Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Patates virüsü X bazlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste.

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61067
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

Summary

Patatesteki endojen mikroRNA'ları (miRNA'lar) işlevsel olarak karakterize etmek için patates virüsü X (PVX) bazlı mikroRNA susturma (VbMS) sistemi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. İlgi çekici miRNA hedef mimik (TM) molekülleri PVX vektörüne entegre edilir ve hedef miRNA veya miRNA ailesini susturmak için patatesle geçici olarak ifade edilir.

Abstract

Virüs bazlı mikroRNA susturma (VbMS), bitkilerdeki mikroRNA'ların (miRNA'lar) fonksiyonel karakterizasyonu için hızlı ve verimli bir araçtır. VbMS sistemi Nicotiana benthamiana, domates, Arabidopsis, pamuk ve buğday ve mısır gibi monokot bitkileri de dahil olmak üzere çeşitli bitki türleri için geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Burada, patatesteki endojen miRNA'ları susturmak için PVX tabanlı VbMS vektörlerini kullanarak ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Belirli bir miRNA'nın ifadesini yıkmak için, ilgi çekici miRNA'nın hedef mimik (TM) molekülleri tasarlanmış, bitki virüs vektörlerine entegre edilmiş ve patateste Agrobacterium infiltration ile doğrudan ilgi çekici sonojen miRNA'ya bağlanmak ve işlevini engellemek için ifade edilir.

Introduction

Bitki mikroRNA'ları (miRNA'lar) 20-24 nükleotid uzunluğunda, nükleer kodlu düzenleyici RNA'lar1 olarak karakterize edilir ve büyüme ve gelişme2,3, fotosentez ve metabolizma4,5,6,7, hormon sentezi ve sinyalizasyon8,9, biyotik ve abiyotik yanıtlar dahil olmak üzere bitki biyolojik süreçlerinin hemen hemen her alanında temel roller oynar10, 11,12,13 ve besin ve enerji düzenlemesi14,15. Tesis miRNA'larının düzenleyici rolleri iyi programlanır ve genellikle transkripsiyon sonrası seviyelerde hedef mRNA'ları ayırarak veya çeviriyle bastırarak yerine getirilir.

Patateste miRNA'ların tanımlanması, transkripsiyonal profil oluşturma ve hedef tahminine doğru muazzam ilerleme kaydedildi16,17,18,19,20,21. Bununla birlikte, patates de dahil olmak üzere bitkilerdeki miRNA'ların fonksiyonel karakterizasyonu, verimli ve yüksek verimli genetik yaklaşımların olmaması nedeniyle diğer organizmaların gerisinde kaldı. Standart fonksiyon kaybı analizi ile bireysel miRNA'nın fonksiyonel analizini yapmak zordur, çünkü çoğu miRNA önemli genetik artıklığa sahip ailelere aittir22. Buna ek olarak, tek bir miRNA birden fazla hedef geni kontrol edebilir23 ve birkaç farklı miRNA aynı moleküler yolu işbirliği içinde modüle edebilir24,25. Bu özellikler, belirli bir miRNA veya miRNA ailesinin işlevini karakterize etmeyi zorlaştırır.

MiRNA'ların fonksiyonel analizinin çoğu, belirgin sınırlamaları olan işlev kazancı yaklaşımlarına büyük ölçüde güvenmektedir. Yapay miRNA (amiRNA) yöntemi, miRNA'ları yüksek düzeyde üretmek için endojen primer transkriptlerden (pri-miRNA' lar) yararlanır ve hedef gen ekspresyonunun inhibisyonunu önler26,27,28,29. Bununla birlikte, güçlü bir constitutive 35S promotörü kullanarak aktivasyon etiketleme ve miRNA aşırı ekspresyonu genellikle in vivo koşulları temsil etmeyen ve bu nedenle miRNAs30'un endojen işlevini yansıtmayabilecek miRNA'ların yüksek ekspresyonuna yol açar. Bağlama ve/veya bölünme bölgelerinde temizlenemez mutasyonlar içeren hedef genlerin miRNA'ya dirençli formlarının ekspresyonini içeren alternatif bir yaklaşım geliştirilmiştir31,32,33. Ancak bu yaklaşım, transgenik eserler nedeniyle miRNA dirençli hedef transgeneden türetilen fenotipin yanlış yorumlanmasına da neden olabilir. Bu nedenle, bu fonksiyon kazanım çalışmalarından sonuçlar dikkatle çıkarılmalıdır34. Yukarıda açıklanan yaklaşımların bir diğer önemli sınırlaması, emek yoğun ve zaman alıcı olan dönüşümü gerektirmeleridir. Ayrıca, transgene bağımlı yaklaşımlar dönüşüm-recalcitrant bitki türleri için neredeyse geçerli değil. Bu nedenle, miRNA'ların işlevini çözmek için hızlı ve verimli bir işlev kaybı yaklaşımı geliştirmek önemlidir.

Dönüştürme prosedürünün ön koşulunı atlamak için, hedef mimik (TM) stratejilerini virüs türevli vektörlerle birleştirerek virüs tabanlı mikroRNA susturma (VbMS) oluşturulmuştur. VbMS sisteminde, yapay olarak tasarlanmış TM molekülleri geçici olarak bir virüs omurgasından ifade edilir ve bitki endojen miRNA'ların işlevini parçalamak için güçlü, yüksek verim ve zaman kazandıran bir araç sunar35,36. VbMS başlangıçta tütün çıngırak virüsü (TRV)35,36,37 ile N. benthamiana ve domates geliştirilmiştir ve Arabidopsis genişletilmiştir, pamuk, buğday ve mısır, patates virüsü X (PVX)38, pamuk yaprağı buruşuk virüs (ClCrV)39, salatalık mozaik virüsü (CMV)40,41,42, Çin buğday mozaik virüsü (CWMV)43 dahil olmak üzere diğer çeşitli virüs ifade sistemlerini kullanarak ve arpa şerit mozaik virüs (BSMV)44,45.

Patates (Solanum tuberosum), yüksek besin değeri, yüksek enerji üretimi ve nispeten düşük girdi gereksinimleri nedeniyle dünyanın en önemli dördüncü gıda ürünü ve en yaygın olarak yetiştirilen noncereal mahsulüdür46. Patatesin çeşitli özellikleri onu çekici bir dikotilendonöz model bitki yapar. Yüksek outcrossing oranı, heterozygozite ve genetik çeşitliliğe sahip bitkisel olarak yayılan bir poliploid mahsulüdür. Bununla birlikte, bugüne kadar, VbMS kullanarak patatesteki miRNA'ların işlevini karakterize eden bir rapor yoktur. Burada, patates bitkilerinde miRNA'ların işlevini değerlendirmek için ligasyondan bağımsız klonlama (LIC) uyarlanmış patates PVX tabanlı VbMS yaklaşımını sunuyoruz38. MiR165/166 ailesini VbMS testini göstermek için seçtik, çünkü miR165/166 ailesi ve hedef mRNA'ları ve Sınıf III homeodomain/Leu fermuarı (HD-ZIP III) transkripsiyon faktörleri 22.47.48 olarak kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir. HD-ZIP III genleri meristem gelişimin ve organ polaritesinin temel düzenleyicileridir ve miR165/166 işlevinin bastırılması HD-ZIP III genlerinin ekspresyonunun artmasına neden olarak, apikal hakimiyetin azalması ve yaprak polaritesinin anormal örüntüleri gibi pleotropik gelişimsel kusurlara neden oluyor22,35,38,41 . MiRNA165/166'nın susturuğu ile ilişkili kolayca dekore edilebilir gelişimsel fenotipler, PVX tabanlı VbMS testinin etkinliğinin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Bu çalışmada, PVX tabanlı VbMS sisteminin patatesteki miRNA'ların işlevini etkili bir şekilde engelleyebileceğini gösteriyoruz. PVX tabanlı virüs kaynaklı gen susturma (VIGS) sistemi bir dizi patates çeşidinde kurulduğundan49,50,51,52, bu PVX tabanlı VbMS yaklaşımı büyük olasılıkla çok çeşitli diploid ve tetraploid patates türlerine uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Patates Bitkileri Yetiştirin.

  1. In vitro patates bitkilerini kültür tüplerinde (25 x 150 mm) Murashige ve Skoog (MS) medyası ve Gamborg vitamini (MS bazal tuz karışımı, Gamborg'un vitamini, 30 g/L sakkaroz, 3,5 g/L agar, pH = 5,7) ile yay. Tüpleri büyüme odasına 20-22 °C, 16 saat ışık/8 saat koyu fotoperiyod ve ışık yoğunluğu 120 μmol/m2⭐s1'in altına yerleştirin.
    NOT: Yeni sürgünler ve kökler normalde bitkilerden 1-2 hafta içinde gelişir. Bitkileri her ay taze MS/Gamborg vitamin ortamı ile yayın.
  2. Dört hafta sonra, in vitro bitkileri toprağa nakledin ve 20-22 ° C, 16 saat ışık / 8 saat karanlık fotoperiyod ve ışık yoğunluğu 120 μmol / m2 ⭐ s1 altındaki bir serada yetiştirin.
    NOT: Yeni geliştirilen kökleri ve yaprakları olan bitkiler ekim için uygundur. Yeni nakledilen bitkiler için nemi ilk 3-4 gün koruyun.

2. VbMS vektörlerini oluşturun.

  1. Kısa tandem TM moleküllerini tasarlayın ve klonla (STTM, Şekil 1)22,53 ilgi miRNA için.
    NOT: Deneysel verilere dayalı olarak veya miRbase veritabanından miRNA dizileri alın54,55,56,57,58,59. Bu çalışmada kullanılan miR166 dizisi daha önce 60 olarak tanımlanmıştır.
    1. MiRNA'nın 10-11. nükleotitlerine karşılık gelen sahadaki miRNA'nın ters tamamlayıcı dizisine normalde 5'-CTA-3' uyumsuzluk dizisi ekleyerek TM modülini tasarlayın.
      NOT: Örneğin, Stu-miR160 dizisi 5'-UGCCUGGCUCCGUAUGCC-3'61'dir ve burada 10-11. Ters kompleman sırası (deoksinükleotidlerde) 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' ve uyumsuz şişkinlik ekleme bölgesi kalın olarak gösterilir. TM molekül dizisi (deoksinükleotid) 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3' olmalıdır.
    2. STTM parçasını klonlamak için astarlar tasarlayın (Şekil 1). PCR klonlama için şablon olarak 48 nt aralayıcı dizisine sahip DNA oligonükleotidlerini kullanın. İleri astar, bir LIC1 bağlayıcıdan (5'-CgACgACAAGACCgT-3'), yukarıdakilerin TM molekülü için tasarlanan ileri dizilimini ve 48 nt aralayıcının kısmi 5' dizisini (5'-GTTGTTTTGTTATGGT-3') oluşur. Ters astar, bir LIC2 bağlayıcıdan (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), TM molekülünün ters tamamlayıcı dizisinden ve 48 nt aralayıcının (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3') 3' dizisine kısmi bir ters tamamlayıcıdan oluşur.
      NOT: 48 nt aralayıcı sırası 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATGGTCTAAGAAGAAT-3'dür. Örneğin, STTM-miR160 için ileri astar 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3' olmalıdır; ters astar 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' olmalıdır (Şekil 1).
    3. Şablon olarak sentezlenmiş evrensel 48 nt aralayıcıyı ve yüksek doğrulukta bir DNA polimerazını kullanarak PCR tarafından 50 μL hacimde STTM parçasını güçlendirin.
      1. Her astarın 0,5 μL'si (40 μM), 0,5 μL'si 48 nt ara oligo (40 μM), 5 μL'si 10x PCR tamponu karıştırarak PCR reaksiyonunun ayarını ayarlayın, 1 μL dNTP karışımı (her biri 10 mM), 0,1 μL yüksek kaliteli DNA polimeraz (10 U/μL) ve 43 μL ddH2O toplam 50 μL hacme aşağıdaki gibi standart PCR amplifikasyonu gerçekleştirin: 3 dakika için 94 °C, 45 s için 94 °C 32 döngü, 45 s için 60 °C ve 60 s için 72 °C.
    4. STTM parçasını etanol çökeltme ile arındırın. PCR ürünlerine 2,5 hacim etanol ve 1/10 hacimli 3 M sodyum asetat (pH = 4,0) ekleyin. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da kuvvetlice karıştırın ve santrifüj. Süpernatant çıkarın ve peletin% 70 etanol 1 mL ile durulayın. Peletin kurut ve 20 μL ddH2O'da çözün.
      NOT: STTM PCR ürünlerinin amplifikasyonlarını kontrol etmek için DNA elektroforezi kullanın.
    5. 2,5 μL saflaştırılmış STTM PCR ürünü, 0,5 μL 10x T4 DNA polimeraz tamponu, 0,05 μL 1 M ditiyothreitol (DTT), 0,25 μL 100 mM dATP karıştırarak buz üzerinde T4 DNA polimeraz reaksiyonu ayarlayın, 0,1 μL T4 DNA polimeraz (3 U/μL) ve 1,6 μL ddH2O toplam 5 μL hacme, karışımı 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatır, ve T4 DNA polimerazını devre dışı bırakmak için ürünleri 75 °C'de 20 dakika boyunca tedavi edin.
  2. PVX tabanlı VbMS yapısını hazırlayın.
    1. 100 μL hacimde 2,5 μL SmaI (20 U/μL) ile 5 μg PVX-LIC plazmid38 sindirin.
    2. Sindirilen PVX-LIC ürünlerine eşit miktarda fenol:kloroform:izopropanol (25:24:1, pH = 6.7/8.0) ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ve süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Eşit miktarda kloroform ekleyin:izopropanol (24:1) ve girdap kuvvetlice. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj.
      NOT: PVX-LIC vektörü klonlama için LIC kasetini barındırır. PVX-LIC vektörün LIC kaseti bir ccdB geni ve kloramfenikol dirençli bir gen içerir ve kanamycin (50 μg/L) ve kloramfenikol (15 μg/L) içeren LB ortamı kullanılarak E. coli strain DB3.1'de tutulması/yayılması gerekir.
    3. Süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. 2,5 cilt etanol ve 1/10 hacim 3 M sodyum asetat (pH = 4,0) ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın.
    4. Peletin% 70 etanol ve girdaptan 1 mL ile kuvvetlice durulayın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Peleti kurutun ve sindirilen PVX-LIC plazmidini 100 μL ddH2O ile çözün.
    5. Sindirilmiş PVX-LIC vektör DNA'sının 2,5 μL'si, 10x T4 DNA polimeraz tamponunun 0,5 μL'si karıştırılarak buz üzerinde T4 DNA polimeraz reaksiyonunun kurulması, 1 M DTT'nin 0,05 μL'si, 100 mM dTTP'nin 0,25 μL'si ve toplam 5 μL hacimde 0,1 μL T4 DNA polimerazı (3 U/μL) karışımı 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın ve ürünleri 20 dakika boyunca 75 °C'de tedavi edin T4 DNA polimerazını etkisiz hale getir.
  3. STTM dizisini LIC reaksiyon kullanarak PVX-LIC vektörüne klonlayın. T4 DNA polimerazla işlenmiş STTM PCR ürünlerini (5 μL) ve T4 DNA polimerazla işlenmiş PVX-LIC plazmidlerini (5 μL) karıştırın. 70 °C'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın, 0,1 °C/s rampada 22 °C'ye kadar soğutun ve PCR makinesi kullanarak 30 dakika boyunca 22 °C'de tutun.
    NOT: LIC klonlamanın daha yüksek verimliliğini elde etmek için kuluçka süresini 4 °C'de geceleme süresine kadar uzatın.
  4. LIC reaksiyon ürünlerinin 5 μL'sini E. coli DH5α'ya dönüştürün ve 50 μg/mL kanamycin62,63 içeren bir LB plakasında büyüyün. PVX-LIC vektörü için klonlama astarları ve evrensel astar ve ardından sıralama ile PCR ile pozitif kolonileri seçin ve doğrulayın.
    1. Pozitif klonları tanımlamak için STTM klonlama için ters astar ile birlikte PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') için ileri astar ile koloni PCR gerçekleştirin. PCR bandının boyutu ~300 bp olmalıdır.
      NOT: Sonlandırıcı döngüsü sırasıyla STTM parçalarının dizilerini doğrulayın64,65.
  5. PVX-STTM plazmidlerini doğrulanmış klonlardan ayırın ve bunları GV3101, GV2260 veya EHA10562,63 Agrobacterium suşlarına dönüştürün. Agrobacterium kolonilerini PCR ile doğrulayın.
    NOT: PVX-LIC için ileri astarı ve STTM klonlama için ters astarı kullanarak Agrobacterium kolonilerini PCR ile onaylayın.

3. Patates bitkilerinde PVX tabanlı VbMS tahlilleri gerçekleştirin.

  1. 4 haftalık tüp patates bitkilerini toprağa nakletin. Nakledilen bitkiler 3-4 gün sonra VbMS testine tabi tutulacaktır.
  2. Patates bitkilerini PVX-STTM plazmidlerini içeren Agrobacterium ile aşılayın.
    NOT: Patateste VbMS tahlili için Agrobakteri aracılı infiltrasyon ve kürdan tırmalama inoktülasyonu aynı anda gerçekleştirilir.
    1. PVX-STTM vektörleri içeren pozitif transformantları 50 μg/mL kanamycin ve 50 μg/mL rifampicin içeren 50 mL sıvı LB'ye alın ve aşılayın. OD600 = 1.0'a kadar 16 saat boyunca 220 rpm'de 28 °C inkübatörde büyüyün.
    2. Aynı zamanda, pozitif Agrobacterium kolonilerini 50 μg/ mL kanamycin ve 50 μg / mL rifampicin içeren en az iki yeni LB plakasına serin ve 1 gün boyunca 28 ° C'de büyüyün. Kontrol olarak PVX-LIC38,66 vektörünü ve virüs yayılmasını izlemek için PVX-GFP67,68'i dahil edin.
    3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3.400 x g'da santrifüjleme ile Agrobacterium sıvı kültürünü toplayın. Agrobacterium hücrelerini eşit hacimli sızma tamponu (10 mM MgCl2, 10 mM MES ve 200 μM asetosyringone, pH = 5,6) ile yeniden biriktirin ve OD600 = 1,0'a ayarlayın. Oda sıcaklığında 6 saat kuluçkaya yatırın.
    4. Agrobacterium kültürünü 1 mL iğnesiz şırınga ile tamamen genişletilmiş yaprakların abaksiyel tarafına sızın.
      1. Bir yaprağı tek elinizle çevirin ve tutun, ardından bir parmağınızı sızıntı yerindeki adaxial taraftan yaprak laminasını desteklemek için kullanın. Şırınnayı diğer elinizle yaprak yüzeyine dikey tutun ve Agrobacterium kültürünü lamina'nın abaksiyel tarafına sızın.
    5. Agrobacterium kültürünü LB plakalarından kazıyın ve sızan patates bitkilerinin ilk bir veya iki internotunun gövde yüzeyini kürdanla çizin. Sapın epidermisini hafifçe çizin. Bitkilere ciddi zararlar verebilecek gövdeden delinmekten kaçının.
  3. 22 °C'de 22 °C'de 16 saat açık/8 saat koyu fotoperiyod ve bir serada 120 μmol/m2φ s1 ışık yoğunluğu ile bitkileri yetiştirin.
    NOT: MiRNA susturma nedeniyle fenotipler genellikle postinokokasyon sonrası 2-4 hafta içinde ortaya çıkar (Şekil 2, Şekil 3). VbMS fenotipinin sızmadan sonra görünmesi genellikle 10-20 gün sürer. VbMS fenotipi, spesifik miRNA ve hedef genlerin özelliklerine, büyüme koşullarına ve patates çeşitlerine bağlıdır.

4. İfade analizi yapın.

  1. Fenotipler 2-4 haftalık postinokokasyonda ortaya çıktığında, vbMS bitkilerinden fenotipli sürgünler, yapraklar, çiçekler veya kökler gibi dokuları ve kontrol tesislerinden gelen dokuları makasla toplayın. Toplanan dokulardan toplam RNA'ları izole edin.
  2. RNA kalitesini elektroforez62,63 ile kontrol edin ve OD260 absorbansını spektrofotometre ile ölçerek RNA konsantrasyonunu ölçün.
  3. MiRNA ifadesini analiz etmek için stem-loop gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) kullanın.
    1. Belirli miRNA'lar için bir kök döngü ters transkripsiyon astarı tasarlayin. Stem-loop RT primer'lar evrensel 5' omurga ve belirli bir miRNA'nın 3' 6 nt uzantısını içerir. Bir kök döngü yapısı oluşturan 5' evrensel omurga (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') tasarlayın. (Büyük harf ters tekrarlanan bir sıraya ve döngü bölgesine küçük harfe karşılık gelir).
    2. Bir döngü oluşturan 5' omurga dizisinin bir kısmı, sonraki PCR amplifikasyonu için ters astar görevi görür (omurga dizisinde kalın-italik sıra). Ters transkripsiyon için özgüllük sağlamak üzere kök döngü astarı için ilgi miRNA'nın 3' ucuna ters tamamlayıcı olan 6 nt'lik bir uzantı dizisi ekleyin (Ek Şekil 1A).
      NOT: Chen ve ark.69 ve Erika Varkonyi-Gasic ve ark.70,71,72 tarafından tanımlandığı gibi kök-döngü ters transkripsiyon astarını tasarlayın. Örneğin, Stu-miR160 için kök döngü ters transkripsiyon astarı 5'-GTCTCCTCTGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGGACGGCATA-3' olarak tasarlanmıştır. Patates miR165/166 ailesi için kök döngü ters transkripsiyon astarı 5'-GTCTCCTCTGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGG(A/G)A-3' olarak tasarlanmıştır. (Kalın büyük harf dizileri, belirli miRNA'lar için ters transkripsiyonun özgüllüğünü sağlar).
    3. Toplam RNA'nın 50-200 ng'si, kök döngü ters transkripsiyon astarının 1 μL'si (100 μM), 2 μL 10x tamponu karıştırarak ters transkripsiyon reaksiyonunu ayarlayın, Buz üzerinde 0,2 μL RNaz inhibitörü (40 U/μL), 0,25 μL dNTP (her biri 10 mM) ve 1 μL ters transkriptaz (200 U/μL). Toplam 20 μL hacme çekirdeksiz ddH2O ekleyin.
    4. Darbeli ters transkripsiyon prosedürünü kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirin. Ters transkripsiyon reaksiyon karışımını 30 dakika boyunca 16 °C'de kuluçkalayın, 30 s için 30 °C, 30 s için 42 °C ve 1 s için 50 °C sıcaklık döngüsünü toplam 60 döngü boyunca gerçekleştirin ve ters transkriptazı 5 dakika boyunca 85 °C'de inkübasyonla etkisiz hale koyun.
    5. MiRNA ifadesinin gerçek zamanlı PCR analizi için, ileri astarı miRNA dizisine göre tasarlayın, ancak yukarıda tasarlanan kök döngü ters transkripsiyon astarı ile çakışır dizileri içermez. Uzunluğu, erime sıcaklığını ve GC içeriğini optimize etmek için ileri astarın 5' kısmına 3–7 nt uzantı ekleyin (Ek Şekil 1).
      NOT: Evrensel ters astar 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'' dür. Örneğin, Stu-miR160 için kök döngü ters transkripsiyon astarı 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3' olarak tasarlanmıştır. MiR165/166 ailesi için kök-döngü ters transkripsiyon astarı 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3''dür. Kalın diziler, astar optimizasyonu için 5' uzantı görevi eder. MiRNA için kök döngü ters transkripsiyon astarları ve gerçek zamanlı PCR astarları miRNA Primer Tasarım Aracı73 kullanılarak tasarlanabilir.
  4. Hedef mRNA'ların cDNA'larını standart ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) ile sentezleyin. Ters transkripsiyon reaksiyon karışımını 37 °C'de 60 dakika kuluçkaya yatırın ve 5 dakika boyunca 85 °C'ye ısıtarak ters transkriptazı devre dışı bırakın.
    NOT: (1) Hedef mRNA'lar bilinmiyorsa psRNATarget programı74 kullanarak hedef mRNA'ları tahmin edin. (2) mRNA için evrensel ters transkripsiyon astarı, 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3' bağlantılı bir astardır.
  5. Hem ilgi çekici miRNA hem de hedef mRNA'lar için gerçek zamanlı PCR reaksiyonlarını ayarlayın. Buz üzerinde toplam 5 μL hacimde 0,5 μL şablon cDNA, 5 μL 2x gerçek zamanlı PCR tamponu SYBR yeşili, her ileri ve ters astarın 0,05 μL'si (40 μM) ve 4,4 μL ddH2O'yu karıştırın.
  6. 3 dakika boyunca 95 °C'de kuluçkaya yaslanın, 3 s için 95 °C'lik 40 döngü ve 30 sn için 60 °C. Sonraki erime eğrisi analizini aşağıdaki gibi yapın: 15 s için 95 °C'de kuluçkalayın, 20 °C/s'lik bir rampada 60 °C'ye kadar soğutun, 60 s için 60 °C'de tutun, 0,2 °C/s'lik bir rampada 95 °C'ye ısıtın ve 15 s için 95 °C'de tutun. ΔΔCt yöntemlerini kullanarak Ct değerlerini analiz edin76,77 ve standart hatalarla araçları çizin.
    NOT: (1) Hedef mRNA'lar için gerçek zamanlı PCR astarları açıklandığı gibi tasarlanabilir75. (2) Patates poliubiquitin 10 geni patateste normalleşme için bir iç kontrol görevi görebilirsiniz. Patates poliubiquitin 10 geni için ileri astar 5'-ATGTTGCCTTTTTTGTGGTTG-3' ve ters astar 5'-TTATTTATTCACATAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Gerçek zamanlı PCR analizi için kontaminasyon ve astar-dimer oluşumu yanlış pozitif sonuçlar üretebilir. Spesifik olmayan amplifikasyonu izlemek ve gerçek zamanlı PCR analizinin sorumluluğunu artırmak için, şablonsuz kontrollerin dahil edilmesi ve gerçek zamanlı PCR tahlilleri için ters transkriptaz yapılması önerilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 2 , PVX-STTM165/166 patates bitkilerini (Katahdin) damarlar boyunca yaprak laminanın abaksiyel tarafından yaprak dokularının ektopik büyümesi ile göstermektedir. Trompet şeklinde yaprak oluşumu gibi daha şiddetli fenotipler de gözlenmiştir. Buna karşılık PVX kontrol tesislerinde fenotipik anormallik gözlenmedi. Bu sonuçlar, VbMS sisteminin tetraploid patates bitkilerinde endojen miRNA fonksiyonunu bastırmada etkili olduğunu ve PVX-VbMS sisteminin spesifik miRNA'ların veya miRNA ailelerinin işlevini belirlemek için sağlam bir genetik araç olduğunu göstermektedir.

Şekil 3 , PVX-STTM165/166 patates bitkilerini (Russet Burbank) damarlar boyunca yaprak laminasının abaksiyel tarafından ektopik yaprak dokusu büyümesi ile göstermektedir. Bu sonuçlar, PVX-VbMS sisteminin büyük bir patates cultivar da dahil olmak üzere diğer patates türlerine uygulanabileceğini göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: PVX tabanlı VbMS vektörlerinin şematik diyagramı ve PVX-STTM165/166 yapısı. LB = T-DNA sol kenarlık; RB = T-DNA sağ kenarlığı; 35S = karnabahar mozaik virüs 35S promotörü; NOST = nopaline synthase sonlandırıcı; RdRP = RNA'ya bağımlı RNA polimeraz; TGB1 = üçlü gen bloğu proteini 1; TGB2 = üçlü gen bloğu proteini 2; TGB3 = üçlü gen bloğu proteini 3; sgP = PVX subgenomik RNA promotörü; CP = kat proteini; LIC Kaset = ligasyondan bağımsız klonlama kaseti; 48 nt = 48 nükleotid kusurlu kök döngü bağlayıcısı. STTM165/166, 48 nt kusurlu kök döngü bağlayıcı dizisi ile ayrılmış miR165/166'nın tandem TM dizilerinden oluşur. PVX-LIC vektöründeki yeşil ok ucu, STTM dizisini barındıran PVX altgenomik RNA'nın başlangıç bölgesini gösterir. MiRNA dizilerindeki üçlü eksi tireler bölünme bölgelerini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Tetraploid patates çeşidi Katahdin'de miR165/166 VbMS. PVX vektör kontrolünü veya PVX-STTM165/166'yı ifade eden patates bitkilerinin (Katahdin) fenotipleri. Macenta okları yaprak damarlarında ektopik olarak oluşturulan yaprak yapılarını gösterir. Turuncu ok ucu trompet benzeri yaprak yapılarını gösterir. Çubuklar = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Tetraploid patates çeşidi Russet Burbank'te miR165/166 vbMS. PVX vektörü kontrol veya PVX-STTM165/166 olarak ifade eden patates bitkilerinin fenotipleri (Russet Burbank). Macenta okları yaprak damarlarında ektopik olarak oluşturulan yaprak yapılarını gösterir. Çubuklar = 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: MiRNA'ların kök döngü RT-PCR analizinin şematik diyagramları ve gerçek zamanlı PCR astar tasarımı. (A) MiRNA'ların kök-döngü RT-PCR analizi. Ters transkripsiyon sırasında, kök döngü astarının 3' miRNA'ya bağlanması ters transkripsiyon başlattı ve cDNA sentezlendi. PCR ürünleri, ilgi çekici miRNA'nın belirli bir ileri astarı ve evrensel ters astar ile güçlendirildi. (B) Gerçek zamanlı PCR astar tasarımı. Stu-miR160 ve Stu-miR165/166 için ileri ve ters astarlar gösterilir. İleri astar miRNA dizisine göre tasarlanmıştır, ancak tasarlanmış kök döngü ters transkripsiyon astarı ile çakılan dizileri içermez. Uzunluğu, erime sıcaklığını ve GC içeriğini ayarlamak için ileri astarın 5' kısmına 3–7 nt'lik bir uzantı eklendi. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

STTM tasarımını PVX vektörüne entegre ederek patatesteki endojen miRNA'ların işlevini karakterize etmek için PVX tabanlı bir miRNA susturma sistemi sunuyoruz. VbMS sisteminin, bitki türleri arasında yüksek oranda korunmuş bir miRNA ailesi olan patateste miRNA165/166'nın susturılmasında etkili olduğu kanıtlanmıştır.

TM yaklaşımı, hedeflenen miRNA'nın elenmesi ve etkinliğinin tutuklanmasıyla sonuçlanan miRNA tamamlama sırasında beklenen bölünme bölgesinde uyumsuz bir döngü oluşturmak için tasarlanmış yapay bir miRNA hedef mimikine dayanan miRNA'ların ifadesini kesintiye uğratacak şekilde geliştirilmiştir22,35,78,79 . TM molekülleri ve hedef miRNA'lar arasındaki eşleştirme, belirli bir miRNA veya miRNA ailesinin seviyelerini düşürerek miRNA'ların işlevini engeller ve bu da hedef mRNA'ların yükselmesine yol açar. MiRNA'ların susturulması için endojen miRNA hedef taklitçiliği (eTM)79,80, eTM tabanlı miRNA taklitleri (MIM'ler)35,78, kısa tandem hedef taklitleri (STTM'ler)22,53, protein kodlama transkriptlerinin 3' UTR'sine entegre TM'lere sahip bir miRNA yem yaklaşımı81 ve miRNA'ları (CMSP'ler) hedeflemek için iki merkezi uyumsuzluğa sahip miRNA bağlama bölgeleri içeren miRNA SPONG'ları 82. STTM, ampirik olarak optimize edilmiş 48 nt'lik bir aralayıcı ile bağlantılı, 3 nt uyumsuz şişkinliğe sahip iki miRNA bağlama sitesinden oluşur. STTM, hedef miRNA'ların22,53'ün verimli inhibisyonunu tetikler. STTM teknolojisi son zamanlarda model bitki Arabidopsis ve pirinç ve mısır gibi büyük mahsullerden miRNA'ların büyük ölçekli fonksiyonel analizine başarıyla uygulanmıştır. Bu, mahsul ıslahını iyileştirmede büyük umut vaat eden verim ve hormon kontrolünde yer alan birkaç endojen miRNA'nın benzeri görülmemiş rollerinin keşfedilmesine yol açtı47. STTM tasarımının bu avantajlarına dayanarak, STTM'yi seçtik ve patatesteki miRNA'ların işlevsel karakterizasyonu için PVX vektörüne entegre ettik. CMSP'ler, MIM'ler ve STTM'ler gibi TM moleküllerinin çeşitli tasarımlarının farklı miRNAs82'nin işlevini engellemede değişken etkililiklere sahip olduğunu belirtmek gerekir. Bu nedenle, çeşitli TM tasarım stratejileri kullanmak daha etkili miRNA bastırma elde etmeye yardımcı olabilir. Eşsiz şişkinliğin uzunluğu ve dizi bağlamının yanı sıra miRNA bağlama bölgelerine bitişik nükleotid değişikliklerinin de belirli bir miRNA susturma sonucu için optimize edilmesi gerekebilir22,36,38,78,83. Ayrıca, deneysel analiz ile birlikte hesaplamalı tahminlerin rehberliğinde TM moleküllerinin tasarımı muhtemelen miRNAs84'ün daha güvenilir inhibisyonunu sağlayacaktır.

PVX tabanlı VIGS sisteminin hem diploid hem de ekili tetraploid Solanum türlerinde RNA susturma tetiklemesinde etkili olduğu gösterilmiştir. PVX tabanlı sistemik susturma, in vitro yayılımlı patates bitkilerinde ve in vitro olarak üretilen mikro yumrularda yaprak dokuları boyunca indüklenmiş ve korunur85. Son zamanlarda PVX tabanlı VIGS sisteminin Ancilla, Arran Pilot, Marius Bard ve Serrana86 gibi çeşitli tetraploid patates kültivatörlerinde ilgi genlerini susturabileceğini bildirdik. PVX tabanlı VbMS etkisinin patateste vejetatif yayılma yoluyla birkaç nesil boyunca bulaşıp sürdürülemeyeceği belirlenmeye devam etmektedir. TM moleküllerini patates bitkilerine saptırmak için transgenik yaklaşımlar, sonraki nesillerde ilgi çekici miRNA'ların susturma etkilerinin sürdürülmesi gerektiğinde hala tavsiye edilir.

Patates büyümesi ve gelişmesinde rol oynayan çok sayıda miRNA tespit edilmiştir. RNA-seq, genom dizilimi ve biyoinformatik tahmin, miRNA'ların ve hedeflerinin tanımlanmasını büyük ölçüde kolaylaştırmış 17,19,20,21. Şimdiye kadar, iki katı monoploid S. tuberosum Grubu Phureja klonu DM1-3, vahşi bir diploid türü S. commersonii ve S. chacoense87,88,89'un diploid inbred klonu M6 dahil olmak üzere üç patates genomu sıralandı. Güncel olarak, çoğu durumda TM teknolojisini kullanarak sadece sınırlı sayıda patates miRNA'sı işlevsel olarak karakterize edilmiştir. Örneğin, ÇİÇEKLİ LOCUS T (FT) homolog SP6A, patateste yumrulaşmayı kontrol etmek için mobil bir sinyal görevi görür ve SP6A transkriptinin ısı kaynaklı bölünmesine aracılık eden SP6A 'nın (SES) ifadesini baskılayan bir miRNA tarafından hedeflenir90,91. SES'in STTM aracılı aşırı ifadesi SES miRNA'nın aktivitesini engeller ve sürekli ısı koşullarında bile yumrulaşmayı kolaylaştırır91. İmmün yanıtta yer alan bir miRNA olan miR160'ın eTM yaklaşımı ile devrilmesi, patates92'de Phytophthora istilacılarına karşı hem lokal hem de sistemik edinilmiş dirençte miR160'ın gerekli olduğunu göstermiştir.

Biyoinformatik bir yaklaşım kullanılarak, patates ve domatesteki nükleotid bağlama bölgesi lösin bakımından zengin tekrar (NLR) immün reseptörlerini hedefleyen sekiz benzersiz miRNA ailesi tespit edildi93. MiRNA ailelerinden biri olan miR482/2118, çeşitli patojenlere karşı direnç sağlayan ve STTM yapılarının transgenik ekspresyonu ile aracılık edilen miR482/2118 ailesi miRNA'larının baskılanması, domateste P. infestans ve Pseudomonas syringae13'e karşı gelişmiş direnç gösterir. Artan kanıtlar, patojenlerde ve konakçılarda üretilen küçük RNA'ların iki organizma arasında seyahat edebildiğine ve krallıklar arası RNA parazitinin aracılık ettiği birbirlerinin gen ekspresyonını bastırabildiğine işaret ediyor94,95,96,97. Örneğin, oomycete patojen türevi sRNA'ların hedef taklitleri bu istilacı sRNA'ları çöpe atabilir ve patojen enfeksiyonunu azaltabilir61. Mevcut VbMS sisteminin, bitkilerdeki direnci artırmak için patojen türevi sRNA'ları hedeflemek için kullanılıp kullanılmayacağını incelemek ilginç olacaktır.

Özetle, virüs tabanlı miRNA susturma sistemi hızlı ve uygun maliyetlidir ve yüksek aktarım hızı biçiminde gerçekleştirilebilir. PVX tabanlı VbMS sistemi, belirli miRNA'ların veya miRNA ailelerinin ve hedef genlerin işlevini belirlemek için verimli ve sağlam bir genetik araç sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiç kimse.

Acknowledgments

PVX-LIC vektörü sağladığı için Tsinghua Üniversitesi'nden Dr. Yule Liu'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Texas A&M AgriLife Research ve USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü'nden JS'ye TEX0-1-9675 Hatch Projesi'nden bir başlangıç fonu tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µM dATP and 100 µM dTTP Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA TQAC136
3 M Sodium acetate, pH 4.0. Teknova, Hollister, CA 95023, USA #S0297
Acetosyringone TCI America, Portland, OR 97203, USA D2666-25G
Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.
Chloroform VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0757-950ML
Dimethyl sulfoxide, DMSO TCI America, Portland, OR 97203, USA D0798-25G
DTT VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0281-25G
E. coli DB3.1 for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene
E. coli DH5α for the destination constructs generated by LIC cloning
Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA G99260
High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA, USA		 7958960001
Isoamyl alcohol VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0944-1L
Koptec Pure Ethanol – 200 Proof Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA V1005M
MES TCI America, Portland, OR 97203, USA M0606-250G
MgCl2 ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA MFCD00149781
M-MuLV Reverse Transcriptase New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0253L
Nano-drop spectrometer: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA ND-ONEC-W
PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA 170-9703
PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA 950030010
pH meter Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA Benchtop pH / mV Meter - 860031
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0. VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA VWRV0883-400ML
Phytagel: Gellan Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA J63423-A1
PVX VIGS vector: PVX-LIC Zhao et al., 2016
Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA 4485697
Real-time PCR reagent: KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) Kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,
Wilmington, MA 01887, USA		 7959389001
Restriction enzyme: SmaI New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA R0141S
Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA 95107-100
RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA SKU: D3485-01
RNase Inhibitor Murine New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0314L
RNAzol RT Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA R4533
Soil: Metro-Mix 360 Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA Metro-Mix 360
T4 DNA polymerase and buffer New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA M0203S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axtell, M. J., Meyers, B. C. Revisiting Criteria for Plant MicroRNA Annotation in the Era of Big Data. The Plant Cell. 30 (2), 272-284 (2018).
  2. Chen, X. Small RNAs and Their Roles in Plant Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25 (1), 21-44 (2009).
  3. Rubio-Somoza, I., Weigel, D. MicroRNA networks and developmental plasticity in plants. Trends in Plant Science. 16 (5), 258-264 (2011).
  4. Zhang, J. -P., et al. MiR408 Regulates Grain Yield and Photosynthesis via a Phytocyanin Protein. Plant Physiology. 175 (3), 1175-1185 (2017).
  5. Gupta, O. P., Karkute, S. G., Banerjee, S., Meena, N. L., Dahuja, A. Contemporary Understanding of miRNA-Based Regulation of Secondary Metabolites Biosynthesis in Plants. Frontiers in Plant Science. 8 (374), (2017).
  6. May, P., et al. The effects of carbon dioxide and temperature on microRNA expression in Arabidopsis development. Nature Communications. 4 (1), 2145 (2013).
  7. Krützfeldt, J., Stoffel, M. MicroRNAs: A new class of regulatory genes affecting metabolism. Cell Metabolism. 4 (1), 9-12 (2006).
  8. Damodharan, S., Corem, S., Gupta, S. K., Arazi, T. Tuning of SlARF10A dosage by sly-miR160a is critical for auxin-mediated compound leaf and flower development. The Plant Journal. 96 (4), 855-868 (2018).
  9. Nizampatnam, N. R., Schreier, S. J., Damodaran, S., Adhikari, S., Subramanian, S. microRNA160 dictates stage-specific auxin and cytokinin sensitivities and directs soybean nodule development. The Plant Journal. 84 (1), 140-153 (2015).
  10. Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends in Plant Science. 12 (10), 444-451 (2007).
  11. Covarrubias, A. A., Reyes, J. L. Post-transcriptional gene regulation of salinity and drought responses by plant microRNAs. Plant, Cell, Environment. 33 (4), 481-489 (2010).
  12. Wang, S., et al. Suppression of nbe-miR166h-p5 attenuates leaf yellowing symptoms of potato virus X on Nicotiana benthamiana and reduces virus accumulation. Molecular Plant Pathology. 19 (11), 2384-2396 (2018).
  13. Canto-Pastor, A., et al. Enhanced resistance to bacterial and oomycete pathogens by short tandem target mimic RNAs in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (7), 2755-2760 (2019).
  14. Chiou, T. -J., Lin, S. -I. Signaling Network in Sensing Phosphate Availability in Plants. Annual Review of Plant Biology. 62 (1), 185-206 (2011).
  15. Sunkar, R., Chinnusamy, V., Zhu, J., Zhu, J. -K. Small RNAs as big players in plant abiotic stress responses and nutrient deprivation. Trends in Plant Science. 12 (7), 301-309 (2007).
  16. Kwenda, S., Birch, P. R. J., Moleleki, L. N. Genome-wide identification of potato long intergenic noncoding RNAs responsive to Pectobacterium carotovorum subspecies brasiliense infection. BMC Genomics. 17 (1), 614 (2016).
  17. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
  18. Koc, I., Filiz, E., Tombuloglu, H. Assessment of miRNA expression profile and differential expression pattern of target genes in cold-tolerant and cold-sensitive tomato cultivars. Biotechnology, Biotechnological Equipment. 29 (5), 851-860 (2015).
  19. Zhang, N., et al. Identification of Novel and Conserved MicroRNAs Related to Drought Stress in Potato by Deep Sequencing. PLoS One. 9 (4), 95489 (2014).
  20. Xie, F., Frazier, T. P., Zhang, B. Identification, characterization and expression analysis of MicroRNAs and their targets in the potato (Solanum tuberosum). Gene. 473 (1), 8-22 (2011).
  21. Zhang, R., Marshall, D., Bryan, G. J., Hornyik, C. Identification and Characterization of miRNA Transcriptome in Potato by High-Throughput Sequencing. PLoS One. 8 (2), 57233 (2013).
  22. Yan, J., et al. Effective Small RNA Destruction by the Expression of a Short Tandem Target Mimic in Arabidopsis. The Plant Cell. 24 (2), 415-427 (2012).
  23. Roodbarkelari, F., Groot, E. P. Regulatory function of homeodomain-leucine zipper (HD-ZIP) family proteins during embryogenesis. New Phytologist. 213 (1), 95-104 (2017).
  24. Reichel, M., Millar, A. A. Specificity of plant microRNA target MIMICs: Cross-targeting of miR159 and miR319. Journal of Plant Physiology. 180, 45-48 (2015).
  25. Taylor, R. S., Tarver, J. E., Hiscock, S. J., Donoghue, P. C. J. Evolutionary history of plant microRNAs. Trends in Plant Science. 19 (3), 175-182 (2014).
  26. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., Weigel, D. Highly Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. The Plant Cell. 18 (5), 1121-1133 (2006).
  27. Martin, A., et al. Graft-transmissible induction of potato tuberization by the microRNA miR172. Development. 136 (17), 2873-2881 (2009).
  28. Yang, L., et al. Overexpression of potato miR482e enhanced plant sensitivity to Verticillium dahliae infection. Journal of Integrative Plant Biology. 57 (12), 1078-1088 (2015).
  29. Tang, Y., et al. Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants. Plant Physiology. 153 (2), 632-641 (2010).
  30. Voinnet, O. Origin, Biogenesis, and Activity of Plant MicroRNAs. Cell. 136 (4), 669-687 (2009).
  31. Teotia, S., Tang, G. To Bloom or Not to Bloom: Role of MicroRNAs in Plant Flowering. Molecular Plant. 8 (3), 359-377 (2015).
  32. Wu, G., Poethig, R. S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development. 133 (18), 3539-3547 (2006).
  33. Zhao, L., Kim, Y., Dinh, T. T., Chen, X. miR172 regulates stem cell fate and defines the inner boundary of APETALA3 and PISTILLATA expression domain in Arabidopsis floral meristems. The Plant Journal. 51 (5), 840-849 (2007).
  34. Li, J., Millar, A. A. Expression of a microRNA-Resistant Target Transgene Misrepresents the Functional Significance of the Endogenous microRNA: Target Gene Relationship. Molecular Plant. 6 (2), 577-580 (2013).
  35. Sha, A., et al. Virus-based microRNA silencing in plants. Plant Physiology. 164 (1), 36-47 (2014).
  36. Zhao, J., Liu, Y. Virus-based MicroRNA Silencing. Bio-protocol. 6 (2), 1714 (2016).
  37. Yan, F., et al. A virus-based miRNA suppression (VbMS) system for miRNA loss-of-function analysis in plants. Biotechnology Journal. 9 (5), 702-708 (2014).
  38. Zhao, J., et al. An efficient Potato virus X-based microRNA silencing in Nicotiana benthamiana. Scientific Reports. 6, 20573 (2016).
  39. Gu, Z., Huang, C., Li, F., Zhou, X. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton. Plant Biotechnology Journal. 12 (5), 638-649 (2014).
  40. Du, Z., et al. Using a viral vector to reveal the role of microRNA159 in disease symptom induction by a severe strain of cucumber mosaic virus. Plant Physiology. 164 (3), 1378-1388 (2014).
  41. Liao, Q., Tu, Y., Carr, J. P., Du, Z. An improved cucumber mosaic virus-based vector for efficient decoying of plant microRNAs. Scientific Reports. 5, 13178 (2015).
  42. Liu, X., et al. Analyses of MiRNA Functions in Maize Using a Newly Developed ZMBJ-CMV-2bN81-STTM Vector. Frontiers in Plant Science. 10, 1277 (2019).
  43. Yang, J., et al. Chinese Wheat Mosaic Virus-Induced Gene Silencing in Monocots and Dicots at Low Temperature. Frontiers in Plant Science. 9, 1627 (2018).
  44. Jiao, J., Wang, Y., Selvaraj, J. N., Xing, F., Liu, Y. Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV) Induced MicroRNA Silencing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS One. 10 (5), 0126621 (2015).
  45. Jian, C., et al. Virus-Based MicroRNA Silencing and Overexpressing in Common Wheat (Triticum aestivum L.). Frontiers in Plant Science. 8, 500 (2017).
  46. Barrell, P. J., Meiyalaghan, S., Jacobs, J. M. E., Conner, A. J. Applications of biotechnology and genomics in potato improvement. Plant Biotechnology Journal. 11 (8), 907-920 (2013).
  47. Peng, T., et al. A Resource for Inactivation of MicroRNAs Using Short Tandem Target Mimic Technology in Model and Crop Plants. Molecular Plant. 11 (11), 1400-1417 (2018).
  48. Teotia, S., Zhang, D., Tang, G. Functional Genomics: Methods and Protocols. Kaufmann, M., Klinger, C., Savelsbergh, A. , Springer. New York. 337-349 (2017).
  49. Dommes, A. B., Herbert, D. B., Kivivirta, K. I., Gross, T., Becker, A. Virus-induced gene silencing: empowering genetics in non-model organisms. Journal of Experimental Botany. 70 (3), 757-770 (2018).
  50. Lacomme, C., Chapman, S. Use of Potato Virus X (PVX)-Based Vectors for Gene Expression and Virus-Induced Gene Silencing (VIGS). Current Protocols in Microbiology. 8 (1), 11-16 (2008).
  51. Lim, H. -S., et al. Efficiency of VIGS and gene expression in a novel bipartite potexvirus vector delivery system as a function of strength of TGB1 silencing suppression. Virology. 402 (1), 149-163 (2010).
  52. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), 134-141 (2007).
  53. Tang, G., et al. Construction of short tandem target mimic (STTM) to block the functions of plant and animal microRNAs. Methods. 58 (2), 118-125 (2012).
  54. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl 1 152-157 (2010).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (1), 68-73 (2013).
  56. Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl 1 109-111 (2004).
  57. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl 1 140-144 (2006).
  58. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl 1 154-158 (2007).
  59. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47 (1), 155-162 (2018).
  60. Yin, K., Tang, Y., Zhao, J. Genome-wide characterization of miRNAs involved in N Gene-mediated Immunity in response to tobacco mosaic virus in Nicotiana benthamiana. Evolutionary Bioinformatics. , Supplementary Files 20744 1-11 (2015).
  61. Dunker, F., et al. Oomycete small RNAs invade the plant RNA-induced silencing complex for virulence. bioRxiv. , 689190 (2019).
  62. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. A Laboratory Mannual 4th. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
  63. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd Edition. , Cold spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  64. Anderson, S., et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290 (5806), 457-465 (1981).
  65. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  66. Qian, L., et al. Hsp90 Interacts With Tm-22 and Is Essential for Tm-22-Mediated Resistance to Tobacco mosaic virus. Frontiers in Plant Science. 9 (411), (2018).
  67. Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 389 (6651), 553 (1997).
  68. Li, C., et al. A cis Element within Flowering Locus T mRNA Determines Its Mobility and Facilitates Trafficking of Heterologous Viral RNA. Journal of Virology. 83 (8), 3540-3548 (2009).
  69. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).
  70. Varkonyi-Gasic, E., Hellens, R. P. RNAi and Plant Gene Function Analysis: Methods and Protocols. Kodama, H., Komamine, A. , Humana Press. 145-157 (2011).
  71. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., Hellens, R. P. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods. 3 (1), 12 (2007).
  72. Varkonyi-Gasic, E. Plant Epigenetics: Methods and Protocols. Kovalchuk, I. , Springer US. 163-175 (2017).
  73. Czimmerer, Z., et al. A Versatile Method to Design Stem-Loop Primer-Based Quantitative PCR Assays for Detecting Small Regulatory RNA Molecules. PLoS One. 8 (1), 55168 (2013).
  74. Dai, X., Zhuang, Z., Zhao, P. X. psRNATarget: a plant small RNA target analysis server (2017 release). Nucleic Acids Research. 46 (1), 49-54 (2018).
  75. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  76. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  77. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  78. Todesco, M., Rubio-Somoza, I., Paz-Ares, J., Weigel, D. A Collection of Target Mimics for Comprehensive Analysis of MicroRNA Function in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics. 6 (7), 1001031 (2010).
  79. Franco-Zorrilla, J. M., et al. Target mimicry provides a new mechanism for regulation of microRNA activity. Nature Genetics. 39 (8), 1033-1037 (2007).
  80. Jiang, N., et al. Tomato lncRNA23468 functions as a competing endogenous RNA to modulate NBS-LRR genes by decoying miR482b in the tomato-Phytophthora infestans interaction. Horticulture Research. 6 (1), 28 (2019).
  81. Ivashuta, S., et al. Regulation of gene expression in plants through miRNA inactivation. PLoS One. 6 (6), 21330 (2011).
  82. Reichel, M., Li, Y., Li, J., Millar, A. A. Inhibiting plant microRNA activity: molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable efficacies against target microRNAs. Plant Biotechnology Journal. 13 (7), 915-926 (2015).
  83. Wong, G., Alonso-Peral, M., Li, B., Li, J., Millar, A. A. MicroRNA MIMIC binding sites: Minor flanking nucleotide alterations can strongly impact MIMIC silencing efficacy in Arabidopsis. Plant Direct. 2 (10), 00088 (2018).
  84. Paschoal, A. R., Lozada-Chávez, I., Domingues, D. S., Stadler, P. F. ceRNAs in plants: computational approaches and associated challenges for target mimic research. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1273-1289 (2018).
  85. Faivre-Rampant, O., et al. Potato Virus X-Induced Gene Silencing in Leaves and Tubers of Potato. Plant Physiology. 134 (4), 1308-1316 (2004).
  86. Zhao, J., et al. Virus-Induced Gene Silencing in Diploid and Tetraploid Potata Species. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  87. Leisner, C. P., et al. Genome sequence of M6, a diploid inbred clone of the high-glycoalkaloid-producing tuber-bearing potato species Solanum chacoense, reveals residual heterozygosity. The Plant Journal. 94 (3), 562-570 (2018).
  88. Aversano, R., et al. The Solanum commersonii Genome Sequence Provides Insights into Adaptation to Stress Conditions and Genome Evolution of Wild Potato Relatives. The Plant Cell. 27 (4), 954-968 (2015).
  89. The Potato Genome Sequencing, C. et al. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature. 475, 189 (2011).
  90. Navarro, C., et al. Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478 (7367), 119-122 (2011).
  91. Lehretz, G. G., Sonnewald, S., Hornyik, C., Corral, J. M., Sonnewald, U. Post-transcriptional Regulation of FLOWERING LOCUS T Modulates Heat-Dependent Source-Sink Development in Potato. Current Biology. 29 (10), 1614-1624 (2019).
  92. Natarajan, B., et al. MiRNA160 is associated with local defense and systemic acquired resistance against Phytophthora infestans infection in potato. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 2023-2036 (2018).
  93. Li, F., et al. MicroRNA regulation of plant innate immune receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1790-1795 (2012).
  94. Weiberg, A., et al. Fungal Small RNAs Suppress Plant Immunity by Hijacking Host RNA Interference Pathways. Science. 342 (6154), 118-123 (2013).
  95. Huang, C. -Y., Wang, H., Hu, P., Hamby, R., Jin, H. Small RNAs - Big Players in Plant-Microbe Interactions. Cell Host, Microbe. 26 (2), 173-182 (2019).
  96. Shahid, S., et al. MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs. Nature. 553 (7686), 82-85 (2018).
  97. Weiberg, A., Jin, H. Small RNAs-the secret agents in the plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology. 26, 87-94 (2015).

Tags

Çevre Bilimleri Sayı 159 virüs bazlı mikroRNA susturma (VbMS) patates virüsü X (PVX) mikroRNA (miRNA) hedef mimik (TM) kısa tandem hedef mimikleri (STTM'ler) Sodyum tuberosum
Patates virüsü X bazlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J.… More

Zhao, J., Rios, C. G., Song, J. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.. J. Vis. Exp. (159), e61067, doi:10.3791/61067 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter