Summary
نقدم نموذج مرض الأوعية الدموية في المختبر للتحقيق في تفاعلات الدم بالكامل مع الـ endothelium المشتق من المريض. يسمح هذا النظام بدراسة خصائص المخثّات المخيّخة للخلايا البطانية الأولية في ظل ظروف مختلفة. وهذه الطريقة مناسبة بشكل خاص لتقييم التجلط الموضعي والعلاج من التخثر خلال مراحل مختلفة من التخثر.
Abstract
ينطوي تكوين جلطات الدم على تفاعلات معقدة بين الخلايا البطانية والمصفوفة الأساسية وخلايا الدم المختلفة والبروتينات. إن بطانة الغدد هو المصدر الرئيسي للعديد من الجزيئات الهفوستية الرئيسية التي تتحكم في تجميع الصفائح الدموية والتخثر والتحلل. على الرغم من أن آلية تجلط الدم قد تم التحقيق فيها لعقود، والدراسات في المختبر تركز أساسا على حالات تلف الأوعية الدموية حيث يحصل على كشف المصفوفة تحت الغدد الصماء، أو على التفاعلات بين الخلايا مع مكونات الدم واحد. تسمح طريقتنا بدراسة التفاعلات بين الدم كله وشبكة خلايا الأوعية الدموية السليمة.
من خلال استخدام الخلايا البطانية البشرية الأولية ، يوفر هذا البروتوكول فرصة فريدة لدراسة تأثير الخلايا البطانية على ديناميكيات الخثرة ويعطي رؤى قيمة في الفيزيولوجيا المرضية من الأمراض الخثارية. استخدام قنوات تدفق microfluidic حسب الطلب يسمح تطبيق هندسات الأوعية الدموية محددة المرض ونموذج تغييرات الأوعية الدموية المورفولوجية محددة. يتم تسجيل تطوير خثرة في الوقت الحقيقي وتتميز كميا التصاق الصفائح الدموية وترسب الفيبرين. يتم تحديد تأثير وظيفة البطانية في ديناميات الخثرة المعدلة عن طريق ما بعد التحليل من خلال تلطيخ الفلوروس المناعي لجزيئات محددة.
تصف النتائج التمثيلية الإعداد التجريبي، وجمع البيانات، وتحليل البيانات. اعتمادا على سؤال البحث، يمكن تعديل المعلمات لكل قسم بما في ذلك نوع الخلية، ومعدلات القص، وهندسة القناة، والعلاج الدوائي، وإجراءات ما بعد الكلى. يتم التحقق من صحة البروتوكول عن طريق تحديد كمي تشكيل خثرات على endothelium الشريان الرئوي من المرضى الذين يعانون من مرض الجلطات الدموية المزمن.
Introduction
يشكل endothelium الطبقة الخلوية الداخلية من الأوعية الدموية ويفصل الدم عن الأنسجة المحيطة. وقد وصفت بأنها جهاز ديناميكي ينظم بنشاط بيئتها الدقيقة ويستجيب للمحفزات الخارجية1. بسبب اتصالها المباشر مع تدفق الدم، و endothelium هو محوري في السيطرة على الهفوات والتخثر وهو المصدر الرئيسي للعديد من الجزيئات التنظيمية الرئيسية التي تتحكم في تجميع الصفائح الدموية، والتخثر، وتحلل2. خلايا البطاحلية صحية وغير معطلة (EC) تنتج عدة جزيئات التي تتصدى لتنشيط الصفائح الدموية ومنع التخثر وتشكيل الخثرة للحفاظ على تدفق الدم، مثل prostacyclin، الجلطات مودولين، أو مثبطات مسار عامل الأنسجة (TFPI)2،3. وهذا يمنع التصاق الصفائح الدموية، وتجميع الصفائح الدموية، وتشكيل خثرات. إصابة أو تنشيط جدار السفينة النتائج في النمط الظاهري الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد التي تبدأ التصاق الصفائح الدموية المترجمة وتشكيل جلطة2,4. عند الصفائح الدموية التنشيط endothelial تلتزم فون ويلبراند Factor (VWF)، وهو بروتين متعدد اميركات صدر من ECs، أو إلى مواقع الربط المكشوفة للمصفوفة تحت الغدد الصماء الأساسية. في وقت لاحق، والتغيرات الجزيئية في الصفائح الدموية والتعرض لعوامل الأنسجة (TF) بدء تفعيل نظام التخثر، الذي يحفز تشكيل خثرة بواسطة البلمرة الفيبرين5،6. معا، والجلطة الناتجة يوفر الأساس لإغلاق الجرح عن طريق إعادة endothelialization7. قد تؤدي اضطرابات نظام التخثر إلى اضطرابات نزيف ، مثل مرض فون ويليبراند ، الهيموفيليا ، أو تجلط الدم ، التي غالبًا ما تنتج عن توازن متوازن ومضاد التشنج في المسار الهتمى البطاريجي2،3.
تحدث عملية الهباس في الدورة الدموية الشريانية والريدية. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة الكامنة في تجلط الشرايين والوريع مختلفة جذريا. بينما تجلط الشرايين، كما رأينا في مرض القلب الإقفائي، هو في الغالب مدفوعة بتمزق البلاك تصلب الشرايين في ظل ظروف من الإجهاد القص عالية، الخثار الوريدي يتطور في الغالب في غياب إصابة البطانية في حالة ركود8،9،10. قد تصمام خثرة الوريد العميق وتنتقل نحو الشرايين الرئوية، حيث تسبب انسداد رئوي. وهذا يمكن أن يؤدي إلى انسداد الأوعية الدموية المزمنة مما يؤدي إلى ضعف كبير القدرات الوظيفية التي قد تعزز تطور أمراض الرئة chonic بما في ذلك تطوير ارتفاع ضغط الدم الرئوي المزمن الجلومبومبولي (CTEPH)11,12,13,14. يتميز CTEPH بارتفاع الضغط الرئوي بسبب انسداد الشرايين الرئوية بواسطة مادة خثارية بعد ثلاثة أشهر على الأقل من العلاج باتخثر15. بالإضافة إلى خمولي الرئة، فمن المسلم به أن البطين الرئوي يوفر بيئة البروثرمومبوتيك في CTEPH التي تسهل في الموقع تخثر وانسداد الشرايين الرئوية المزمنة، مما تسبب في زيادة في ضغط الدم التي يمكن أن تؤدي في نهاية المطاف إلى فشل القلب، إذا لم تعالج16،17.
على مدى السنوات الماضية، أدت دراسات مختلفة إلى تطوير المقايسات لفحص تشكيل خثرات من خلال قياس وظيفة الصفائح الدموية والتخثر18. ومع ذلك، معظمهم إما دراسة تفاعل الدم كله مع مكونات مصفوفة خارج الخلية واحد مثل الكولاجين أو الفيبرين، أو وظيفة البطانية في التفاعل مع مكونات الدم واحد، مثل البطانية الصفائح الدموية أو التفاعل البطانية الكريات البيض19،20،21،22. هذه الأقوال هي الأكثر شيوعاً مع الخلايا الوريدية الوريدية (HUVEC)، كما يتم الحصول على هذه الخلايا بسهولة. ومع ذلك، يتم التعبير عن الجينات هيمستيك بشكل تفاضلي عبر شجرة الأوعية الدموية، وأنواع الأوعية، وأنظمة الجهاز23،24، مما يجعل استخدام HUVECs لتمثيل الخلايا البطانية المشاركة في تجلط الشرايين أو الانسداد الرئوي إشكالية23.
بالإضافة إلى اللدونة EC، يمكن أن تعزز التعديلات والمتغيرات في رفرف الأوعية الدموية في الدمانية الخاصة بالأمراض تشكيل الخثرة في الـ endotheliumالعادي 25. معدلات القص الأعلى، بسبب تضيق الأوعية المحلية أو التغيرات في هندسة السفينة، على سبيل المثال، قد يؤدي إلى تشكيل الخثارة الحادة، مما تسبب في تضيق أن يسرع وقف تدفق الدم26. استخدام قنوات تدفق microengineered حسب الطلب يسمح لتصميم على وجه التحديد هندسات الأوعية الدموية التي تمثل البيولوجيا (patho). وبهذه الطريقة، فمن الممكن لدراسة تأثير القوى البيوميكانيكية المحلية على صحية أو المرضى EC27.
هناك علاجات التخثر المتاحة لاستهداف مراحل وجزيئات مختلفة في سلسلة التخثر، والتي تشكل جميعها مخاطر وفوائد خاصة يمكن أن تكون محددة لبعض الاضطرابات. إن نهج نمّجة المرض الموصوف في هذه الورقة مناسب بشكل خاص لاختبار آثار مضادات التخثر المختلفة والعلاجات المضادة للصفيحات على ديناميكيات الخثرة.
والهدف من ذلك هو تقديم نموذج من تجلط الدم الذي يشمل اللجان الإلكترونية الأولية، مما يؤدي إلى نموذج متعدد الاستخدامات مناسب لتحليل مختلف أشكال الخثار حسب نوع اللجان الإلكترونية الأولية المستخدمة. وكمثال على ذلك، استخدمنا الخلايا البطاية الشريانية الرئوية من مرضى CTEPH في التفاعل مع الدم البشري كله التي تحتوي على جميع المكونات المشاركة في تشكيل خثرة (الصفائح الدموية، الكريات البيض، كريات الدم الحمراء، البروتينات التخثر، والمحسنات). ويمكن تطبيق هذا النهج في قنوات التدفق الموازي التجارية أو في قنوات التدفق المجهرية المصنوعة خصيصاً مع تصميم خاص للأوعية الدموية. على هذا النحو، يمكن استخدام النموذج في نهاية المطاف في دراسة تشكيل الخثرة والقرار، لتقييم الاستجابات الالتهابية في نميطة المرض، لعلاج مضاد القشرة أو مضادات التخثر، وفي نهاية المطاف للطب الشخصي.
تصف هذه الدراسة عزل الخلايا البطانية الشريانية الرئوية الأساسية. لعزل أنواع الخلايا البطانية البشرية الأساسية الأخرى، نشير إلى الأساليب المنشورة سابقا، بما في ذلك الخلايا البطانية البطانية الدقيقة الأوعية الدموية الرئوية25، الخلايا البطانية الوريدية البشرية28، والدم تعميم مستعمرة البطانية تشكيل الخلايا الشكل 1A29.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة الأخلاقية الطبية المؤسسية للمركز الطبي VU أمستردام، هولندا (METC VUmc، NL69167.029.19). تم عزل الخلايا الأولية وجمع الدم للمواد البشرية بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة وفقا لإعلان هلسنكي.
1. العزلة وثقافة الإنسان الأساسي الخلايا البطاية الشريانية الرئوية (PAEC)
- دافئة كامل بطانةية المتوسطة (cECM) تكملها 5٪ مصل الأبقار الجنين (FBS), 1% البنسلين / ستريبتوميسين (P/ S), 1% مكملات نمو الخلايا البطانية (ECGS), و 1% الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA), في حمام مائي في 37 درجة مئوية. تعقيم مقص الجراحية، ملقط، ومشرط مع إما 120 درجة مئوية معقم للحرارة أو 70٪ الإيثانول. تنفيذ عزل PAEC في خزانة تدفق المفارز في ظل ظروف معقمة.
- معطف خلية تقارب عالية ربط 60 ملم طبق ثقافة الخلية (انظر جدول المواد)مع 2 مل من 5 ميكروغرام / مل fibronectin واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- الحصول على نسيج الشريان الرئوي (PA) من الجراحة(على سبيل المثال، استئصال الفص أو استئصال الرحم الرئوي) ، وتخزينه في عازلة الحبل البارد 4 °C (4 mM كلوريد البوتاسيوم ، 140 mM كلوريد الصوديوم ، 10 mM HEPES ، 11 mM D -glucoss ، و 1 ٪ P / S ، pH = 7.3) ، والحفاظ على الجليد حتى العزل.
- عزل الخلايا البطانية من السلطة الفلسطينية داخل 2 ح بعد إزالة الأنسجة. خذ السلطة الفلسطينية مع ملقط ووضعها في طبق بيتري 10 سم لغسل مع برنامج تلفزيوني. إذا كانت السلطة الفلسطينية لا تزال حلقة، وقطع الشريان الرئوي مفتوحة مع مقص. كن حذرا جداً لعدم لمس الطبقة الأعمق من السفينة مع الأدوات، كما هو معطوب بسهولة endothelium و / أو إزالتها.
- إزالة الليفية من طبق ثقافة الخلية وإضافة 4 مل من cECM المتوسطة.
- خذ أنسجة السلطة الفلسطينية مع ملقط ووضعها في الوسط. وفي الوقت نفسه، كشط بعناية الطبقة الداخلية من السفينة في المتوسط مع مشرط. في كثير من الأحيان، يمكن رؤية تراكمات الدهون في جدار السفينة. محاولة حذف هذه، لأنها سوف تؤثر على الخلايا خارج.
- الحفاظ على الخلايا في الثقافة حتى المستعمرات الصغيرة من الخلايا البطانية تبدأ في الظهور.
- استبدل الوسط كل يومين. إذا الليفية تلوث الثقافة، تنقية مع فصل الخلية تقارب المغناطيسي لD144 مع مجموعة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). استخدم طريقة العمودين للتنقية الأولية وطريقة العمود الواحد لكل تنقية متتالية. عموما، يتم تعريف ثقافة نقية عندما يكشف تدفق الخلايا الخلايا الملوثة ≤10٪.
- انقسام الخلايا في نسب 1:3 إلى 1:4 حتى تتم زراعة PAECs كافية للاستخدام التجريبي. عندما تكون PAECs جاهزة للاستخدام، تابع الخطوة التالية.
- بعد تنقية, الخلايا البطانية الأولية تحتاج إلى أن تتميز لوجود علامات محددة EC(على سبيل المثال,VE-cadherin, CD31, TIE2) ولعداد خلايا العضلات الملساء (α-SMA), الخلايا الليفية (فيمنتين), والظهارية (السيتوكيراتين) علامات(الشكل 1B).
2. إعداد غرف التدفق وpaec monolayers
ملاحظة: اعتماداً على الفرضية، استخدم إما غرف التدفق المتوفرة تجارياً (راجع جدول المواد والشكل 1الخيار C A،الخطوة 2.1 من البروتوكول) أو غرفة تدفق microfluidic مخصصة الصنع (الشكل 1C الخيار B، الخطوة 2.2 من البروتوكول).
- بذر الخلية من أحادية البطاين في الانهيارات الصغيرة المتاحة تجاريا
ملاحظة: غرف التدفق المتوفرة تجارياً سهلة الاستخدام وتوفر نمط تدفق لامينر في جميع أنحاء القناة التي يمكن استخدامها بمعدلات القص العالية. تم تصميم هذه الانهيارات الصغيرة للسماح بتشغيل متوازية متعددة القنوات وتوفير ملف تعريف تدفق دقيق ويمكن إعادة إنتاجه. نظرًا لأنها محسنة للمجهر المقلوب ، فمن الممكن التقاط صور فلورية عالية الجودة. وعلاوة على ذلك، تتوفر أبعاد مختلفة من غرف التدفق في أحجام أو هندسات مختلفة للقناة. ويفضل قنوات تدفق 6-جيدا لهذا الفحص لأن هذه الانهيارات الصغيرة لها أبعاد صغيرة والسماح multiparallel يعمل.- لمعطف قناة واحدة من شريحة تدفق 6-جيدا (3.5 مم عرض × 0.4 مم ارتفاع × 17 مم) استخدام 30 ميكرولتر من 0.1٪ الجيلاتين لكل قناة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- لذرية قناة واحدة، التربسينيزي 10 سم2 من PAECs اخلط وتدور في 300 × ز لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- تعليق PAECs في 600 ميكرولتر من cECM والماصات 100 ميكرولتر (1.5 سم2) من تعليق الخلية في قناة واحدة. وهذا يغطي الانهيارات الصغيرة من خلال عمل الشعيرات الدموية. إذا كان يجري بطيئة جدا، وسوف تشكل فقاعات الهواء. تجنب تشكيل فقاعات الهواء باستخدام قوة أكثر قليلا عندما pipetting.
ملاحظة: تؤثر كثافة الخلايا على النمط الظاهري endothelial. يبلغ إجمالي 1.5 سم2 من الخلايا المُتقَدّة لكل قناة قدرة على الإفراط في الوفرة، لأن القناة لديها مساحة 0.6 سم2. قبل البدء في التجربة، ثقافة هذه الخلايا لمدة 6 أيام أخرى داخل القنوات حتى تصل إلى أقصى حد التقاء. - إضافة 50 ميكرولتر إضافية من cECM إلى القناة لتوفير وسيلة كافية للحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. تغيير المتوسطة في اليوم التالي لغسل الخلايا غير المنضمة.
- إبقاء الخلايا في الثقافة لمدة 6 أيام في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 للسماح لPAEC لتشكيل شركة، monolayer التقاء. تغيير المتوسط كل يومين مع 150 ميكرولتر من cECM.
- في اليوم 7، وعلاج PAEC مع 100 ميكرولتر من 1 μM الهستامين في ECM و 1٪ FBS دون أي إضافات أخرى لمدة 30 دقيقة قبل الفحص. يمكن اختيار التحفيز إعلان libitum. على سبيل المثال ، تم استخدام TNF-α بشكل شائع كمنشط التهابي.
- إعداد غرف تدفق ميكروفلويديك حسب الطلب
ملاحظة: يتم تكييف غرف تدفق مصنوعة حسب الطلب لاحتياجات المستخدم لأنه يمكن تغيير الأبعاد و هندستها بسهولة إلى تفضيل. على سبيل المثال، لتقليد وعاء أكثر ذات صلة من الناحية الفسيولوجية، يمكن إدخال تضيق(الشكل 1D). يسمح هذا النهج باستخدام كميات صغيرة جدا من الدم كما رأينا في الأمراض الوعائية الدقيقة.- الطباعة الحجرية لينة من بوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS) باستخدام رقائق منقوشة
- الجمع بين عامل علاج PDMS وpopolymer على الثقل الدقيق في نسبة 1:10 وخلط شامل مع خلاط مختبر الغرض العام.
- لإزالة فقاعات الهواء الناتجة، degas PDMS في جهاز اجست لحوالي 1 ساعة.
- خط طبق بيتري الزجاج مع رقائق الألومنيوم وإضافة بضع قطرات من الماء قبل وضع رقاقة في طبق بيتري اصطف. الويفر بمثابة القالب للقناة حسب الطلب.
ملاحظة: يتم توفير الرقاقة أو القوالب من خلال مرافق الغرفة النظيفة. يتم نقش ضوئيات سلبية على رقائق لخلق ملامح جاحظ مثل قناة مع الأبعاد النموذجية التالية: عرض 300 ميكرومتر × 270 μm الارتفاع × 14 مم طول. - صب PDMS دي الغاز على رقاقة وضعت في طبق بيتري الزجاج.
- ديغا وPMS سكب على رقاقة في جهاز ادمى لمدة 15 دقيقة إضافية لإزالة أي فقاعات التي قد تكون تشكلت أثناء الصب.
- إزالة طبق بيتري تحتوي على العفن وDMS من مجفف وضعه في فرن 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعة كحد أدنى لربط عبر PDMS.
- إعداد نظام إدارة المباني المشتركة للترابط مع الشرائح الزجاجية
- إزالة العفن وPMS عبر المرتبطة من الفرن والانتقال إلى غطاء محرك السيارة عبر تدفق للمعالجة خالية من الغبار من PDMS.
- إزالة أي PDMS من الجزء السفلي من القالب باستخدام مشرط وإزالة لوح أعلى من PDMS عبر مرتبطة من القالب.
- خط لوح PDMS المنقوشة المكشوفة مع شريط لاصق لمنع أي جزيئات الغبار أن تأتي في اتصال مع قنوات PDMS.
- قطع رقائق PDMS إلى حجم ولكمة مداخل قطرها 1 مم ومنافذ باستخدام لكمة خزعة.
- التعقيم والترابط من قنوات PDMS microfluidic والشرائح الزجاجية
- تنظيف شرائح المجهر الزجاج عن طريق الشطف بدقة مع الإيثانول تليها شطف الكحول ايزوبروبيل. بعد كل شطف، يجف جيدا الشرائح مع بندقية النيتروجين.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن استخدام زلات الغطاء إذا تم إجراء التحليل باستخدام مجهر اإلداعي. - افتح غرفة البلازما وحمّل شرائح المجهر المُنظفة ورقائق microfluidic بدون الشريط الواقي.
- أغلق الغرفة، واطهر بالنيتروجين لمدة دقيقة، وملأ الغرفة بالهواء المصفى حتى يتم الوصول إلى ضغط 500 mTor.
- عرض الشرائح الزجاجية ورقائق PDMS إلى البلازما لمدة 40 ثانية باستخدام قوة 50 واط وتردد 5 كيلوهرتز.
- بعد التعرض إلى البلازما، السندات على الفور الشرائح الزجاجية ورقائق microfluidic. تخزين الأجهزة في أطباق بيتري العقيمة.
- تنظيف شرائح المجهر الزجاج عن طريق الشطف بدقة مع الإيثانول تليها شطف الكحول ايزوبروبيل. بعد كل شطف، يجف جيدا الشرائح مع بندقية النيتروجين.
- الطباعة الحجرية لينة من بوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS) باستخدام رقائق منقوشة
- بذر الخلية من monolays البطانية في القنوات microfluidic
- معطف microchannel حسب الطلب عن طريق pipetting 10 ميكرولتر من 0.1 ملغ / مل الكولاجين نوع الأول أو 0.1٪ الجيلاتين لكل قناة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- لذرية أربعة microchannels، trypsinize 25 سم2 من PAECs اخلط وتدور في 300 × ز لمدة 7 دقائق في RT.
ملاحظة: نسبة صغيرة فقط من الخلايا سوف تلتزم السطح. لذلك ، من الضروري استخدام فائض من الخلايا لتحقيق أحادية الطبقات. - تعليق PAECs في 20 ميكرولتر من cECM واستخدام 5 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل قناة. بسبب أبعاد القناة الصغيرة، سوف تملأ قوات الشعيرات الدموية الانهيارات الدقيقة وتمنع تشكيل فقاعة الهواء.
- تغيير المتوسطة بعد 3-4 ح لغسل الخلايا غير المنضمة.
- إبقاء الخلايا في الثقافة لمدة 6 أيام للسماح لPAEC لتشكيل شركة، monolayer التقاء. بسبب حجم صغير، وتغيير المتوسطة كل يوم مع 150 ميكرولتر من cECM. اتركي طرف الماصات مملوءًا بالوسيطة في المدخل ووضعي طرفًا فارغًا في المأخذ. وسيكون ذلك بمثابة خزان يوفر ما يكفي من العناصر الغذائية وعوامل النمو للخلايا ويمنع الشريحة من الجفاف.
- في اليوم 7، وصمة عار النوى في الخلايا الحية مع Hoechst (1:5،000 في cECM) واحتضان لمدة أقصاها 10 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- غسل بعناية 3x مع cECM وعلاج مع 1 μM الهستامين في ECM + 1٪ FBS لمدة 30 دقيقة قبل الفحص. يمكن اختيار التحفيز إعلان libitum. على سبيل المثال ، تم استخدام TNF-α بشكل شائع كمنشط التهابي.
- استخدام 1.27 مم قطرها 90 درجة موصلات الفولاذ المقاوم للصدأ الزاوية لتوصيل منفذ رقائق PDMS إلى أنابيب.
3. إعداد الدم كله البشري
- سحب الدم الوريدي من المواضيع في 0.109 M الصوديوم citrate مضاد التخثر. يمكن أن يكون هذا من أشخاص صحي أو مرض لا يتلقون علاجًا لتخثر التخثر. عكس بلطف الأنابيب لخلط. يعتمد إجمالي كمية الدم المطلوبة لتجربة ما بشكل رئيسي على معدل التدفق المحدد. مع معدل تدفق 25 مل / ساعة، في الشرائح 6-جيدا إبيدي، وحجم إجمالي 2 مل مع القليل من الفائض لملء أحواض المياه وتدفق قناة كافية.
- نقل الدم إلى أنبوب 50 مل وإضافة Calcein AM (1:10،000) إلى تسمية خلايا الدم fluorescently و Alexa488-fibrinogen (15 ميكروغرام / مل) إلى الفيرينوجين التلقائي. دع الدم يحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بالامتصاص الكامل.
- تخفيف الدم 1:1 مع عازلة إعادة التكليس (154 mM كلوريد الصوديوم، 10.8 mM سيترات ثلاثي الصوديوم، 2.5 mM كلوريد الكالسيوم، و 2 mM كلوريد المغنيسيوم) مباشرة قبل بدء التجربة.
ملاحظة: لم يؤثر Hemodilution بحد أقصى 50% على وقت رد فعل التخثر30. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يحتوي الدم البشري على فيروسات وعوامل أخرى. ولذلك فإن العمل مع عينات الدم ينطوي على خطر الإصابة. ويوصى بشدة باستخدام تدابير السلامة المناسبة والتعامل مع المواد بعناية.
4. تجميع نظام التدفق
- قبل توصيل الأنبوب، شطف أنابيب التدفق مع حقنة 20 مل مليئة العازلة غسل (36 mM حمض الستريك، 103 mM كلوريد الصوديوم، 5 mM كلوريد البوتاسيوم، 5 mM EDTA، و 0.35٪ wt/vol بولفين مصل الألبومين [BSA]، pH = 6.5) لمنع تخثر الدم في الأنابيب.
- استخدام حقنة جديدة لملء أنابيب تدفق مع العازلة HEPES (132 mM كلوريد الصوديوم، 20 mM HEPES، 6 mM كلوريد البوتاسيوم، 1 mM كلوريد المغنيسيوم، 1٪ BSA، و 5.5 M D-الجلوكوز، درجة حِس = 7.4) وربط بعناية مع موصل لور على شكل مرفق إلى الميكروسلي المليء بـ EC في المتوسط. أثناء إرفاق الموصلات إلى القنوات الصغيرة ، حاول منع تشكيل أي فقاعات الهواء في الشريحة. سوف فقاعات الضرر endothelium وتؤثر على نتائج تجربتك. إزالة مخزن الغسيل تماما ولا تدع المخزن المؤقت في الحصول على اتصال مع الخلايا، وهذا سوف يمنع التخثر.
- إعداد نظام التدفق كما هو موضح في الشكل 1E. تناول 2 مل من عازلة غسل في حقنة 20 مل وشطف لمنع تخثر الدم عندما يدخل الحقنة. أدخل الحقنة الفارغة في مضخة الحقنة وربط أنبوب المنفذ بموصل Luer أنثى بهذه الحقنة. وضع أنبوب مدخل في وعاء يحتوي على الدم البشري المعد.
- التبديل على مضخة حقنة وحساب معدل التدفق. تتبع ملفات تعريف التدفق نمطاً مكافئاً في الارتفاع. على افتراض أن الدم يعمل بمثابة السائل نيوتن، واستخدام الصيغة التالية لحساب معدل التدفق.
(المعادلة 1)
حيث
τ = إجهاد القص
η = لزوجة ديناميكية
Q = معدل التدفق الحجمي
h = ارتفاع القناة
ث = عرض القناة
ملاحظة: بالنسبة لتدفق الشرايين الرئوية مع الدم في الانهيارات الصغيرة التجارية 6 قناة ذات أبعاد مستطيلة مع 0.4 مم وارتفاع 3.5 مم، تم استخدام معدل تدفق حجمي من 25 مل / ساعة لمدة 5 دقائق. نظرًا للاختلافات في أبعاد قنوات التدفق المخصصة، ستتغير هذه الديناميكيات أيضًا. اضبط المتغيرات للتأكد من أن إجهاد القص يساوي. - تحديد قطر حقنة 20 مل إلى 19.05 ملم وتعيين البرنامج لسحب. سحب الدم من خلال قناة المغلفة بالخلايا عن طريق تطبيق الضغط السلبي يضمن معدلات القص المستمرة والحد الأدنى من الضرر لطبقة الخلية.
(المعادلة 1)
5. إعداد المجهر للحصول على صورة
- استخدام الهدف 20x ووضع microslide على خشبة المسرح من المجهر الفلورسنت المرحلة المقلوبة التباين. بدء تشغيل برنامج المجهر لتحريك المرحلة في اتجاه Z للتركيز على monolayer الخلية.
- حدد منطقة ذات أهمية (ROI) في بداية كل قناة تدفق ووسطها ونهايةها. يجب أن تكون البداية والنهاية على الأقل 3 مم بعيدا عن مدخل ومخرج القناة. قم بتعيين مرشحات الفلورسنت الزرقاء والأخضرة والأحمرة مع قوة ليزر وكثافة ضوء تظهر الحد الأدنى من الخلفية.
6. سفك الدم كله على PAECs
- بعد كل شيء متصل كما هو الحال في الشكل 1E والمجهر جاهز للتسجيل، ودفع ابدأ لتسجيل الفيديو. دفع ابدأ على مضخة حقنة لنفخ الدم على بطانة الغدد.
- بمجرد أن يبدأ الدم يتدفق على بطانة الغدد، الحصول على الصور مع القنوات النشطة المنتخبة مسبقا ومواقف العائد على الاستثمار كل 15 ثانية لمدة 5 دقائق.
- بعد 5 دقيقة من perfusion، والانتهاء من تسجيل ووقف مضخة حقنة. تفكيك غرفة تدفق وإزالة بعناية شديدة الأنابيب. في كثير من الأحيان، سوف تتشكل فقاعة الهواء إذا كان ذلك يتم مع الكثير من القوة. في محاولة لمنع هذا، لأن هذا سوف طرد endothelium.
7. التثبيت وما بعد التحليل
ملاحظة: لاستبعاد التصاق الصفائح الدموية الإيجابية الكاذبة عن طريق الضرر البطيني بسبب تجربة التسريب ، من الضروري تحديد خصائص الخلايا البطانية لتشكيل الفجوة والطبقات الأحادية. ويمكن القيام بذلك عن طريق تلوين المناعة العادية ل VE-cadherin.
- بعد التسريب وتفكيك الأنابيب، وغسل قناة microfluidic مع HEPES. الماصات HEPES في القناة بحيث أنه سيتم دفع الدم إلى منفذ. إزالة الزائدة مع ماصة أخرى.
- اختياريا، وغسل القناة مع برنامج تلفزيوني++ (مع 0.5 mM كلوريد المغنيسيوم و 0.9 mM كلوريد الكالسيوم) لمنع هطول الأمطار من البروتين الفائق. هذا يقلل الخلفية. ومع ذلك، يمكن أن تؤدي خطوة الغسيل الإضافية إلى تغيير السلوك الخلوي والمورفولوجيا التي يمكن أن تؤثر على التصوير بعد التحليل.
- إزالة HEPES وإصلاح endothelium مع الصفائح الدموية الملتزم بها والفيبرين المودعة عن طريق الأنابيب 37 درجة مئوية تدفئة 4٪ شبهformaldehyde (PFA) في القناة واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
ملاحظة: كن حذراً إضافية عند إصلاح microfluidics حسب الطلب كما تكون هذه القنوات أصغر، مما يؤدي إلى ارتفاع قوات القص في القناة أثناء كل خطوة معالجة. - إزالة PFA من القناة وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني. microslides هي الآن على استعداد لبروتوكول تلطيخ القياسية لتوصيف علامات الخلايا البطانية مثل VE-cadherin، CD31، P-selectin أو integrins، CD42b للصفائح الدموية الملتموجة، أو CD45 للوريث البيض.
