Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Potatisvirus X-baserad mikroRNA-ljuddämpning (vbMS) i potatis.

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

Vi presenterar ett detaljerat protokoll för potatisvirus X (PVX)-baserade microRNA ljuddämpning (VbMS) system för att funktionellt karakterisera endogena microRNAs (miRNAs) i potatis. Målimiter (TM) molekyler av miRNA av intresse integreras i PVX vektorn och uttrycks tillfälligt i potatis för att tysta målet miRNA eller miRNA familjen.

Abstract

Virusbaserad mikroRNA-ljuddämpning (VbMS) är ett snabbt och effektivt verktyg för funktionell karakterisering av mikroRNA (miRNAs) i växter. VbMS-systemet har utvecklats och tillämpats för olika växtarter inklusive Nicotiana benthamiana, tomat, arabidopsis, bomull och monokotiska växter som vete och majs. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll med PVX-baserade VbMS vektorer för att tysta endogena miRNAs i potatis. För att slå ner uttrycket av ett specifikt miRNA, mål härma (TM) molekyler av miRNA av intresse är utformade, integrerade i växtvirus vektorer, och uttrycks i potatis av Agrobacterium infiltration att binda direkt till den endogena miRNA av intresse och blockera dess funktion.

Introduction

VäxtmikroRNA (miRNAs) karakteriseras som 20–24 nukleotidlånga, nukleära kodade reglerande RNAs1 och spelar grundläggande roller i nästan alla aspekter av växtbiologiska processer, inklusive tillväxt och utveckling2,3, fotosyntes och metabolism4,5,6,7, hormonsyntes och signalering8,9, biotiska och abiotiska svar10, 11,12,13 och närings- och energireglering14,15. De regulatoriska rollerna för växtmiRNA är välprogrammerade och uppfyllda vanligtvis på post-transkriptionell nivå genom att antingen klyva eller translationellt undertrycka målet mRNAs.

Enorma framsteg har gjorts mot identifiering, transkriptionsprofilering och målprognos av miRNAs i potatis16,17,18,19,20,21. Den funktionella karakteriseringen av miRNAs i växter, inklusive potatis, har dock släpat efter andra organismer på grund av bristen på effektiva och höggenomströmning genetiska metoder. Det är utmanande att utföra funktionell analys av enskilda miRNA genom standard förlust-av funktion analys, eftersom de flesta miRNAs tillhör familjer med betydande genetisk redundans22. Dessutom kan ett enda miRNA styra flera målgener23 och flera olika miRNAs kan modulera samma molekylära väg tillsammans24,25. Dessa egenskaper gör det svårt att karakterisera funktionen hos en specifik miRNA eller en miRNA-familj.

Mycket av den funktionella analysen av miRNAs har förlitat sig starkt på funktionsvinstmetoder som har uppenbara begränsningar. Den artificiella miRNA-metoden (amiRNA) utnyttjar de endogena primära transkriptionerna (pri-miRNAs) för att producera miRNAs på en hög nivå, vilket leder till hämning av målgenuttryck26,27,28,29. Aktiveringsmärkning och miRNA-överuttryck med hjälp av en stark konstituerande 35S-promotor leder dock ofta till förhöjt uttryck av miRNAs som inte är representativa för in vivo-förhållanden och därför kanske inte återspeglar den endogena funktionen hos miRNAs30. Ett alternativt tillvägagångssätt har utvecklats som omfattar uttryck av miRNA-resistenta former av målgener som innehåller ofördelaktiga mutationer i bindnings- och/eller klyvningsplatserna31,32,33. Men detta tillvägagångssätt kan också potentiellt orsaka feltolkning av fenotyp som härrör från miRNA-resistent måltransgen på grund av att transgena artefakter. Därför bör slutsatser från dessa förvärvsstudier dras med försiktighet34. En annan viktig begränsning av de ovan beskrivna metoderna är att de kräver omvandling, vilket är arbetsintensivt och tidskrävande. Dessutom är de transgeneberoende metoderna knappast tillämpliga för transformerade motsträviga växtarter. Därför är det viktigt att utveckla en snabb och effektiv funktionsförlustmetod för att lösa upp funktionen hos miRNAs.

För att kringgå förutsättningen för omvandlingsförfarandet har virusbaserad mikroRNA-ljuddämpning (VbMS) fastställts genom att kombinera målimitationsstrategierna (TM) med virusbaserade vektorer. I VbMS-systemet uttrycks artificiellt utformade TM-molekyler övergående från ett virusstomme, vilket erbjuder ett kraftfullt, högt genomströmnings- och tidsbesparande verktyg för att dissekera funktionen hos växt endogen miRNAs35,36. VbMS utvecklades ursprungligen i N. benthamiana och tomat med tobaksskramlet (TRV)35,36,37 och har utvidgats till arabidopsis, bomull, vete och majs med hjälp av olika andra virusuttryckssystem, inklusive potatisvirus X (PVX)38, bomullsbladssmulvirus (ClCrV)39, gurkamosaikvirus (CMV)40,41,42, kinesiskt vetemosaikvirus (CWMV)39, gurkamosaikvirus (CMV)40,41,42, kinesiskt vetemosaikvirus (CWMV)39, gurkamosaikvirus (CMV)40,41,42, kinesiskt vetemosaikvirus (CWMV)40,41,42, kinesiskt vetemosaikvirus (CWMV)39, gurkamosaikvirus (CMV)40,41,42, kinesiskt vetemosaikvirus (CWMV)39, gurkamosaikvirus (CMV)40,41,42, kinesiskt vetemosaikvirus (CWMV)39, gurkamosaikvirus (CMV)40,41,42, kinesiskt vetemosaikvirus (CWMV)3 , och korn rand mosaikvirus (BSMV)44,45.

Potatis (Solanum tuberosum) är den fjärde viktigaste livsmedelsskörden och den mest odlade icke-industriella grödan i världen främst på grund av dess höga näringsvärde, höga energiproduktion och relativt låga insatsbehov46. Flera egenskaper hos potatis gör det till en attraktiv dicotyledonous modellväxt. Det är en vegetativt förökad polyploid gröda med hög outcrossing hastighet, heterozygosity, och genetisk mångfald. Hittills finns det dock ingen rapport som kännetecknar funktionen av miRNAs i potatis med VbMS. Här presenterar vi en ligatur-oberoende kloning (LIC)-anpassad potatis PVX-baserade VbMS-metod för att utvärdera funktionen av miRNAs i potatisväxter38. Vi valde miR165/166 familjen för att illustrera VbMS-analysen eftersom miR165/166 familjen och deras mål mRNAs och klass III homeodomain/Leu zipper (HD-ZIP III) transkriptionsfaktorer har karakteriserats i stor utsträckning22,47,48. HD-ZIP III-generna är viktiga regulatorer för meristemutveckling och organpolaritet, och undertryckande av miR165/166-funktionen leder till ökat uttryck för HD-ZIP III-generna, vilket resulterar i pleotropiska utvecklingsdefekter som minskad apikal dominans och avvikande mönster av bladpolaritet22,35,38,41 . De lätt brännbara utvecklingsfenotyperna korrelerade med ljuddämpning av miRNA165/166 möjliggör noggrann utvärdering av effektiviteten hos den PVX-baserade VbMS-analysen.

I denna studie visar vi att det PVX-baserade VbMS-systemet effektivt kan blockera funktionen hos miRNAs i potatis. Eftersom det PVX-baserade virusinducerade gendämpningssystemet (VIGS) har etablerats i ett antal potatissorter49,50,51,52, kan detta PVX-baserade VbMS-tillvägagångssätt sannolikt tillämpas på ett brett spektrum av diploida och tetraploidpotatisarter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Odla potatisplantor.

  1. Föröka in vitro-potatisplantor i odlingsrör (25 x 150 mm) med Murashige- och Skoogmedier plus Gamborgs vitamin (MS basalsaltblandning, Gamborgs vitamin, 30 g/L sackaros, 3,5 g/L agar, pH = 5,7). Placera rören i tillväxtrummet under 20–22 °C, 16 h ljus/8 h mörk fotoperiod och ljusintensitet 120 μmol/m2▼s1.
    OBS: Nya skott och rötter utvecklas normalt inom 1–2 veckor från växter. Föröka växter med färska MS/Gamborgs vitaminmedier varje månad.
  2. Fyra veckor senare transplanterar in vitro-växter i jord och odlar dem i ett växthus under 20–22 °C, 16 h ljus/8 h mörk fotoperiod och ljusintensitet 120 μmol/m2▼s1.
    OBS: Växterna med nyutvecklade rötter och blad är lämpliga för transplantation. Behåll fukt för de nytransplanterade växterna under de första 3-4 dagarna.

2. Skapa VbMS-vektorerna.

  1. Designa och klona de korta tandem TM-molekylerna (STTM, figur 1)22,53 för miRNA av intresse.
    OBS: Förvärva miRNA-sekvenser baserat på experimentella data eller från miRbase-databasen54,55,56,57,58,59. MiR166-sekvensen som används i denna studie har beskrivits tidigare60.
    1. Designa TM-modulen genom att infoga en felmatchningssekvens, normalt 5'-CTA-3', i den omvända komplementsekvensen av miRNA på den plats som motsvarar miRNA: s 10:e–11:e nukleotider.
      OBS: Stu-miR160-sekvensen är till exempel 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, där 10:e–11:e nukleotiderna är i fetstil. Den omvända komplementsekvensen (i deoxynucleotides) är 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' och felmatchning utbuktning insättningsstället visas i fetstil. TM-molekylsekvensen (deoxynukleotid) ska vara 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'.
    2. Designprimrar för kloning av STTM-fragmentet (figur 1). Använd DNA-oligonukleotider med 48-nt distanssekvensen som mall för PCR-kloning. Den främre primern består av en LIC1-linker (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), den främre sekvensen av ovanstående avsedd för TM-molekyl och den partiella 5' sekvensen av 48-nt distans (5'-GTTGTTTGTGTTATGGT-3'). Den omvända primern består av en LIC2-länkare (5'-gAggAgAgAgCCgT-3'), tm-molekylens omvända komplementsekvens och ett partiellt omvänt komplement till 3' sekvensen av 48-nt distans (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3').
      OBS: 48-nt distanssekvensen är 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAGAAT-3'. För STTM-miR160 bör till exempel den främre primern vara 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTTGTTATGGT-3". Den omvända primern bör vara 5'-gAggAgAgAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' (figur 1).
    3. Förstärk STTM-fragmentet i en volym av 50 μL med PCR med hjälp av den syntetiserade universella 48-nt distansen som mall och en HÖG trohet DNA-polymeras.
      1. Ställ in PCR-reaktionen genom att blanda 0,5 μL av varje primer (40 μM), 0,5 μL 48-nt distans oligo (40 μM), 5 μL 10x PCR-buffert, 1 μL dNTP-blandning (10 mM vardera), 0,1 μL med hög trohet DNA-polymeras (10 U/μL) och 0,1 μL med hög återgivning DNA-polymeras (10 U/μL) och 0,1 μL med hög återgivning AV DNA-polymeras (10 U/μL) och 0,1 μL med hög återgivning AV DNA-polymeras (10 U/μL) och 0,1 μL med hög återgivning AV DNA-polymeras (10 U/μL) och 0,1 μL med hög återgivning AV DNA-polymeras (10 U/μL) och 0,1 μL med hög återgivning av DNA-polymeras (10 U/μL) och 0,1 μL med hög återgivning AV DNA-polymeras (10 U/μL) och 0,1 μL dNTP-blandning (10 mM vardera), 0,1 μL DNA-polymeras (10 U/μL) och 1 μL dNTP-blandning (10 mM vardera), 0,1 μL dna-polymeras med hög återgivning (10 U/μL) och 0, 1 μL dNTP-blandning (10 mM vardera), 0,1 μL DNA-polymeras med hög återgivning 94 °C i 3 minuter, 32 cykler på 94 °C för 45 s, 60 °C för 45 s och 72 °C för 60 s.
    4. Rena STTM-fragmentet genom etanolutfällning. Tillsätt 2,5 volymer etanol och 1/10 volym 3 M natriumacetat (pH = 4,0) till PCR-produkterna. Blanda kraftigt och centrifugera vid 14 000 x g i 10 min. Ta bort supernatanten och skölj pelleten med 1 ml 70% etanol. Torka pelleten och lös upp den i 20 μL ddH2O.
      OBS: Använd DNA-elektrofores för att kontrollera förstärkningen av STTM PCR-produkterna.
    5. Ställ in T4 DNA-polymerasreaktionen på is genom att blanda 2,5 μL renad STTM PCR-produkt. 0,5 μL 10x T4 DNA-polymerasbuffert, 0,05 μL 1 M dithiothreitol (DTT), 0,25 μL 100 mM dATP, 0,1 μL T4 DNA-polymeras (3 U/μL) och 1,6 μL ddH2O till en total volym av 5 μL. och behandla produkterna vid 75 °C i 20 minuter för att inaktivera T4 DNA-polymeraset.
  2. Förbered den PVX-baserade VbMS-konstruktionen.
    1. Smält 5 μg PVX-LIC plasmid38 med 2,5 μL SmaI (20 U/μL) i en volym av 100 μL.
    2. Tillsätt lika stor mängd fenol:kloroform:isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8,0) till de smälta PVX-LIC-produkterna och blanda kraftigt. Centrifugera vid 14 000 x g i 10 minuter och överför supernatanten till ett nytt centrifugrör. Tillsätt en lika stor mängd kloroform:isopropanol (24:1) och virvel kraftigt. Centrifug vid 14 000 x g i 10 min.
      OBS: PVX-LIC-vektorn hyser LIC-kassetten för kloning. LIC-kassetten av PVX-LIC-vektor innehåller en ccdB-gen och en kloramfenicolresistent gen och måste bibehållas/förökas i E. coli-stammen DB3.1 med LB-medium som innehåller kanamycin (50 μg/L) och kloramfenicol (15 μg/L).
    3. Överför supernatanten till ett nytt centrifugrör. Tillsätt 2,5 volymer etanol och 1/10 volym 3 M natriumacetat (pH = 4,0) och blanda kraftigt. Centrifugera vid 14 000 x g i 10 minuter och ta bort supernatanten.
    4. Skölj pelleten med 1 ml 70% etanol och virvel kraftigt. Centrifugera vid 14 000 x g i 10 minuter och ta bort supernatanten. Torka pelleten och lös upp den smälta PVX-LIC-plasmiden med 100 μL ddH2O.
    5. Ställ in T4 DNA-polymerasreaktionen på is genom att blanda 2,5 μL smält PVX-LIC-vektor-DNA, 0,5 μL 10x T4 DNA-polymerasbuffert, 0,05 μL 1 M DTT, 0,25 μL 100 mM dTTP och 0,1 μL T4 DNA-polymeras (3 U/μL) i en total volym av 5 μL. Inkubera blandningen vid 37 °C i 15 minuter och behandla produkterna vid 15 minuter och behandla produkterna vid 15 minuter. inaktivera T4 DNA-polymeraset.
  3. Klona STTM-sekvensen till PVX-LIC-vektorn med hjälp av en LIC-reaktion. Blanda T4 DNA-polymerasbehandlade STTM PCR-produkter (5 μL) och T4 DNA-polymerasbehandlade PVX-LIC-plasmider (5 μL). Inkubera vid 70 °C i 5 minuter, svalna till 22 °C vid en ramp på 0,1 °C/s och håll vid 22 °C i 30 minuter med en PCR-maskin.
    OBS: Förläng inkubationstiden till över natten vid 4 °C för att uppnå högre effektivitet vid LIC-kloning.
  4. Omvandla 5 μL av LIC-reaktionsprodukterna till E. coli DH5α och odla på en LB-platta som innehåller 50 μg/ml kanamycin62,63. Välj och verifiera positiva kolonier med PCR med kloningsprimrar och universell primer för PVX-LIC-vektorn följt av sekvensering.
    1. Utför koloni PCR med den främre primern för PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') i kombination med den omvända primern för STTM kloning för att identifiera positiva kloner. Storleken på PCR-bandet ska vara ~ 300 bp.
      OBS: Kontrollera sekvenserna av STTM-fragment genom terminatorcykelsekvensering64,65.
  5. Isolera PVX-STTM-plasmiderna från de validerade klonerna och omvandla dem till Agrobacterium-stammarna GV3101, GV2260 eller EHA10562,63. Verifiera Agrobacteriumkolonier med PCR.
    OBS: Bekräfta Agrobacteriumkolonier med PCR med hjälp av den främre primern för PVX-LIC och den omvända primern för STTM-kloning.

3. Utför PVX-baserad VbMS-analys i potatisplantor.

  1. Transplantera 4 veckor gamla in vitro-potatisplantor i jorden. De transplanterade växterna kommer att genomgå VbMS-analys 3–4 dagar senare.
  2. Inokulera potatisplantor med Agrobacterium som innehåller PVX-STTM-plasmiderna.
    OBS: För VbMS-analysen i potatis utförs Agrobacterium-medierad infiltration och tandpetare-skrapande inokulering samtidigt.
    1. Plocka och inokulera positiva transformanter som innehåller PVX-STTM-vektorer till 50 ml flytande LB innehållande 50 μg/ml kanamycin och 50 μg/mL rifampicin. Odla i en inkubator på 28 °C vid 220 varv/min i 16 timmar tills OD600 = 1,0.
    2. Samtidigt sträcker de positiva Agrobacteriumkolonierna på minst två nya LB-plattor som innehåller 50 μg/ml kanamycin och 50 μg/mL rifampicin och växer vid 28 °C i 1 dag. Inkludera PVX-LIC38,66 vektorn som en kontroll och PVX-GFP67,68 för att övervaka virusspridning.
    3. Samla upp Agrobacteriums flytande odling genom centrifugering vid 3 400 x g i 10 minuter vid rumstemperatur. Resuspend Agrobacterium celler med en lika stor mängd infiltrationsbuffert (10 mM MgCl2, 10 mM MES och 200 μM acetosyringone, pH = 5,6) och justera till OD600 = 1,0. Inkubera vid rumstemperatur i 6 timmar.
    4. Infiltrera Agrobacterium-kulturen i den abaxiella sidan av helt expanderade blad med en 1 mL nållös spruta.
      1. Vänd och håll ett blad med en hand och använd sedan ett finger för att stödja blad lamina från adaxialsidan vid infiltrationsplatsen. Håll sprutan vertikal mot bladytan med den andra handen och infiltrera Agrobacterium-kulturen i laminas abaxiala sida.
    5. Skrapa Agrobacterium-kulturen från LB-plattorna och skrapa stamytan på de första eller två internoderna av de infiltrerade potatisplantorna med en tandpetare. Skrapa försiktigt stammens epidermis. Undvik att genomborra genom stammen, vilket kan orsaka allvarliga skador på växterna.
  3. Odla de infiltrerade växterna vid 22 °C med en 16 h ljus/8 h mörk fotoperiod och ljusintensitet på 120 μmol/m2∙ s1 i ett växthus.
    OBS: Fenotyper orsakade av miRNA-ljuddämpning förekommer vanligtvis i 2-4 veckor postinokulering (figur 2, figur 3). Det tar vanligtvis 10-20 dagar för VbMS-fenotypen att visas efter infiltration. VbMS fenotyp beror på egenskaperna hos de specifika miRNA och målgenerna, tillväxtförhållandena och potatissorterna.

4. Utför uttrycksanalys.

  1. När fenotyper uppträder vid 2-4 veckors postinymulering, samla vävnader som skott, löv, blommor eller rötter med fenotyper från VbMS växter och vävnader från kontrollanläggningarna med sax. Isolera totala RNAs från de insamlade vävnaderna.
  2. Kontrollera RNA-kvaliteten med elektrofores62,63 och kvantifiera RNA-koncentrationen genom att mäta OD260-absorbansen med en spektrofotometer.
  3. Använd stamslinga i realtid omvänd transkription PCR (RT-PCR) för att analysera miRNA-uttrycket.
    1. För specifika miRNAs, designa en stam-loop omvänd transkription primer. Stem-loop RT primers innehåller en universell 5 ' ryggrad och en 3 ' 6-nt förlängning av en specifik miRNA. Designa en 5' universell ryggrad (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') som bildar en stamslingastruktur. (Det övre fallet motsvarar en omvänd upprepad sekvens och det gemener till loopregionen).
    2. En del av 5' ryggradssekvensen som bildar en slinga fungerar som den omvända primern för efterföljande PCR-förstärkning (fet-kursiv sekvens i stamnätssekvensen). Lägg till en 6-nt förlängningssekvens som är omvänd-komplementär till 3' slutet av miRNA av intresse till stem-loop primer för att ge specificitet för omvänd transkription (kompletterande figur 1A).
      OBS: Designa stamslingan omvänd transkriptionsprimer enligt beskrivningen av Chen et al.69 och Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72. Till exempel är stamslingan omvänd transkriptionsprimer för Stu-miR160 utformad som 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3'. Stamslingan omvänd transkriptionsprimer för potatis miR165/166-familjen är utformad som 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3'. (De fetstilta versalersekvenserna ger specificiteten hos omvänd transkription för specifika miRNAs).
    3. Ställ in den omvända transkriptionsreaktionen genom att blanda 50–200 ng totalt RNA, 1 μL av stamslingan reverse transcription primer (100 μM), 2 μL 10x buffert, 0,2 μL RNase-hämmare (40 U/μL), 0,25 μL dNTPs (10 mM vardera) och 1 μL Tillsätt nukleasfri ddH2O till en total volym på 20 μL.
    4. Utför omvänd transkription med den pulsade omvända transkriptionsproceduren. Inkubera den omvända transkriptionsreaktionsblandningen vid 16 °C i 30 minuter, utför en temperaturcykel på 30 °C för 30 s, 42 °C för 30 s och 50 °C i 1 s, i totalt 60 cykler, och inaktivera den omvända transkriptasen genom inkubation vid 85 °C i 5 minuter.
    5. För PCR-analys i realtid av miRNA-uttryck, designa den främre primern baserat på miRNA-sekvensen men inkludera inte sekvenser som överlappar den ovan utformade stamslingan omvänd transkriptionsprimer. Tillsätt en 3–7-nt förlängning till 5' av den främre primern för att optimera längden, smälttemperaturen och GC-innehållet (kompletterande figur 1).
      OBS: Den universella omvända primern är 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Till exempel är stamslingan omvänd transkriptionsprimer för Stu-miR160 utformad som 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'. Stem-loop omvänd transkription primer för miR165/166 familjen är 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. De djärva sekvenserna fungerar som 5' tillägg för primeroptimering. Stem-loop omvänd transkriptionsprimrar och PCR-primers i realtid för miRNA kan utformas med miRNA Primer Design Tool73.
  4. Syntetisera cDNAs av målet mRNAs genom standard omvänd transkription PCR (RT-PCR). Inkubera den omvända transkriptionsreaktionsblandningen vid 37 °C i 60 minuter och inaktivera den omvända transkriptasen genom uppvärmning till 85 °C i 5 min.
    OBS: (1) Förutsäg mål mRNAs med psRNATarget-programmet74 om målet mRNAs inte är kända. (2) Den universella omvända transkriptionsprimer för mRNA är en förankrad primer 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'.
  5. Ställ in PCR-reaktionen i realtid för både miRNA av intresse och mål mRNAs. Blanda 0,5 μL mall-cDNA, 5 μL 2x PCR-buffert i realtid med SYBR grön, 0,05 μL av varje framåt- och bakåtprimer (40 μM) och 4,4 μL ddH2O i en total volym på 5 μL på is.
  6. Inkubera vid 95 °C i 3 min, 40 cykler på 95 °C för 3 s och 60 °C i 30 s. Gör en efterföljande analys av smältkurvan enligt följande: Inkubera vid 95 °C för 15 s, svalna till 60 °C vid en ramp på 20 °C/s, håll vid 60 °C i 60 s, värm till 95 °C vid en ramp på 0,2 °C/s och håll vid 95 °C i 15 s. Analysera Ct-värdena med hjälp av ΔΔCt-metoderna76,77 och rita medelvärden med standardfel.
    OBS: (1) PCR-primers i realtid för mål mRNAs kan utformas enligt beskrivningen75. (2) Potatispolyubquitin 10-genen kan fungera som en intern kontroll för normalisering i potatis. Den främre primern för potatispolyubiquitin 10 genen är 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' och den omvända primern 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) För PCR-analys i realtid kan kontaminering och primer-dimer-bildning generera falska positiva resultat. För att övervaka ospecificerad förstärkning och öka ansvaret för PCR-analys i realtid rekommenderas att inkludera kontroller utan mall och omvänd transkriptas för PCR-analyser i realtid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 visar potatisplantorna PVX-STTM165/166 (Katahdin) med ektopisk tillväxt av bladvävnader från blad laminas abaxiala sida längs venerna. Svårare fenotyper som trumpetformad bladbildning har också observerats. Däremot observerades inga fenotypiska avvikelser i PVX kontrollanläggningar. Dessa resultat visar att VbMS systemet var effektivt för att undertrycka endogena miRNA funktion i tetraploid potatis växter och PVX-VbMS systemet var ett robust genetiskt verktyg för att bestämma funktionen av specifika miRNAs eller miRNA familjer.

Figur 3 visar pvx-STTM165/166 potatisplantorna (Russet Burbank) med ektopisk bladvävnadstillväxt från blad laminas abaxiala sida längs venerna. Dessa resultat visar att PVX-VbMS-systemet skulle kunna tillämpas på andra potatisarter, inklusive en stor potatisodling.

Figure 1
Bild 1: Schematiskt diagram över PVX-baserade VbMS-vektorer och PVX-STTM165/166-strukturen. LB = T-DNA vänster kant; RB = T-DNA höger kant; 35S = blomkålmosaikvirus 35S promotor; NOST = nopaline syntas terminator; RdRP = RNA-beroende RNA-polymeras; TGB1 = trippelgenblockprotein 1; TGB2 = trippelgenblockprotein 2; TGB3 = trippelgenblockprotein 3; sgP = PVX subgenomisk RNA-promotor; CP = pälsprotein; LIC-kassett = ligaturoberoende kloningskassett; 48 nt = 48 nukleotid ofullkomliga stamslingalänkare. STTM165/166 består av tandem TM-sekvenser av miR165/166 åtskilda av en 48-nt ofullkomlig stamslingalänkersekvens. Den gröna pilspetsen i PVX-LIC-vektorn indikerar startplatsen för PVX subgenomiska RNA som hyser STTM-sekvensen. Trippel minus bindestreck i miRNA-sekvenser indikerar klyvningsplatserna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: VbMS av miR165/166 i tetraploidpotatissorten Katahdin. Fenotyper av potatisplantorna (Katahdin) som uttrycker PVX-vektorkontrollen eller PVX-STTM165/166. Magentapilar betecknar extopiskt genererade bladstrukturer i bladvenerna. Den orange pilspetsen betecknar trumpetliknande bladstrukturer. Staplar = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: VbMS av miR165/166 i tetraploidpotatissorten Russet Burbank. Fenotyper av potatisplantorna (Russet Burbank) som uttrycker PVX-vektor som kontroll eller PVX-STTM165/166. Magentapilar betecknar extopiskt genererade bladstrukturer i bladvenerna. Staplar = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: Schematiska diagram över stamslinga RT-PCR-analys av miRNAs och PCR primer design i realtid. A) RT-PCR-analys av miRNAs. Under omvänd transkription, bindningen av stem-loop primer till 3 ' miRNA initierade den omvända transkription och cDNA syntetiserades. PCR-produkter förstärktes med en specifik främre primer av miRNA av intresse och den universella omvända primern. (B) PCR-primerdesign i realtid. Fram- och bakåtprimarna för Stu-miR160 och Stu-miR165/166 visas. Den främre primern designades baserat på miRNA-sekvensen men inkluderade inte sekvenser som överlappade med den utformade stamslingan omvänd transkriptionsprimer. En 3-7-nt förlängning lades till 5' av den främre primern för att justera längden, smälttemperaturen och GC-innehållet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterar ett PVX-baserat miRNA-ljuddämpningssystem för att karakterisera funktionen av endogena miRNAs i potatis genom att integrera STTM-designen i PVX-vektorn. VbMS-systemet visade sig vara effektivt för att tysta miRNA165/166 i potatis, en mycket bevarad miRNA-familj över växtarter.

TM-metoden har utvecklats för att störa uttrycket av miRNAs baserat på ett artificiellt miRNA-mål som är utformat för att skapa en missmatchningsslinga vid den förväntade klyvningsplatsen inom miRNA-komplementeringssekvensen som resulterar i bindning av riktat miRNA och gripande av dess aktivitet22,35,78,79 . Parningen mellan TM-molekyler och målmiRNAs blockerar miRNA: s funktion genom att slå ner nivåerna av ett specifikt miRNA eller en miRNA-familj, vilket leder till uppreglering av mål mRNAs. Flera TM-tekniker har utvecklats för ljuddämpning av miRNAs, inklusive endogen miRNA-målimi mimicry (eTM)79,80, eTM-baserade miRNA-härmar (MIMs)35,78, korta tandemmålimiter (STTMs)22,53, en miRNA-lockbetesmetod med TMs integrerade i 3' UTR av proteinkodande transkriptioner81, och miRNA-sponger som innehåller miRNA-bindningsplatser med TMs integrerade i 3' UTR av proteinkodande transkriptioner81 och miRNA-sponger som innehåller miRNA-bindningsplatser med TMs integrerade i 3' UTR av proteinkodande transkriptioner81 och miRNA-sponger som innehåller miRNA-bindningsplatser med miRNA-bindningsplatser( 82. STTM består av två miRNA-bindningsplatser med en 3-nt missmatchning utbuktning, länkad av en 48-nt distans som var empiriskt optimerad. STTM utlöser effektiv hämning av mål miRNAs22,53. STTM-tekniken har nyligen framgångsrikt tillämpats på en storskalig funktionell analys av miRNAs från modellväxten Arabidopsis och större grödor som ris och majs. Detta ledde till upptäckten av oöverträffade roller av flera endogena miRNAs involverade i avkastning och hormonkontroll, vilket har stora löften om att förbättra växtförädling47. Baserat på dessa fördelar med STTM-design valde vi STTM och integrerade den i PVX-vektorn för funktionell karakterisering av miRNAs i potatis. Det är värt att notera att de olika designerna av TM-molekyler, såsom cmSPs, MIMs och STTMs, har varierande effektivitet för att blockera funktionen hos olika miRNAs82. Därför kan användning av olika TM-designstrategier bidra till att uppnå effektivare miRNA-dämpning. Längden och sekvenskontexten för den oöverträffade utbuktningen samt nukleotidändringarna intill miRNA-bindningsplatserna kan också behöva optimeras för ett specifikt miRNA-ljuddämpande resultat22,36,38,78,83. Dessutom kommer design av TM-molekyler under ledning av beräkningsprognoser tillsammans med experimentell analys förmodligen att leda till mer tillförlitlig hämning av miRNAs84.

Det visade sig att det PVX-baserade VIGS-systemet är effektivt för att utlösa RNA-ljuddäsning hos både diploida och odlade tetraploid Solanum arter. Den PVX-baserade systemiska ljuddämpningen induceras och underhålls i hela bladvävnaderna på förökade potatisplantor in vitro i flera cykler och på in vitro-genererade mikrorör85. Vi har nyligen rapporterat att det PVX-baserade VIGS-systemet kan tysta gener av intresse i flera tetraploida potatissorter, såsom Ancilla, Arran Pilot, Marius Bard och Serrana86. Det återstår att avgöra om den PVX-baserade VbMS-effekten kan överföras och upprätthållas i flera generationer genom vegetativ förökning i potatis. Transgena metoder för att introducera TM-molekyler stabilt i potatisplantor rekommenderas fortfarande när de tystande effekterna av miRNAs av intresse måste bibehållas i de följande generationerna.

Många miRNAs som är involverade i potatis tillväxt och utveckling har identifierats. RNA-seq, genomsekvensering och bioinformatisk förutsägelse har i hög grad underlättat identifieringen av miRNAs och deras mål17,19,20,21. Hittills har tre potatisgenom sekvenserats, inklusive en dubbel monoploid S. tuberosum Group Phureja klon DM1-3, en vild diploidart S. commersonii och en diploid inavlade klon M6 av S. chacoense7,88,89. Hittills har endast ett begränsat antal potatis miRNAs funktionellt karakteriserats, i de flesta fall med TM-teknik. Till exempel fungerar FLOWERING LOCUS T (FT) homolog SP6A som en mobil signal för att kontrollera tuberisering i potatis och är riktad mot ett miRNA, undertryckande uttryck för SP6A (SES), som förmedlar värmeinducerad klyvning av SP6A-transkriptionen90,91. STTM-medierad överuttryck av SES blockerar aktiviteten hos SES miRNA och underlättar tuberization även under kontinuerliga värmeförhållanden91. Knockdown av miR160, en miRNA som är involverad i immunsvar, genom eTM-metoden visade att miR160 krävs i både lokala och systemiska förvärvade resistens mot Phytophthora infestans i potatis92.

Med hjälp av en bioinformatisk metod identifierades åtta unika familjer av miRNAs som riktar sig till nukleotid bindande webbplats leucin-rika upprepa (NLR) immunreceptorer i potatis och tomat93. En av miRNA-familjerna, miR482/2118, riktar sig mot flera NLR som ger motstånd mot olika patogener och undertryckande av miR482/2118 familjen miRNAs medierade av transgena uttryck av STTM konstruktioner leder till ökat motstånd i tomat mot P. infestans och Pseudomonas syringae13. Ökande bevis tyder på att små RNAs produceras i patogener och värdar kan resa mellan de två organismerna och undertrycka varandras genuttryck medierade av kors-kungarike RNA interferens94,95,96,97. Till exempel kan målimiter av en oomycete patogen-härledda sRNAs rensa dessa invaderande sRNAs och minska patogen infektion61. Det skulle vara intressant att undersöka om det nuvarande VbMS-systemet kan användas för att rikta in sig på patogen-härledda sRNAs för att förbättra resistensen i växter.

Sammanfattningsvis är virusbaserat miRNA-ljuddämpningssystem snabbt och kostnadseffektivt och kan utföras i ett höggenomströmningsformat. Det PVX-baserade VbMS-systemet ger ett effektivt och robust genetiskt verktyg för att bestämma funktionen hos specifika miRNAs- eller miRNA-familjer och målgenerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Yule Liu från Tsinghua University för att ha tillhandahållit PVX-LIC-vektorn. Detta arbete stöddes av en startfond från Texas A&M AgriLife Research och Hatch Project TEX0-1-9675 från USDA National Institute of Food and Agriculture till JS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145 (2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -J., Lin, S. -I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614 (2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489 (2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233 (2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714 (2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573 (2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178 (2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277 (2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627 (2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621 (2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500 (2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G. Functional Genomics: Methods and Protocols. Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. , Springer. New York. 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl 1 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl 1 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl 1 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl 1 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , Supplementary Files 20744 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190 (2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , Cold spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553 (1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P. RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. Kodama, H., Komamine, A. , Humana Press. 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12 (2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E. Plant Epigenetics: Methods and Protocols. Kovalchuk, I. , Springer US. 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168 (2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031 (2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28 (2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330 (2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088 (2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189 (2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs - Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

Tags

Miljövetenskap utgåva 159 virusbaserad mikroRNA-ljuddämpning (VbMS) potatisvirus X (PVX) mikroRNA (miRNA) målimit (TM) korta tandemmålimiter (STTMs) Solanum tuberosum
Potatisvirus X-baserad mikroRNA-ljuddämpning (vbMS) i potatis.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter