבוסס PVX מבוסס VbMS כדי להעריך את הפונקציה של miRNAs בצמחי תפוחי אדמה38. בחרנו את משפחת miR165/166 כדי להמחיש את בדיקת VbMS מכיוון שמשפחת miR165/166 וגורמי התמלול של mRNAs היעד שלהם ורוכסן הביתי השלישי (HD-ZIP III) אופיינו בהרחבה22,47,48. הגנים HD-ZIP III הם רגולטורים מרכזיים של התפתחות מריסטם וקוטביות איברים, ודיכוי של תפקוד miR165/166 מוביל לביטוי מוגבר של הגנים HD-ZIP III, וכתוצאה מכך פגמים התפתחותיים pleotropic כגון דומיננטיות אפית מופחתת ודפוסים חריגים של קוטביות עלים22,35,38,41 . הפנוטיפים ההתפתחותיים הניתנים לציון בקלות בקורלציה עם השתקה של miRNA165/166 מאפשרים הערכה מדויקת של האפקטיביות של בדיקות VbMS מבוססות PVX.

במחקר זה, אנו מדגימים כי מערכת VbMS מבוססת PVX יכולה לחסום ביעילות את הפונקציה של miRNAs בתפוחי אדמה. מכיוון שמערכת השתקת הגנים (VIGS) המבוססת על וירוסים מבוססת PVX הוקמה במספר זני תפוחי אדמה49,50,51,52, גישה זו המבוססת על VbMS מבוססת PVX יכולה להיות מיושמת ככל הנראה על מגוון רחב של מיני תפוחי אדמה דיפלואידים וטטרפלואידים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. לגדל צמחי תפוחי אדמה.

  1. להפיץ צמחים תפוחי אדמה במבחנה בצינורות תרבות (25 x 150 מ"מ) עם Murashige ו Skoog (MS) מדיה בתוספת ויטמין של גמבורג (תערובת מלח בזאלי MS, ויטמין של גמבורג, 30 גרם / L סוכרוז, 3.5 גרם / ליטר אגר, pH = 5.7). מניחים את הצינורות בחדר הצמיחה מתחת ל-20-22 °C (50 °F), 16 שעות אור/8 שעות פוטופריוד כהה, ועוצמת האור 120 מיקרומול/מ"ר 2∙s1.
    הערה: יורה חדש ושורשים מתפתחים בדרך כלל 1-2 שבועות מצמחים. להפיץ צמחים עם מדיה ויטמין טרי MS / גמבורג מדי חודש.
  2. ארבעה שבועות לאחר מכן, להשתיל בצמחי במבחנה לתוך האדמה ולגדל אותם בחממה תחת 20-22 °C (20 °F), 16 שעות אור / 8 שעות פוטופריוד כהה, ועוצמת האור 120 מיקרומול / m2 ∙s1.
    הערה: הצמחים עם שורשים ועלים שפותחו לאחרונה מתאימים להשתלה. לשמור על לחות עבור הצמחים טריים מושתל במשך 3-4 הימים הראשונים.

2. לבנות את וקטורי VbMS.

  1. עצב ושכפל את מולקולות הטנדם TM הקצרות (STTM, איור 1)22,53 עבור ה-miRNA של עניין.
    הערה: לרכוש רצפי miRNA המבוססים על נתונים ניסיוניים או ממסד הנתונים miRbase54,55,56,57,58,59. רצף miR166 המשמש במחקר זה תואר בעבר60.
    1. עצב את מודול TM על ידי החדרת רצף אי התאמה, בדרך כלל 5'-CTA-3', לרצף המשלים ההפוך של miRNA באתר המתאים לנוקלאוטידים ה -10-11 של ה- miRNA.
      הערה: לדוגמה, רצף Stu-miR160 הוא 5'-UGCCUGGCUCUCUCUGUAUGCC-3'61, כאשר הנוקלאוטידים ה-10-11 מודגשים. רצף ההשלמה ההפוך (ב deoxynucleotides) הוא 5'-GGCATACAGAGAGAGCCAGGCA-3' ואתר הכניסה בליטה אי התאמה מוצג מודגש. רצף מולקולות TM (deoxynucleotide) צריך להיות 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.
    2. עצב פריימרים לשיבוט מקטע STTM (איור 1). השתמש באוליגונוקלאוטידים של DNA עם רצף מרווחים של 48 nt כתבנית לשיבוט PCR. הפריימר הקדמי מורכב ממקשר LIC1 (5'-CgACgACAAGACCGT-3'), הרצף הקדמי של האמור לעיל המיועד למולקולת TM, ורצף חלקי של 5' של מרווח 48 nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). הפריימר ההפוך מורכב ממקשר LIC2 (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), רצף ההשלמה ההפוך של מולקולת TM, ומשלים חלקי הפוך לרצף 3' של מרווח 48 nt (5'-ATTCTTCTCTTTAGACCAT-3').
      הערה: רצף Spacer 48 nt הוא 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAATGGTCTAAAGAAGAAGAAGAAT-3'. לדוגמה, עבור STTM-miR160, הפריימר הקדמי צריך להיות 5'-CgACgACAAgACCGT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'; הפריימר ההפוך צריך להיות 5'-gAggAgAagCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTTAGACCAT-3' (איור 1).
    3. הגבר את שבר STTM בנפח של 50 μL על ידי PCR באמצעות מרווח אוניברסלי מסונתז 48 nt כתבנית ופולימראז DNA נאמנות גבוהה.
      1. הגדר את תגובת PCR על ידי ערבוב 0.5 μL של כל פריימר (40 מיקרומטר), 0.5 μL של 48-nt spacer אוליגו (40 מיקרומטר), 5 μL של 10x חיץ PCR, 1 μL של תערובת dNTP (10 mM כל אחד), 0.1 μL של פולימראז DNA אמינות גבוהה (10 U / μL ), ו 43 μL של ddH2O לנפח כולל של 50 μL. בצע הגברה PCR סטנדרטי כדלקמן: 94 °C (55 °F) במשך 3 דקות, 32 מחזורים של 94 °C (75 °F) במשך 45 °C (65 °F) ל-45 °C (60 °F)
    4. לטהר את שבר STTM על ידי משקעים אתנול. הוסף 2.5 כרכים של אתנול ונפח 1/10 של 3 M נתרן אצטט (pH = 4.0) למוצרי PCR. מערבבים במרץ וצנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 10 דקות. הסר את supernatant ולשטוף את הכדור עם 1 מ"ל של 70% אתנול. לייבש את הכדור ולהמיס אותו ב 20 μL של ddH2O.
      הערה: השתמש באלקטרופורזה DNA כדי לבדוק את ההגברה של מוצרי ה- PCR STTM.
    5. הגדר את תגובת הפולימראז של ה-DNA T4 על קרח על ידי ערבוב 2.5 μL של מוצר PCR STTM מטוהר, 0.5 μL של 10x T4 DNA פולימראז חוצץ, 0.05 μL של 1 M dithiothreitol (DTT), 0.25 μL של 100 mM dATP, 0.1 μL של פולימראז DNA T4 (3 U / μL), ו 1.6 μL של ddH2O לנפח כולל של 5 μL. דגירה התערובת ב 37 °C במשך 15 דקות, ולטפל במוצרים ב 75 °C (75 °F) במשך 20 דקות כדי לנטרל את פולימראז ה- DNA T4.
  2. הכן את מבנה VbMS מבוסס PVX.
    1. תקציר 5 מיקרוגרם של PVX-LIC plasmid38 עם 2.5 μL של SmaI (20 U/μL) בנפח של 100 μL.
    2. הוסף נפח שווה של פנול:כלורופורם:איזופרופנול (25:24:1, pH = 6.7/8.0) למוצרי PVX-LIC המעוכלים ומערבבים במרץ. צנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 10 דקות ולהעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש. הוסף נפח שווה של כלורופורם:איזופרופנול (24:1) ומערבולת במרץ. צנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 10 דקות.
      הערה: וקטור PVX-LIC מכיל את קלטת LIC לשיבוט. קלטת LIC של וקטור PVX-LIC מכילה גן CCDB גן עמיד לכלוראמפניקול ויש לשמור / להפיץ בזן E. coli DB3.1 באמצעות מדיום LB המכיל קנאמיצין (50 מיקרוגרם / ליטר) וכלורמפניקול (15 מיקרוגרם / ליטר).
    3. מעבירים את הסופר-נט לצינור צנטריפוגות חדש. הוסיפו 2.5 כרכים של אתנול ונפח 1/10 של 3 מ' נתרן אצטט (pH = 4.0) וערבבו במרץ. צנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 10 דקות ולהסיר את supernatant.
    4. לשטוף את הכדור עם 1 מ"ל של 70% אתנול ומערבולת במרץ. צנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 10 דקות ולהסיר את supernatant. יבש את הכדור ולהמיס את plasmid PVX-LIC מעוכל עם 100 μL של ddH2O.
    5. הגדר את תגובת פולימראז DNA T4 על קרח על ידי ערבוב 2.5 μL של DNA וקטור PVX-LIC מעוכל, 0.5 μL של 10x T4 DNA מאגר פולימראז, 0.05 μL של 1 M DTT, 0.25 μL של 100 mM dTTP, ו 0.1 μL של T4 DNA פולימראז (3 U / μL) בנפח כולל של 5 μL. דגירה התערובת ב 37 °C במשך 15 דקות ולטפל במוצרים ב 75 °C במשך 20 דקות עד לנטרל את ה-טי-4 די.אן.איי פולימראז.
  3. שכפל את רצף STTM לווקטור PVX-LIC באמצעות תגובת LIC. מערבבים את מוצרי ה-STTM PCR שטופלו בפולימראז T4 (5 מיקרול) ואת פלסמידים PVX-LIC שטופלו ב-T4 בפולימראז (5 μL). דגירה ב 70 °C (5 דקות), להתקרר עד 22 °C (5 °F) ברמפה של 0.1 °C (5 °F) / s, ולשמור על 22 °C (70 °F) במשך 30 דקות באמצעות מכונת PCR.
    הערה: להאריך את זמן הדגירה ללילה ב 4 °C (7 °F) כדי להשיג יעילות גבוהה יותר של שיבוט LIC.
  4. להפוך 5 μL של מוצרי התגובה LIC לתוך E. coli DH5α ולגדול על צלחת LB המכיל 50 מיקרוגרם / mL kanamycin62,63. בחר ואמת מושבות חיוביות על-ידי PCR עם פריימרים שיבוט פריימר אוניברסלי עבור וקטור PVX-LIC ואחריו רצף.
    1. בצע PCR מושבה עם פריימר קדמי עבור PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') בשילוב עם פריימר הפוך עבור שיבוט STTM כדי לזהות שיבוטים חיוביים. הגודל של רצועת PCR צריך להיות ~ 300 bp.
      הערה: אמת את הרצפים של שברי STTM על-ידי רצף מחזור שליחות קטלנית64,65.
  5. לבודד את plasmids PVX-STTM מן השיבוטים מאומת ולהפוך אותם לזני אגרובקטריום GV3101, GV2260, או EHA10562,63. לאמת מושבות אגרובקטריום על ידי PCR.
    הערה: אשר מושבות אגרובקטריום על ידי PCR באמצעות פריימר קדמי עבור PVX-LIC ואת פריימר הפוך עבור שיבוט STTM.

3. בצע VbMS מבוסס PVX בצמחי תפוחי אדמה.

  1. להשתלה בת 4 שבועות בצמחי תפוחי אדמה במבחנה לתוך אדמה. הצמחים המושתלים יהיו נתונים לבדיקת VbMS 3-4 ימים לאחר מכן.
  2. צמחי תפוחי אדמה מסורסים עם אגרובקטריום המכיל את פלסמידים PVX-STTM.
    הערה: עבור בדיקות VbMS בתפוח אדמה, חדירה בתיווך אגרובקטריום וחיסון גירוד קיסם מבוצעים בו זמנית.
    1. בחר ולחסן טרנספורמטים חיוביים המכילים וקטורים PVX-STTM לתוך 50 מ"ל של LB נוזלי המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin ו 50 מיקרוגרם / mL ריפים. לגדול בחממה 28 °C ב 220 סל"ד עבור 16 שעות עד OD600 = 1.0.
    2. יחד עם זאת, פס מושבות אגרובקטריום חיוביות על לפחות שתי צלחות LB חדשות המכילות 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin ו 50 מיקרוגרם / mL rifampicin לגדול ב 28 °C (50 °F) ליום אחד. כלול את וקטור PVX-LIC38,66 כפקד ו- PVX-GFP67,68 לניטור התפשטות הנגיף.
    3. לאסוף את התרבות הנוזלית אגרובקטריום על ידי צנטריפוגה ב 3,400 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend Agrobacterium תאים עם נפח שווה של חוצץ חדירה (10 mM MgCl2, 10 mM MES, ו 200 μM acetosyringone, pH = 5.6) ולהתאים OD600 = 1.0. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 6 שעות.
    4. לחדור את תרבות האגרובקטריום לתוך הצד abaxial של עלים מורחבים לחלוטין עם מזרק 1 מ"ל ללא מחט.
      1. הפוך והחזק עלה ביד אחת, ולאחר מכן השתמש באצבע אחת כדי לתמוך בלמינת העלים מהצד האדקסיאלי באתר ההסתננות. שמור את המזרק אנכי על פני השטח עלה עם היד השנייה לחדור את תרבות האגרובקטריום לתוך הצד abaxial של למינה.
    5. לגרד את תרבות האגרובקטריום מלוחות LB ולגרד את פני השטח של הראשון או שניים internodes של צמחי תפוחי אדמה הסתננו עם קיסם. לגרד בעדינות את האפידרמיס של הגבעול. הימנע פירסינג דרך הגבעול, אשר עלול לגרום נזק חמור לצמחים.
  3. לגדל את הצמחים הסתננו ב 22 °C (55 °F) עם 16 שעות אור / 8 שעות פוטופריוד כהה ועוצמת אור של 120 μmol / m2 ∙ s1 בחממה.
    הערה: פנוטיפים הנגרמים על ידי השתקת miRNA מופיעים בדרך כלל בשבועיים עד 4 שבועות לאחר ניתוח (איור 2, איור 3). זה בדרך כלל לוקח 10-20 ימים עבור פנוטיפ VbMS להופיע לאחר ההסתננות. פנוטיפ VbMS תלוי בתכונות של miRNA ספציפי גנים היעד, תנאי גדילה, זנים תפוחי אדמה.

4. בצע ניתוח ביטוי.

  1. כאשר פנוטיפים מופיעים 2-4 שבועות postinoculation, לאסוף רקמות כגון יורה, עלים, פרחים, או שורשים עם פנוטיפים מן הצמחים VbMS ורקמות מן הצמחים הבקרה עם מספריים. לבודד RNAs הכולל מן הרקמות שנאספו.
  2. בדוק את איכות ה- RNA על ידי אלקטרופורזיס62,63 וכמת את ריכוז ה- RNA על ידי מדידת ספיגת OD260 באמצעות ספקטרופוטומטר.
  3. השתמש PCR תמלול הפוך לולאת גזע בזמן אמת (RT-PCR) כדי לנתח את ביטוי miRNA.
    1. עבור miRNAs ספציפיים, עצבו פריימר תמלול הפוך של לולאת גזע. פריימריז RT לולאת גזע מכילים עמוד שדרה אוניברסלי 5 ' ותוסף 3 ' 6-nt של miRNA ספציפי. עצב עמוד שדרה אוניברסלי בגודל 5 אינץ' (GTCTCCTCTGTGTCagtccggtccggtattttcCACCAGAGGAGAC-3') היוצר מבנה לולאת גזע. (האותיות העליונות תואמות לרצף חוזר הפוך ולאותיות התחתונות לאזור הלולאה).
    2. חלק מרצף עמוד השדרה בגודל 5' היוצר לולאה משמש פריימר הפוך להגברת PCR עוקבת (רצף מודגש-נוי ברצף עמוד השדרה). הוסף רצף הרחבה של 6 nt המשלים הפוך לקצה ה-3 אינץ' של ה-miRNA של העניין לפריימר לולאת הגבעול כדי לספק ספציפיות לתמלול הפוך (איור 1A משלים).
      הערה: עצבו את פריימר התמלול ההפוך של לולאת הגבעול כפי שתואר על ידי חן ואח '69 ואריקה ורקוני-גסיק ואח ' 70,71,72. לדוגמה, פריימר התמלול ההפוך של לולאת גזע עבור Stu-miR160 מתוכנן כ- 5'-GTCTCCTCTGTGTGCagtccggtattcGCACCAGAGGAGAGGCATA-3'. פריימר התמלול ההפוך של לולאת הגבעול עבור משפחת תפוחי האדמה miR165/166 מתוכנן כ- 5'-GTCTCCTCTGTGTGCaggtccggtatttcCACCAGAGGAGAGGGGG(A/G)A-3'. (רצפי האותיות הרישיות הנועזים מספקים את הספציפיות של תמלול הפוך עבור miRNAs ספציפיים).
    3. הגדר את תגובת התמלול ההפוך על ידי ערבוב 50-200 ננוגרם של RNA כולל, 1 μL של פריימר שעתוק הפוך לולאת גזע (100 μM), 2 μL של חיץ 10x, 0.2 μL של מעכב RNase (40 U /μL), 0.25 μL של dNTPs (10 mM כל אחד), ו 1 μL של תמלול הפוך (200 U /μL) על קרח. הוסף ddH2O ללא גרעין לנפח כולל של 20 μL.
    4. בצע תמלול הפוך באמצעות הליך התמלול ההפוך הפעום. לדגור את תערובת תגובת שעתוק הפוך ב 16 °C (5 °F) במשך 30 דקות, לבצע מחזור טמפרטורה של 30 °C (50 °F) במשך 30 °C (50 °F) עבור 1 s, עבור סך של 60 מחזורים, ולהפעיל את התמלול ההפוך על ידי דגירה ב 85 °C (5 דקות).
    5. לניתוח PCR בזמן אמת של ביטוי miRNA, עצב את הפריימר הקדמי המבוסס על רצף ה-miRNA אך אל תכלול רצפים החופפים עם פריימר התמלול ההפוך של לולאת גזע שתוכנן לעיל. הוסיפו הרחבה של 3-7 nt ל-5' של הפריימר הקדמי כדי למטב את האורך, טמפרטורת ההיתוך ותוכן ה-GC (איור 1 משלים).
      הערה: הפריימר ההפוך האוניברסלי הוא 5'-GTGCAGGGTCCGGT-3'. לדוגמה, פריימר התמלול ההפוך של לולאת גזע עבור Stu-miR160 מתוכנן כ- 5'-CGGCTTCCTGGCTCC-3'. פריימר התמלול ההפוך של לולאת גזע עבור משפחת miR165/166 הוא 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. הרצפים הנועזים משמשים כהרחבות של 5' לאופטימיזציה של פריימר. ניתן לעצב את פריימרי התמלול ההפוך של לולאת הגבעול ואת פריימרי ה-PCR בזמן אמת עבור miRNA באמצעות כלי העיצוב miRNA Primer Design Tool73.
  4. סנתז cDNAs של mRNAs היעד על-ידי PCR תמלול הפוך סטנדרטי (RT-PCR). לדגור על תערובת תגובת שעתוק הפוך ב 37 °C (60 °F) במשך 60 דקות ולהנטרל את התמלול ההפוך על ידי חימום ל 85 °C (5 דקות).
    הערה: (1) לחזות mRNAs יעד באמצעות psRNATarget program74 אם mRNAs היעד אינם ידועים. (2) פריימר התמלול ההפוך האוניברסלי עבור mRNA הוא פריימר מעוגן 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVTVN-3'.
  5. הגדר את תגובת ה-PCR בזמן אמת הן עבור miRNA של עניין והן עבור mRNAs היעד. ערבבו 0.5 μL של cDNA תבנית, 5 μL של 2x חיץ PCR בזמן אמת עם ירוק SYBR, 0.05 μL של כל פריימר קדימה והפוך (40 מיקרומטר) ו 4.4 μL של ddH2O בנפח כולל של 5 μL על קרח.
  6. דגירה ב 95 °C (55 °F) במשך 3 דקות, 40 מחזורים של 95 °C (55 °F) במשך 3 °C (60 °F) עבור 30 °C (60 °F). בצע ניתוח עקומת המסה הבאים כדלקמן: דגירה ב 95 °C (5 °F) במשך 15 °C (60 °F) ברמפה של 20 °C (60 °F) במשך 60 °C (60 °F) נתח את ערכי Ct באמצעות שיטות ΔΔCt76,77 והתווה את האמצעים עם שגיאות סטנדרטיות.
    הערה: (1) ניתן לעצב את פריימרי ה- PCR בזמן אמת עבור mRNAs יעד כמתואר75. (2) פוליוביקוויטין תפוחי אדמה 10 גן יכול לשמש בקרה פנימית לנורמליזציה בתפוח אדמה. הפריימר הקדמי של הגן פוליוביקוויטין 10 תפוחי אדמה הוא 5'-ATGTTTCTCTTATGTGTGGTTG-3' ואת הפריימר ההפוך 5'-TTATTTATTATTCACATAAACCAGTTCAACC-3'. (3) לניתוח PCR בזמן אמת, זיהום ויצירת פריימר-עמעם עשויים ליצור תוצאות חיוביות שגויות. כדי לעקוב אחר הגברה לא מדעית ולהגדיל את החבות של ניתוח PCR בזמן אמת, מומלץ לכלול פקדים ללא תבנית ולתמלול הפוך לבדיקות PCR בזמן אמת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 2 מציג את צמחי תפוחי האדמה PVX-STTM165/166 (קטהדין) עם צמיחה חוץ רחמית של רקמות עלים מהצד האבקסיאלי של למינה עלים לאורך הוורידים. פנוטיפים חמורים יותר כגון היווצרות עלה בצורת חצוצרה נצפו גם. לעומת זאת, לא נצפתה חריגה פנוטיפית במפעלי הבקרה של PVX. תוצאות אלה מראות כי מערכת VbMS הייתה יעילה בדיכוי תפקוד miRNA אנדוגני בצמחי תפוחי אדמה טטרפלואידים ומערכת PVX-VbMS הייתה כלי גנטי חזק כדי לקבוע את הפונקציה של miRNAs ספציפיים או משפחות miRNA.

איור 3 מציג את צמחי תפוחי האדמה PVX-STTM165/166 (רוסט בורבנק) עם צמיחת רקמת עלה חוץ רחמי מהצד האבקסיאלי של למינת העלים לאורך הוורידים. תוצאות אלה מראות כי מערכת PVX-VbMS ניתן להחיל על מינים אחרים תפוחי אדמה, כולל cultivar תפוחי אדמה גדול.

Figure 1
איור 1: דיאגרמה סכמטית של וקטורים מבוססי VbMS מבוססי PVX ומבנה PVX-STTM165/166. LB = גבול שמאלי T-DNA; RB = גבול ימין T-DNA; 35S = וירוס פסיפס כרובית 35S מקדם; NOST = nopaline synthase שליחות קטלנית; RdRP = RNA פולימראז תלוי RNA; TGB1 = חלבון בלוק גנים משולש 1; TGB2 = חלבון בלוק גנים משולש 2; TGB3 = חלבון בלוק גנים משולש 3; sgP = מקדם RNA תת-גנומי PVX; CP = חלבון מעיל; LIC Cassette = קלטת שיבוט עצמאית של קשירה; 48 nt = 48 מקשר לולאת גזע לא מושלם נוקלאוטיד. STTM165/166 מורכב מרצפי TM דו-מושביים של miR165/166 המופרדים באמצעות רצף מקשר לולאת גזע לא מושלם של 48 nt. ראש החץ הירוק בווקטור PVX-LIC מציין את אתר ההתחלה של ה- RNA התת-גנומי של PVX המסתיר את רצף STTM. המקפים המשולשים של המינוס ברצפי miRNA מציינים את אתרי המחשוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: VbMS של miR165/166 במגוון תפוחי האדמה הטטרפלואידים Katahdin. פנוטיפים של צמחי תפוחי האדמה (Katahdin) המבטאים את השליטה הווקטורית PVX או PVX-STTM165/166. חיצי מגנטה מציינים מבני עלים שנוצרו באופן חוץ רחמי בוורידים של העלים. ראש החץ הכתום מציין מבני עלים דמויי חצוצרה. פסים = 1 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: VbMS של miR165/166 במגוון תפוחי האדמה הטטרפלואידים רוסט בורבנק. פנוטיפים של צמחי תפוחי האדמה (Russet Burbank) מבטאים וקטור PVX כמו שליטה או PVX-STTM165/166. חיצי מגנטה מציינים מבני עלים שנוצרו באופן חוץ רחמי בוורידים של העלים. פסים = 1 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 1 משלים: דיאגרמות סכמטיות של ניתוח RT-PCR לולאת גזע של miRNAs ועיצוב פריימר PCR בזמן אמת. (A) ניתוח RT-PCR לולאת גזע של miRNAs. במהלך שעתוק הפוך, הכריכה של פריימר לולאת גזע ל- miRNA 3' יזמה את התמלול ההפוך ו- cDNA היה מסונתז. מוצרי PCR הוגברו עם פריימר קדמי ספציפי של ה- miRNA של עניין ואת פריימר הפוך אוניברסלי. (ב) עיצוב פריימר PCR בזמן אמת. פריימרים קדמיים ואחורה עבור Stu-miR160 וסטו-miR165/166 מוצגים. הפריימר הקדמי תוכנן על סמך רצף ה- miRNA אך לא כלל רצפים חופפים עם פריימר התמלול ההפוך של לולאת גזע מעוצב. הרחבה של 3-7 nt נוספה ל- 5' של הפריימר הקדמי כדי להתאים את האורך, טמפרטורת ההיתוך ותוכן GC. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מציגים מערכת השתקה miRNA מבוססת PVX כדי לאפיין את הפונקציה של miRNAs אנדוגני בתפוח אדמה על ידי שילוב עיצוב STTM לתוך וקטור PVX. מערכת VbMS הוכיחה את עצמה כיעילה בהשתקת miRNA165/166 בתפוחי אדמה, משפחת מירנ"א שמורה ביותר על פני מיני צמחים.

גישת TM פותחה כדי להפריע לביטוי של miRNAs המבוסס על חיקוי יעד miRNA מלאכותי שנועד ליצור לולאת אי התאמה באתר המחשוף הצפוי בתוך רצף ההשלמה של miRNA המביא לפירוק של miRNA ממוקד ומעצר פעילותה22,35,78,79 . השיוך בין מולקולות TM לבין miRNAs היעד חוסם את הפונקציה של miRNAs על ידי הפלת רמות של miRNA ספציפי או משפחת miRNA, מה שמוביל upregulation של mRNAs היעד. מספר טכנולוגיות TM פותחו להשתקת miRNAs, כולל חיקוי יעד miRNA אנדוגני (eTM)79,80, חיקויי חיקויים מבוססי eTM (MIMs)35,78, חיקויי יעד טנדם קצרים (STTMs)22,53, גישת פענוח miRNA עם TMs המשולבת ב- UTR 3' של תמלילי קידוד חלבונים81, ו- miRNA SPONGEs המכיל אתרי איגוד miRNA עם שני אי-התאמות מרכזיות ל- miRNAs היעד (cmSPs) 82. STTM מורכב משני אתרי איגוד miRNA עם בליטה של 3 nt אי התאמה, מקושר על-ידי spacer 48 nt כי היה אופטימיזציה אמפירית. STTM מפעיל עיכוב יעיל של miRNAs היעד22,53. טכנולוגיית STTM יושמה לאחרונה בהצלחה לניתוח פונקציונלי בקנה מידה גדול של miRNAs מצמח המודל Arabidopsis וגידולים גדולים כגון אורז ותירס. זה הוביל לגילוי של תפקידים חסרי תקדים של כמה miRNAs אנדוגני מעורב תשואה ושליטה הורמונלית, אשר מחזיק הבטחה גדולה בשיפור גידול יבול47. בהתבסס על יתרונות אלה של עיצוב STTM, בחרנו STTM ושילבנו אותו בווקטור PVX לאפיון פונקציונלי של miRNAs בתפוחי אדמה. ראוי לציין כי העיצובים השונים של מולקולות TM, כגון cmSPs, MIMs ו- STTMs, יש יעילות משתנה בחסימת הפונקציה של miRNAs82 שונים. לכן, שימוש באסטרטגיות תכנון TM שונות עשוי לעזור להשיג דיכוי miRNA יעיל יותר. ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה של הקשר האורך והרצף של הבליטה שאין דומה לה, כמו גם שינויי הנוקלאוטיד הצמודים לאתרי איגוד ה-miRNA, לקבלת תוצאה ספציפית של השתקת miRNA22,36,38,78,83. יתר על כן, עיצוב של מולקולות TM תחת הדרכה של תחזיות חישוביות יחד עם ניתוח ניסיוני כנראה יוביל עיכוב אמין יותר של miRNAs84.

הוכח כי מערכת VIGS מבוססת PVX יעילה בהפעלת השתקת RNA הן במינים דיפלואידיים והן במינים מעובדים של סולנום טטרפלואיד. ההשתקה המערכתית מבוססת PVX מושרה ומתוחזקת בכל רקמות הפוליאר על צמחי תפוחי אדמה מופצים במבחנה במשך מספר מחזורים ובפריה שנוצרה microtubers85. לאחרונה דיווחנו כי מערכת VIGS מבוססת PVX יכולה להשתיק גנים של עניין בכמה cultivars תפוחי אדמה טטרפלואידים, כגון Ancilla, אראן פיילוט, מריוס בארד, ו Serrana86. נותר לקבוע אם אפקט VbMS מבוסס PVX יכול להיות מועבר ומתמשך במשך כמה דורות באמצעות התפשטות וגטטיבית בתפוח אדמה. גישות מהונדסות כדי להכניס מולקולות TM ביציבות לתוך צמחי תפוחי אדמה עדיין מומלץ כאשר ההשפעות ההשתקה של miRNAs של עניין צריך להישמר בדורות הבאים.

זוהו רנ"א רבים המעורבים בגידול ופיתוח תפוחי אדמה. RNA-seq, ריצוף הגנום והחיזוי הביו-פורמטי הקלו מאוד על זיהוי ה-miRNAs והיעדים שלהם17,19,20,21. עד כה, שלושה גנומי תפוחי אדמה כבר רצפים, כולל מונופלואיד כפול S. tuberosum הקבוצה Phureja שיבוט DM1-3, מין דיפלואיד בר S. commersonii, ושיבוט בטן דיפלואיד M6 של S. chacoense87,88,89. עד כה, רק מספר מוגבל של miRNAs תפוחי אדמה אופיינו מבחינה פונקציונלית, ברוב המקרים באמצעות טכנולוגיית TM. לדוגמה, LOCUS T הפורח (FT) homolog SP6A פועל כאות נייד לשליטה על שחפת בתפוח אדמה והוא ממוקד על ידי miRNA, דיכוי ביטוי של SP6A (SES), אשר מתווך מחשוף המושרה בחום של תמלול SP6A90,91. ביטוי יתר בתיווך STTM של SES חוסם את הפעילות של SES miRNA ומאפשר שחפת גם בתנאי חום מתמשכים91. נוקאאוט של miR160, miRNA המעורב בתגובה החיסונית, על ידי גישת eTM הראה כי miR160 נדרש הן מקומי והן התנגדות מערכתית נרכשת נגד Phytophthora infestans בתפוח אדמה92.

באמצעות גישה ביואינפורמטית, זוהו שמונה משפחות ייחודיות של miRNAs המתמקדות נוקלאוטידים מחייב אתר לאוצין עשיר חוזר (NLR) קולטנים חיסוניים בתפוחי אדמה ועגבניות זוהו93. אחת ממשפחות ה-miRNA, miR482/2118, מכוונת למספר חברי פרל"ר המעניקים עמידות בפני פתוגנים שונים ודיכוי miRNAs המשפחה miR482/2118 בתיווך ביטוי מהונדס של מבני STTM מוביל להתנגדות מוגברת בעגבניות נגד P. infestans ו- Pseudomonas syringae13. ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך ש- RNAs קטנים המיוצרים בפתוגנים ובמארחים יכולים לנוע בין שני האורגניזמים ולדכא את ביטוי הגנים אחד של השני בתיווך הפרעות RNA חוצות ממלכה94,95,96,97. לדוגמה, חיקויי יעד של sRNAs שמקורו בפתוגן oomycete יכולים לחפש sRNAs פולשים אלה ולהפחית זיהום פתוגן61. זה יהיה מעניין לבחון אם מערכת VbMS הנוכחית ניתן להשתמש כדי למקד sRNAs נגזר פתוגן כדי לשפר את ההתנגדות בצמחים.

לסיכום, מערכת השתקת miRNA מבוססת וירוסים היא מהירה וחסכונית וניתן לבצעה במתכונת של תפוקה גבוהה. מערכת VbMS מבוססת PVX מספקת כלי גנטי יעיל וחזק כדי לקבוע את הפונקציה של miRNAs ספציפיים או משפחות miRNA וגנים היעד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ללא.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר יול ליו מאוניברסיטת צינגחואה על שסיפק את וקטור PVX-LIC. עבודה זו נתמכה על ידי קרן סטארט-אפ מטקסס A&M AgriLife Research ופרויקט האץ' TEX0-1-9675 מהמכון הלאומי למזון וחקלאות של משרד החקלאות האמריקאי ל- JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145 (2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -J., Lin, S. -I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614 (2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489 (2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233 (2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714 (2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573 (2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178 (2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277 (2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627 (2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621 (2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500 (2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G. Functional Genomics: Methods and Protocols. Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. , Springer. New York. 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl 1 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl 1 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl 1 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl 1 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , Supplementary Files 20744 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190 (2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , Cold spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553 (1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P. RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. Kodama, H., Komamine, A. , Humana Press. 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12 (2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E. Plant Epigenetics: Methods and Protocols. Kovalchuk, I. , Springer US. 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168 (2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031 (2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28 (2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330 (2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088 (2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189 (2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs - Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

Tags

מדעי הסביבה בעיה 159 השתקת מיקרו-רנ"א מבוססת וירוסים (VbMS) וירוס תפוחי אדמה X (PVX) מיקרורנ"א (miRNA) חיקוי יעד (TM) חיקויי יעד טנדם קצרים (STTMs) צינור סולנום
וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter