Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Глушение микроРНК на основе вируса картофеля X (VbMS) в картофеле.

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

Мы представляем подробный протокол для системы глушения микроРНК (VbMS) на основе вируса картофеля X (PVX) для функциональной характеристики эндогенных микроРНК (миРНК) в картофеле. Целевые мимические (ТМ) молекулы интересующей миРНК интегрированы в вектор PVX и временно экспрессируются в картофеле, чтобы заглушить целевое семейство миРНК или миРНК.

Abstract

Глушение микроРНК на основе вирусов (VbMS) является быстрым и эффективным инструментом для функциональной характеристики микроРНК (миРНК) в растениях. Система VbMS была разработана и применена для различных видов растений, включая Nicotiana benthamiana, помидоры, арабидопсис, хлопчатник и монокотные растения, такие как пшеница и кукуруза. Здесь мы описываем подробный протокол, использующий векторы VbMS на основе PVX для подавления эндогенных миРНК в картофеле. Чтобы сбить экспрессию специфической миРНК, разрабатываются целевые мимикрирующие (ТМ) молекулы интересующей миРНК, интегрируются в векторы вирусов растений и экспрессируются в картофеле путем инфильтрации Agrobacterium для непосредственного связывания с эндогенной миРНК, представляющей интерес, и блокирования ее функции.

Introduction

МикроРНК растений (миРНК) характеризуются как 20-24 нуклеотидные, ядерно-кодируемые регуляторные РНК1 и играют фундаментальную роль почти во всех аспектах растительных биологических процессов, включая рост и развитие2,3, фотосинтез и метаболизм4,5,6,7, синтез и передачу сигналов гормонов8,9, биотические и абиотические реакции10, 11,12,13, регулирование питательных веществ и энергии14,15. Регуляторные роли растительных миРНК хорошо запрограммированы и выполняются, как правило, на посттранскрипционных уровнях путем либо расщепления, либо трансляционного подавления целевых мРНК.

Огромный прогресс был достигнут в области идентификации, транскрипционного профилирования и целевого прогнозирования микроРНК в картофеле16,17,18,19,20,21. Однако функциональная характеристика микроРНК в растениях, включая картофель, отстает от других организмов из-за отсутствия эффективных и высокопроизводительных генетических подходов. Выполнить функциональный анализ отдельных миРНК путем стандартного анализа потери функции сложно, поскольку большинство микроРНК относятся к семействам со значительной генетической избыточностью22. Кроме того, одна миРНК может контролировать несколько генов-мишеней23, а несколько различных миРНК могут совместно модулировать один и тот же молекулярный путь24,25. Эти свойства затрудняют характеристику функции конкретной миРНК или семейства миРНК.

Большая часть функционального анализа микроРНК в значительной степени опирается на подходы с усилением функции, которые имеют очевидные ограничения. Метод искусственной миРНК (амиРНК) использует эндогенные первичные транскрипты (примиРНК) для производства миРНК на высоком уровне, что приводит к ингибированию экспрессии генов-мишеней26,27,28,29. Однако активационная маркировка и гиперэкспрессия миРНК с использованием сильного конститутивного промотора 35S часто приводят к повышенной экспрессии миРНК, которые не являются репрезентативными для состояний in vivo и, следовательно, могут не отражать эндогенную функцию miRNAs30. Был разработан альтернативный подход, включающий экспрессию устойчивых к миРНК форм генов-мишеней, которые содержат непроницаемые мутации в сайтах связывания и/или расщепления31,32,33. Но этот подход также может потенциально вызвать неправильную интерпретацию фенотипа, полученного из микроРНК-резистентного целевого трансгена из-за трансгенных артефактов. Поэтому выводы из этих исследований усиления функции следует делать с осторожностью34. Другим существенным ограничением вышеописанных подходов является то, что они требуют трансформации, которая является трудоемкой и трудоемкой. Кроме того, трансген-зависимые подходы вряд ли применимы к трансформно-непокорным видам растений. Поэтому важно разработать быстрый и эффективный подход к потере функции для разгадки функции микроРНК.

Чтобы обойти предпосылку процедуры трансформации, было установлено подавление микроРНК на основе вируса (VbMS) путем объединения стратегий мишенной имитации (TM) с векторами, полученными из вируса. В системе VbMS искусственно разработанные молекулы ТМ временно экспрессируются из вирусной основы, предлагая мощный, высокопроизводительный и экономящий время инструмент для рассечения функции эндогенных микроРНК растений35,36. VbMS был первоначально разработан в N. benthamiana и помидорах с вирусом табачной погремушки (TRV)35,36,37 и был распространен на арабидопсис, хлопок, пшеницу и кукурузу с использованием различных других систем экспрессии вируса, включая вирус картофеля X (PVX)38, вирус смятия листьев хлопчатника (ClCrV)39, вирус мозаики огурцов (CMV)40,41,42, вирус китайской мозаики пшеницы (CWMV)43 , и вирус ячменной полосатой мозаики (BSMV)44,45.

Картофель (Solanum tuberosum) является четвертой по важности продовольственной культурой и наиболее широко выращиваемой нецереальной культурой в мире, прежде всего из-за его высокой питательной ценности, высокого производства энергии и относительно низких потребностей в ресурсах46. Несколько особенностей картофеля делают его привлекательным двудольным модельным растением. Это вегетативно размножаемая полиплоидная культура с высокой скоростью ауткроссирования, гетерозиготностью и генетическим разнообразием. Однако на сегодняшний день нет отчета, характеризующего функцию миРНК в картофеле с использованием VbMS. Здесь мы представляем адаптированный к лигированию (LIC) подход VbMS на основе PVX картофеля для оценки функции миРНК в растениях картофеля38. Мы выбрали семейство miR165/166 для иллюстрации анализа VbMS, потому что семейство miR165/166 и их целевые мРНК и факторы транскрипции гомеодомена/молнии класса III (HD-ZIP III) были широко охарактеризованы22,47,48. Гены HD-ZIP III являются ключевыми регуляторами развития меристемы и полярности органов, а подавление функции miR165/166 приводит к увеличению экспрессии генов HD-ZIP III, что приводит к плеотропным дефектам развития, таким как снижение апикального доминирования и аберрантные паттерны полярности листьев22,35,38,41 . Легко оцениваемые фенотипы развития, коррелирующие с глушением miRNA165/166, позволяют точно оценить эффективность анализа VbMS на основе PVX.

В этом исследовании мы демонстрируем, что система VbMS на основе PVX может эффективно блокировать функцию миРНК в картофеле. Поскольку система глушения генов на основе PVX(VIGS) была создана в ряде сортов картофеля49,50,51,52, этот подход VbMS на основе PVX, вероятно, может быть применен к широкому кругу диплоидных и тетраплоидных видов картофеля.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Выращивайте растения картофеля.

  1. Размножайте растения картофеля in vitro в культуральных трубках (25 х 150 мм) средой Мурашиге и Скуг (МС) плюс витамин Гамборга (смесь базальной соли РС, витамин Гамборга, 30 г/л сахарозы, 3,5 г/л агара, рН = 5,7). Поместите трубки в комнату роста при температуре 20–22 °C, 16 ч света/8 ч темного фотопериода и интенсивности света 120 мкмоль/м2∙s1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Новые побеги и корни обычно развиваются через 1-2 недели из растений. Размножайте растения свежими витаминными средами MS/Gamborg каждый месяц.
  2. Четыре недели спустя пересадите растения in vitro в почву и выращивайте их в теплице при температуре 20–22 °C, 16 ч света/8 ч темного фотопериода и интенсивности света 120 мкмоль/м2∙s1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растения с недавно выведенными корнями и листьями пригодны для пересадки. Сохраняйте влагу для свежепересаженных растений в течение первых 3–4 дней.

2. Построение векторов VbMS.

  1. Разработка и клонирование коротких тандемных молекул ТМ (STTM, рисунок 1)22,53 для интересующей миРНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Получение последовательностей миРНК на основе экспериментальных данных или из базы данных miRbase54,55,56,57,58,59. Последовательность miR166, используемая в этом исследовании, была описана ранее60.
    1. Спроектировать модуль ТМ путем вставки последовательности несоответствия, обычно 5'-CTA-3', в обратную последовательность комплемента миРНК на участке, соответствующем 10-11-м нуклеотидам миРНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, последовательность Stu-miR160 представляет собой 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, где 10-11-й нуклеотиды выделены жирным шрифтом. Обратная последовательность комплемента (в дезоксинуклеотидах) составляет 5'-GGCATACAGAGAGCCAGGCA-3', а место вставки несоответствующей выпуклости показано жирным шрифтом. Последовательность молекул ТМ (дезоксинуклеотид) должна быть 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.
    2. Проектные грунтовки для клонирования фрагмента STTM (рисунок 1). Используйте олигонуклеотиды ДНК с 48-новой спейсерной последовательностью в качестве шаблона для клонирования ПЦР. Передний праймер состоит из линкера LIC1 (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), прямой последовательности вышеуказанной, предназначенной для молекулы ТМ, и частичной 5' последовательности 48-нтовой спейсера (5'-GTTGTTGTTGTTATGGT-3'). Обратный праймер состоит из линкера LIC2 (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), обратной последовательности комплемента молекулы TM и частичного обратного дополнения к 3' последовательности 48-nt спейсера (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3').
      ПРИМЕЧАНИЕ: 48-нтовая спейсерная последовательность 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT-3'. Например, для STTM-miR160 прямая грунтовка должна быть 5'-CgACgACAAGACCgT-GGCATACAGAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTGTTATGGT-3'; обратная грунтовка должна быть 5'-gAggAgAagCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' (рисунок 1).
    3. Амплифицируют фрагмент STTM в объеме 50 мкл методом ПЦР с использованием синтезированного универсального 48-нтового спейсера в качестве шаблона и высокоточной ДНК-полимеразы.
      1. Настройте реакцию ПЦР путем смешивания 0,5 мкл каждого праймера (40 мкМ), 0,5 мкл 48-нт спейсерного олиго (40 мкМ), 5 мкл 10-кратного буфера ПЦР, 1 мкл смеси dNTP (по 10 мМ), 0,1 мкл высокоточной ДНК-полимеразы (10 ЕД/мкл) и 43 мкл ddH2O до общего объема 50 мкл. Выполните стандартную амплификацию ПЦР следующим образом: 94 °C в течение 3 мин, 32 цикла 94 °C в течение 45 с, 60 °C в течение 45 с и 72 °C в течение 60 с.
    4. Очищают фрагмент STTM путем осаждения этанола. Добавьте 2,5 объема этанола и 1/10 объема 3 М ацетата натрия (рН = 4,0) к продуктам ПЦР. Энергично перемешайте и центрифугируйте при 14 000 х г в течение 10 мин. Удалите надосадочное вещество и промойте гранулу 1 мл 70% этанола. Гранулу высушите и растворите в 20 мкл ddH2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте электрофорез ДНК для проверки амплификации продуктов STTM PCR.
    5. Настройте днк-полимеразную реакцию Т4 на льду путем смешивания 2,5 мкл очищенного продукта STTM PCR, 0,5 мкл 10x T4 ДНК-полимеразного буфера, 0,05 мкл 1 М дитиотрейтола (DTT), 0,25 мкл 100 мМ dATP, 0,1 мкл ДНК-полимеразы T4 (3 ЕД/мкл) и 1,6 мкл ddH2O до общего объема 5 мкл. Инкубируйте смесь при 37 °C в течение 15 мин, и обрабатывать продукты при 75 °C в течение 20 мин для инактивации ДНК-полимеразы Т4.
  2. Подготовьте конструкцию VbMS на основе PVX.
    1. Переваривает 5 мкг плазмиды PVX-LIC38 с 2,5 мкл SmaI (20 Ед/мкл) в объеме 100 мкл.
    2. Добавьте равный объем фенола:хлороформа:изопропанола (25:24:1, pH = 6,7/8,0) к переваренным продуктам PVX-LIC и энергично перемешайте. Центрифуга при 14 000 х г в течение 10 мин и перенос супернатанта в новую центрифужную трубку. Добавьте равный объем хлороформа: изопропанола (24: 1) и энергично вихрь. Центрифуга при 14 000 х г в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вектор PVX-LIC содержит кассету LIC для клонирования. Кассета LIC вектора PVX-LIC содержит ген ccdB и ген, устойчивый к хлорамфениколу, и должна поддерживаться/размножаться в штамме E. coli DB3.1 с использованием среды LB, содержащей канамицин (50 мкг/л) и хлорамфеникол (15 мкг/л).
    3. Перенесите супернатант на новую центрифужную трубку. Добавьте 2,5 объема этанола и 1/10 объема 3 М ацетата натрия (рН = 4,0) и энергично перемешайте. Центрифуга при 14 000 х г в течение 10 мин и удаление супернатанта.
    4. Промыть гранулу 1 мл 70% этанола и энергично вихрь. Центрифуга при 14 000 х г в течение 10 мин и удаление супернатанта. Высушите гранулу и растворите переваренную плазмиду PVX-LIC со 100 мкл ddH2O.
    5. Настройте реакцию ДНК-полимеразы Т4 на льду путем смешивания 2,5 мкл переваренной векторной ДНК PVX-LIC, 0,5 мкл 10x Т4 ДНК-полимеразного буфера, 0,05 мкл 1 М ДТТ, 0,25 мкл 100 мМ dTTP и 0,1 мкл ДНК-полимеразы Т4 (3 ЕД/мкл) в общем объеме 5 мкл. Инкубируйте смесь при 37 °C в течение 15 мин и обрабатывайте продукты при 75 °C в течение 20 мин инактивировать ДНК-полимеразу Т4.
  3. Клонируйте последовательность STTM в вектор PVX-LIC с помощью реакции LIC. Смешайте обработанные Т4 ДНК-полимеразой продукты STTM PCR (5 мкл) и обработанные ДНК-полимеразой Т4 плазмиды PVX-LIC (5 мкл). Инкубировать при 70 °C в течение 5 мин, охлаждать до 22 °C при рампе 0,1 °C/с и хранить при 22 °C в течение 30 мин с помощью ПЦР-машины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличить время инкубации до ночи при 4 °C для достижения более высокой эффективности клонирования LIC.
  4. Преобразовать 5 мкл продуктов реакции LIC в E. coli DH5α и расти на пластине LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина62,63. Отбирайте и проверяйте положительные колонии методом ПЦР с помощью праймеров клонирования и универсальной грунтовки для вектора PVX-LIC с последующим секвенированием.
    1. Выполняют колониальную ПЦР с форвардным праймером для PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') в сочетании с обратной грунтовкой для клонирования STTM для выявления положительных клонов. Размер полосы ПЦР должен составлять ~300 bp.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверка последовательностей фрагментов STTM методом последовательности цикла терминатора64,65.
  5. Изолируйте плазмиды PVX-STTM от проверенных клонов и превратите их в штаммы Agrobacterium GV3101, GV2260 или EHA10562,63. Проверка колоний агробактерий методом ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите колонии агробактерий методом ПЦР с помощью прямого праймера для PVX-LIC и обратного праймера для клонирования STTM.

3. Выполните анализ VbMS на основе PVX на растениях картофеля.

  1. Пересадите 4-недельные растения картофеля in vitro в почву. Пересаженные растения будут подвергнуты анализу VbMS через 3–4 дня.
  2. Инокулируйте растения картофеля агробактериями , содержащими плазмиды PVX-STTM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа VbMS в картофеле одновременно проводятся опосредованная агробактериями инфильтрация и прививка зубочистки.
    1. Отбор и инокуляция положительных трансформантов, содержащих векторы PVX-STTM, в 50 мл жидкого LB, содержащего 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл рифампицина. Растите в инкубаторе с температурой 28 °C при 220 об/мин в течение 16 ч до OD600 = 1,0.
    2. В то же время перенос положительных колоний agrobacterium по меньшей мере на две новые пластины LB, содержащие 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл рифампицина, и растут при 28 °C в течение 1 дня. Включите вектор PVX-LIC38,66 в качестве контроля и PVX-GFP67,68 для мониторинга распространения вируса.
    3. Соберите жидкую культуру Agrobacterium путем центрифугирования при 3 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Повторно суспендировать клетки Agrobacterium с равным объемом инфильтрационного буфера (10 мМ MgCl2, 10 мМ MES и 200 мкМ ацетосиргинона, рН = 5,6) и приспособить к OD600 = 1,0. Инкубировать при комнатной температуре в течение 6 ч.
    4. Внедрить культуру Agrobacterium в абаксиальную сторону полностью расширенных листьев с помощью безгольчатого шприца объемом 1 мл.
      1. Переверните и удерживайте лист одной рукой, затем используйте один палец, чтобы поддержать пластинку листа с адаксиальной стороны в месте инфильтрации. Держите шприц вертикально к поверхности листа другой рукой и проникните культуру Agrobacterium в абаксиальную сторону пластинки.
    5. Соскоблите культуру Agrobacterium с пластин LB и поцарапайте зубочисткой поверхность стебля первых одного или двух междоузлий инфильтрированных растений картофеля. Аккуратно поцарапать эпидермис стебля. Избегайте прокалывания через стебель, который может нанести серьезный ущерб растениям.
  3. Выращивайте инфильтрированные растения при 22 °C с 16-часовым светом/8 ч темным фотопериодом и интенсивностью света 120 мкмоль/м2∙s1 в теплице.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фенотипы, вызванные глушением миРНК, обычно появляются через 2–4 недели после посева (рисунок 2, рисунок 3). Обычно требуется 10-20 дней, чтобы фенотип VbMS появился после инфильтрации. Фенотип VbMS зависит от свойств специфических миРНК и генов-мишеней, условий роста и сортов картофеля.

4. Выполните анализ выражений.

  1. Когда фенотипы появляются через 2-4 недели после посева, соберите ткани, такие как побеги, листья, цветы или корни с фенотипами из растений VbMS и ткани из контрольных растений ножницами. Изолируйте общие РНК из собранных тканей.
  2. Проверьте качество РНК с помощью электрофореза62,63 и количественно оцените концентрацию РНК, измерив абсорбцию OD260 с помощью спектрофотометра.
  3. Используйте ПЦР обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени для анализа экспрессии миРНК.
    1. Для конкретных микроРНК разработайте праймер обратной транскрипции со стволовой петлей. Праймеры RT stem-loop содержат универсальную 5' основу и 3' 6-nt расширение специфической миРНК. Спроектируйте 5-футовую универсальную магистраль (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3'), которая образует структуру стволовой петли. (Верхний регистр соответствует обратно-повторяющейся последовательности, а нижний регистр — области цикла).
    2. Часть 5' магистральной последовательности, которая образует петлю, служит обратным праймером для последующей амплификации ПЦР (полужирно-курсивная последовательность в основной последовательности). Добавьте 6-нтовую последовательность расширений, которая обратно комплементарна к 3' концу интересующей миРНК, к праймеру стволовой петли, чтобы обеспечить специфичность для обратной транскрипции (дополнительный рисунок 1А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Спроектируйте праймер обратной транскрипции стволовой петли, как описано Chen et al.69 и Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Например, праймер обратной транскрипции стволовой петли для Stu-miR160 разработан как 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'. Праймер обратной транскрипции для семейства картофеля miR165/166 разработан как 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGGGGGG(A/G)A-3'. (Жирные прописные последовательности обеспечивают специфичность обратной транскрипции для конкретных микроРНК).
    3. Настройте реакцию обратной транскрипции путем смешивания 50–200 нг общей РНК, 1 мкл праймера обратной транскрипции стволовой петли (100 мкМ), 2 мкл 10x буфера, 0,2 мкл ингибитора РНКАЗЫ (40 ЕД/мкл), 0,25 мКЛ дНТП (по 10 мМ) и 1 мкл обратной транскриптазы (200 Ед/мкл) на льду. Добавьте не содержащий нуклеазы ddH2O к общему объему 20 мкл.
    4. Выполните обратную транскрипцию с помощью процедуры импульсной обратной транскрипции. Инкубируют реакционную смесь обратной транскрипции при 16 °C в течение 30 мин, выполняют температурный цикл 30 °C в течение 30 с, 42 °C в течение 30 с и 50 °C в течение 1 с в общей сложности 60 циклов и инактивируют обратную транскриптазу путем инкубации при 85 °C в течение 5 мин.
    5. Для ПЦР-анализа экспрессии миРНК в режиме реального времени спроектируйте прямой праймер на основе последовательности миРНК, но не включайте последовательности, которые перекрываются с вышеуказанным праймером обратной транскрипции стволовой петли. Добавьте расширение 3–7 нт к 5' передней грунтовки для оптимизации длины, температуры плавления и содержания ГК (дополнительный рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Универсальная обратная грунтовка 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Например, праймер обратной транскрипции стволовой петли для Stu-miR160 разработан как 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. Праймер обратной транскрипции стволовой петли для семейства miR165/166 - 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Жирные последовательности служат 5' расширениями для оптимизации праймера. Праймеры обратной транскрипции со стволовой петлей и праймеры ПЦР в реальном времени для миРНК могут быть разработаны с использованием miRNA Primer Design Tool73.
  4. Синтезируют кДНК целевых мРНК методом стандартной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Инкубируют реакционную смесь обратной транскрипции при 37 °C в течение 60 мин и инактивируют обратную транскриптазу нагреванием до 85 °C в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Прогнозирование целевых мРНК с помощью программы psRNATarget74 , если целевые мРНК неизвестны. (2) Универсальный праймер обратной транскрипции для мРНК представляет собой якорный праймер 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
  5. Настройте реакцию ПЦР в режиме реального времени как для миРНК, представляющей интерес, так и для целевых мРНК. Смешайте 0,5 мкл шаблонной кДНК, 5 мкл 2-кратного буфера ПЦР реального времени с зеленым SYBR, 0,05 мкл каждого прямого и обратного праймера (40 мкМ) и 4,4 мкл ddH2O в общем объеме 5 мкл на льду.
  6. Инкубировать при 95 °C в течение 3 мин, 40 циклов при 95 °C в течение 3 с и 60 °C в течение 30 с. Выполните последующий анализ кривой плавления следующим образом: инкубируйте при 95 °C в течение 15 с, охлаждайте до 60 °C при рампе 20 °C/s, держите при 60 °C в течение 60 с, нагревайте до 95 °C при рампе 0,2 °C/s и держите при 95 °C в течение 15 с. Анализ Ct-значений с помощью методов ΔΔCt76,77 и построение средних значений со стандартными погрешностями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Праймеры ПЦР в реальном времени для целевых мРНК могут быть спроектированы так, как описано75. (2) Ген полиубиквитина 10 картофеля может служить внутренним контролем для нормализации в картофеле. Передний праймер для гена полиубиквитина картофеля 10 представляет собой 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTTTG-3', а обратный праймер 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Для анализа ПЦР в режиме реального времени загрязнение и образование праймер-димера могут привести к ложноположительным результатам. Для мониторинга неспецифической амплификации и повышения ответственности ПЦР-анализа в режиме реального времени рекомендуется включать контроль без шаблона и обратную транскриптазу для ПЦР-анализов в режиме реального времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На фиг.2 показаны растения картофеля PVX-STTM165/166 (Катахдин) с эктопическим ростом тканей листьев с абаксиальной стороны листовой пластинки вдоль жилок. Также наблюдались более серьезные фенотипы, такие как образование листьев в форме трубы. Напротив, в контрольных установках PVX не наблюдалось фенотипических аномалий. Эти результаты показывают, что система VbMS была эффективна в подавлении эндогенной функции миРНК у тетраплоидных растений картофеля, а система PVX-VbMS была надежным генетическим инструментом для определения функции конкретных миРНК или семейств миРНК.

На рисунке 3 показаны растения картофеля PVX-STTM165/166 (Russet Burbank) с ростом ткани листьев эктопии с абаксиальной стороны листовой пластинки вдоль жилок. Эти результаты показывают, что система PVX-VbMS может быть применена к другим видам картофеля, включая один из основных сортов картофеля.

Figure 1
Рисунок 1: Принципиальная схема векторов VbMS на основе PVX и структуры PVX-STTM165/166. LB = левая граница Т-ДНК; RB = правая граница Т-ДНК; 35S = промотор вируса мозаики цветной капусты 35S; NOST = терминатор нопалинсинтазы; RdRP = РНК-зависимая РНК-полимераза; TGB1 = тройной генный блок белка 1; TGB2 = тройной генный блок белка 2; TGB3 = тройной генный блок белка 3; sgP = PVX субгеномный промотор РНК; CP = белок шерсти; Кассета КСЖ = кассета клонирования, независимая от лигирования; 48 nt = 48 нуклеотидов несовершенный ствол-петлевой линкер. STTM165/166 состоит из тандемных последовательностей TM miR165/166, разделенных 48-новой несовершенной последовательностью линкера стволовой петли. Зеленая стрелка в векторе PVX-LIC указывает на стартовый участок субгеномной РНК PVX, содержащей последовательность STTM. Дефисы тройного минуса в последовательностях миРНК указывают на участки расщепления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: VbMS miR165/166 в тетраплоидном сорте картофеля Катахдин. Фенотипы растений картофеля (катахдин), экспрессирующие контроль вектора PVX или PVX-STTM165/166. Пурпурные стрелки обозначают эктопически генерируемые листовые структуры в жилках листьев. Оранжевый наконечник стрелы обозначает трубчатые структуры листьев. Бруски = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: VbMS miR165/166 в тетраплоидном сорте картофеля Russet Burbank. Фенотипы растений картофеля (Руссет Бербанк), экспрессирующие вектор PVX в качестве контрольного или PVX-STTM165/166. Пурпурные стрелки обозначают эктопически генерируемые листовые структуры в жилках листьев. Бруски = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Принципиальные диаграммы стволовых отот-ПЦР-анализа микроРНК и проектирование праймеров ПЦР в реальном времени. (A) Стволовый анализ ОТ-ПЦР миРНК. Во время обратной транскрипции связывание праймера стволовой петли с 3' миРНК инициировало обратную транскрипцию и синтезировали кДНК. Продукты ПЦР амплифицировали специфическим прямым праймером интересующей миРНК и универсальным обратным праймером. (B) Проектирование праймеров для ПЦР в режиме реального времени. Показаны передние и обратные праймеры для Stu-miR160 и Stu-miR165/166. Прямой праймер был разработан на основе последовательности миРНК, но не включал последовательности, которые перекрывались с разработанным праймером обратной транскрипции стволовой петли. К 5' передней грунтовки было добавлено расширение на 3-7 нт для регулировки длины, температуры плавления и содержания GC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Представлена система глушения миРНК на основе PVX для характеристики функции эндогенных миРНК в картофеле путем интеграции конструкции STTM в вектор PVX. Система VbMS оказалась эффективной в подавлении miRNA165/166 в картофеле, высококонсервативном семействе miRNA среди видов растений.

Подход ТМ был разработан для вмешательства в экспрессию миРНК на основе искусственной имитации мишени миРНК, которая предназначена для создания петли несоответствия в ожидаемом месте расщепления в последовательности комплементации миРНК, что приводит к секвестрации целевой миРНК и остановке ее активности22,35,78,79 . Спаривание между молекулами ТМ и целевыми миРНК блокирует функцию миРНК, снижая уровни конкретной миРНК или семейства миРНК, что приводит к повышению регуляции целевых мРНК. Было разработано несколько технологий ТМ для глушения миРНК, в том числе эндогенная мимикрия мишеней миРНК (eTM)79,80, имитация миРНК на основе eTM (МММ)35,78, короткие тандемные целевые мимики (STTM)22,53, подход приманки миРНК с ТМ, интегрированными в 3' UTR кодирующих белок транскриптов81, и губки миРНК, содержащие сайты связывания миРНК с двумя центральными несоответствиями целевым миРНК (cmSP). 82. STTM состоит из двух сайтов связывания миРНК с выпуклостью несоответствия 3-nt, связанных 48-нтовой спейсером, которая была эмпирически оптимизирована. STTM запускает эффективное ингибирование целевых микроРНК22,53. Технология STTM недавно была успешно применена для крупномасштабного функционального анализа миРНК из модельного растения Arabidopsis и основных культур, таких как рис и кукуруза. Это привело к открытию беспрецедентной роли нескольких эндогенных микроРНК, участвующих в контроле урожайности и гормонов, что имеет большие перспективы в улучшении селекции сельскохозяйственных культур47. Основываясь на этих преимуществах конструкции STTM, мы выбрали STTM и интегрировали его в вектор PVX для функциональной характеристики микроРНК в картофеле. Стоит отметить, что различные конструкции молекул ТМ, такие как cmSP, MIM и STTM, имеют переменную эффективность в блокировании функции различных miRNAs82. Поэтому использование различных стратегий проектирования ТМ может помочь достичь более эффективного подавления миРНК. Длина и контекст последовательности непревзойденной выпуклости, а также нуклеотидные изменения, прилегающие к сайтам связывания миРНК, также могут быть оптимизированы для конкретного исхода глушения миРНК22,36,38,78,83. Кроме того, проектирование молекул ТМ под руководством вычислительных прогнозов вместе с экспериментальным анализом, вероятно, приведет к более надежному ингибированию miRNAs84.

Было показано, что система VIGS на основе PVX эффективна в запуске глушения РНК как у диплоидных, так и у культивируемых тетраплоидных видов Solanum. Системное глушение на основе PVX индуцируется и поддерживается во всех внекорневых тканях на растениях картофеля in vitro в течение нескольких циклов и на микротрубках, генерируемых in vitro85. Недавно мы сообщили, что система VIGS на основе PVX может заглушить гены, представляющие интерес для нескольких тетраплоидных сортов картофеля, таких как Ancilla, Arran Pilot, Marius Bard и Serrana86. Еще предстоит определить, может ли эффект VbMS на основе PVX передаваться и поддерживаться в течение нескольких поколений посредством вегетативного размножения в картофеле. Трансгенные подходы к стабильному введению молекул ТМ в растения картофеля по-прежнему рекомендуются, когда в последующих поколениях необходимо поддерживать эффекты глушения представляющих интерес миРНК.

Были выявлены многочисленные микроРНК, участвующие в росте и развитии картофеля. РНК-секв, секвенирование генома и биоинформационное прогнозирование значительно облегчили идентификацию микроРНК и их мишеней17,19,20,21. До сих пор были секвенированы три генома картофеля, в том числе двойной моноплоидный клон S. tuberosum Group Phureja DM1-3, дикий диплоидный вид S. commersonii и диплоидный инбредный клон M6 S. chacoense87,88,89. На сегодняшний день функционально охарактеризовано лишь ограниченное число картофельных микроРНК, в большинстве случаев с использованием технологии ТМ. Например, гомолог FLOWERING LOCUS T (FT) SP6A действует как мобильный сигнал для контроля клубней в картофеле и нацелен на миРНК, подавляя экспрессию SP6A (SES), которая опосредует тепловое расщепление транскрипта SP6A90,91. STTM-опосредованная сверхэкспрессия СЭС блокирует активность миРНК СЭС и облегчает туберизацию даже в условиях непрерывного нагрева91. Нокдаун miR160, миРНК, участвующей в иммунном ответе, с помощью подхода eTM показал, что miR160 необходим как в местной, так и в системной приобретенной резистентности против Phytophthora infestans в potato92.

Используя биоинформационный подход, были идентифицированы восемь уникальных семейств миРНК, которые нацелены на нуклеотидные сайты, богатые лейцином повторные (NLR) иммунные рецепторы в картофеле и помидорах93. Одно из семейств миРНК, miR482/2118, нацелено на несколько НЛР, которые придают устойчивость к различным патогенам и подавление миРНК семейства miR482/2118, опосредованное трансгенной экспрессией конструкций STTM, приводит к усилению резистентности томатов против P. infestans и Pseudomonas syringae13. Все больше данных свидетельствуют о том, что небольшие РНК, продуцируемые в патогенах и хозяевах, могут перемещаться между двумя организмами и подавлять экспрессию генов друг друга, опосредованную межкорабельной РНК-интерференцией94,95,96,97. Например, целевые имитации сРНК, полученных из патогена оомицета, могут поглощать эти вторгающиеся сРНК и уменьшать патогенную инфекцию61. Было бы интересно изучить, может ли нынешняя система VbMS быть использована для нацеливания на сРНК, полученные из патогенов, для повышения устойчивости растений.

Таким образом, система глушения микроРНК на основе вирусов является быстрой и экономически эффективной и может быть выполнена в формате с высокой пропускной способностью. Система VbMS на основе PVX обеспечивает эффективный и надежный генетический инструмент для определения функции конкретных миРНК или семейств миРНК и генов-мишеней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Никакой.

Acknowledgments

Мы благодарим доктора Юле Лю из Университета Цинхуа за предоставление вектора PVX-LIC. Эта работа была поддержана стартовым фондом от Texas A&M AgriLife Research и Hatch Project TEX0-1-9675 от Национального института продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США до JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145 (2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -J., Lin, S. -I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614 (2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489 (2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233 (2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714 (2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573 (2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178 (2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277 (2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627 (2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621 (2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500 (2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G. Functional Genomics: Methods and Protocols. Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. , Springer. New York. 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl 1 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl 1 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl 1 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl 1 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , Supplementary Files 20744 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190 (2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , Cold spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553 (1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P. RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. Kodama, H., Komamine, A. , Humana Press. 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12 (2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E. Plant Epigenetics: Methods and Protocols. Kovalchuk, I. , Springer US. 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168 (2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031 (2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28 (2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330 (2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088 (2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189 (2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs - Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

Tags

Науки об окружающей среде Выпуск 159 Глушение микроРНК на основе вирусов (VbMS) вирус картофеля X (PVX) микроРНК (miRNA) мимика мишени (TM) короткие тандемные мишени (STTM) Solanum tuberosum
Глушение микроРНК на основе вируса картофеля X (VbMS) в картофеле.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter