Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Potetvirus X-basert mikroRNA-silencing (VbMS) i potet.

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

Vi presenterer en detaljert protokoll for potetvirus X (PVX)-basert microRNA silencing (VbMS) system for å funksjonelt karakterisere endogene mikroRNAer (miRNAer) i potet. Mål etterligne (TM) molekyler av miRNA av interesse er integrert i PVX vektoren og midlertidig uttrykt i potet for å kneble målet miRNA eller miRNA familie.

Abstract

Virusbasert microRNA-silencing (VbMS) er et raskt og effektivt verktøy for funksjonell karakterisering av mikroRNAer (miRNAer) i planter. VbMS-systemet er utviklet og anvendt for ulike plantearter, inkludert Nicotiana benthamiana, tomat, Arabidopsis, bomull og monokotplanter som hvete og mais. Her beskriver vi en detaljert protokoll ved hjelp av PVX-baserte VbMS-vektorer for å kneble endogene miRNAer i potet. For å slå ned uttrykket av en bestemt miRNA, er målmimilering (TM) molekyler av miRNA av interesse designet, integrert i plantevirusvektorer, og uttrykt i potet av Agrobacterium infiltrasjon for å binde seg direkte til den endogene miRNA av interesse og blokkere funksjonen.

Introduction

PlantemikroRNAer (miRNAer) er karakterisert som 20–24 nukleotidlange, kjernefysiske kodede regulatoriske RNAer1 og spiller grunnleggende roller i nesten alle aspekter av plantebiologiske prosesser, inkludert vekst og utvikling2,3, fotosyntese og metabolisme4,5,6,7, hormonsyntese og signalering8,9, biotisk og abiotisk respons10, 11,12,13, og nærings- og energiregulering14,15. De regulatoriske rollene til plante-miRNAer er godt programmert og oppfylt vanligvis på posttranskripsjonsnivåer ved enten å spalte eller undertrykke mål-mRNAene.

Det er gjort enorme fremskritt mot identifisering, transkripsjonsprofilering og målprediksjon av miRNAer i potet16,17,18,19,20,21. Imidlertid har den funksjonelle karakteriseringen av miRNAer i planter, inkludert potet, ligget bak andre organismer på grunn av mangel på effektive og genetiske tilnærminger med høy gjennomstrømning. Det er utfordrende å utføre funksjonell analyse av individuelle miRNA ved standard tap av funksjonsanalyse, fordi de fleste miRNAer tilhører familier med betydelig genetisk redundans22. I tillegg kan en enkelt miRNA kontrollere flere målgener23, og flere forskjellige miRNAer kan modulere den samme molekylære banen sammen med24,25. Disse egenskapene gjør det vanskelig å karakterisere funksjonen til en bestemt miRNA eller en miRNA-familie.

Mye av den funksjonelle analysen av miRNAer har stolt sterkt på gain-of-function tilnærminger som har åpenbare begrensninger. Den kunstige miRNA -metoden (amiRNA) utnytter de endogene primærtranskripsjonene (pri-miRNAer) for å produsere miRNAer på et høyt nivå, noe som fører til hemming av målgenuttrykk26,27,28,29. Imidlertid fører aktiveringsmerking og miRNA-overuttrykk ved hjelp av en sterk konstituerende 35S-promotor ofte til økt uttrykk for miRNAer som ikke er representative for in vivo-forhold og derfor kanskje ikke gjenspeiler den endogene funksjonen til miRNAs30. Det er utviklet en alternativ tilnærming som involverer uttrykk for miRNA-resistente former for målgener som inneholder urene mutasjoner i bindings- og/eller spaltingsstedene31,32,33. Men denne tilnærmingen kan også potensielt forårsake feiltolkning av fenotypen avledet fra miRNA-resistente måltransgene på grunn av transgene gjenstander. Derfor bør konklusjoner fra disse funksjonsøkningsstudiene trekkes med forsiktighet34. En annen stor begrensning av de ovenfor beskrevne tilnærmingene er at de krever transformasjon, noe som er arbeidskrevende og tidkrevende. Videre gjelder de transgene-avhengige tilnærmingene neppe for transform-recalcitrant plantearter. Derfor er det viktig å utvikle en rask og effektiv tap av funksjonstilnærming for å avdekke miRNAenes funksjon.

For å omgå forutsetningen for transformasjonsprosedyren er virusbasert microRNA-silencing (VbMS) etablert ved å kombinere TM-strategier (target mimic) med virusavledede vektorer. I VbMS-systemet uttrykkes kunstig utformede TM-molekyler forbigående fra et virusryggrad, og tilbyr et kraftig, høy gjennomstrømnings- og tidsbesparende verktøy for å dissekere funksjonen til plantens endogene miRNAs35,36. VbMS ble opprinnelig utviklet i N. benthamiana og tomat med tobakk rattle virus (TRV)35,36,37 og har blitt utvidet til Arabidopsis, bomull, hvete og mais ved hjelp av ulike andre virusuttrykkssystemer, inkludert potetvirus X (PVX)38, bomullsblad krøllete virus (ClCrV)39, agurkmosaikkvirus (CMV)40,41,42, kinesisk hvetemosaikkvirus (CWMV)43 , og bygg stripe mosaikkvirus (BSMV)44,45.

Potet (Solanum tuberosum) er den fjerde viktigste matavlingen og den mest utbredte noncereal avlingen i verden, hovedsakelig på grunn av sin høye næringsverdi, høy energiproduksjon og relativt lave inngangsbehov46. Flere egenskaper av potet gjør det til en attraktiv dikotyledonisk modellplante. Det er en vegetativt forplantet polyploid avling med høy outcrossing rate, heterozygositet og genetisk mangfold. Til dags dato er det imidlertid ingen rapport som karakteriserer funksjonen til miRNAer i potet ved hjelp av VbMS. Her presenterer vi en ligation-uavhengig kloning (LIC)-tilpasset potet PVX-basert VbMS tilnærming for å evaluere funksjonen til miRNAer i potetplanter38. Vi valgte miR165/166-familien for å illustrere VbMS-analysen fordi miR165/166-familien og deres mål-mRNAer og klasse III homeodomain/Leu-glidelås (HD-ZIP III) transkripsjonsfaktorer har blitt omfattende karakterisert22,47,48. HD-ZIP III-genene er sentrale regulatorer for meristem-utvikling og organpolaritet, og undertrykkelse av miR165/166-funksjonen fører til økt uttrykk for HD-ZIP III-genene, noe som resulterer i pleotropiske utviklingsfeil som redusert apikal dominans og avvikende mønstre av bladpolalitet22,35,38,41 . De lett scorable utviklingsfenotypene korrelert med silencing av miRNA165/166 muliggjør nøyaktig evaluering av effektiviteten til den PVX-baserte VbMS-analysen.

I denne studien viser vi at det PVX-baserte VbMS-systemet effektivt kan blokkere funksjonen til miRNAer i potet. Fordi det PVX-baserte virusinduserte genaktiveringssystemet (VIGS) er etablert i en rekke potetvarianter49,50,51,52, kan denne PVX-baserte VbMS-tilnærmingen sannsynligvis brukes på et bredt spekter av diploide og tetraploide potetarter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dyrk potetplanter.

  1. Forplant in vitro potetplanter i kulturrør (25 x 150 mm) med Murashige og Skoog (MS) medier pluss Gamborgs vitamin (MS basal saltblanding, Gamborgs vitamin, 30 g / L sukrose, 3,5 g / l agar, pH = 5,7). Plasser rørene i vekstrommet under 20–22 °C, 16 t lys/8 t mørk fotoperiod og lysintensitet 120 μmol/m2∙s1.
    MERK: Nye skudd og røtter utvikler seg normalt i 1-2 uker fra planter. Forplante planter med ferske MS/Gamborgs vitaminmedier hver måned.
  2. Fire uker senere transplanterer in vitro planter i jord og vokser dem i et drivhus under 20-22 °C, 16 t lys/8 t mørk fotoperiod og lysintensitet 120 μmol/m2∙s1.
    MERK: Plantene med nyutviklede røtter og blader er egnet for transplantasjon. Oppretthold fuktighet for de nytransplantasjonede plantene de første 3-4 dagene.

2. Konstruer VbMS-vektorene.

  1. Design og klone de korte tandem TM-molekylene (STTM, figur 1)22,53 for miRNA av interesse.
    MERK: Hent miRNA-sekvenser basert på eksperimentelle data eller fra miRbase-databasen54,55,56,57,58,59. MiR166-sekvensen som ble brukt i denne studien er beskrevet tidligere60.
    1. Design TM-modulen ved å sette inn en mismatchsekvens, normalt 5'-CTA-3', i den omvendte komplementsekvensen av miRNA på stedet som tilsvarer 10.-11.
      MERK: Stu-miR160-sekvensen er for eksempel 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, der 10.-11. Den omvendte komplementsekvensen (i deoksynukleotider) er 5'-GGCATACAGGGGGCCAGGCA-3', og det uovertrufne innsettingsstedet for buler vises med fet skrift. TM-molekylsekvensen (deoksynukleotid) skal være 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.
    2. Design primere for kloning av STTM-fragmentet (figur 1). Bruk DNA oligonukleotider med 48-nt spacer sekvens som mal for PCR kloning. Den fremre primeren består av en LIC1-kobling (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), den fremre sekvensen av ovennevnte designet for TM-molekyl, og den delvise 5' sekvensen av 48-nt spacer (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). Den omvendte primeren består av en LIC2-kobling (5'-gAggAgAagCCgT-3'), den omvendte komplementsekvensen av TM-molekylet, og en delvis omvendt komplement til 3' sekvensen av 48-nt-spaceren (5'-ATTCTTCTTCTTTATTAGACCAT-3').
      MERK: Avstandssekvensen på 48 nt er 5'-GTTGTTTGTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT-3'. For STTM-miR160 bør for eksempel fremoverprimeren være 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTGTTATGGT-3'; den omvendte primeren skal være 5'-gAggAgAagCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' (figur 1).
    3. Forsterk STTM-fragmentet i et volum på 50 μL av PCR ved hjelp av syntetisert universell 48-nt spacer som mal og en høy kvalitet DNA polymerase.
      1. Sett opp PCR-reaksjonen ved å blande 0,5 μL av hver primer (40 μM), 0,5 μL 48-nt spacer oligo (40 μM), 5 μL 10x PCR-buffer, 1 μL dNTP-blanding (10 mM hver), 0,1 μL høy gjengivelse DNA-polymerase (10 U/μL ) og 43 μL ddH2O til et totalt volum på 50 μL. Utfør standard PCR-forsterkning som følger: 94 °C i 3 min, 32 sykluser på 94 °C i 45 s, 60 °C i 45 s og 72 °C i 60 s.
    4. Rens STTM-fragmentet ved etanolnedbør. Tilsett 2,5 volumer etanol og 1/10 volum 3 M natriumacetat (pH = 4,0) til PCR-produktene. Bland kraftig og sentrifuger ved 14 000 x g i 10 min. Fjern supernatanten og skyll pelletsen med 1 ml 70% etanol. Tørk pelletsen og oppløs den i 20 μL ddH2O.
      MERK: Bruk DNA-elektroforese for å kontrollere forsterkningen av STTM PCR-produktene.
    5. Sett opp T4 DNA-polymerasereaksjonen på is ved å blande 2,5 μL renset STTM PCR-produkt, 0,5 μL 10x T4 DNA-polymerasebuffer, 0,05 μL 1 M dithiothreitol (DTT), 0,25 μL 100 mM dATP, 0,1 μL T4 DNA-polymerase (3 U/μL) og 1,6 μL ddH2O til et totalt volum på 5 μL. Inkuber blandingen ved 37 °C i 15 minutter, og behandle produktene ved 75 °C i 20 minutter for å inaktivere T4 DNA-polymerasen.
  2. Klargjør den PVX-baserte VbMS-konstruksjonen.
    1. Fordøye 5 μg PVX-LIC plasmid38 med 2,5 μL SmaI (20 U/μL) i et volum på 100 μL.
    2. Tilsett et likt volum fenol:kloroform:isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8,0) til de fordøyde PVX-LIC-produktene og bland kraftig. Sentrifuge ved 14.000 x g i 10 min og overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør. Tilsett et likt volum kloroform:isopropanol (24:1) og virvel kraftig. Sentrifuge ved 14.000 x g i 10 min.
      MERK: PVX-LIC-vektoren har LIC-kassetten for kloning. LIC-kassetten med PVX-LIC-vektor inneholder et ccdB-gen og et kloramfenikolresistent gen og må opprettholdes/forplantes i E. coli-stammen DB3.1 ved hjelp av LB-medium som inneholder kanamycin (50 μg/L) og kloramfenikol (15 μg/L).
    3. Overfør supernatanten til et nytt sentrifugerør. Tilsett 2,5 volumer etanol og 1/10 volum 3 M natriumacetat (pH = 4,0) og bland kraftig. Sentrifuge ved 14.000 x g i 10 min og fjern supernatanten.
    4. Skyll pelletsen med 1 ml 70% etanol og virvel kraftig. Sentrifuge ved 14.000 x g i 10 min og fjern supernatanten. Tørk pelletsen og oppløs den fordøyde PVX-LIC-plasmiden med 100 μL ddH2O.
    5. Sett opp T4 DNA-polymerasereaksjonen på is ved å blande 2,5 μL fordøyd PVX-LIC vektor-DNA, 0,5 μL 10x T4 DNA-polymerasebuffer, 0,05 μL 1 M DTT, 0,25 μL 100 mM dTTP og 0,1 μL T4 DNA-polymerase (3 U/μL) i et totalt volum på 5 μL. Inkuber blandingen ved 37 °C i 15 minutter og behandle produktene ved 75 °C i 20 minutter. aktivere T4 DNA-polymerasen.
  3. Klone STTM-sekvensen inn i PVX-LIC-vektoren ved hjelp av en LIC-reaksjon. Bland de T4 DNA-polymerasebehandlede STTM PCR-produktene (5 μL) og de T4 DNA-polymerasebehandlede PVX-LIC-plasmidene (5 μL). Inkuber ved 70 °C i 5 minutter, avkjøl ned til 22 °C ved en rampe på 0,1 °C/s, og hold den ved 22 °C i 30 minutter med en PCR-maskin.
    MERK: Utvid inkubasjonstiden til over natten ved 4 °C for å oppnå høyere effektivitet ved LIC-kloning.
  4. Transformer 5 μL av LIC-reaksjonsproduktene til E. coli DH5α og vokse på en LB-plate som inneholder 50 μg/ml kanamycin62,63. Velg og bekreft positive kolonier av PCR med kloning primere og universell primer for PVX-LIC vektor etterfulgt av sekvensering.
    1. Utfør koloni-PCR med foroverprimeren for PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') i kombinasjon med omvendt primer for STTM-kloning for å identifisere positive kloner. Størrelsen på PCR-båndet skal være ~ 300 bp.
      MERK: Kontroller sekvensene til STTM-fragmenter ved terminatorsyklussekvensering64,65.
  5. Isoler PVX-STTM-plasmidene fra de validerte klonene og forvandle dem til Agrobacteriumstammer GV3101, GV2260 eller EHA10562,63. Verifiser Agrobacterium kolonier av PCR.
    MERK: Bekreft Agrobacterium kolonier av PCR ved hjelp av fremover primer for PVX-LIC og omvendt primer for STTM kloning.

3. Utfør PVX-basert VbMS-analyse i potetplanter.

  1. Transplanter 4 uker gamle in vitro potetplanter i jord. De transplanterte plantene vil bli utsatt for VbMS-analyse 3-4 dager senere.
  2. Inokuler potetplanter med Agrobacterium som inneholder PVX-STTM plasmider.
    MERK: For VbMS-analysen i potet utføres Agrobacterium-mediert infiltrasjon og tannpirker-riper inokulering samtidig.
    1. Plukk og inokuler positive transformanter som inneholder PVX-STTM-vektorer i 50 ml flytende LB som inneholder 50 μg/ml kanamycin og 50 μg/ml rifampicin. Vokse i en 28 °C inkubator ved 220 o/min i 16 timer til OD600 = 1,0.
    2. Samtidig strekker du de positive Agrobacterium-koloniene på minst to nye LB-plater som inneholder 50 μg/ml kanamycin og 50 μg/ml rifampicin og vokser ved 28 °C i 1 dag. Inkluder PVX-LIC38,66-vektoren som en kontroll og PVX-GFP67,68 for å overvåke virusspredning.
    3. Samle Agrobacterium flytende kultur ved sentrifugering ved 3,400 x g i 10 min ved romtemperatur. Resuspend Agrobacterium celler med et likt volum infiltrasjon buffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES, og 200 μM acetosyringone, pH = 5,6) og juster til OD600 = 1,0. Inkuber ved romtemperatur i 6 timer.
    4. Infiltrer Agrobacterium-kulturen i den abaxiale siden av fullt utvidede blader med en 1 ml nål nålløs sprøyte.
      1. Vend og hold et blad med en hånd, og bruk deretter en finger til å støtte blad lamina fra adaxialsiden på infiltrasjonsstedet. Hold sprøyten vertikal til bladoverflaten med den andre hånden og infiltrer Agrobacterium-kulturen i den abaxiale siden av lamina.
    5. Skrap Agrobacterium-kulturen fra LB-platene og skrap stammeoverflaten til de første en eller to internodene til de infiltrerte potetplantene med en tannpirker. Skrap forsiktig epidermis av stammen. Unngå piercing gjennom stammen, noe som kan forårsake alvorlig skade på plantene.
  3. Dyrk de infiltrerte plantene ved 22 °C med en mørk fotoperiod på 16 timer og lysintensitet på 120 μmol/m2∙ s1 i et drivhus.
    MERK: Fenotyper forårsaket av miRNA-silencing vises vanligvis i 2–4 uker etterinokulasjon (figur 2, figur 3). Det tar vanligvis 10-20 dager før VbMS-fenotypen vises etter infiltrasjon. VbMS-fenotypen avhenger av egenskapene til de spesifikke miRNA- og målgenene, vekstforholdene og potetvariantene.

4. Utføre uttrykksanalyse.

  1. Når fenotyper vises ved 2-4 uker postinokulasjon, samle vev som skudd, blader, blomster eller røtter med fenotyper fra VbMS planter og vev fra kontrollplantene med saks. Isoler totale RNAer fra det innsamlede vevet.
  2. Kontroller RNA-kvaliteten med elektroforese62,63 og kvantifisere RNA-konsentrasjonen ved å måle OD260-absorbansen med et spektrofotometer.
  3. Bruk stem-loop sanntids omvendt transkripsjon PCR (RT-PCR) for å analysere miRNA-uttrykket.
    1. For spesifikke miRNAer, design en stamme-loop omvendt transkripsjon primer. Stem-loop RT primere inneholder en universell 5 'ryggrad og en 3 '6-nt forlengelse av en bestemt miRNA. Design en 5' universell ryggrad (5'- GTCTCCTCTGGTGGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') som danner en stamcellestruktur. (Store bokstaver tilsvarer en omvendt gjentatt sekvens og små bokstaver i løkkeområdet).
    2. En del av 5's ryggrad sekvens som danner en løkke fungerer som omvendt primer for påfølgende PCR forsterkning (fet-kursiv sekvens i ryggraden sekvens). Legg til en 6-nt forlengelse sekvens som er omvendt komplementær til 3 'enden av miRNA av interesse til stem-loop primer for å gi spesifisitet for omvendt transkripsjon (Supplerende figur 1A).
      MERK: Design stem-loop reverse transkripsjon primer som beskrevet av Chen et al.69 og Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. For eksempel er stem-loop reverse transkripsjon primer for Stu-miR160 designet som 5'-GTCTCCTCTGGGGGCagggtccgaggtattcGCACCAGGAGACGGCATA-3'. Den omvendte transkripsjonsprimeren for potet miR165/166-familien er designet som 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGGAGACGGGGGG(A/G)A-3'. (De fete sekvensene med store bokstaver gir spesifisiteten til omvendt transkripsjon for bestemte miRNAer).
    3. Sett opp den omvendte transkripsjonsreaksjonen ved å blande 50-200 ng av total RNA, 1 μL av stamløkke reverseringsprimeren (100 μM), 2 μL 10x buffer, 0,2 μL RNase-hemmer (40 U/μL), 0,25 μL dNTPer (10 mM hver) og 1 μL omvendt transkripsjonase (200 U/μL) på is. Legg nukleasefri ddH2O til et totalt volum på 20 μL.
    4. Utfør omvendt transkripsjon ved hjelp av den pulserte omvendte transkripsjonsprosedyren. Inkuber den omvendte transkripsjonsreaksjonsblandingen ved 16 °C i 30 minutter, utfør en temperatursyklus på 30 °C i 30 s, 42 °C i 30 s og 50 °C i 1 s, i totalt 60 sykluser, og aktiver omvendt transkripsjon ved inkubasjon ved 85 °C i 5 minutter.
    5. For PCR-analyse i sanntid av miRNA-uttrykk, design den fremre primeren basert på miRNA-sekvensen, men ikke inkluder sekvenser som overlapper med den ovenfor designede omvendte transkripsjonsprimeren. Legg til en 3–7-nt forlengelse i 5' av den fremre primeren for å optimalisere lengden, smeltetemperaturen og GC-innholdet (tilleggsfigur 1).
      MERK: Den universelle reversprimeren er 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. For eksempel er den omvendte transkripsjonsprimeren for Stu-miR160 designet som 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. Den omvendte transkripsjonsprimeren for miR165/166-serien er 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. De dristige sekvensene fungerer som 5'utvidelser for primeroptimalisering. Stem-loop reverse transkripsjon primere og sanntids PCR primere for miRNA kan utformes ved hjelp av miRNA Primer Design Tool73.
  4. Syntetiser cDNAer for mål-mRNAene ved standard omvendt transkripsjon PCR (RT-PCR). Inkuber den omvendte transkripsjonsreaksjonsblandingen ved 37 °C i 60 minutter og inaktiver den omvendte transkripsjonen ved oppvarming til 85 °C i 5 minutter.
    MERK: (1) Forutsi mål-mRNAer ved hjelp av psRNATarget-programmet74 hvis mål-mRNAene ikke er kjent. (2) Universal reverse transcription primer for mRNA er en forankret primer 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'.
  5. Sett opp PCR-reaksjonen i sanntid for både miRNA av interesse og mål-mRNAene. Bland 0,5 μL mal cDNA, 5 μL 2x sanntids PCR-buffer med SYBR grønn, 0,05 μL av hver fremre og omvendt primer (40 μM) og 4,4 μL ddH2O i et totalt volum på 5 μL på is.
  6. Inkuber ved 95 °C i 3 minutter, 40 sykluser på 95 °C i 3 s og 60 °C i 30 s. Utfør en etterfølgende smeltekurveanalyse som følger: Inkuber ved 95 °C i 15 s, avkjøl ned til 60 °C ved en rampe på 20 °C/s, hold ved 60 °C i 60 s, varm ned til 95 °C ved en rampe på 0,2 °C/s, og hold ved 95 °C i 15 s. Analyser Ct-verdiene ved hjelp av ΔΔCt-metodene76,77 og tegn inn midlene med standardfeil.
    MERK: (1) PCR-primere i sanntid for mål-mRNAer kan utformes som beskrevet75. (2) Potetpolyubiquitin 10 gen kan tjene som en intern kontroll for normalisering i potet. Den fremre primeren for potetpolyubiquitin 10-genet er 5'-ATGTTGCCTTCTTATGTGTGGTTG-3' og omvendt primer 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) For PCR-analyse i sanntid kan forurensning og primer-dimerdannelse generere falske positive resultater. For å overvåke ikke-spesifikk forsterkning og øke ansvaret for PCR-analyse i sanntid, anbefales det å inkludere kontroller uten mal og omvendt transkripsjon for PCR-analyser i sanntid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 viser PVX-STTM165/166 potetplanter (Katahdin) med ektopisk vekst av bladvev fra den abaxiale siden av blad lamina langs venene. Det er også observert mer alvorlige fenotyper som trompetformet bladdannelse. I motsetning ble det ikke observert fenotypisk abnormitet i PVX-kontrollanleggene. Disse resultatene viser at VbMS-systemet var effektivt for å undertrykke endogen miRNA-funksjon i tetraploide potetplanter, og PVX-VbMS-systemet var et robust genetisk verktøy for å bestemme funksjonen til spesifikke miRNAer eller miRNA-familier.

Figur 3 viser PVX-STTM165/166 potetplanter (Russet Burbank) med ektopisk bladvevsvekst fra den abaxiale siden av blad lamina langs venene. Disse resultatene viser at PVX-VbMS-systemet kan brukes på andre potetarter, inkludert en stor potetkultivar.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk diagram over PVX-baserte VbMS-vektorer og PVX-STTM165/166-strukturen. LB = T-DNA venstre kant; RB = T-DNA høyre kant; 35S = blomkål mosaikk virus 35S promotor; NOST = nopaline synthase terminator; RdRP = RNA-avhengig RNA-polymerase; TGB1 = trippel genblokkprotein 1; TGB2 = trippel genblokkprotein 2; TGB3 = trippel genblokkprotein 3; sgP = PVX subgenomisk RNA-promotor; CP = frakkprotein; LIC Cassette = ligation-uavhengig kloning kassett; 48 nt = 48 nukleotid ufullkommen stamme-loop linker. STTM165/166 består av tandem TM-sekvenser av miR165/166 atskilt med en 48-nt ufullkommen koblingssekvens for stammesløyfe. Den grønne pilspissen i PVX-LIC-vektoren angir startstedet for den PVX-subgenomiske RNA som huser STTM-sekvensen. Trippel minus bindestreker i miRNA-sekvenser angir spaltingsstedene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: VbMS av miR165/166 i tetraploidpotetsort katahdin. Fenotyper av potetplanter (Katahdin) som uttrykker PVX vektorstyring eller PVX-STTM165/166. Magenta piler betegner ektopisk genererte bladstrukturer i bladårene. Den oransje pilspissen betegner trompetlignende bladstrukturer. Bars = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: VBMS av miR165/166 i tetraploid potetsorten Russet Burbank. Fenotyper av potetplanter (Russet Burbank) som uttrykker PVX-vektor som kontroll eller PVX-STTM165/166. Magenta piler betegner ektopisk genererte bladstrukturer i bladårene. Bars = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Skjematiske diagrammer over stamme-loop RT-PCR analyse av miRNAer og sanntids PCR primer design. (A) Stem-loop RT-PCR analyse av miRNAer. Under omvendt transkripsjon initierte bindingen av stammesløyfeprimeren til 3' miRNA omvendt transkripsjon og cDNA ble syntetisert. PCR-produkter ble forsterket med en spesifikk fremoverprimer av miRNA av interesse og den universelle omvendte primeren. (B) PCR-primerdesign i sanntid. De fremre og omvendte primerne for Stu-miR160 og Stu-miR165/166 vises. Den fremre primeren ble designet basert på miRNA-sekvensen, men inkluderte ikke sekvenser som overlappet med den designede omvendte transkripsjonsprimeren. En 3-7-nt forlengelse ble lagt til 5' av den fremre primeren for å justere lengden, smeltetemperaturen og GC-innholdet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterer et PVX-basert miRNA-silencingsystem for å karakterisere funksjonen til endogene miRNAer i potet ved å integrere STTM-designen i PVX-vektoren. VbMS-systemet viste seg å være effektivt for å silencing miRNA165/166 i potet, en høyt bevart miRNA-familie på tvers av plantearter.

TM-tilnærmingen er utviklet for å forstyrre uttrykket av miRNAer basert på et kunstig miRNA-mål som er designet for å skape en mismatch-løkke på det forventede spaltingsstedet innenfor miRNA-komplementeringssekvensen som resulterer i fangst av målrettet miRNA og arrestasjon av sin aktivitet22,35,78,79 . Sammenkoblingen mellom TM-molekyler og mål-miRNAene blokkerer miRNAenes funksjon ved å slå ned nivåene til en bestemt miRNA- eller miRNA-familie, noe som fører til oppregulering av mål-mRNAene. Flere TM-teknologier er utviklet for silencing av miRNAer, inkludert endogen miRNA-målimilering (eTM)79,80, eTM-baserte miRNA-etterligninger (MIM-er)35,78, korte tandemmålimimer (STTM-er)22,53, en miRNA-decoy-tilnærming med TMs integrert i 3' UTR av proteinkodingstranskripsjoner81, og miRNA SPONGEs som inneholder miRNA-bindingssteder med to sentrale uoverensstemmelser for å målrette miRNAer (cmSPer) 82. STTM består av to miRNA bindingssteder med en 3-nt mismatch bulge, koblet av en 48-nt spacer som var empirisk optimalisert. STTM utløser effektiv inhibering av mål miRNAs22,53. STTM-teknologien har nylig blitt brukt på en storstilt funksjonell analyse av miRNAer fra modellanlegget Arabidopsis og store avlinger som ris og mais. Dette førte til oppdagelsen av enestående roller av flere endogene miRNAer involvert i utbytte og hormonkontroll, som har stort løfte om å forbedre avl avl47. Basert på disse fordelene med STTM-design, valgte vi STTM og integrerte den i PVX-vektoren for funksjonell karakterisering av miRNAer i potet. Det er verdt å merke seg at de forskjellige designene til TM-molekyler, for eksempel cmSPer, MIMs og STTMs, har variable effekter i å blokkere funksjonen til forskjellige miRNAer82. Derfor kan bruk av ulike TM-designstrategier bidra til å oppnå mer effektiv miRNA-undertrykkelse. Lengden og sekvenskonteksten til den uovertrufne bulen samt nukleotidendringene ved siden av miRNA-bindingsstedene må kanskje også optimaliseres for et spesifikt miRNA-silencingresultat22,36,38,78,83. Videre vil design av TM-molekyler under veiledning av beregningsforutsigelser sammen med eksperimentell analyse sannsynligvis føre til mer pålitelig hemming av miRNAs84.

Det ble vist at det PVX-baserte VIGS-systemet er effektivt for å utløse RNA-silencing i både diploide og dyrkede tetraploide Solanum-arter. Den PVX-baserte systemiske silencingen induseres og vedlikeholdes i hele bladvevet på in vitro-forplantede potetplanter i flere sykluser og på in vitro-genererte mikrotubere85. Vi har nylig rapportert at det PVX-baserte VIGS-systemet kan kneble gener av interesse for flere tetraploide potetkultivarer, som Ancilla, Arran Pilot, Marius Bard og Serrana86. Det gjenstår å avgjøre om den PVX-baserte VbMS-effekten kan overføres og opprettholdes i flere generasjoner gjennom vegetativ forplantning i potet. Transgene tilnærminger for å introdusere TM-molekyler stabilt i potetplanter anbefales fortsatt når silencingeffektene av miRNAer av interesse må opprettholdes i de påfølgende generasjonene.

Tallrike miRNAer involvert i potetvekst og utvikling er identifisert. RNA-seq, genomsekvensering og bioinformatisk prediksjon har i stor grad lagt til rette for identifisering av miRNAer og deres mål17,19,20,21. Så langt har tre potetgenomer blitt sekvensert, inkludert en doblet monoploid S. tuberosum Group Phureja klone DM1-3, en vill diploid art S. commersonii, og en diploid innavlet klone M6 av S. chacoense87,88,89. Oppdatert har bare et begrenset antall potet-miRNAer blitt funksjonelt karakterisert, i de fleste tilfeller ved hjelp av TM-teknologi. For eksempel fungerer FLOWERING LOCUS T (FT) homolog SP6A som et mobilsignal for å kontrollere tuberisering i potet og er målrettet av en miRNA, undertrykkende uttrykk for SP6A (SES), som formidler varmeindusert spalting av SP6A-transkripsjonen90,91. STTM-mediert overekspression av SES blokkerer aktiviteten til SES miRNA og letter tuberisering selv under kontinuerlige varmeforhold91. Knockdown av miR160, en miRNA involvert i immunrespons, ved eTM-tilnærmingen viste at miR160 er nødvendig i både lokal og systemisk ervervet motstand mot Phytophthora infestans i potet92.

Ved hjelp av en bioinformatisk tilnærming ble åtte unike familier av miRNAer som retter seg mot nukleotidbindingsstedet leucinerike repeterende (NLR) immunreseptorer i potet og tomat identifisert93. En av miRNA-familiene, miR482/2118, retter seg mot flere NLR-er som gir motstand mot ulike patogener og undertrykkelse av miR482/2118-familien miRNAer formidlet av transgent uttrykk for STTM-konstruksjoner fører til forbedret motstand i tomat mot P. infestans og Pseudomonas syringae13. Økende bevis tyder på at små RNAer produsert i patogener og verter kan reise mellom de to organismene og undertrykke hverandres genuttrykk formidlet av RNA-interferens94,95,96,97. For eksempel kan målmikro etterligner av en oomycete patogen-avledede sRNAer scavenge disse invaderende sRNAene og redusere patogeninfeksjon61. Det ville være interessant å undersøke om det nåværende VbMS-systemet kan brukes til å målrette patogenavledede sRNAer for å forbedre motstanden i planter.

Oppsummert er virusbasert miRNA-silencingsystem raskt og kostnadseffektivt og kan utføres i et format med høy gjennomstrømning. Det PVX-baserte VbMS-systemet gir et effektivt og robust genetisk verktøy for å bestemme funksjonen til spesifikke miRNAer eller miRNA-familier og målgenene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Yule Liu fra Tsinghua University for å ha levert PVX-LIC-vektoren. Dette arbeidet ble støttet av et oppstartsfond fra Texas A&M AgriLife Research og Hatch Project TEX0-1-9675 fra USDA National Institute of Food and Agriculture til JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145 (2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -J., Lin, S. -I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614 (2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489 (2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233 (2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714 (2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573 (2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178 (2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277 (2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627 (2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621 (2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500 (2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G. Functional Genomics: Methods and Protocols. Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. , Springer. New York. 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl 1 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl 1 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl 1 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl 1 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , Supplementary Files 20744 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190 (2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , Cold spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553 (1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P. RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. Kodama, H., Komamine, A. , Humana Press. 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12 (2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E. Plant Epigenetics: Methods and Protocols. Kovalchuk, I. , Springer US. 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168 (2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031 (2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28 (2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330 (2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088 (2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189 (2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs - Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

Tags

Miljøvitenskap utgave 159 virusbasert microRNA-silencing (VbMS) potetvirus X (PVX) microRNA (miRNA) målmimilering (TM) korte tandemmålmikromer (STTMer) Solanum tuberosum
Potetvirus X-basert mikroRNA-silencing (VbMS) i potet.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter