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Silenciador de microRNA baseado em vírus de batata (VbMS) na batata.

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

Apresentamos um protocolo detalhado para o sistema de silenciamento de microRNA baseado em vírus de batata X (PVX) para caracterizar funcionalmente microRNAs endógenas (miRNAs) na batata. As moléculas de mímica alvo (TM) de miRNA de interesse são integradas ao vetor PVX e transitavelmente expressas na batata para silenciar a família miRNA ou miRNA alvo.

Abstract

O silenciamento de microRNA baseado em vírus (VbMS) é uma ferramenta rápida e eficiente para caracterização funcional de microRNAs (miRNAs) em plantas. O sistema VbMS foi desenvolvido e aplicado para várias espécies vegetais, incluindo Nicotiana benthamiana, tomate, Arabidopsis, algodão e plantas monocotas, como trigo e milho. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado usando vetores VbMS baseados em PVX para silenciar miRNAs endógenas na batata. Para derrubar a expressão de um miRNA específico, moléculas de mímica-alvo (TM) de miRNA de interesse são projetadas, integradas em vetores de vírus vegetais, e expressas em batata pela infiltração de Agrobacterium para se ligar diretamente ao miRNA endógeno de interesse e bloquear sua função.

Introduction

As microRNAs (miRNAs) são caracterizadas como RNAs1 regulatórias codificadas por 20 a 24 anos, codificadas por armas nucleares e desempenham papéis fundamentais em quase todos os aspectos dos processos biológicos das plantas, incluindo crescimento e desenvolvimento2,3, fotossíntese e metabolismo4,5,6,7, síntese hormonal e sinalização 8,9, respostas biográficas e abióticas10, 11,12,13, e regulação de nutrientes e energia14,15. Os papéis regulatórios das miRNAs vegetais são bem programados e cumpridos tipicamente em níveis pós-transcrição, apertando ou reprimindo translacionadamente os mRNAs alvo.

Foram feitos enormes progressos na identificação, perfil transcricional e previsão de metas de miRNAs em batata16,17,18,19,20,21. No entanto, a caracterização funcional de miRNAs em plantas, incluindo batata, tem ficado para trás de outros organismos devido à falta de abordagens genéticas eficientes e de alto rendimento. É desafiador realizar a análise funcional do miRNA individual por análise padrão de perda de função, pois a maioria dos miRNAs pertencem a famílias com considerável redundância genética22. Além disso, um único miRNA pode controlar múltiplos genes-alvo23 e vários miRNAs diferentes podem modular a mesma via molecular de forma colaborativa24,25. Essas propriedades dificultam a caracterização da função de um miRNA específico ou de uma família miRNA.

Grande parte da análise funcional das miRNAs tem se apoiado fortemente em abordagens de ganho de função que têm limitações óbvias. O método artificial miRNA (amiRNA) explora as transcrições primárias endógenas (pri-miRNAs) para produzir miRNAs em alto nível, levando à inibição da expressão genética alvo26,27,28,29. No entanto, a marcação de ativação e a superexpressão do miRNA usando um forte promotor 35S constitutivo muitas vezes levam a uma expressão aumentada de miRNAs que não são representativas de condições in vivo e, portanto, podem não refletir a função endógena do miRNAs30. Uma abordagem alternativa foi desenvolvida envolvendo a expressão de formas resistentes ao miRNA de genes-alvo que contêm mutações impuros nos locais de ligação e/ou decote31,32,33. Mas essa abordagem também pode potencialmente causar má interpretação do fenótipo derivado do transgene alvo resistente ao miRNA devido a artefatos transgênicos. Portanto, as conclusões desses estudos de ganho de função devem ser tomadas com cautela34. Outra grande limitação das abordagens acima descritas é que elas requerem transformação, que é intensiva em mão-de-obra e demorada. Além disso, as abordagens dependentes de transgene dificilmente são aplicáveis para espécies de plantas recalcitrantes de transformação. Portanto, é essencial desenvolver uma abordagem rápida e eficiente de perda de função para desvendar a função dos miRNAs.

Para contornar o pré-requisito do procedimento de transformação, o silenciamento microRNA baseado em vírus (VbMS) foi estabelecido combinando as estratégias de imitação de alvo (TM) com vetores derivados do vírus. No sistema VbMS, moléculas de TM projetadas artificialmente são expressas transitoriamente a partir de uma espinha dorsal do vírus, oferecendo uma poderosa ferramenta de alta produtividade e economia de tempo para dissecar a função de miRNAs 35,36 endógenos vegetais. O VbMS foi inicialmente desenvolvido em N. benthamiana e tomate com o vírus do chocalho de tabaco (TRV)35,36,37 e foi estendido para Arabidopsis, algodão, trigo e milho usando vários outros sistemas de expressão de vírus, incluindo o vírus da batata X (PVX)38, o vírus do crumple da folha de algodão (ClCrV)39, o vírus do mosaico de pepino (CMV)40,41,42, vírus do mosaico de trigo chinês (CWMV)43 , e o vírus do mosaico de listras de cevada (BSMV)44,45.

A batata (solanum tuberosum) é a quarta cultura alimentar mais importante e a cultura noncereal mais cultivada noncereal no mundo principalmente devido ao seu alto valor nutricional, alta produção de energia e requisitos relativamente baixos de insumos46. Várias características da batata fazem dele uma planta modelo dicotyledonous atraente. É uma cultura poliploide propagada vegetativamente com alta taxa de cruzamento, heterozigosidade e diversidade genética. No entanto, até o momento, não há nenhum relatório caracterizando a função de miRNAs na batata usando VbMS. Aqui, apresentamos uma clonagem independente de ligadura (LIC) adaptada à batata VbMS baseada em VbMS para avaliar a função de miRNAs em plantas de batata38. Selecionamos a família miR165/166 para ilustrar o ensaio VbMS porque a família miR165/166 e seus mRNAs alvo e os fatores de transcrição de homeodomína/leu classe III (HD-ZIP III) foram amplamente caracterizados22,47,48. Os genes HD-ZIP III são os principais reguladores do desenvolvimento de meristem e polaridade de órgãos, e a supressão da função miR165/166 leva ao aumento da expressão dos genes HD-ZIP III, resultando em defeitos de desenvolvimento pleotrópico, como a redução da dominância apical e padrões aberrantes de polaridade de folhas222,35,38,41 . Os fenótipos de desenvolvimento facilmente escoráveis correlacionados com o silenciamento do miRNA165/166 permitem uma avaliação precisa da eficácia do ensaio VbMS baseado em PVX.

Neste estudo, demonstramos que o sistema VbMS baseado em PVX pode efetivamente bloquear a função de miRNAs na batata. Como o sistema de silenciamento genético induzido por vírus (VIGS) baseado em PVX foi estabelecido em várias variedades de batata49,50,51,52, essa abordagem VbMS baseada em PVX pode provavelmente ser aplicada a uma ampla gama de espécies de batata diploide e tetraploide.

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Protocol

1. Cultivar plantas de batata.

  1. Propagar plantas de batata in vitro em tubos de cultura (25 x 150 mm) com mídia Murashige e Skoog (MS) mais vitamina Gamborg (mistura de sal basal de MS, vitamina Gamborg, 30 g/L de sacarose, 3,5 g/L de ágar, pH = 5,7). Coloque os tubos na sala de crescimento abaixo de 20-22 °C, 16 h de luz/8 h fotoperíodo escuro e intensidade de luz 120 μmol/m2∙s1.
    NOTA: Novas brotos e raízes normalmente se desenvolvem em 1-2 semanas a partir de plantas. Propagar plantas com mídia de vitaminas ms/Gamborg frescas todos os meses.
  2. Quatro semanas depois, transplante plantas in vitro no solo e as plante em uma estufa abaixo de 20-22 °C, 16 h de luz/8 h fotoperíodo escuro e intensidade de luz 120 μmol/m2∙s1.
    NOTA: As plantas com raízes e folhas recém-desenvolvidas são adequadas para transplante. Mantenha a umidade para as plantas recém-transplantadas durante os primeiros 3-4 dias.

2. Construa os vetores VbMS.

  1. Projete e clone as moléculas TM de tandem curto (STTM, Figura 1)22,53 para o miRNA de interesse.
    NOTA: Adquira sequências de miRNA com base em dados experimentais ou no banco de dados miRbase54,55,56,57,58,59. A sequência miR166 utilizada neste estudo foi descrita anteriormente60.
    1. Projete o módulo TM inserindo uma sequência de incompatibilidade, normalmente 5'-CTA-3', na sequência de complemento reverso do miRNA no local correspondente aos nucleotídeos 10-11 do miRNA.
      NOTA: Por exemplo, a sequência de Stu-miR160 é 5'-UGCCUCUCUCUGUAUGCC-3'61, onde o nucleotídeos 10-11 está em negrito. A sequência de complemento reverso (em desoxinucleotídeos) é de 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' e o local de inserção da protuberância é mostrado em negrito. A sequência de moléculas TM (desoxynucleotide) deve ser de 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.
    2. Projete primers para clonagem do fragmento STTM (Figura 1). Use oligonucleotídeos de DNA com a sequência espaçadora de 48 nt como modelo para clonagem PCR. O primer dianteiro consiste em um linker LIC1 (5'-CgACgACAAGACCgT-3'), a sequência dianteira do acima projetado para molécula TM e a sequência parcial de 5' do espaçador de 48 nt (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). O primer reverso consiste em um linker LIC2 (5'-gAggAgAgAgCCgT-3'), a sequência de complemento reverso da molécula TM e um complemento reverso parcial à sequência de 3' do espaçador de 48 nt (5'-ATTCTTCTTTTTTAGACCAT-3').
      NOTA: A sequência de espaçadora de 48 nt é de 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAATGGTCTAAGAAGAAGAAT-3'. Por exemplo, para STTM-miR160, o primer para a frente deve ser 5'-CgACgACAAGCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'; o primer reverso deve ser de 5'-gAggAgAgAgCcgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTTTTTAGACCAT-3' (Figura 1).
    3. Amplie o fragmento STTM em um volume de 50 μL por PCR usando o espaçador universal 48-nt sintetizado como modelo e uma polimerase de DNA de alta fidelidade.
      1. Configure a reação do PCR misturando 0,5 μL de cada primer (40 μM), 0,5 μL de oligo espaçador de 48 nt (40 μM), 5 μL de tampão PCR 10x, 1 μL de mistura dNTP (10 mM cada), 0,1 μL de polimerase de DNA de alta fidelidade (10 U/μL ), e 43 μL de ddH2O a um volume total de 50 μL. Realize a amplificação padrão do PCR da seguinte forma: 94 °C para 3 min, 32 ciclos de 94 °C para 45 s, 60 °C para 45 s e 72 °C para 60 s.
    4. Purificar o fragmento STTM por precipitação de etanol. Adicione 2,5 volumes de etanol e 1/10 de volume de acetato de sódio de 3 M (pH = 4,0) aos produtos pcr. Misture vigorosamente e centrífuga a 14.000 x g por 10 min. Retire o supernasce e enxágue a pelota com 1 mL de 70% de etanol. Seque a pelota e dissolva-a em 20 μL de ddH2O.
      NOTA: Use eletroforese de DNA para verificar a amplificação dos produtos PCR STTM.
    5. Configure a reação de polimerase de DNA T4 no gelo misturando 2,5 μL de produto PCR STTM purificado, 0,5 μL de 10x T4 tampão de polimerase de DNA, 0,05 μL de 1 M dithiothreitol (DTT), 0,25 μL de 100 mM dATP, 0,1 μL de polimerase de DNA T4 (3 U/μL) e 1,6 μL de ddH2O a um volume total de 5 μL. Incubar a mistura a 37 °C por 15 min, e trate os produtos a 75 °C por 20 minutos para inativar a polimerase de DNA T4.
  2. Prepare a construção VbMS baseada em PVX.
    1. Digerir 5 μg de plásmid PVX-LIC com 2,5 μL de SmaI (20 U/μL) em um volume de 100 μL.
    2. Adicione um volume igual de fenol:clorofórmio:isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8.0) aos produtos PVX-LIC digeridos e misture vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g por 10 min e transferir o supernatante para um novo tubo centrífuga. Adicione um volume igual de clorofórmio:isopropanol (24:1) e vórtice vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g por 10 min.
      NOTA: O vetor PVX-LIC abriga o LIC para clonagem. O LIC do vetor PVX-LIC contém um gene ccdB e um gene resistente a clororamfenicol e precisa ser mantido/propagado na cepa E. coli DB3.1 usando meio LB contendo kanamycina (50 μg/L) e clororamfenicol (15 μg/L).
    3. Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga. Adicione 2,5 volumes de etanol e 1/10 de volume de acetato de sódio de 3 M (pH = 4,0) e misture vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g por 10 min e remover o supernatante.
    4. Enxágüe a pelota com 1 mL de 70% de etanol e vórtice vigorosamente. Centrifugar a 14.000 x g por 10 min e remover o supernatante. Seque a pelota e dissolva o plasmídeo PVX-LIC digerido com 100 μL de ddH2O.
    5. Configure a reação de polimerase de DNA T4 no gelo misturando 2,5 μL de DNA vetor PVX-LIC digerido, 0,5 μL de 10x tampão de polimerase de DNA T4, 0,05 μL de 1 M DTT, 0,25 μL de 100 mM dTTP, e 0,1 μL de polimerase de DNA T4 (3 U/μL) em um volume total de 5 μL. Incubar a mistura a 37 °C por 15 min e tratar os produtos a 75 °C por 20 min. inativar a polimerase de DNA T4.
  3. Clone a sequência STTM no vetor PVX-LIC usando uma reação LIC. Misture os produtos STTM PCR tratados com DNA T4 (5 μL) e os plasmídeos PVX-LIC tratados com DNA T4 (5 μL). Incubar a 70 °C por 5 min, esfriar até 22 °C em uma rampa de 0,1 °C/s, e manter a 22 °C por 30 min usando uma máquina PCR.
    NOTA: Estenda o tempo de incubação para durante a noite a 4 °C para obter maior eficiência da clonagem LIC.
  4. Transforme 5 μL dos produtos de reação LIC no E. coli DH5α e cresça em uma placa LB contendo 50 μg/mL kanamycin62,63. Escolha e verifique colônias positivas por PCR com os primers de clonagem e primer universal para o vetor PVX-LIC seguido de sequenciamento.
    1. Execute o PCR colônia com o primer dianteiro para PVX-LIC (5'-GTGTTGGCCAAACTAGAT-3') em combinação com o primer reverso para clonagem STTM para identificar clones positivos. O tamanho da banda PCR deve ser de ~300 bp.
      NOTA: Verifique as sequências de fragmentos STTM por sequenciamento do ciclo do exterminador64,65.
  5. Isole os plasmídeos PVX-STTM dos clones validados e transforme-os em cepas de Agrobacterium GV3101, GV2260 ou EHA10562,63. Verifique colônias de agrobacterium por PCR.
    NOTA: Confirme colônias de agrobacterium por PCR usando o primer dianteiro para PVX-LIC e o primer reverso para clonagem STTM.

3. Realize o ensaio VbMS baseado em PVX em plantas de batata.

  1. Transplante de 4 semanas de idade em plantas de batata in vitro no solo. As plantas transplantadas serão submetidas ao ensaio VbMS 3-4 dias depois.
  2. Plantas de batata inoculadas com Agrobacterium contendo os plasmídeos PVX-STTM.
    NOTA: Para o ensaio VbMS na batata, a infiltração mediada por Agrobacterium e a inoculação de arranhões de palito são realizadas simultaneamente.
    1. Escolha e inocula os transformadores positivos contendo vetores PVX-STTM em 50 mL de LB líquido contendo 50 μg/mL kanamycin e 50 μg/mL rifampicina. Cresça em uma incubadora de 28 °C a 220 rpm por 16 h até OD600 = 1,0.
    2. Ao mesmo tempo, cruze as colônias positivas de Agrobacterium em pelo menos duas novas placas LB contendo kanamycina de 50 μg/mL e 50 μg/mL rifampicina e crescem a 28 °C por 1 dia. Inclua o vetor PVX-LIC38,66 como controle e PVX-GFP67,68 para monitorar a propagação do vírus.
    3. Colete a cultura líquida agrobacterium por centrifugação a 3.400 x g por 10 min a temperatura ambiente. Resuspend Agrobacterium células com igual volume de tampão de infiltração (10 mM MgCl2, 10 mM MES e 200 μM acetosyringone, pH = 5,6) e ajustar-se a OD600 = 1,0. Incubar em temperatura ambiente por 6 h.
    4. Infiltrar-se na cultura Agrobacterium no lado abaxial de folhas totalmente expandidas com uma seringa sem agulha de 1 mL.
      1. Vire e segure uma folha com uma mão, em seguida, use um dedo para apoiar a folha lamina do lado adaxial no local de infiltração. Mantenha a seringa vertical à superfície da folha com a outra mão e infiltre-se na cultura Agrobacterium no lado abaxial da lamina.
    5. Raspe a cultura Agrobacterium das placas LB e arranhe a superfície do caule do primeiro ou dois internos das plantas de batata infiltradas com um palito de dente. Coce suavemente a epiderme da haste. Evite perfurar através da haste, o que pode causar danos graves às plantas.
  3. Cresça as plantas infiltradas a 22 °C com um fotoperíodo escuro de 16 h/8h e intensidade leve de 120 μmol/m2∙ s1 em uma estufa.
    NOTA: Fenótipos causados pelo silenciamento do miRNA geralmente aparecem em 2-4 semanas pós-incopulsão (Figura 2, Figura 3). Normalmente leva de 10 a 20 dias para que o fenótipo VbMS apareça após a infiltração. O fenótipo VbMS depende das propriedades do miRNA específico e dos genes-alvo específicos, condições de crescimento e variedades de batata.

4. Realize a análise de expressão.

  1. Quando os fenótipos aparecem em 2-4 semanas pós-inoculação, colete tecidos como brotos, folhas, flores ou raízes com fenótipos das plantas vbMS e tecidos das plantas de controle com tesouras. Isole o total de RNAs dos tecidos coletados.
  2. Verifique a qualidade do RNA por eletroforese62,63 e quantifique a concentração de RNA medindo a absorvância OD260 com um espectotômetro.
  3. Use o PCR de transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) para analisar a expressão miRNA.
    1. Para miRNAs específicos, projete um primer de transcrição reversa de loop-tronco. Os primers RT de loop-tronco contêm uma espinha dorsal universal de 5' e uma extensão de 3' 6-nt de um miRNA específico. Projete uma espinha dorsal universal de 5''- GTCTCCTCTGGTGCaggccgaggtattcGCACCAGAGAGGAGAC-3') que forme uma estrutura de loop-tronco. (A caixa superior corresponde a uma sequência inversa repetida e a minúscula à região do loop).
    2. Parte da sequência de backbone de 5' que forma um loop serve como primer reverso para amplificação PCR subsequente (sequência em negrito-itálico na sequência backbone). Adicione uma sequência de extensão de 6-nt que seja inversa-complementar ao final de 3' do miRNA de interesse ao primer de loop-tronco para fornecer especificidade para transcrição reversa (Figura Suplementar 1A).
      NOTA: Projete o primer de transcrição reversa do loop-tronco, conforme descrito por Chen et al.69 e Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Por exemplo, o primer de transcrição reversa de loop-tronco para Stu-miR160 foi projetado como 5'-GTCTCCCTGGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGAGGAGACGGCATA-3'. O primer de transcrição reversa do loop-de-haste para a família batata miR165/166 foi projetado como 5'-GTCTCCCTGGGGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGAGAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3'. (As sequências maiússmenas em negrito fornecem a especificidade da transcrição reversa para miRNAs específicos).
    3. Configure a reação de transcrição reversa misturando 50-200 ng de RNA total, 1 μL do primer de transcrição reversa de alça-tronco (100 μM), 2 μL de buffer de 10x, 0,2 μL de inibidor de RNase (40 U/μL), 0,25 μL de dNTPs (10 mM cada) e 1 μL de transcriptase reversa (200 U/μL) no gelo. Adicione ddH2O sem nuclease a um volume total de 20 μL.
    4. Realize a transcrição reversa usando o procedimento de transcrição reversa pulsada. Incubar a mistura de reação de transcrição reversa a 16 °C por 30 min, realizar um ciclo de temperatura de 30 °C para 30 s, 42 °C para 30 s e 50 °C para 1 s, para um total de 60 ciclos, e inativar a transcriptase reversa por incubação a 85 °C por 5 min.
    5. Para análise pcr em tempo real da expressão miRNA, projete o primer dianteiro com base na sequência miRNA, mas não inclua sequências que se sobrepõem com o primer de transcrição reversa de loop de haste projetado acima. Adicione uma extensão de 3-7-nt aos 5' do primer dianteiro para otimizar o comprimento, a temperatura de fusão e o conteúdo gc (Figura Suplementar 1).
      NOTA: O primer reverso universal é de 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Por exemplo, o primer de transcrição reversa de loop-tronco para Stu-miR160 foi projetado como 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. O primer de transcrição reversa do loop-tronco para a família miR165/166 é 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. As sequências ousadas servem como extensões de 5' para otimização do primer. Os primers de transcrição reversa do loop-tronco e os primers PCR em tempo real para miRNA podem ser projetados usando o miRNA Primer Design Tool73.
  4. Sintetizar cDNAs dos mRNAs de destino por PCR de transcrição reversa padrão (RT-PCR). Incubar a mistura de reação de transcrição reversa a 37 °C por 60 min e inativar a transcriptase reversa aquecendo a 85 °C por 5 min.
    NOTA: (1) Prever mRNAs de destino usando o programa psRNATarget74 se os mRNAs de destino não forem conhecidos. (2) O primer de transcrição reversa universal para mRNA é um primer ancorado 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'.
  5. Configure a reação pcr em tempo real tanto para miRNA de interesse quanto para os mRNAs de destino. Misture 0,5 μL de modelo cDNA, 5 μL de 2x tampão PCR em tempo real com verde SYBR, 0,05 μL de cada primer para frente e reverso (40 μM) e 4,4 μL de ddH2O em um volume total de 5 μL no gelo.
  6. Incubar a 95 °C por 3 min, 40 ciclos de 95 °C para 3 s e 60 °C para 30 s. Realize uma análise subsequente da curva de fusão da seguinte forma: Incubar a 95 °C para 15 s, esfriar até 60 °C em uma rampa de 20 °C/s, manter a 60 °C para 60 s, aquecer a 95 °C em uma rampa de 0,2 °C/s, e manter a 95 °C para 15 s. Analise os valores Ct usando os métodos ΔΔCt76,77 e plote os meios com erros padrão.
    NOTA: (1) Os primers pcr em tempo real para mRNAs de destino podem ser projetados conforme descrito75. (2) A poliubiquitina de batata 10 pode servir como um controle interno para a normalização na batata. O primer dianteiro para o gene de poliubiquitina de batata 10 é 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' e o primer reverso 5'-TTATTTATTCACATAACAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Para análise de PCR em tempo real, a contaminação e a formação de primer-dimer podem gerar resultados falsos positivos. Para monitorar a amplificação não específica e aumentar a responsabilidade da análise pcr em tempo real, recomenda-se incluir controles sem modelo e transcriptase reversa para ensaios PCR em tempo real.

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Representative Results

A Figura 2 mostra as plantas de batata PVX-STTM165/166 (Katahdin) com crescimento ectópico de tecidos de folhas do lado abaxial da folha de lamina ao longo das veias. Fenótipos mais severos, como a formação de folhas em forma de trompete, também foram observados. Em contraste, não foi observada anormalidade fenotípica nas plantas de controle PVX. Esses resultados mostram que o sistema VbMS foi eficaz na supressão da função miRNA endógena em plantas de batata tetraploide e o sistema PVX-VbMS foi uma ferramenta genética robusta para determinar a função de famílias específicas de miRNAs ou miRNA.

A Figura 3 mostra as plantas de batata PVX-STTM165/166 (Russet Burbank) com crescimento de tecido de folhas ectópicas a partir do lado abaxial da folha lamina ao longo das veias. Esses resultados mostram que o sistema PVX-VbMS poderia ser aplicado a outras espécies de batata, incluindo uma grande cultivar de batata.

Figure 1
Figura 1: Diagrama esquemático dos vetores VbMS baseados em PVX e na estrutura PVX-STTM165/166. LB = T-DNA fronteira esquerda; RB = T-DNA fronteira direita; 35S = vírus do mosaico de couve-flor 35S promotor; NOST = terminator de synthase nopalina; RdRP = polimerase de RNA dependente de RNA; TGB1 = tripla proteína do bloco genético 1; TGB2 = tripla proteína do bloco genético 2; TGB3 = tripla proteína do bloco genético 3; sgP = promotor de RNA subgêmico PVX; CP = proteína do casaco; LIC = de clonagem independente de ligadura; 48 nt = 48 nucleotídeos imperfeitos linker de laço de haste. STTM165/166 consiste em sequências de TM tandem de miR165/166 separadas por uma sequência de linker de loop de haste imperfeita de 48 nt. A ponta da seta verde no vetor PVX-LIC indica o local inicial do RNA subgêmico PVX que abriga a sequência STTM. O triplo menos hífens em sequências de miRNA indicam os locais de decote. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: VbMS de miR165/166 na variedade de batata tetraploide Katahdin. Fenótipos das plantas de batata (Katahdin) expressando o controle vetorial PVX ou PVX-STTM165/166. As setas magenta denotam estruturas de folhas geradas em êxtase nas veias da folha. A ponta da flecha laranja denota estruturas de folhas semelhantes a trombetas. Barras = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: VbMS de miR165/166 na variedade de batata tetraploide Russet Burbank. Fenótipos das plantas de batata (Russet Burbank) expressando vetor PVX como controle ou PVX-STTM165/166. As setas magenta denotam estruturas de folhas geradas em êxtase nas veias da folha. Barras = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Diagramas esquemáticos da análise RT-PCR de loop-tronco de miRNAs e design de primer PCR em tempo real. (A) Análise RT-PCR de loop-tronco de miRNAs. Durante a transcrição reversa, a vinculação do primer de alça-tronco ao miRNA de 3' iniciou a transcrição reversa e o cDNA foi sintetizado. Os produtos PCR foram amplificados com um primer avançado específico do miRNA de interesse e o primer reverso universal. (B) Design de primer PCR em tempo real. Os primers dianteiros e invertidos para Stu-miR160 e Stu-miR165/166 são mostrados. O primer dianteiro foi projetado com base na sequência miRNA, mas não incluiu sequências que se sobrepuseram com o primer de transcrição reversa de loop-tronco projetado. Uma extensão de 3-7-nt foi adicionada aos 5' da cartilha dianteira para ajustar o comprimento, a temperatura de fusão e o conteúdo gc. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Apresentamos um sistema de silenciamento miRNA baseado em PVX para caracterizar a função de miRNAs endógenos na batata, integrando o design STTM ao vetor PVX. O sistema VbMS mostrou-se eficaz no silenciamento do miRNA165/166 na batata, uma família de miRNA altamente conservada entre espécies vegetais.

A abordagem TM foi desenvolvida para interferir na expressão de miRNAs baseada em uma mímica de alvo miRNA artificial que foi projetada para criar um loop de incompatibilidade no local esperado de decote dentro da sequência de complementação miRNA que resulta em sequestro de miRNA direcionado e prisão de sua atividade22,35,78,79 . O emparelhamento entre moléculas de TM e os miRNAs alvo bloqueia a função dos miRNAs derrubando os níveis de um miRNA específico ou uma família miRNA, o que leva à regulação dos mRNAs alvo. Várias tecnologias TM foram desenvolvidas para silenciar miRNAs, incluindo mimetização de alvo miRNA endógena (eTM)79,80, Mamadeiras miRNA baseadas em eTM (MIMs)35,78, mímicas de alvos de tandem curto (STTMs)22,53, uma abordagem de isca miRNA com TMs integrados ao UTR de transcrições de codificação de proteínas81, e iRNA SPONGEs contendo sites de ligação miRNA com dois desencontros centrais para miRNAs (cmSPs) 82. O STTM consiste em dois sites de ligação miRNA com uma protuberância de incompatibilidade de 3 nt, ligado por um espaçador de 48 nt que foi empiricamente otimizado. O STTM desencadeia a inibição eficiente dos miRNAs22,53 alvos. A tecnologia STTM foi recentemente aplicada com sucesso a uma análise funcional em larga escala de miRNAs da planta modelo Arabidopsis e grandes culturas como arroz e milho. Isso levou à descoberta de papéis sem precedentes de vários miRNAs endógenos envolvidos no rendimento e controle hormonal, o que mantém grande promessa na melhoria da reprodução das culturas47. Com base nessas vantagens do design STTM, escolhemos o STTM e o integramos ao vetor PVX para caracterização funcional de miRNAs na batata. Vale ressaltar que os diversos desenhos de moléculas de TM, como cmSPs, MIMs e STTMs, possuem eficácias variáveis no bloqueio da função de diferentes miRNAs82. Portanto, o uso de várias estratégias de design de TM pode ajudar a alcançar uma supressão de miRNA mais eficaz. O comprimento e o contexto sequencial da protuberância incomparável, bem como as alterações de nucleotídeos adjacentes aos locais de ligação do miRNA também podem precisar ser otimizados para um resultado específico de silenciamento de miRNA22,36,38,78,83. Além disso, o design de moléculas de TM sob orientação de previsões computacionais juntamente com análises experimentais provavelmente levará a uma inibição mais confiável do miRNAs84.

Foi demonstrado que o sistema VIGS baseado em PVX é eficaz no desencadeamento do silenciamento de RNA em espécies de diploide e tetraploide solanum cultivado. O silenciamento sistêmico baseado em PVX é induzido e mantido em todos os tecidos foliar em plantas de batata propagadas in vitro por vários ciclos e em microtubos gerados in vitro85. Recentemente, relatamos que o sistema VIGS baseado em PVX pode silenciar genes de interesse em várias cultivares de batata tetraploide, como Ancilla, Arran Pilot, Marius Bard e Serrana86. Resta saber se o efeito VbMS baseado em PVX pode ser transmitido e sustentado por várias gerações através da propagação vegetativa na batata. Abordagens transgênicas para introduzir moléculas de TM stably em plantas de batata ainda são recomendadas quando os efeitos silenciador de miRNAs de interesse precisam ser mantidos nas gerações seguintes.

Foram identificadas inúmeras miRNAs envolvidas no crescimento e desenvolvimento da batata. RNA-seq, sequenciamento de genomas e previsão bioinformática facilitaram muito a identificação de miRNAs e suas metas17,19,20,21. Até agora, três genomas de batata foram sequenciados, incluindo um clone do grupo de tubos phureja do grupo de tubos DM1-3, uma espécie diploide selvagem S. commersonii, e um clone de raça diploide M6 de S. chacoense87,88,89. Até o momento, apenas um número limitado de miRNAs de batata foram caracterizados funcionalmente, na maioria dos casos usando a tecnologia TM. Por exemplo, o SP6A homólogo de LOCUS T (FT) florido atua como um sinal móvel para controlar a tuberização na batata e é alvo de um miRNA, suprimindo a expressão do SP6A (SES), que media o decote induzido pelo calor da transcrição SP6A90,91. A superexpressão mediada pela STTM da SES bloqueia a atividade do SES miRNA e facilita a tuberização mesmo em condições de calor contínua91. Knockdown de miR160, um miRNA envolvido na resposta imune, pela abordagem eTM mostrou que o miR160 é necessário tanto em resistência adquirida local quanto sistêmica contra infestanos Phytophthora na batata92.

Utilizando uma abordagem bioinformática, foram identificadas oito famílias únicas de miRNAs que visam receptores imunológicos ricos em leucina (NLR) em batata e tomate. Uma das famílias miRNA, miR482/2118, tem como alvo vários NLRs que conferem resistência a vários patógenos e supressão dos miR482/2118 miRNAs familiares mediados pela expressão transgênica de construções STTM leva a uma maior resistência no tomate contra infestanos P. e Pseudomonas syringae13. Evidências crescentes sugerem que pequenos RNAs produzidos em patógenos e hospedeiros podem viajar entre os dois organismos e suprimir a expressão genética um do outro mediado por interferências de RNA entre reinos94,95,96,97. Por exemplo, as imitações de alvo de um sRNAs derivado de patógeno oomycete podem ressarcer esses sRNAs invasores e reduzir a infecção por patógenos61. Seria interessante examinar se o atual sistema VbMS pode ser empregado para atingir sRNAs derivados de patógenos para melhorar a resistência nas plantas.

Em resumo, o sistema de silenciamento miRNA baseado em vírus é rápido e econômico e pode ser realizado em um formato de alto rendimento. O sistema VbMS baseado em PVX fornece uma ferramenta genética eficiente e robusta para determinar a função de famílias miRNAs ou miRNA específicas e os genes-alvo.

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Disclosures

Nenhum.

Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Yule Liu, da Universidade de Tsinghua, por fornecer o vetor PVX-LIC. Este trabalho foi apoiado por um fundo inicial da Texas A&M AgriLife Research e do Projeto Hatch TEX0-1-9675 do Instituto Nacional de Alimentos e Agricultura do USDA para o JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

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References

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145 (2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -J., Lin, S. -I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614 (2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489 (2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233 (2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714 (2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573 (2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178 (2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277 (2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627 (2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621 (2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500 (2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G. Functional Genomics: Methods and Protocols. Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. , Springer. New York. 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl 1 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl 1 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl 1 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl 1 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , Supplementary Files 20744 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190 (2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , Cold spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553 (1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P. RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. Kodama, H., Komamine, A. , Humana Press. 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12 (2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E. Plant Epigenetics: Methods and Protocols. Kovalchuk, I. , Springer US. 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168 (2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031 (2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28 (2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330 (2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088 (2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189 (2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs - Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

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Ciências Ambientais Questão 159 silenciamento de microRNA baseado em vírus (VbMS) vírus da batata X (PVX) microRNA (miRNA) mímica de alvo (TM) mímica de alvos de tandem curto (STTMs) tubos de solanum
Silenciador de microRNA baseado em vírus de batata (VbMS) na batata.
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Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

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