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Virus della patata Silenziamento del microRNA basato sull'X (VbMS) nella patata.

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

Presentiamo un protocollo dettagliato per il sistema di silenziamento dei microRNA (VbMS) basato sul virus della patata X (PVX) per caratterizzare funzionalmente i microRNA endogeni (miRNA) nella patata. Le molecole mimiche bersaglio (TM) di miRNA di interesse sono integrate nel vettore PVX ed espresse transitoriamente in patata per silenziare il miRNA bersaglio o la famiglia di miRNA.

Abstract

Il silenziamento di microRNA basato su virus (VbMS) è uno strumento rapido ed efficiente per la caratterizzazione funzionale dei microRNA (miRNA) nelle piante. Il sistema VbMS è stato sviluppato e applicato per varie specie vegetali tra cui Nicotiana benthamiana, pomodoro, Arabidopsis, cotone e piante monocotiledoni come grano e mais. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che utilizza vettori VbMS basati su PVX per silenziare i miRNA endogeni nella patata. Per abbattere l'espressione di uno specifico miRNA, vengono progettate molecole bersaglio mimico (TM) di miRNA di interesse, integrate in vettori di virus vegetali ed espresse in patate dall'infiltrazione di Agrobacterium per legarsi direttamente al miRNA endogeno di interesse e bloccarne la funzione.

Introduction

I microRNA vegetali (miRNA) sono caratterizzati da 20-24 RNA regolatori a base di nucleotidi, codificati nucleari1 e svolgono un ruolo fondamentale in quasi tutti gli aspetti dei processi biologici delle piante, tra cui crescita e sviluppo2,3, fotosintesi e metabolismo4,5,6,7, sintesi e segnalazione ormonale8,9, risposte biotiche e abiotiche10, 11,12,13 e regolazione dei nutrienti e dell'energia14,15. I ruoli regolatori dei miRNA vegetali sono ben programmati e soddisfatti tipicamente a livelli post-trascrizionali mediante scissione o repressione traslazionale degli mRNA bersaglio.

Sono stati compiuti enormi progressi verso l'identificazione, la profilazione trascrizionale e la previsione target dei miRNA nella patata16,17,18,19,20,21. Tuttavia, la caratterizzazione funzionale dei miRNA nelle piante, compresa la patata, è rimasta indietro rispetto ad altri organismi a causa della mancanza di approcci genetici efficienti e ad alto rendimento. È difficile eseguire l'analisi funzionale dei singoli miRNA mediante l'analisi standard della perdita di funzione, perché la maggior parte dei miRNA appartiene a famiglie con notevole ridondanza genetica22. Inoltre, un singolo miRNA può controllare più geni bersaglio23 e diversi miRNA possono modulare lo stesso percorso molecolare in modo collaborativo24,25. Queste proprietà rendono difficile caratterizzare la funzione di uno specifico miRNA o di una famiglia di miRNA.

Gran parte dell'analisi funzionale dei miRNA si è basata fortemente su approcci di guadagno di funzione che hanno evidenti limitazioni. Il metodo dei miRNA artificiali (amiRNA) sfrutta i trascritti primari endogeni (pri-miRNA) per produrre miRNA ad alto livello, portando all'inibizione dell'espressione genica bersaglio26,27,28,29. Tuttavia, il tagging di attivazione e la sovraespressione di miRNA utilizzando un forte promotore costitutivo 35S spesso portano ad una maggiore espressione di miRNA che non sono rappresentativi delle condizioni in vivo e quindi potrebbero non riflettere la funzione endogena dei miRNA30. È stato sviluppato un approccio alternativo che coinvolge l'espressione di forme di geni bersaglio resistenti ai miRNA che contengono mutazioni uncleavable nei siti di legame e/o scissione31,32,33. Ma questo approccio può anche potenzialmente causare un'interpretazione errata del fenotipo derivato dal transgene bersaglio resistente ai miRNA a causa di artefatti transgenici. Pertanto, le conclusioni di questi studi sul guadagno di funzione devono essere tratte con cautela34. Un altro importante limite degli approcci sopra descritti è che richiedono una trasformazione, che richiede molta manodopera e tempo. Inoltre, gli approcci transgenici-dipendenti sono difficilmente applicabili per le specie vegetali trasformatrici-recalcitranti. Pertanto, è essenziale sviluppare un approccio rapido ed efficiente alla perdita di funzione per svelare la funzione dei miRNA.

Per aggirare il prerequisito della procedura di trasformazione, è stato stabilito il silenziamento di microRNA basato su virus (VbMS) combinando le strategie mimiche target (TM) con vettori derivati da virus. Nel sistema VbMS, le molecole tm progettate artificialmente sono espresse transitoriamente da una spina dorsale del virus, offrendo uno strumento potente, ad alto rendimento e risparmio di tempo per sezionare la funzione dei miRNA endogeni delle piante35,36. VbMS è stato inizialmente sviluppato in N. benthamiana e pomodoro con il virus del sonaglio del tabacco (TRV)35,36,37 ed è stato esteso a Arabidopsis, cotone, grano e mais utilizzando vari altri sistemi di espressione del virus, tra cui il virus della patata X (PVX)38, il virus dell'accartocciamento delle foglie di cotone (ClCrV)39, il virus del mosaico del cetriolo (CMV)40,41,42, il virus cinese del mosaico del grano (CWMV)43 , e il virus del mosaico a strisce d'orzo (BSMV)44,45.

La patata (Solanum tuberosum) è la quarta coltura alimentare più importante e la coltura non cereale più coltivata al mondo principalmente a causa del suo elevato valore nutrizionale, dell'elevata produzione di energia e del fabbisogno di input relativamente basso46. Diverse caratteristiche della patata ne fanno un'attraente pianta modello dicotiledone. È una coltura poliploide propagata vegetativamente con alto tasso di outcrossing, eterozigosi e diversità genetica. Tuttavia, ad oggi, non esiste alcun rapporto che caratterizzi la funzione dei miRNA nella patata utilizzando VbMS. Qui presentiamo un approccio VbMS basato su PVX di patate adattato alla clonazione indipendente dalla legatura (LIC) per valutare la funzione dei miRNA nelle piante di patate38. Abbiamo selezionato la famiglia miR165/166 per illustrare il test VbMS perché la famiglia miR165/166 e i loro mRNA target e i fattori di trascrizione hd-ZIP III (omeodomain/Leu zipper) di Classe III sono stati ampiamente caratterizzati22,47,48. I geni HD-ZIP III sono regolatori chiave dello sviluppo del meristema e della polarità degli organi, e la soppressione della funzione miR165/166 porta ad una maggiore espressione dei geni HD-ZIP III, con conseguenti difetti dello sviluppo pleotropico come la ridotta dominanza apicale e modelli aberranti di polarità fogliare22,35,38,41 . I fenotipi dello sviluppo facilmente ottenibili correlati con il silenziamento di miRNA165/166 consentono una valutazione accurata dell'efficacia del test VbMS basato su PVX.

In questo studio, dimostriamo che il sistema VbMS basato su PVX può bloccare efficacemente la funzione dei miRNA nella patata. Poiché il sistema di silenziamento genico indotto da virus basato su PVX (VIGS) è stato stabilito in un certo numero di varietà di patate49,50,51,52, questo approccio VbMS basato su PVX può essere probabilmente applicato a una vasta gamma di specie di patate diploidi e tetraploidi.

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Protocol

1. Coltiva piante di patate.

  1. Propagare in vitro le piante di patate in tubi di coltura (25 x 150 mm) con mezzi Murashige e Skoog (MS) più la vitamina di Gamborg (miscela di sale basale MS, vitamina di Gamborg, 30 g/L di saccarosio, 3,5 g/L di agar, pH = 5,7). Posizionare i tubi nella stanza di crescita a meno di 20-22 °C, 16 ore di luce/8 ore di fotoperiodo scuro e intensità luminosa 120 μmol/m2∙s1.
    NOTA: Nuovi germogli e radici normalmente si sviluppano in 1-2 settimane dalle piante. Propagare le piante con i mezzi vitaminici freschi di MS / Gamborg ogni mese.
  2. Quattro settimane dopo, trapiantare piante in vitro nel terreno e coltivarle in una serra sotto i 20-22 °C, 16 ore di luce/8 ore di fotoperiodo scuro e intensità luminosa 120 μmol/m2∙s1.
    NOTA: Le piante con radici e foglie di nuova concezione sono adatte al trapianto. Mantenere l'umidità per le piante appena trapiantate per i primi 3-4 giorni.

2. Costruisci i vettori VbMS.

  1. Progettare e clonare le molecole TM in tandem corto (STTM, Figura 1)22,53 per il miRNA di interesse.
    NOTA: Acquisire sequenze di miRNA basate su dati sperimentali o dal database miRbase54,55,56,57,58,59. La sequenza miR166 utilizzata in questo studio è stata descritta in precedenza60.
    1. Progettare il modulo TM inserendo una sequenza di mismatch, normalmente 5'-CTA-3', nella sequenza del complemento inverso di miRNA nel sito corrispondente al 10°-11° nucleotide del miRNA.
      NOTA: Ad esempio, la sequenza Stu-miR160 è 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, dove il 10°-11° nucleotide è in grassetto. La sequenza del complemento inverso (nei deossinucleotidi) è 5'-GGCATACAGGGAGGGCCAGGCA-3' e il sito di inserimento del rigonfiamento disallineamento è mostrato in grassetto. La sequenza di molecole TM (deossinucleotide) deve essere 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.
    2. Primer di progettazione per la clonazione del frammento STTM (Figura 1). Utilizzare oligonucleotidi del DNA con la sequenza distanziatore 48-nt come modello per la clonazione PCR. Il primer anteriore è costituito da un linker LIC1 (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), la sequenza in avanti di quanto sopra progettata per la molecola TM e la sequenza parziale 5' del distanziatore 48-nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). Il primer inverso è costituito da un linker LIC2 (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), la sequenza del complemento inverso della molecola TM e un complemento inverso parziale alla sequenza 3' del distanziatore 48-nt (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3').
      NOTA: la sequenza distanziatore 48-nt è 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT-3'. Ad esempio, per STTM-miR160, il primer anteriore deve essere 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'; il primer inverso dovrebbe essere 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' (Figura 1).
    3. Amplificare il frammento STTM in un volume di 50 μL mediante PCR utilizzando il distanziatore universale sintetizzato da 48 nt come modello e una DNA polimerasi ad alta fedeltà.
      1. Impostare la reazione PCR mescolando 0,5 μL di ciascun primer (40 μM), 0,5 μL di oligo distanziatore 48-nt (40 μM), 5 μL di tampone PCR 10x, 1 μL di miscela dNTP (10 mM ciascuno), 0,1 μL di DNA polimerasi ad alta fedeltà (10 U/μL) e 43 μL di ddH2O per un volume totale di 50 μL. Eseguire l'amplificazione PCR standard come segue: 94 °C per 3 min, 32 cicli di 94 °C per 45 s, 60 °C per 45 s e 72 °C per 60 s.
    4. Purificare il frammento STTM mediante precipitazione di etanolo. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo e 1/10 di volume di 3 M di acetato di sodio (pH = 4,0) ai prodotti PCR. Mescolare energicamente e centrifugare a 14.000 x g per 10 min. Rimuovere il surnatante e risciacquare il pellet con 1 mL di etanolo al 70%. Asciugare il pellet e scioglierlo in 20 μL di ddH2O.
      NOTA: Utilizzare l'elettroforesi del DNA per verificare l'amplificazione dei prodotti STTM PCR.
    5. Impostare la reazione T4 DNA polimerasi sul ghiaccio mescolando 2,5 μL di prodotto STTM PCR purificato, 0,5 μL di 10x T4 DNA polimerasi tampone, 0,05 μL di 1 M ditiotreitolo (DTT), 0,25 μL di 100 mM dATP, 0,1 μL di T4 DNA polimerasi (3 U/μL) e 1,6 μL di ddH2O per un volume totale di 5 μL. Incubare la miscela a 37 °C per 15 min, e trattare i prodotti a 75 °C per 20 minuti per inattivare la DNA polimerasi T4.
  2. Preparare il costrutto VbMS basato su PVX.
    1. Digerire 5 μg di plasmide PVX-LIC38 con 2,5 μL di SmaI (20 U/μL) in un volume di 100 μL.
    2. Aggiungere un volume uguale di fenolo:cloroformio:isopropanolo (25:24:1, pH = 6,7/8,0) ai prodotti PVX-LIC digeriti e mescolare vigorosamente. Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e trasferire il surnatante in un nuovo tubo centrifuga. Aggiungere un volume uguale di cloroformio:isopropanolo (24:1) e vorticare vigorosamente. Centrifuga a 14.000 x g per 10 min.
      NOTA: il vettore PVX-LIC ospita la cassetta LIC per la clonazione. La cassetta LIC del vettore PVX-LIC contiene un gene ccdB e un gene resistente al cloramfenicolo e deve essere mantenuta/propagata nel ceppo DB3.1 di E. coli utilizzando un mezzo LB contenente kanamicina (50 μg/L) e cloramfenicolo (15 μg/L).
    3. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo della centrifuga. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo e 1/10 di volume di 3 M di acetato di sodio (pH = 4,0) e mescolare vigorosamente. Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
    4. Risciacquare il pellet con 1 ml di etanolo al 70% e vorticare vigorosamente. Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante. Asciugare il pellet e sciogliere il plasmide PVX-LIC digerito con 100 μL di ddH2O.
    5. Impostare la reazione T4 DNA polimerasi sul ghiaccio mescolando 2,5 μL di DNA vettore PVX-LIC digerito, 0,5 μL di 10x T4 DNA polimerasi tampone, 0,05 μL di 1 M DTT, 0,25 μL di 100 mM dTTP e 0,1 μL di T4 DNA polimerasi (3 U/μL) in un volume totale di 5 μL. Incubare la miscela a 37 °C per 15 min e trattare i prodotti a 75 °C per 20 min fino a inattivare la DNA polimerasi T4.
  3. Clonare la sequenza STTM nel vettore PVX-LIC usando una reazione LIC. Mescolare i prodotti STTM PCR trattati con DNA polimerasi T4 (5 μL) e i plasmidi PVX-LIC trattati con DNA polimerasi T4 (5 μL). Incubare a 70 °C per 5 minuti, raffreddare a 22 °C su una rampa di 0,1 °C/s e mantenere a 22 °C per 30 minuti utilizzando una macchina PCR.
    NOTA: Estendere il tempo di incubazione a una notte a 4 °C per ottenere una maggiore efficienza della clonazione LIC.
  4. Trasformare 5 μL dei prodotti di reazione LIC in E. coli DH5α e crescere su una piastra LB contenente 50 μg/mL kanamicina62,63. Selezionare e verificare le colonie positive mediante PCR con i primer di clonazione e il primer universale per il vettore PVX-LIC seguito dal sequenziamento.
    1. Eseguire la PCR della colonia con il primer anteriore per PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') in combinazione con il primer inverso per la clonazione STTM per identificare i cloni positivi. La dimensione della banda PCR dovrebbe essere ~ 300 bp.
      NOTA: Verificare le sequenze dei frammenti STTM mediante sequenziamento del ciclo terminatore64,65.
  5. Isolare i plasmidi PVX-STTM dai cloni convalidati e trasformarli in ceppi di Agrobacterium GV3101, GV2260 o EHA10562,63. Verificare le colonie di Agrobacterium mediante PCR.
    NOTA: Confermare le colonie di Agrobacterium mediante PCR utilizzando il primer anteriore per PVX-LIC e il primer inverso per la clonazione STTM.

3. Eseguire il test VbMS basato su PVX nelle piante di patate.

  1. Trapianto di piante di patate in vitro di 4 settimane nel terreno. Le piante trapiantate saranno sottoposte al test VbMS 3-4 giorni dopo.
  2. Inoculare le piante di patate con Agrobacterium contenente i plasmidi PVX-STTM.
    NOTA: Per il test VbMS nella patata, l'infiltrazione mediata da Agrobacterium e l'inoculazione da graffio di stuzzicadenti vengono eseguite contemporaneamente.
    1. Prelevare e inoculare i trasformatori positivi contenenti vettori PVX-STTM in 50 mL di LB liquido contenente 50 μg/mL kanamicina e 50 μg/mL di rifampicina. Crescere in un incubatore a 28 °C a 220 giri/min per 16 ore fino a OD600 = 1,0.
    2. Allo stesso tempo, strisciare le colonie positive di Agrobacterium su almeno due nuove piastre LB contenenti 50 μg/mL di kanamicina e 50 μg/mL di rifampicina e crescere a 28 °C per 1 giorno. Includere il vettore PVX-LIC38,66 come controllo e PVX-GFP67,68 per monitorare la diffusione del virus.
    3. Raccogliere la coltura liquida di Agrobacterium per centrifugazione a 3.400 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Sospendere le cellule agrobatterio con un volume uguale di tampone di infiltrazione (10 mM MgCl2, 10 mM MES e 200 μM acetosiringone, pH = 5,6) e regolare a OD600 = 1,0. Incubare a temperatura ambiente per 6 ore.
    4. Infiltrare la coltura di Agrobacterium nel lato abassiale delle foglie completamente espanse con una siringa senza ago da 1 mL.
      1. Capovolgere e tenere una foglia con una mano, quindi utilizzare un dito per sostenere la lamina fogliare dal lato adassiale nel sito di infiltrazione. Tenere la siringa verticale sulla superficie fogliare con l'altra mano e infiltrare la coltura di Agrobacterium nel lato abassiale della lamina.
    5. Raschiare la coltura di Agrobacterium dalle piastre LB e graffiare la superficie del gambo del primo o due internodi delle piante di patate infiltrate con uno stuzzicadenti. Grattare delicatamente l'epidermide del gambo. Evitare di perforare il gambo, che può causare gravi danni alle piante.
  3. Coltiva le piante infiltrate a 22 °C con un fotoperiodo scuro di 16 ore di luce/8 ore e un'intensità luminosa di 120 μmol/m2∙ s1 in una serra.
    NOTA: I fenotipi causati dal silenziamento dei miRNA di solito compaiono in 2-4 settimane di post-oculazione (Figura 2, Figura 3). In genere ci vogliono 10-20 giorni perché il fenotipo VbMS appaia dopo l'infiltrazione. Il fenotipo VbMS dipende dalle proprietà dei geni specifici del miRNA e del bersaglio, dalle condizioni di crescita e dalle varietà di patate.

4. Eseguire l'analisi delle espressioni.

  1. Quando i fenotipi compaiono a 2-4 settimane di post-osservazione, raccogliere tessuti come germogli, foglie, fiori o radici con fenotipi dalle piante VbMS e tessuti dalle piante di controllo con le forbici. Isolare gli RNA totali dai tessuti raccolti.
  2. Controllare la qualità dell'RNA mediante elettroforesi62,63 e quantificare la concentrazione di RNA misurando l'assorbanza OD260 con uno spettrofotometro.
  3. Utilizzare la PCR a trascrizione inversa in tempo reale (RT-PCR) per analizzare l'espressione del miRNA.
    1. Per miRNA specifici, progettare un primer di trascrizione inversa stem-loop. I primer RT stem-loop contengono una spina dorsale universale da 5' e un'estensione di 3' 6-nt di un miRNA specifico. Progettare una spina dorsale universale da 5' (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') che formi una struttura stem-loop. (Il maiuscolo corrisponde a una sequenza ripetuta inversa e il minuscolo alla regione del loop).
    2. Parte della sequenza dorsale di 5' che forma un loop funge da primer inverso per la successiva amplificazione PCR (sequenza grassetto-corsivo nella sequenza backbone). Aggiungere una sequenza di estensione 6-nt che sia complementare all'estremità 3' del miRNA di interesse al primer stem-loop per fornire specificità per la trascrizione inversa (Figura supplementare 1A).
      NOTA: Progettare il primer di trascrizione inversa stem-loop come descritto da Chen et al.69 e Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Ad esempio, il primer di trascrizione inversa stem-loop per Stu-miR160 è progettato come 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'. Il primer a trascrizione inversa stem-loop per la famiglia miR165/166 di patate è progettato come 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3'. (Le sequenze maiuscole in grassetto forniscono la specificità della trascrizione inversa per specifici miRNA).
    3. Impostare la reazione di trascrizione inversa mescolando 50-200 ng di RNA totale, 1 μL del primer di trascrizione inversa stem-loop (100 μM), 2 μL di tampone 10x, 0,2 μL di inibitore della RNasi (40 U/μL), 0,25 μL di dNTPs (10 mM ciascuno) e 1 μL di trascrittasi inversa (200 U/μL) sul ghiaccio. Aggiungere ddH2O senza nucleasi a un volume totale di 20 μL.
    4. Eseguire la trascrizione inversa utilizzando la procedura di trascrizione inversa pulsata. Incubare la miscela di reazione a trascrizione inversa a 16 °C per 30 min, eseguire un ciclo di temperatura di 30 °C per 30 s, 42 °C per 30 s e 50 °C per 1 s, per un totale di 60 cicli, e inattivare la trascrittasi inversa per incubazione a 85 °C per 5 min.
    5. Per l'analisi PCR in tempo reale dell'espressione dei miRNA, progettare il primer in avanti basato sulla sequenza di miRNA, ma non includere sequenze che si sovrappongono al primer di trascrizione inversa stem-loop progettato sopra. Aggiungere un'estensione di 3-7-nt ai 5' del primer in avanti per ottimizzare la lunghezza, la temperatura di fusione e il contenuto di GC (Figura supplementare 1).
      NOTA: il primer inverso universale è 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Ad esempio, il primer di trascrizione inversa stem-loop per Stu-miR160 è progettato come 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. Il primer di trascrizione inversa stem-loop per la famiglia miR165/166 è 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Le sequenze in grassetto fungono da estensioni da 5' per l'ottimizzazione del primer. I primer di trascrizione inversa stem-loop e i primer PCR in tempo reale per miRNA possono essere progettati utilizzando il miRNA Primer Design Tool73.
  4. Sintetizzare cDNA degli mRNA bersaglio mediante PCR a trascrizione inversa standard (RT-PCR). Incubare la miscela di reazione a trascrizione inversa a 37 °C per 60 minuti e inattivare la trascrittasi inversa riscaldando a 85 °C per 5 minuti.
    NOTA: (1) Prevedere gli mRNA bersaglio utilizzando il programma psRNATarget74 se gli mRNA bersaglio non sono noti. (2) Il primer universale di trascrizione inversa per mRNA è un primer ancorato 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'.
  5. Impostare la reazione PCR in tempo reale sia per i miRNA di interesse che per gli mRNA target. Mescolare 0,5 μL di cDNA modello, 5 μL di 2x buffer PCR in tempo reale con verde SYBR, 0,05 μL di ciascun primer avanti e indietro (40 μM) e 4,4 μL di ddH2O in un volume totale di 5 μL su ghiaccio.
  6. Incubare a 95 °C per 3 min, 40 cicli di 95 °C per 3 s e 60 °C per 30 s. Eseguire una successiva analisi della curva di fusione come segue: incubare a 95 °C per 15 s, raffreddare a 60 °C su una rampa di 20 °C/s, mantenere a 60 °C per 60 s, riscaldare a 95 °C a una rampa di 0,2 °C/s e mantenere a 95 °C per 15 s. Analizzare i valori Ct utilizzando i metodi ΔΔCt76,77 e tracciare i mezzi con errori standard.
    NOTA: (1) I primer PCR in tempo reale per gli mRNA target possono essere progettati come descritto75. (2) Il gene della poliubiquitina 10 della patata può servire come controllo interno per la normalizzazione nella patata. Il primer in avanti per il gene della poliubiquitina 10 della patata è 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' e il primer inverso 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Per l'analisi PCR in tempo reale, la contaminazione e la formazione di primer-dimero possono generare risultati falsi positivi. Per monitorare l'amplificazione non specifica e aumentare la responsabilità dell'analisi PCR in tempo reale, si consiglia di includere controlli senza modello e trascrittasi inversa per i test PCR in tempo reale.

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Representative Results

La Figura 2 mostra le piante di patata PVX-STTM165/166 (Katahdin) con crescita ectopica dei tessuti fogliari dal lato abassiale della lamina fogliare lungo le vene. Sono stati osservati anche fenotipi più gravi come la formazione di foglie a forma di tromba. Al contrario, non è stata osservata alcuna anomalia fenotipica negli impianti di controllo PVX. Questi risultati mostrano che il sistema VbMS era efficace nel sopprimere la funzione endogena dei miRNA nelle piante di patate tetraploidi e il sistema PVX-VbMS era un robusto strumento genetico per determinare la funzione di specifici miRNA o famiglie di miRNA.

La Figura 3 mostra le piante di patate PVX-STTM165/166 (Russet Burbank) con crescita ectopica del tessuto fogliare dal lato abassiale della lamina fogliare lungo le vene. Questi risultati mostrano che il sistema PVX-VbMS potrebbe essere applicato ad altre specie di patate, tra cui una delle principali cultivar di patate.

Figure 1
Figura 1: Diagramma schematico dei vettori VbMS basati su PVX e della struttura PVX-STTM165/166. LB = T-DNA bordo sinistro; RB = T-DNA bordo destro; 35S = promotore del virus del mosaico del cavolfiore 35S; NOST = terminatore della nopalina sintasi; RdRP = RNA polimerasi RNA-dipendente; TGB1 = proteina 1 a triplo blocco genico; TGB2 = proteina 2 a triplo blocco genico; TGB3 = proteina 3 a triplo blocco genico; sgP = promotore dell'RNA subgenomico PVX; CP = proteina del mantello; LIC Cassette = cassetta di clonazione indipendente dalla legatura; 48 nt = 48 nucleotide linker stem-loop imperfetto. STTM165/166 è costituito da sequenze TM tandem di miR165/166 separate da una sequenza di linker stem-loop imperfetta da 48 nt. La punta di freccia verde nel vettore PVX-LIC indica il sito iniziale dell'RNA subgenomico PVX che ospita la sequenza STTM. I tripli trattini meno nelle sequenze di miRNA indicano i siti di scissione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: VbMS di miR165/166 nella varietà di patate tetraploidi Katahdin. Fenotipi delle piante di patata (Katahdin) che esprimono il controllo vettoriale PVX o PVX-STTM165/166. Le frecce magenta denotano strutture fogliari generate ectopicamente nelle vene fogliari. La punta di freccia arancione denota strutture fogliari simili a trombe. Barre = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: VbMS di miR165/166 nella varietà di patate tetraploidi Russet Burbank. Fenotipi delle piante di patate (Russet Burbank) che esprimono il vettore PVX come controllo o PVX-STTM165/166. Le frecce magenta denotano strutture fogliari generate ectopicamente nelle vene fogliari. Barre = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Diagrammi schematici dell'analisi RT-PCR stem-loop dei miRNA e progettazione del primer PCR in tempo reale. (A) Analisi RT-PCR stem-loop dei miRNA. Durante la trascrizione inversa, il legame del primer stem-loop al miRNA 3' ha avviato la trascrizione inversa ed è stato sintetizzato il cDNA. I prodotti PCR sono stati amplificati con uno specifico primer in avanti del miRNA di interesse e il primer inverso universale. (B) Progettazione del primer PCR in tempo reale. Vengono mostrati i primer avanti e indietro per Stu-miR160 e Stu-miR165/166. Il primer in avanti è stato progettato sulla base della sequenza di miRNA, ma non includeva sequenze che si sovrapponevano al primer di trascrizione inversa a stelo progettato. Un'estensione di 3-7-nt è stata aggiunta ai 5' del primer anteriore per regolare la lunghezza, la temperatura di fusione e il contenuto di GC. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Presentiamo un sistema silenziatore di miRNA basato su PVX per caratterizzare la funzione dei miRNA endogeni nella patata integrando il design STTM nel vettore PVX. Il sistema VbMS si è dimostrato efficace nel silenziare il miRNA165/166 nella patata, una famiglia di miRNA altamente conservata in tutte le specie vegetali.

L'approccio TM è stato sviluppato per interferire con l'espressione dei miRNA basati su un miRNA artificiale bersaglio mimico che è progettato per creare un ciclo di mismatch nel sito di scissione atteso all'interno della sequenza di complementazione del miRNA che si traduce nel sequestro del miRNA mirato e nell'arresto della sua attività22,35,78,79 . L'accoppiamento tra le molecole di TM e i miRNA bersaglio blocca la funzione dei miRNA abbattendo i livelli di uno specifico miRNA o di una famiglia di miRNA, il che porta ad una sovraregolazione degli mRNA bersaglio. Sono state sviluppate diverse tecnologie tm per il silenziamento dei miRNA, tra cui il mimetismo endogeno del bersaglio del miRNA (eTM)79,80, le imitazioni di miRNA basate su eTM (MIMs)35,78, le imitazioni di bersaglio tandem brevi (STM)22,53, un approccio di esca di miRNA con TM integrato nel 3' UTR di trascritti codificanti proteine81 e le SPONGE di miRNA contenenti siti di legame di miRNA con due disallineamenti centrali per indirizzare i miRNA (cmSP) 82. STTM è costituito da due siti di legame del miRNA con un rigonfiamento di mancata corrispondenza di 3 nt, collegato da un distanziatore da 48 nt che è stato ottimizzato empiricamente. STTM innesca un'inibizione efficiente dei miRNA bersaglio22,53. La tecnologia STTM è stata recentemente applicata con successo a un'analisi funzionale su larga scala di miRNA dalla pianta modello Arabidopsis e da colture importanti come riso e mais. Ciò ha portato alla scoperta di ruoli senza precedenti di diversi miRNA endogeni coinvolti nel controllo della resa e degli ormoni, il che è molto promettente nel miglioramento dell'allevamento delle colture47. Sulla base di questi vantaggi della progettazione STTM, abbiamo scelto STTM e lo abbiamo integrato nel vettore PVX per la caratterizzazione funzionale dei miRNA nella patata. Vale la pena notare che i vari progetti di molecole TM, come cmSP, MIM e STTM, hanno efficacie variabili nel bloccare la funzione di diversi miRNA82. Pertanto, l'utilizzo di varie strategie di progettazione della Meditazione Trascendentale può aiutare a ottenere una soppressione più efficace dei miRNA. La lunghezza e il contesto di sequenza del rigonfiamento senza pari, nonché le alterazioni nucleotidiche adiacenti ai siti di legame del miRNA, potrebbero anche dover essere ottimizzati per uno specifico risultato di silenziamento del miRNA22,36,38,78,83. Inoltre, la progettazione di molecole di TM sotto la guida di previsioni computazionali insieme all'analisi sperimentale porterà probabilmente a un'inibizione più affidabile dei miRNA84.

È stato dimostrato che il sistema VIGS basato su PVX è efficace nell'innescare il silenziamento dell'RNA sia nelle specie diploidi che in quelle tetraploidi coltivate Solanum. Il silenziamento sistemico basato su PVX viene indotto e mantenuto in tutti i tessuti fogliari su piante di patate propagate in vitro per diversi cicli e su microtuber generati in vitro85. Abbiamo recentemente riferito che il sistema VIGS basato su PVX può silenziare i geni di interesse in diverse cultivar di patate tetraploidi, come Ancilla, Arran Pilot, Marius Bard e Serrana86. Resta da determinare se l'effetto VbMS basato su PVX possa essere trasmesso e sostenuto per diverse generazioni attraverso la propagazione vegetativa nella patata. Gli approcci transgenici per introdurre stabilmente le molecole di Meditazione Trascendentale nelle piante di patate sono ancora raccomandati quando gli effetti silenzianti dei miRNA di interesse devono essere mantenuti nelle generazioni successive.

Sono stati identificati numerosi miRNA coinvolti nella crescita e nello sviluppo delle patate. L'RNA-seq, il sequenziamento del genoma e la previsione bioinformatica hanno notevolmente facilitato l'identificazione dei miRNA e dei loro bersagli17,19,20,21. Finora, sono stati sequenziati tre genomi di patate, tra cui un clone di Phureja del gruppo monoploide raddoppiato di Phureja DM1-3, una specie diploide selvatica S. commersonii e un clone inbred diploide M6 di S. chacoense87,88,89. Fino ad oggi, solo un numero limitato di miRNA di patate è stato caratterizzato funzionalmente, nella maggior parte dei casi utilizzando la tecnologia TM. Ad esempio, l'omologo FLOWERING LOCUS T (FT) SP6A agisce come un segnale mobile per controllare la tuberizzazione nella patata ed è preso di mira da un miRNA, sopprimendo l'espressione di SP6A (SES), che media la scissione indotta dal calore del trascritto SP6A90,91. La sovraespressione mediata da STTM di SES blocca l'attività del miRNA SES e facilita la tuberizzazione anche in condizioni di calore continuo91. L'abbattimento di miR160, un miRNA coinvolto nella risposta immunitaria, da parte dell'approccio eTM ha dimostrato che miR160 è richiesto sia nella resistenza acquisita locale che sistemica contro Phytophthora infestans in potato92.

Utilizzando un approccio bioinformatico, sono state identificate otto famiglie uniche di miRNA che prendono di mira i recettori immunitari a ripetizione ricca di leucina (NLR) del sito di legame nucleotidico nella patata e nel pomodoro93. Una delle famiglie di miRNA, miR482/2118, prende di mira diversi NLR che conferiscono resistenza a vari agenti patogeni e la soppressione dei miRNA della famiglia miR482/2118 mediata dall'espressione transgenica di costrutti STTM porta ad una maggiore resistenza nel pomodoro contro P. infestans e Pseudomonas syringae13. Prove crescenti suggeriscono che piccoli RNA prodotti in agenti patogeni e ospiti possono viaggiare tra i due organismi e sopprimere l'espressione genica l'uno dell'altro mediata dall'interferenza dell'RNA tra i regni94,95,96,97. Ad esempio, le imitazioni target di sRNA derivati da un agente patogeno oomicete possono eliminare questi sRNA invasori e ridurre l'infezione da agenti patogeni61. Sarebbe interessante esaminare se l'attuale sistema VbMS possa essere impiegato per colpire gli sRNA derivati da agenti patogeni per migliorare la resistenza nelle piante.

In sintesi, il sistema di silenziamento dei miRNA basato su virus è rapido ed economico e può essere eseguito in un formato ad alto rendimento. Il sistema VbMS basato su PVX fornisce uno strumento genetico efficiente e robusto per determinare la funzione di specifici miRNA o famiglie di miRNA e dei geni bersaglio.

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Disclosures

Nessuno.

Acknowledgments

Ringraziamo il Dr. Yule Liu della Tsinghua University per aver fornito il vettore PVX-LIC. Questo lavoro è stato supportato da un fondo di start-up del Texas A & M AgriLife Research e dal progetto Hatch TEX0-1-9675 dall'USDA National Institute of Food and Agriculture a JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

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Scienze ambientali Numero 159 silenziamento di microRNA basato su virus (VbMS) virus della patata X (PVX) microRNA (miRNA) mimica bersaglio (TM) imitazione di bersagli tandem brevi (STTM) Solanum tuberosum
Virus della patata Silenziamento del microRNA basato sull'X (VbMS) nella patata.
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Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

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