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आलू वायरस एक्स आधारित माइक्रोआरएनए साइलेंसिंग (वीबीएमएस) आलू में।

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

हम आलू वायरस एक्स (पीवीएक्स) आधारित माइक्रोआरएनए साइलेंसिंग (वीबीएमएस) प्रणाली के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ताकि आलू में कार्यात्मक रूप से अंतर्जात माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) को चिह्नित किया जा सके। ब्याज के miRNA के लक्ष्य नकल (TM) अणुओं को PVX वेक्टर में एकीकृत किया जाता है और लक्ष्य miRNA या miRNA परिवार को चुप करने के लिए आलू में क्षणिक रूप से व्यक्त किया जाता है।

Abstract

वायरस-आधारित माइक्रोआरएनए साइलेंसिंग (वीबीएमएस) पौधों में माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक तेज और कुशल उपकरण है। VbMS प्रणाली विकसित की गई है और Nicotiana benthamiana, टमाटर, Arabidopsis, कपास, और गेहूं और मक्का जैसे मोनोकोट पौधों सहित विभिन्न पौधों की प्रजातियों के लिए लागू किया गया है। यहां, हम आलू में अंतर्जात miRNAs को चुप करने के लिए PVX-आधारित VbMS वैक्टर का उपयोग करके एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एक विशिष्ट miRNA की अभिव्यक्ति को नीचे गिराने के लिए, ब्याज के miRNA के लक्ष्य नकल (टीएम) अणुओं को डिजाइन किया गया है, पौधे के वायरस वैक्टर में एकीकृत किया गया है, और एग्रोबैक्टीरियम घुसपैठ द्वारा आलू में व्यक्त किया गया है ताकि ब्याज के अंतर्जात miRNA को सीधे बांधा जा सके और इसके कार्य को अवरुद्ध किया जा सके।

Introduction

संयंत्र माइक्रोआरएनए (miRNAs) को 20-24 न्यूक्लियोटाइड-लंबे, परमाणु-एन्कोडेड नियामक आरएनए 1 के रूप में चिह्नित किया गया है और पौधे की जैविक प्रक्रियाओं के लगभग हर पहलू में मौलिक भूमिका निभाता है, जिसमें विकास और विकास 2,3, प्रकाश संश्लेषण और चयापचय 4,5,6,7, हार्मोन संश्लेषण और सिग्नलिंग 8,9, जैविक और अजैविक प्रतिक्रियाएं शामिल हैं10, 11,12,13, और पोषक तत्व और ऊर्जा विनियमन 14,15। संयंत्र miRNAs की नियामक भूमिकाओं को अच्छी तरह से क्रमादेशित किया जाता है और आमतौर पर पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल स्तरों पर या तो लक्ष्य mRNA को दबाकर या अनुवादिक रूप से दबाकर पूरा किया जाता है।

आलू 16,17,18,19,20,21 में एमआईआरएनए की पहचान, ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग और लक्ष्य की भविष्यवाणी की दिशा में जबरदस्त प्रगति हुई है। हालांकि, आलू सहित पौधों में एमआईआरएनए का कार्यात्मक लक्षण वर्णन, कुशल और उच्च-थ्रूपुट आनुवंशिक दृष्टिकोण की कमी के कारण अन्य जीवों से पीछे रह गया है। मानक हानि-कार्य विश्लेषण द्वारा व्यक्तिगत miRNA का कार्यात्मक विश्लेषण करना चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि अधिकांश miRNAs काफी आनुवंशिक अतिरेक 22 वाले परिवारों से संबंधित हैं। इसके अलावा, एक एकल miRNA कई लक्ष्य जीन23 को नियंत्रित कर सकता है और कई अलग-अलग miRNas एक ही आणविक मार्ग को सहयोगी रूप से 24,25 से संशोधित कर सकते हैं। ये गुण एक विशिष्ट miRNA या miRNA परिवार के कार्य को चिह्नित करना मुश्किल बनाते हैं।

MIRNAs के अधिकांश कार्यात्मक विश्लेषण ने लाभ-के-फ़ंक्शन दृष्टिकोणों पर बहुत अधिक भरोसा किया है जिनकी स्पष्ट सीमाएं हैं। कृत्रिम miRNA (amiRNA) विधि एक उच्च स्तर पर miRNAs का उत्पादन करने के लिए अंतर्जात प्राथमिक टेपों (pri-miRNAs) का शोषण करती है, जिससे लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति 26,27,28,29 का निषेध होता है। हालांकि, सक्रियण टैगिंग और miRNA overexpression एक मजबूत संवैधानिक 35S प्रमोटर का उपयोग करके अक्सर miRNAs की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का कारण बनता है जो विवो स्थितियों में प्रतिनिधि नहीं हैं और इसलिए mirnas30 के अंतर्जात कार्य को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण विकसित किया गया है जिसमें लक्ष्य जीन के miRNA-प्रतिरोधी रूपों की अभिव्यक्ति शामिल है जिसमें बाध्यकारी और / या दरार साइटों में अशुद्ध उत्परिवर्तन होते हैं31,32,33। लेकिन यह दृष्टिकोण संभावित रूप से ट्रांसजेनिक कलाकृतियों के कारण एमआईआरएनए-प्रतिरोधी लक्ष्य ट्रांसजीन से व्युत्पन्न फेनोटाइप की गलत व्याख्या का कारण बन सकता है। इसलिए, इन लाभ-के-फ़ंक्शन अध्ययनों से निष्कर्ष सावधानी के साथ तैयार किए जाने चाहिए34। उपर्युक्त वर्णित दृष्टिकोणों की एक और प्रमुख सीमा यह है कि उन्हें परिवर्तन की आवश्यकता होती है, जो श्रम-गहन और समय लेने वाली है। इसके अलावा, ट्रांसजीन-निर्भर दृष्टिकोण शायद ही ट्रांसफॉर्म-अड़ियल पौधों की प्रजातियों के लिए लागू होते हैं। इसलिए, mirnas के कार्य को सुलझाने के लिए एक तेज और कुशल हानि-के-फ़ंक्शन दृष्टिकोण को विकसित करना आवश्यक है।

परिवर्तन प्रक्रिया की शर्त को बायपास करने के लिए, वायरस-व्युत्पन्न वैक्टर के साथ लक्ष्य नकल (टीएम) रणनीतियों के संयोजन से वायरस-आधारित माइक्रोआरएनए साइलेंसिंग (वीबीएमएस) स्थापित किया गया है। VbMS प्रणाली में, कृत्रिम रूप से डिज़ाइन किए गए टीएम अणुओं को वायरस बैकबोन से क्षणिक रूप से व्यक्त किया जाता है, जो पौधे अंतर्जात miRNAs35,36 के कार्य को विच्छेदित करने के लिए एक शक्तिशाली, उच्च-थ्रूपुट और समय-बचत उपकरण की पेशकश करता है। VbMS शुरू में तम्बाकू रैटल वायरस (TRV)35,36,37 के साथ N. benthamiana और टमाटर में विकसित किया गया था और आलू वायरस X (PVX)38, कपास पत्ती crumple वायरस (ClCrV)39, ककड़ी मोज़ेक वायरस (CMV)40,41,42, चीनी गेहूं मोज़ेक वायरस (CWMV)43 सहित विभिन्न अन्य वायरस अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग करके Arabidopsis, कपास, गेहूं, और मक्का के लिए विस्तारित किया गया है , और जौ पट्टी मोज़ेक वायरस (BSMV)44,45.

आलू (सोलनम ट्यूबरोसम) चौथी सबसे महत्वपूर्ण खाद्य फसल है और दुनिया में सबसे व्यापक रूप से उगाई जाने वाली गैर-सीरियल फसल है, मुख्य रूप से इसके उच्च पोषण मूल्य, उच्च ऊर्जा उत्पादन और अपेक्षाकृत कम इनपुट आवश्यकताओं के कारण। आलू की कई विशेषताएं इसे एक आकर्षक डाइकोटिलेडोनस मॉडल प्लांट बनाती हैं। यह एक वनस्पति रूप से प्रचारित पॉलीप्लॉइड फसल है जिसमें उच्च आउटक्रॉसिंग दर, हेटरोजाइगोसिटी और आनुवंशिक विविधता है। हालांकि, आज तक, वीबीएमएस का उपयोग करके आलू में एमआईआरएनए के कार्य की विशेषता वाली कोई रिपोर्ट नहीं है। यहां, हम आलू के पौधों में miRNAs के कार्य का मूल्यांकन करने के लिए एक बंधाव-स्वतंत्र क्लोनिंग (एलआईसी) -अनुकूलित आलू PVX-आधारित VbMS दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं38। हमने वीबीएमएस परख को चित्रित करने के लिए miR165/166 परिवार का चयन किया क्योंकि miR165/166 परिवार और उनके लक्ष्य mRNA और कक्षा III होमियोडोमेन / ल्यू जिपर (HD-ZIP III) प्रतिलेखन कारकों को बड़े पैमाने पर 22,47,48 की विशेषता दी गई है। HD-ZIP III जीन मेरिस्टेम विकास और अंग ध्रुवीयता के प्रमुख नियामक हैं, और miR165/166 फ़ंक्शन के दमन से HD-ZIP III जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है, जिसके परिणामस्वरूप प्लियोट्रोपिक विकासात्मक दोष जैसे कि कम एपिकल प्रभुत्व और पत्ती ध्रुवीयता के विकृत पैटर्न 22,35,38,41 . आसानी से स्कोरेबल विकासात्मक फेनोटाइप miRNA165/166 के मौन के साथ सहसंबद्ध PVX-आधारित VbMS परख की प्रभावशीलता के सटीक मूल्यांकन को सक्षम करते हैं।

इस अध्ययन में, हम प्रदर्शित करते हैं कि पीवीएक्स-आधारित वीबीएमएस प्रणाली आलू में एमआईआरएनए के कार्य को प्रभावी ढंग से अवरुद्ध कर सकती है। क्योंकि पीवीएक्स-आधारित वायरस-प्रेरित जीन साइलेंसिंग (वीआईजीएस) प्रणाली को कई आलू किस्मों 49,50,51,52 में स्थापित किया गया है, इस पीवीएक्स-आधारित वीबीएमएस दृष्टिकोण को संभवतः द्विगुणित और टेट्राप्लोइड आलू प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. आलू के पौधे उगाएं।

  1. संस्कृति ट्यूबों (25 x 150 मिमी) में इन विट्रो आलू के पौधों को मुराशिगे और स्कूग (एमएस) मीडिया प्लस गैम्बोर्ग के विटामिन (एमएस बेसल नमक मिश्रण, गैम्बोर्ग के विटामिन, 30 ग्राम / एल सुक्रोज, 3.5 ग्राम / एल आगर, पीएच = 5.7) के साथ प्रचारित करें। 20-22 °C, 16 h प्रकाश / 8 h अंधेरे photoperiod, और प्रकाश तीव्रता 120 μmol / m2 s1 के तहत विकास कक्ष में ट्यूबों को रखें।
    नोट: नए शूट और जड़ें आमतौर पर पौधों से 1-2 सप्ताह में विकसित होती हैं। हर महीने ताजा एमएस / गैम्बोर्ग के विटामिन मीडिया के साथ पौधों का प्रचार करें।
  2. चार सप्ताह बाद, मिट्टी में विट्रो पौधों में प्रत्यारोपण करें और उन्हें 20-22 डिग्री सेल्सियस, 16 एच प्रकाश / 8 एच अंधेरे फोटोपीरियड, और प्रकाश तीव्रता 120 μmol / m2 s1 के तहत ग्रीनहाउस में विकसित करें।
    नोट: नई विकसित जड़ों और पत्तियों के साथ पौधे प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त हैं। पहले 3-4 दिनों के लिए ताजा प्रत्यारोपित पौधों के लिए नमी बनाए रखें।

2. VbMS वैक्टर का निर्माण.

  1. डिजाइन और छोटे अग्रानुक्रम टीएम अणुओं (एसटीटीएम, चित्रा 1) 22,53 ब्याज के miRNA के लिए क्लोन.
    नोट:: प्रयोगात्मक डेटा के आधार पर या miRbase डेटाबेस से miRNA अनुक्रम प्राप्त करें54,55,56,57,58,59. इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले miR166 अनुक्रम को पहले 60 वर्णित किया गया है।
    1. एक बेमेल अनुक्रम, आमतौर पर 5'-CTA-3', को miRNA के 10 वें-11 वें न्यूक्लियोटाइड्स के अनुरूप साइट पर miRNA के रिवर्स पूरक अनुक्रम में सम्मिलित करके टीएम मॉड्यूल को डिज़ाइन करें।
      नोट: उदाहरण के लिए, Stu-miR160 अनुक्रम 5'-UGCCUGGCUCCCUGUUGCC-3'61 है, जहां 10 वीं-11 वीं न्यूक्लियोटाइड बोल्ड में है। रिवर्स पूरक अनुक्रम (डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड्स में) 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' है और बेमेल उभार सम्मिलन साइट बोल्ड में दिखाया गया है। टीएम अणु अनुक्रम (डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड) 5 '-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3' होना चाहिए।
    2. एसटीटीएम टुकड़े (चित्रा 1) क्लोनिंग के लिए प्राइमर डिजाइन करें। पीसीआर क्लोनिंग के लिए टेम्पलेट के रूप में 48-nt स्पेसर अनुक्रम के साथ डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करें। आगे प्राइमर में एक LIC1 लिंकर (5'-CgACgACAAgACCGT-3') होता है, जो टीएम अणु के लिए डिज़ाइन किए गए उपरोक्त का आगे का अनुक्रम होता है, और 48-nt स्पेसर (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3') का आंशिक 5 'अनुक्रम होता है। रिवर्स प्राइमर में एक LIC2 लिंकर (5'-gAggAgCCgT-3'), TM अणु का रिवर्स पूरक अनुक्रम, और 48-nt स्पेसर (5'-ATTCTTTCTTTCTTTACACCAT-3') के 3 'अनुक्रम के लिए एक आंशिक रिवर्स पूरक) होता है।
      नोट: 48-nt स्पेसर अनुक्रम 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAATATGGTCTAAAGAAGAAT-3' है। उदाहरण के लिए, STTM-miR160 के लिए, आगे प्राइमर 5'-CgACgACAAgACCGT-GGCATACAGGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTGTTGGTGTGGTGGT-3'; रिवर्स प्राइमर 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' (चित्रा 1) होना चाहिए।
    3. संश्लेषित सार्वभौमिक 48-nt स्पेसर टेम्पलेट और एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ के रूप में उपयोग करके पीसीआर द्वारा 50 μL की मात्रा में STTM टुकड़े को बढ़ाना।
      1. प्रत्येक प्राइमर (40 μM) के 0.5 μL, 48-nt स्पेसर ओलिगो (40 μM) के 0.5 μL, 10x PCR बफर के 5 μL, dNTP मिश्रण के 1 μL (10 mM प्रत्येक), उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ (10 U/ μL) के 0.1 μL, और ddH2O के 43 μL को 50 μL की कुल मात्रा में मिलाकर पीसीआर प्रतिक्रिया को निम्नानुसार सेट करें: 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 45 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 32 चक्र, 45 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 60 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
    4. इथेनॉल वर्षा द्वारा एसटीटीएम टुकड़े को शुद्ध करें। पीसीआर उत्पादों में इथेनॉल के 2.5 वॉल्यूम और 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच = 4.0) की 1/10 मात्रा जोड़ें। 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर जोरदार और सेंट्रीफ्यूज मिलाएं। supernatant निकालें और 70% इथेनॉल के 1 mL के साथ गोली कुल्ला। गोली सूखी और ddH2O के 20 μL में इसे भंग.
      नोट: एसटीटीएम पीसीआर उत्पादों के प्रवर्धन की जांच करने के लिए डीएनए वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करें।
    5. शुद्ध एसटीटीएम पीसीआर उत्पाद के 2.5 μL, 10x T4 डीएनए पोलीमरेज़ बफर के 0.5 μL, 1 M dithiothreitol (DTT) के 0.05 μL, 100 mM dATP के 0.25 μL, T4 डीएनए पोलीमरेज़ (3 U / μL) के 0.1 μL, और ddH2O के 1.6 μL को मिलाकर बर्फ पर T4 डीएनए पोलीमरेज़ प्रतिक्रिया स्थापित करें, और 1.6 μL के लिए ddH2O की कुल मात्रा 5 μL के लिए 5 μL के लिए 5 μL के लिए 5 μL मिश्रण। और T4 डीएनए पोलीमरेज़ को निष्क्रिय करने के लिए 20 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर उत्पादों का इलाज करें।
  2. PVX-आधारित VbMS निर्माण तैयार करें।
    1. 100 μL की मात्रा में SmaI (20 U / μL) के 2.5 μL के साथ PVX-LIC plasmid38 के 5 μg को डाइजेस्ट करें।
    2. पचे हुए PVX-LIC उत्पादों के लिए फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोप्रोपेनॉल (25: 24: 1, पीएच = 6.7 / 8.0) की एक समान मात्रा जोड़ें और जोर से मिश्रण करें। 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant को एक नई सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। क्लोरोफॉर्म की एक समान मात्रा जोड़ें: आइसोप्रोपेनॉल (24: 1) और भंवर को सख्ती से। 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
      नोट:: PVX-LIC वेक्टर क्लोनिंग के लिए LIC कैसेट harbors. पीवीएक्स-एलआईसी वेक्टर के एलआईसी कैसेट में एक सीसीडीबी जीन और एक क्लोराम्फेनिकोल-प्रतिरोधी जीन होता है और इसे ई कोलाई स्ट्रेन डीबी 3.1 में बनाए रखने / प्रचारित करने की आवश्यकता होती है, जिसमें एलबी माध्यम का उपयोग किया जाता है जिसमें कानामाइसिन (50 μg / L) और क्लोरैम्फेनिकोल (15 μg / L) होता है।
    3. supernatant एक नई सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए स्थानांतरण. इथेनॉल के 2.5 संस्करणों और 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच = 4.0) की 1/10 मात्रा जोड़ें और जोरदार मिश्रण करें। 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant को हटाने।
    4. 70% इथेनॉल और भंवर के 1 मिलीलीटर के साथ गोली को सख्ती से कुल्ला करें। 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant को हटाने। गोली सूखी और ddH2O के 100 μL के साथ पचा PVX-LIC प्लास्मिड भंग.
    5. पचे हुए PVX-LIC वेक्टर डीएनए के 2.5 μL, 10x T4 DNA पोलीमरेज़ बफर के 0.5 μL, 1 M DTT के 0.05 μL, 100 mM dTTP के 0.25 μL, और T4 DNA पोलीमरेज़ (3 U/μL) के 0.1 μL को 5 μL की कुल मात्रा में मिलाकर बर्फ पर T4 DNA पोलीमरेज़ प्रतिक्रिया सेट करें। 15 मिनट के लिए 37 °C पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें और 15 मिनट के लिए 37 °C पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें। T4 डीएनए पोलीमरेज़ को निष्क्रिय करें।
  3. एक एलआईसी प्रतिक्रिया का उपयोग कर PVX-LIC वेक्टर में STTM अनुक्रम क्लोन। T4 डीएनए पोलीमरेज़-उपचारित एसटीटीएम पीसीआर उत्पादों (5 μL) और T4 डीएनए पोलीमरेज़-उपचारित PVX-LIC प्लास्मिड (5 μL) को मिलाएं। 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 0.1 डिग्री सेल्सियस / सेकंड के रैंप पर 22 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, और पीसीआर मशीन का उपयोग करके 30 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: एलआईसी क्लोनिंग की उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए इनक्यूबेशन समय का विस्तार करें।
  4. ई कोलाई DH5α में एलआईसी प्रतिक्रिया उत्पादों के 5 μL को बदलने और 50 μg / mL kanamycin62,63 युक्त एक एलबी प्लेट पर बढ़ते हैं। क्लोनिंग प्राइमरों और पीवीएक्स-एलआईसी वेक्टर के लिए सार्वभौमिक प्राइमर के साथ पीसीआर द्वारा सकारात्मक कॉलोनियों को चुनें और सत्यापित करें, जिसके बाद अनुक्रमण किया जाता है।
    1. सकारात्मक क्लोन की पहचान करने के लिए एसटीटीएम क्लोनिंग के लिए रिवर्स प्राइमर के साथ संयोजन में PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') के लिए फॉरवर्ड प्राइमर के साथ कॉलोनी पीसीआर निष्पादित करें। पीसीआर बैंड का आकार ~ 300 बीपी होना चाहिए।
      नोट:: टर्मिनेटर चक्र sequencing64,65 द्वारा STTM टुकड़े के अनुक्रमों की जाँच करें।
  5. PVX-STTM plasmids को मान्य क्लोन से अलग करें और उन्हें Agrobacterium उपभेदों GV3101, GV2260, या EHA10562,63 में परिवर्तित करें। पीसीआर द्वारा एग्रोबैक्टीरियम कॉलोनियों को सत्यापित करें।
    नोट: PVX-LIC के लिए आगे प्राइमर और STTM क्लोनिंग के लिए रिवर्स प्राइमर का उपयोग कर PCR द्वारा Agrobacterium कॉलोनियों की पुष्टि करें।

3. आलू के पौधों में PVX-आधारित VbMS परख प्रदर्शन.

  1. मिट्टी में 4 सप्ताह पुराने इन विट्रो आलू के पौधों को ट्रांसप्लांट करें। प्रत्यारोपित पौधों को 3-4 दिनों के बाद VbMS परख के अधीन किया जाएगा।
  2. PVX-STTM plasmids युक्त Agrobacterium के साथ आलू के पौधों को टीका.
    नोट: आलू में VbMS परख के लिए, Agrobacterium-मध्यस्थता घुसपैठ और टूथपिक-scratching टीका एक साथ प्रदर्शन कर रहे हैं.
    1. चुनें और 50 μg / mL kanamycin और 50 μg / mL rifampicin युक्त तरल एलबी के 50 mL में PVX-STTM वैक्टर युक्त सकारात्मक transformants टीका। OD600 = 1.0 तक 16 h के लिए 220 rpm पर 28 °C इनक्यूबेटर में बढ़ें।
    2. उसी समय, सकारात्मक एग्रोबैक्टीरियम कॉलोनियों को कम से कम दो नए एलबी प्लेटों पर लकीरें जिसमें 50 μg / mL kanamycin और 50 μg / mL रिफैम्पिसिन होते हैं और 1 दिन के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते हैं। PVX-LIC38,66 वेक्टर को नियंत्रण के रूप में और PVX-GFP67,68 को वायरस के प्रसार की निगरानी के लिए शामिल करें।
    3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 3,400 x g पर centrifugation द्वारा Agrobacterium तरल संस्कृति ले लीजिए। घुसपैठ बफर (10 mM MgCl2, 10 mM MES, और 200 μM एसिटोसाइरिंगोन, pH = 5.6) की एक समान मात्रा के साथ Agrobacterium कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और OD600 = 1.0 को समायोजित करें। 6 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    4. Agrobacterium संस्कृति एक 1 मिलीलीटर सुई रहित सिरिंज के साथ पूरी तरह से विस्तारित पत्तियों के abaxial पक्ष में घुसपैठ.
      1. फ्लिप करें और एक हाथ से एक पत्ती पकड़ें, फिर घुसपैठ स्थल पर अक्षीय पक्ष से पत्ती लामिना का समर्थन करने के लिए एक उंगली का उपयोग करें। सिरिंज को दूसरे हाथ से पत्ती की सतह पर ऊर्ध्वाधर रखें और एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति को लामिना के अक्षीय पक्ष में घुसपैठ करें।
    5. एलबी प्लेटों से एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति को खुरचें और टूथपिक के साथ घुसपैठ किए गए आलू के पौधों के पहले एक या दो इंटरनोड्स की स्टेम सतह को खरोंच करें। धीरे से तने के एपिडर्मिस को खरोंचें। तने के माध्यम से भेदी से बचें, जिससे पौधों को गंभीर नुकसान हो सकता है।
  3. एक ग्रीनहाउस में 16 h प्रकाश / 8 h अंधेरे photoperiod और 120 μmol / m2 s1 की प्रकाश तीव्रता के साथ 22 डिग्री सेल्सियस पर घुसपैठ पौधों को विकसित करें।
    नोट: MIRNA मौन के कारण फेनोटाइप आमतौर पर 2-4 सप्ताह के पोस्टइनोक्यूलेशन (चित्रा 2, चित्रा 3) में दिखाई देते हैं। आमतौर पर घुसपैठ के बाद वीबीएमएस फेनोटाइप के प्रकट होने में 10-20 दिन लगते हैं। VbMS फेनोटाइप विशिष्ट miRNA और लक्ष्य जीन, विकास की स्थिति और आलू की किस्मों के गुणों पर निर्भर करता है।

4. अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रदर्शन.

  1. जब फेनोटाइप 2-4 सप्ताह के पोस्टइनोक्यूलेशन पर दिखाई देते हैं, तो कैंची के साथ नियंत्रण पौधों से वीबीएमएस पौधों और ऊतकों से फेनोटाइप के साथ शूट, पत्तियों, फूलों या जड़ों जैसे ऊतकों को इकट्ठा करें। एकत्रित ऊतकों से कुल आरएनए को अलग करें।
  2. वैद्युतकणसंचलन 62,63 द्वारा आरएनए गुणवत्ता की जांच करें और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ OD260 absorbance को मापकर आरएनए एकाग्रता को मापें।
  3. MiRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए स्टेम-लूप रीयल-टाइम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-पीसीआर) का उपयोग करें।
    1. विशिष्ट miRNAs के लिए, एक स्टेम-लूप रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर डिज़ाइन करें। स्टेम-लूप आरटी प्राइमरों में एक सार्वभौमिक 5 'बैकबोन और एक विशिष्ट miRNA का 3'6-nt विस्तार होता है। एक 5 'सार्वभौमिक रीढ़ (5'- GTCTCCTCTGGTGCaggggggattattgCACACACAGAGGAGAGAC-3') डिजाइन करें जो एक स्टेम-लूप संरचना बनाता है। (ऊपरी मामला एक व्युत्क्रम-दोहराए गए अनुक्रम और लूप क्षेत्र के निचले मामले से मेल खाता है)।
    2. 5 'बैकबोन अनुक्रम का हिस्सा जो एक लूप बनाता है, बाद के पीसीआर प्रवर्धन (बैकबोन अनुक्रम में बोल्ड-इटैलिक अनुक्रम) के लिए रिवर्स प्राइमर के रूप में कार्य करता है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (पूरक चित्रा 1 ए) के लिए विशिष्टता प्रदान करने के लिए स्टेम-लूप प्राइमर के लिए ब्याज के miRNA के 3 'अंत में रिवर्स-पूरक है कि एक 6-nt एक्सटेंशन अनुक्रम जोड़ें।
      नोट: डिजाइन स्टेम-लूप रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर के रूप में चेन एट al.69 और एरिका Varkonyi-Gasic et al.70,71,72 द्वारा वर्णित है. उदाहरण के लिए, स्टेम-लूप रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर के लिए Stu-miR160 5'-GTCTCCCTGGTGCaggggattattcCACACACACACAGGGAGGGGCATA-3' के रूप में डिज़ाइन किया गया है। आलू miR165/166 परिवार के लिए स्टेम-लूप रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर को 5'-GTCTCCCTGGTGCaggggtccgaggattcGCACACACACACAGGGGGGGGGGGG (A/G) A-3' के रूप में डिज़ाइन किया गया है। (बोल्ड अपरकेस अनुक्रम विशिष्ट miRNAs के लिए रिवर्स प्रतिलेखन की विशिष्टता प्रदान करते हैं)।
    3. कुल आरएनए के 50-200 एनजी, स्टेम-लूप रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर (100 μM) के 1 μL, 10x बफर के 2 μL, RNase अवरोधक (40 U / μL) के 0.2 μL, dNTPs के 0.25 μL (प्रत्येक 10 mM), और बर्फ पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (200 U / μL) के 1 μL को मिलाकर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया सेट करें। न्यूक्लिएज मुक्त ddH2O 20 μL की कुल मात्रा में जोड़ें।
    4. स्पंदित रिवर्स प्रतिलेखन प्रक्रिया का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन करें। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया मिश्रण को 30 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 30 सेकंड के लिए 30 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस और 1 सेकंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस का तापमान चक्र करें, कुल 60 चक्रों के लिए, और 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन द्वारा रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज को निष्क्रिय करें।
    5. MIRNA अभिव्यक्ति के वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के लिए, miRNA अनुक्रम के आधार पर आगे प्राइमर डिजाइन करें, लेकिन उपरोक्त डिज़ाइन किए गए स्टेम-लूप रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर के साथ ओवरलैप होने वाले अनुक्रमों को शामिल न करें। लंबाई, पिघलने के तापमान, और जीसी सामग्री (पूरक चित्रा 1) को अनुकूलित करने के लिए आगे प्राइमर के 5 'में 3-7-nt एक्सटेंशन जोड़ें।
      नोट: यूनिवर्सल रिवर्स प्राइमर 5 '-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' है। उदाहरण के लिए, स्टेम-लूप रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर के लिए Stu-miR160 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3' के रूप में डिज़ाइन किया गया है। MIR165/166 परिवार के लिए स्टेम-लूप रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3' है। बोल्ड अनुक्रम प्राइमर अनुकूलन के लिए 5 'एक्सटेंशन के रूप में काम करते हैं। स्टेम-लूप रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर और miRNA के लिए वास्तविक समय पीसीआर प्राइमरों को miRNA प्राइमर डिज़ाइन टूल 73 का उपयोग करके डिज़ाइन किया जा सकता है।
  4. मानक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-पीसीआर) द्वारा लक्ष्य एमआरएनए के सीडीएनए को संश्लेषित करें। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया मिश्रण को 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज को निष्क्रिय करें।
    नोट: (1) लक्ष्य mRNA ज्ञात नहीं हैं, तो psRNATarget program74 का उपयोग कर लक्ष्य mRNAs की भविष्यवाणी करें। (2) mRNA के लिए सार्वभौमिक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर एक लंगर प्राइमर 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTN-3' है।
  5. ब्याज के miRNA और लक्ष्य mRNA दोनों के लिए वास्तविक समय पीसीआर प्रतिक्रिया स्थापित करें। टेम्पलेट cDNA के 0.5 μL, SYBR हरे रंग के साथ 2x वास्तविक समय पीसीआर बफर के 5 μL, प्रत्येक आगे और रिवर्स प्राइमर (40 μM) के 0.05 μL, और बर्फ पर 5 μL की कुल मात्रा में ddH2O के 4.4 μL मिश्रण।
  6. 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 3 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र और 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस। एक बाद के पिघलने वक्र विश्लेषण निम्नानुसार प्रदर्शन करें: 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 20 डिग्री सेल्सियस / सेकंड के रैंप पर 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, 60 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर रखें, 0.2 डिग्री सेल्सियस / सेकंड के रैंप पर 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी रखें, और 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर रखें। Ct-मानों का विश्लेषण करें, जो कि ΠCt methods76,77 का उपयोग करके और मानक त्रुटियों के साथ साधनों को प्लॉट करते हैं।
    नोट: (1) लक्ष्य mRNA के लिए वास्तविक समय पीसीआर प्राइमरों को वर्णित 75 के रूप में डिज़ाइन किया जा सकता है। (2) आलू polyubiquitin 10 जीन आलू में सामान्यीकरण के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में काम कर सकते हैं। आलू polyubiquitin 10 जीन के लिए आगे प्राइमर 5 '-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGTGGTTG-3' और रिवर्स प्राइमर 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3' है। (3) वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के लिए, संदूषण और प्राइमर-डिमर गठन झूठे सकारात्मक परिणाम उत्पन्न कर सकते हैं। गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की निगरानी करने और वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण की देयता को बढ़ाने के लिए, वास्तविक समय पीसीआर assays के लिए टेम्पलेट और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस के बिना नियंत्रण शामिल करने की सिफारिश की जाती है।

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Representative Results

चित्रा 2 PVX-STTM165/166 आलू के पौधों (Katahdin) को नसों के साथ पत्ती लामिना के abaxial पक्ष से पत्ती के ऊतकों के अस्थानिक विकास के साथ दिखाता है। तुरही के आकार के पत्ते के गठन जैसे अधिक गंभीर फेनोटाइप भी देखे गए हैं। इसके विपरीत, पीवीएक्स नियंत्रण संयंत्रों में कोई फेनोटाइपिक असामान्यता नहीं देखी गई थी। इन परिणामों से पता चलता है कि VbMS प्रणाली tetraploid आलू पौधों में अंतर्जात miRNA समारोह को दबाने में प्रभावी था और PVX-VbMS प्रणाली विशिष्ट miRNAs या miRNA परिवारों के कार्य को निर्धारित करने के लिए एक मजबूत आनुवंशिक उपकरण था।

चित्रा 3 PVX-STTM165/166 आलू के पौधों (Russet Burbank) को नसों के साथ पत्ती लामिना के abaxial पक्ष से अस्थानिक पत्ती ऊतक विकास के साथ दिखाता है। इन परिणामों से पता चलता है कि PVX-VbMS प्रणाली को अन्य आलू प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है, जिसमें एक प्रमुख आलू की खेती भी शामिल है।

Figure 1
चित्रा 1: PVX-आधारित VbMS वैक्टर और PVX-STTM165/166 संरचना का योजनाबद्ध आरेख। एलबी = टी-डीएनए बाईं सीमा; आरबी = टी-डीएनए सही सीमा; 35S = फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर; NOST = nopaline synthase टर्मिनेटर; RDRP = आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़; TGB1 = ट्रिपल जीन ब्लॉक प्रोटीन 1; TGB2 = ट्रिपल जीन ब्लॉक प्रोटीन 2; TGB3 = ट्रिपल जीन ब्लॉक प्रोटीन 3; एसजीपी = पीवीएक्स सबजीनोमिक आरएनए प्रमोटर; सीपी = कोट प्रोटीन; एलआईसी कैसेट = बंधाव-स्वतंत्र क्लोनिंग कैसेट; 48 nt = 48 न्यूक्लियोटाइड अपूर्ण स्टेम-लूप लिंकर। STTM165/166 में miR165/166 के अग्रानुक्रम TM अनुक्रम होते हैं जो 48-nt अपूर्ण स्टेम-लूप लिंकर अनुक्रम द्वारा अलग किए जाते हैं। PVX-LIC वेक्टर में हरे रंग का एरोहेड PVX सबजीनोमिक आरएनए की शुरुआती साइट को इंगित करता है जो STTM अनुक्रम को आश्रय देता है। MIRNA अनुक्रमों में ट्रिपल माइनस हाइफ़न दरार साइटों को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: टेट्राप्लॉइड आलू किस्म Katahdin में miR165/166 के VbMS. आलू के पौधों के फेनोटाइप (Katahdin) PVX वेक्टर नियंत्रण या PVX-STTM165/166 व्यक्त करते हैं। मैजेंटा तीर पत्ती नसों में अस्थानिक रूप से उत्पन्न पत्ती संरचनाओं को निरूपित करते हैं। नारंगी एरोहेड तुरही जैसी पत्ती संरचनाओं को दर्शाता है। सलाखों = 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: टेट्राप्लॉइड आलू किस्म रुसेट बरबैंक में miR165/166 के VbMS. आलू के पौधों के फेनोटाइप (Russet Burbank) नियंत्रण या PVX-STTM165/166 के रूप में PVX वेक्टर व्यक्त. मैजेंटा तीर पत्ती नसों में अस्थानिक रूप से उत्पन्न पत्ती संरचनाओं को निरूपित करते हैं। सलाखों = 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: स्टेम-लूप आरटी-पीसीआर विश्लेषण miRNAs और वास्तविक समय पीसीआर प्राइमर डिजाइन के योजनाबद्ध आरेख। (ए) एमआईआरएनए का स्टेम-लूप आरटी-पीसीआर विश्लेषण। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के दौरान, स्टेम-लूप प्राइमर के 3 'miRNA के बंधन ने रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन शुरू किया और सीडीएनए को संश्लेषित किया गया। पीसीआर उत्पादों को ब्याज के miRNA और सार्वभौमिक रिवर्स प्राइमर के एक विशिष्ट फॉरवर्ड प्राइमर के साथ प्रवर्धित किया गया था। (बी) वास्तविक समय पीसीआर प्राइमर डिजाइन। Stu-miR160 और Stu-miR165/166 के लिए आगे और रिवर्स प्राइमर दिखाए गए हैं। आगे प्राइमर को miRNA अनुक्रम के आधार पर डिज़ाइन किया गया था, लेकिन इसमें उन अनुक्रमों को शामिल नहीं किया गया था जो डिज़ाइन किए गए स्टेम-लूप रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर के साथ ओवरलैप किए गए थे। लंबाई, पिघलने के तापमान और जीसी सामग्री को समायोजित करने के लिए आगे प्राइमर के 5 'में एक 3-7-nt एक्सटेंशन जोड़ा गया था। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हम एक PVX-आधारित miRNA मौन प्रणाली प्रस्तुत करने के लिए PVX वेक्टर में STTM डिजाइन को एकीकृत करके आलू में अंतर्जात miRNAs के कार्य को चिह्नित करने के लिए। VbMS प्रणाली आलू में miRNA165/166 को शांत करने में प्रभावी साबित हुई, जो पौधों की प्रजातियों में एक अत्यधिक संरक्षित miRNA परिवार है।

टीएम दृष्टिकोण को एक कृत्रिम miRNA लक्ष्य की नकल के आधार पर miRNAs की अभिव्यक्ति में हस्तक्षेप करने के लिए विकसित किया गया है जिसे miRNA पूरक अनुक्रम के भीतर अपेक्षित दरार साइट पर एक बेमेल लूप बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है जिसके परिणामस्वरूप लक्षित miRNA को अलग किया जाता है और इसकी गतिविधि की गिरफ्तारी होती है22,35,78,79 . टीएम अणुओं और लक्ष्य miRNAs के बीच युग्मन एक विशिष्ट miRNA या miRNA परिवार के स्तर को खटखटाकर miRNAs के कार्य को अवरुद्ध करता है, जो लक्ष्य mRNA के upregulation की ओर जाता है। कई टीएम प्रौद्योगिकियों को miRNA के मौन के लिए विकसित किया गया है, जिसमें अंतर्जात miRNA लक्ष्य मिमिक्री (eTM)79,80, eTM-आधारित miRNA mimics (MIMs)35,78, short tandem target mimics (STTMs)22,53, TMs के साथ एक miRNA डिकॉय दृष्टिकोण शामिल है, जिसमें प्रोटीन-कोडिंग टेप81 के 3 'UTR में एकीकृत किया गया है, और miRNA SPONGEs जिसमें miRNA बाइंडिंग साइटों को लक्षित करने के लिए दो केंद्रीय बेमेल (cmSPs) शामिल हैं। 82. STTM एक 3-nt बेमेल उभार के साथ दो miRNA बाध्यकारी साइटों के होते हैं, एक 48-nt स्पेसर है कि अनुभवजन्य अनुकूलित किया गया था द्वारा जुड़ा हुआ है. एसटीटीएम लक्ष्य miRNAs22,53 के कुशल निषेध को ट्रिगर करता है। एसटीटीएम तकनीक को हाल ही में मॉडल संयंत्र Arabidopsis और चावल और मक्का जैसी प्रमुख फसलों से mirnas के बड़े पैमाने पर कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है। इसने उपज और हार्मोन नियंत्रण में शामिल कई अंतर्जात miRNAs की अभूतपूर्व भूमिकाओं की खोज का नेतृत्व किया, जो फसल प्रजनन में सुधार में महान वादा करता है47। एसटीटीएम डिजाइन के इन फायदों के आधार पर, हमने एसटीटीएम को चुना और आलू में एमआईआरएनए के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए पीवीएक्स वेक्टर में इसे एकीकृत किया। यह ध्यान देने योग्य है कि टीएम अणुओं के विभिन्न डिजाइन, जैसे कि cmSPs, MIMs, और STTMs, विभिन्न miRNAs82 के कार्य को अवरुद्ध करने में परिवर्तनीय प्रभावकारिताएं हैं। इसलिए, विभिन्न टीएम डिजाइन रणनीतियों का उपयोग करने से अधिक प्रभावी miRNA दमन प्राप्त करने में मदद मिल सकती है। बेजोड़ उभार की लंबाई और अनुक्रम संदर्भ के साथ-साथ miRNA बाध्यकारी साइटों से सटे न्यूक्लियोटाइड परिवर्तनों को भी एक विशिष्ट miRNA मौन परिणाम 22,36,38,78,83 के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, प्रयोगात्मक विश्लेषण के साथ कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणियों के मार्गदर्शन में टीएम अणुओं के डिजाइन से शायद miRNAs84 के अधिक विश्वसनीय निषेध का कारण होगा।

यह दिखाया गया था कि पीवीएक्स-आधारित वीआईजीएस प्रणाली द्विगुणित और खेती की गई टेट्राप्लोइड सोलनम दोनों प्रजातियों में आरएनए साइलेंसिंग को ट्रिगर करने में प्रभावी है। PVX-आधारित प्रणालीगत मौन को प्रेरित किया जाता है और इन विट्रो प्रचारित आलू के पौधों पर पत्ती के ऊतकों में कई चक्रों के लिए और इन विट्रो उत्पन्न माइक्रोट्यूबर्स 85 पर बनाए रखा जाता है। हमने हाल ही में बताया है कि पीवीएक्स-आधारित वीआईजीएस सिस्टम कई टेट्राप्लॉइड आलू किस्मों में रुचि के जीन को चुप कर सकता है, जैसे कि एंसिला, एरन पायलट, मैरियस बार्ड और सेराना 86। यह निर्धारित किया जाना बाकी है कि क्या पीवीएक्स-आधारित वीबीएमएस प्रभाव को आलू में वनस्पति प्रसार के माध्यम से कई पीढ़ियों तक प्रसारित और बनाए रखा जा सकता है। आलू के पौधों में टीएम अणुओं को स्थिर रूप से पेश करने के लिए ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण अभी भी अनुशंसित हैं जब ब्याज के एमआईआरएनए के मौन प्रभावों को बाद की पीढ़ियों में बनाए रखने की आवश्यकता होती है।

आलू के विकास और विकास में शामिल कई एमआईआरएनए की पहचान की गई है। आरएनए-सेक, जीनोम अनुक्रमण और जैव सूचना विज्ञान भविष्यवाणी ने एमआईआरएनए और उनके लक्ष्यों की पहचान करने में बहुत मदद की है17,19,20,21। अब तक, तीन आलू जीनोम अनुक्रमित किए गए हैं, जिनमें एक दोगुना मोनोप्लॉइड एस ट्यूबरोसम ग्रुप फुरेजा क्लोन डीएम 1-3, एक जंगली द्विगुणित प्रजाति एस कॉमर्सोनी, और एस चाकोएन्स 87,88,89 का एक द्विगुणित इनब्रीड क्लोन एम 6 शामिल है। आज तक, केवल सीमित संख्या में आलू miRNAs कार्यात्मक रूप से विशेषता है, ज्यादातर मामलों में टीएम प्रौद्योगिकी का उपयोग कर रहा है। उदाहरण के लिए, FLOWERING LOCUS T (FT) होमोलॉग SP6A आलू में ट्यूबराइजेशन को नियंत्रित करने के लिए एक मोबाइल सिग्नल के रूप में कार्य करता है और एक miRNA द्वारा लक्षित किया जाता है, SP6A (SES) की अभिव्यक्ति को दबाता है, जो SP6A ट्रांसक्रिप्ट90,91 की गर्मी-प्रेरित दरार की मध्यस्थता करता है। एसईएस के एसटीटीएम-मध्यस्थता ओवरएक्सप्रेशन एसईएस miRNA की गतिविधि को अवरुद्ध करता है और निरंतर गर्मी की स्थिति में भी ट्यूबराइजेशन की सुविधा प्रदान करता है। MIR160 के नॉकडाउन, ईटीएम दृष्टिकोण द्वारा प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल एक miRNA से पता चला है कि miR160 दोनों में स्थानीय और प्रणालीगत अधिग्रहित प्रतिरोध आलू 92 में Phytophthora infestans के खिलाफ आवश्यक है।

एक जैव सूचना विज्ञान दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, आलू और टमाटर में न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइट ल्यूसीन-समृद्ध दोहराव (एनएलआर) प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स को लक्षित करने वाले एमआईआरएनए के आठ अद्वितीय परिवारों की पहचान की गई थी। MIRNA परिवारों में से एक, miR482/2118, कई एनएलआर को लक्षित करता है जो विभिन्न रोगजनकों के लिए प्रतिरोध प्रदान करते हैं और एसटीटीएम निर्माणों की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति द्वारा मध्यस्थता किए गए miR482/2118 परिवार miRNAs के दमन से पी. इंफेस्टन्स और स्यूडोमोनास सिरिंगे 13 के खिलाफ टमाटर में प्रतिरोध बढ़ जाता है। बढ़ते सबूत बताते हैं कि रोगजनकों और मेजबानों में उत्पादित छोटे आरएनए दो जीवों के बीच यात्रा कर सकते हैं और क्रॉस-किंगडम आरएनए हस्तक्षेप 94,95,96,97 द्वारा मध्यस्थता वाले एक-दूसरे की जीन अभिव्यक्ति को दबा सकते हैं। उदाहरण के लिए, एक oomycete रोगज़नक़ व्युत्पन्न sRNA के लक्ष्य mimics इन हमलावर sRNAs scavenge और रोगज़नक़ संक्रमण को कम कर सकते हैं61. यह जांचना दिलचस्प होगा कि क्या वर्तमान वीबीएमएस प्रणाली को पौधों में प्रतिरोध में सुधार करने के लिए रोगज़नक़-व्युत्पन्न एसआरएनए को लक्षित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

संक्षेप में, वायरस-आधारित miRNA मौन प्रणाली तेजी से और लागत प्रभावी है और इसे उच्च-थ्रूपुट प्रारूप में किया जा सकता है। PVX-आधारित VbMS प्रणाली विशिष्ट miRNAs या miRNA परिवारों और लक्ष्य जीन के कार्य को निर्धारित करने के लिए एक कुशल और मजबूत आनुवंशिक उपकरण प्रदान करती है।

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Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

हम PVX-LIC वेक्टर प्रदान करने के लिए Tinghua University के डॉ यूल लियू को धन्यवाद देते हैं। इस काम को टेक्सास ए एंड एम एग्रीलाइफ रिसर्च और हैच प्रोजेक्ट TEX0-1-9675 से यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ फूड एंड एग्रीकल्चर से जेएस तक स्टार्ट-अप फंड द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

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Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

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