- بعد تلطيخ، تأخذ ما لا يقل عن خمس صور مع المجهر confocal العادية لتوصيف الكولوكية.
8. تحليل الصور
- افتح صورة فحص التدفق التي تحتوي إما على الصفائح الدموية المسماة بالفلورسنت أو الليفين الفلورسنت في ImageJ. اسحب الصورة التي تختارها إلى ImageJ.
- يتم التقاط الصورة بلون RGB. للتحليل، يفضل صورة 8 بت، لذلك تحويل الصورة إلى 8 بت: صورة | نوع | 8 بت.
- لتقليل الخلفية، قم بطرحها باستخدام القطع المكافئ المنزلق، حيث تقوم كرة المتداول بحساب وحدات البكسل الخلفية وطرحها من الصورة الأصلية: العملية | طرح الخلفية | نصف قطر الكرة المتداول = 50 بكسل | انزلاق Paraboloid.
ملاحظة: يتم تعريف حجم الصورة بالبكسل. ومع ذلك ، لقياس المجال ، من الضروري وضع الجدول. عندما يتم التقاط الصور مع هدف 20x مع فتحة رقمية من 0.45، المجهر يكون مقياس 2 بكسل لكل ميكرومتر. في معظم الأحيان يتم تخزين المعلومات اللازمة لتعيين مقياس في البيانات الوصفية للصورة ويمكن استخدامها تلقائيا من قبل ImageJ: تحليل | تعيين مقياس. - تعيين عتبة لتحديد الصفائح الدموية الملتزم بها أو الليفين المودعة. استخدام طريقة المثلث وسوف عتبة ضبط تلقائيا: صورة | ضبط | الحد الأدنى.
- تحليل المنطقة التي تغطيها الصفائح الدموية أو الفيبرين مع الأمر تحليل الجسيمات. ضبط حجم في 2-اللانهاية، كما حجم الحد الأدنى من الصفائح الدموية هو 2 μm: تحليل | تحليل الجسيمات.
- وستتيح النتائج المساحة الإجمالية في μm2، مع متوسط حجم المجاميع في μm2 والنسبة المئوية للمنطقة المغطاة.
Representative Results
يمكن تقسيم النتائج التمثيلية إلى ثلاثة أجزاء، يمثل كل منها الخطوات الخاصة بالإعداد التجريبي، وجمع البيانات، وتحليل البيانات. اعتمادا على سؤال البحث، يمكن تغيير المعلمات لكل خطوة. يتم تطبيق البيانات المعروضة لدراسة تأثير بطانة الغدد اللواء على تشكيل الخثرة.
الإعداد التجريبي
ومن الثابت أن الخلايا البطانية غير متجانسة للغاية في الهيكل والوظيفة ، اعتمادا على الموقع والوقت ، أثناء الصحة والمرض23. يمكن استخدام مصادر مختلفة من الخلايا البطانية لدراسة التفاعل بين الدم البطانية، والتي كانت في هذه الحالة هي الـ HUVECs و PAECs(الشكل 1A). وكانت مراكز الوفيات الناجمة عن السرطان هي الأكثر شيوعاً في النماذج المختبرية، في حين أن خلايا الـ PAECs هي خلايا معزولة مستمدة من المريض من الشرايين الرئوية. وعلاوة على ذلك، هناك بروتوكولات راسخة متاحة لعزل الخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة (MVEC) من الدورة الدموية الرئوية أو الدم تعميم الخلايا تشكيل مستعمرة البطانية (ECFC)25,28,29.
بعد العزل، تميزت الخلايا البطانية من قبل VE-cadherin، CD31، و TIE2 تلطيخ لتأكيد النمط الظاهري البطانية. وصف لوجود αSMA والسيتوكيراتين أشار إلى عدم وجود الخلايا الليفية أو النمط الظاهري الظهاري مثل (الشكل 1B). بعد الحصول على مجموعة سكانية نقية للغاية من ECs ، تم استخدام الخلايا مرور 3-5 لبذور إما microslide التجارية أو قنوات تدفق microfluidic حسب الطلب (الشكل 1C). في حين أن microslids المتاحة تجاريا هي في المقام الأول متوازي سير الغرف ، أو قنوات على شكل Y مع المعلمات محددة خصيصا في ارتفاع أو زاوية التشعب ، واستخدام الشرائح microfluidic يجعل من الممكن للتكيف مع المعلمات التجريبية في هندسة الأوعية في الجسم الحي وديناميات تدفق الدم31. ومع ذلك، والأحجام microfluidic حسب الطلب هي أصغر وتميل إلى الحد من انتشار الخلايا والحث على المزيد من موت الخلايا32،33. استخدام فائض من الخلايا يعوض عن حقيقة أن نسبة مئوية صغيرة فقط من الخلايا سوف تلتزم. وقد لوحظ ذلك عندما تم إدخال تضيق، حيث أظهرت الخلايا البطانية نمط ظاهري أكثر ممدود مقارنة مع قناة microfluidic موازية(الشكل 1D). غرف التدفق التجاري لها مساحة أكبر يمكن للخلايا أن ترتبط بها. وهذا يتطلب عدد أقل من الخلايا لبذات.
لدراسة تفاعل الدم الخلوي البطيني ، تم غرس الدم كله على طبقة أحادية البطانية. تم جمع الدم المُسجَّل في يوم التجربة ومباشرة قبل إعادة تعداد الضخ. وحفزت الخلايا مع الهستامين للحث على الافراج عن VWF والتصاق الصفائح الدموية 30 دقيقة قبل perfusion (الشكل 1E)34,35. وبسبب الأبعاد الصغيرة، سمحت القنوات الدقيقة المُصَدَرة باستخدام كميات دم أصغر.
جمع البيانات
للتحقيق في تشكيل خطات على PAECs، Calcein AM-Red المسمى خلايا الدم و Alexa488-مترافق الفيبرين تم perbried لمدة 5 دقائق في 2.5 dyne/cm2 (الشكل 2A–C). تم تحديد كمية خلايا الدم المضمّنة والفيبرين المودع. تم الحصول على الصور كل 30 s وتم تحديدها كميا مع ImageJ. كان من المهم طرح الخلفية للقضاء على الفلورة التلقائية من الصفائح الدموية غير المُعَدَّد. تم استخدام خوارزمية المثلث لتحديد العتبة لتحديد الحد الأدنى من الخلفية. سمحت لقياس مجاميع الصفائح الدموية الصغيرة (الشكل 2D).
من المتوقع، في ظل ظروف غير مُنَخَّذة، عدم وجود أي ربط للصفائح الدموية والفيبرين بـ endothelium. لتعزيز الإفراج VWF وربط الصفائح الدموية، تم تحفيز PAECs مع الهستامين، مما أدى إلى زيادة فورية من التصاق الصفائح الدموية تصل إلى هضبة بعد 2.5 دقيقة. في هذا الوقت، بدأت الصفائح الدموية لافراز عوامل الأوتكرين التي تسبب تراكم الصفائح الدموية وانشقاق الفيبرينوجين في الفيبرين. أودعت فيبرين بعد 3 دقائق وشكلت مجموعة مستقرة مع الصفائح الدموية بعد 4 دقائق(الشكل 2E).
للتحقيق فيما إذا كان هذا التأثير يمكن أن يمنعه مضاد تخثري عن طريق الفم مباشرة (DOAC)، عولج الدم بـ 10 nM dabigatran. تمت إضافة Dabigatran إلى تخفيف الدم ، حيث يمنع عامل IIa في مسار التخثر ، ومنع انشقاق الفيبرينوجين لتشكيل ألياف الفيبرين. عندما تم perabigatran المعالجة الدم على PAECs حفز، يمكن تثبيط تشكيل تجلط مباشرة أساسا عن طريق تأخير ترسب الفيبرين (الشكل 2F).
تحليل البيانات
لدراسة تأثير مختلف مصادر البطانية على تشكيل خثرة، تم تحليل التغيرات الخلوية على 5 دقائق من ضخ الدم. تم تثبيت البطانة الدموية وسمت الصفائح الدموية مع CD42b قبل التصوير تحت مجهر confocal. هذا وقدم تحليلا مفصلا لcalcalization من الصفائح الدموية والفيبرين التي يمكن أن تشير إلى عوامل التخثر المختلة في الدم. تم تحديد تأثير EC في تشكيل الجلطة بواسطة تلطيخ المناعة القياسي. تم الحفاظ على اتصالات الخلايا الغدد الغدد الغدد ، كما أكد VE -cadherin تلطيخ ، مما يشير إلى أن جلطات الدم التي تشكلت على رأس أحادية البطانية بدلا من على المصفوفة الأساسية بين الفجوات البطانية(الشكل 3). وعلاوة على ذلك، أدى استخدام مصادر الخلايا المختلفة في أنماط مختلفة من الجلطات تشكيل على endothelium. HUVECs هي الخلايا البطانية الوريدية وأظهرت التصاق الصفائح الدموية محدودة وترسب الفيبرين, في حين أن المرضى PAEC الأولية من مرضى CTEPH أظهرت التصاق الصفائح الدموية وفيرة وترسب أكثر فيرين على التحفيز الهيستامين بالمقارنة مع PAEC صحية. وهذا يشير إلى أن بطانة بطانة المرضى CTEPH تظهر استجابة أعلى للافوس التنشيط الذي يؤدي إلى زيادة تشكيل الخثرة.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية للبروتوكول. (أ)تم عزل مختلف المصادر وأنواع مختلفة من الخلايا البطانية واستزراعها للاستخدام في قناة تدفق ميكروفلورييدي لإجراء تجارب الانسياب. تمثيل صور brightfield من أنواع مختلفة من الخلايا البطانية. شريط مقياس = 50 ميكرومتر (B) تميزت الخلايا المعزولة من قبل تلطيخ مناعي لتأكيد النمط الظاهري البطاخيل. شريط مقياس = 50 ميكرومتر (C) يمكن أن تكون الخلايا مبذرة في الشرائح إما تدفق التجارية أو قناة microfluidic حسب الطلب. (D) ممثل برايتفيلد صور HUVEC نمت في هندسات قناة مختلفة. شريط مقياس = 50 ميكرومتر (E) الإعداد التجريبي لتجارب الضخ الدم. تم جمع الدم المُستَنَدِف، وخفف من عازلة ملحية، وجرى نفخه فوق الخلايا البطانية بمضخة حقنة. تم تعديل الرئة والوريد السري في هذا الشكل من سيرفير للفنون الطبية ، المرخص لها بموجب ترخيص عام 3.0 إحالة الإبداعية العامة. http://smart.servier.com/ يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الحصول على الصور وتحديد كميّة تشكيل الخثرة. (أ)تمثيلي الوقت الفاصل التصوير من الالسين AM-الأحمر الملصقة الصفائح الدموية وترسب Alexa488-مترافق في 1، 3، و 5 دقائق بعد ضخ الدم كله على PAECs غير مُنَخَذ (B)وعلى الهستامين حفز PAECs. (C) تمثيل الوقت الفاصل الصور من التصاق الصفائح الدموية وترسب في 1, 3, و 5 دقائق من القذف مع الدم كله المحتضنة مع dabigatran perfused على PAECs حفز الهستامين. شريط المقياس = 50 ميكرومتر (D) نظرة عامة تخطيطية على كمية الصورة في ImageJ. (E) الكم من التصاق الصفائح الدموية وترسب الفيبرين لكل 30 s على unstimulated و الهستامين حفز endothelium. (F) القياس الكمي لتأثير dabigatran على تشكيل خثرات كمية بواسطة التصاق الصفائح الدموية وترسب الفيبرين. يتم تمثيل البيانات في المتوسط ± SD، n = 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تمثيلية من تجارب التدفق لتوصيف تشكيل الخثرة في التصاق الصفائح الدموية وترسب الفيبرين على الخلايا البطانية. وقد تميزت اتصالات الخلايا endothelial بواسطة VE-cadherin وقياسها في PAECs التحكم، CTEPH PAECs المستمدة من المريض، وهوفك. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
التخثر هو نتيجة للتفاعل المعقد والمتحكم فيه زمنيا بين بطانة الدم ومكونات الدم. يقدم هذا الفحص في المختبر طريقة للتحقيق في الخصائص المخبوطاتية للخلايا البطانية في الوقت الحقيقي. يمكن استخدام أنواع مختلفة من الخلايا البطانية البشرية الأولية ، مما يسهل التجلط في الموقع بطريقة خاصة بالأعضاء والمريض. في هذه الدراسة، أوضحنا استخدام هذا البروتوكول مقارنة الخصائص الخثرة من PAECs معزولة عن المتبرعين الأصحاء مقابل مرضى CTEPH. تمت دراسة تكوين الخثرة الحية عن طريق ضخ الدم كله من الموضوعات الصحية على endothelium المنشطة الهستامين ، في حين تم اختبار تأثير DOAC كعامل مضاد للتشنج.
إلى جانب استخدام القنوات الصغيرة المتاحة تجاريا، كما هو مبين في النتائج التمثيلية، وإدخال القنوات microfluidic حسب الطلب تمكن من دراسة تأثير التغيرات الهندسية الوعائية على تشكيل خثرة. على سبيل المثال، انخفاض تدفق عند نقطة فرع أو تضيق يؤدي إلى زيادة في الإجهاد القص وتنشيط أكثر الصفائحالدموية 36. ومع ذلك، هناك قيد كبير لهذه الأقنية microfluidic حسب الطلب هو شرط أرقام الخلايا العالية لتشكيل أحادية ثابتة من ECs كما هو موضح في الخطوة 2.3.2. وهذا قد يمثل عاملاً مقيداً عندما تكون الخلايا المشتقة من المريض نادرة. نقاط القوة في الانهيارات الصغيرة المتاحة تجاريا هي أن يتم تعديل المناطق السطحية لثقافة الخلية ومناطق النمو هي أكبر، مما يسمح ECs لتشكيل أحادية التقاء ومستقرة. من ناحية أخرى، فإن مساحة أكبر من السطح يؤدي إلى أكبر التجويف. وفقاً للمعادلة 1، يتطلب هذا كميات دم أعلى للوصول إلى معدلات تدفق مماثلة كما هو الحال في microfluidics المصنوع خصيصًا.
يمكن أن يكون تحسين هذا البروتوكول هو التحقق من فقدان EC مباشرة أو تغييرات في سلامة الحاجز. ولا يقاس الضرر الذي يلحق باتفاقية الاتحاد الأوروبي في هذا البروتوكول إلا في نهاية التجربة. للتتبع المباشر ، يمكن أن يتم وضع علامة على ECs باستخدام mCherry VE-cadherin ، على سبيل المثال37. ومع ذلك ، لأن هذا من شأنه أن يحتاج إلى بروتوكول الأمثل للغاية مع الفيروسات كفاءة transfection ، الخلية الكهربائية الركيزة المعاوقة الاستشعار (ECIS) يمكن استخدامها كبديل لدراسة سلامة endothelial و وظيفة الحاجز38. يسمح الضخ عبر قنوات تدفق ECIS الخاصة بالرصد الطولي لسلامة الحاجز البطانية تحت التدفق. تسمح هذه الميزات المحددة ECIS بقياسات متوازية لخصائص الحاجز البطانية وتشكيل الخثرة. وتشمل الطرق البديلة لقياسات حاجز EC المتوازية، وخاصة في صفائف حسب الطلب استخدام الفلورسنت ديكسترانس في perfusate، التي تنتشر خارج تجويف، اعتمادا على خصائص حاجز الجماعة الأوروبية.
وهناك قيد من البروتوكول الموصوف هو أن يتم إزالة ECs من جسم الإنسان ومثقف على البلاستيك ثقافة الأنسجة، وهو صلب، الركيزة الاصطناعية. تتكيف الخلايا مع بيئتها البيوفيزيائية. هذا يمكن أن تؤثر ربما على الاستجابة البطانية لتنشيط الصفائح الدموية، كما أن هناك علاقة بين تنشيط الصفائح الدموية وصلابة الجدار39. على الرغم من هذه التكيفات مع البلاستيك الثقافة, الخلايا لا تبقي خصائص خاصة بمرض التي يمكن تحديدها في المقارنة المباشرة مع ECs المستمدة من المتبرعين الأصحاء كما هو مبين مع السيطرة, CTEPH-PAEC, و HUVEC التي بذلت أنماط مختلفة من التصاق الصفائح الدموية وترسب الفيبرين بعد 5 دقيقة من ضخ الدم.
على النقيض من البروتوكولات الأخرى، يستخدم هذا النظام الدم كله بينما يدرس آخرون تفاعل EC مع مكون دم واحد مثل الصفائح الدموية و كريات الدم البيض19،20،21. كانت هناك نماذج microfluidic أكثر تقدما المتقدمة التي تسمح لدراسة وظيفة endothelial في نموذج الأوعية الدموية مع هندسة السفينة جولة ومصفوفة لينة خارج الخلية. ومع ذلك ، يتم تحسين هذه مع HUVECs40،41،42. الجدة من البروتوكول الموصوف هو استخدام ECs الأولية جنبا إلى جنب مع الدم كله جلب نمذجة في الموقع الخثار خطوة واحدة أقرب إلى في الظروف الجسمية. بعد أن الأمثل بروتوكول لاستخدام المرضى المستمدة من ECs والدم المستمدة من المريض مزيد من تحسين النمذجة المرض في المختبر، والسماح لتقييم شخصية تشكيل خثرة والعلاج من المخدرات.
يمكن تطبيق البروتوكول الموصوف لدراسة تأثير علاجات التخثر على الخلايا المشتقة من المريض. في حين أننا استخدمنا dabigatran لمنع تشكيل خثرات، فمن الممكن استخدام مضادات التخثر الأخرى، مثل rivaroxaban، الذي يمنع مباشرة عامل Xa في سلسلة التخثر. يمكن دراسة مثبطات الصفائح الدموية المباشرة مثل clopidogrel أو الأسبرين أيضًا ، حيث تعمل هذه على المرحلة الأولية من الهباسات حيث ترتبط الصفائح الدموية بـ ECs. في نهاية المطاف، يمكن استخدام القدرات الجلطاتية للمرضى في التفاعل مع دم المريض نفسه للتنبؤ بالتأثير الشخصي للعلاج باتخثر على المريض الفردي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن توفر ضربة قاضية من بروتينات محددة معلومات وظيفية إضافية.
هناك بعض الخطوات في البروتوكول الموصوفة التي تعتبر هامة لتجربة تخبط ناجحة. أولاً، أثناء عزل الخلايا الأولية، من الضروري الحصول على ثقافة EC نقية للغاية. ثانياً، من المهم أن تشكل اللجان الأوروبية طبقة أحادية ثابتة. إذا لم يكن هذا هو الحال، يمكن أن يسبب تغيير طفيف في الإجهاد القص الضرر البطانية وتفعيل تتالي التخثر، أو الصفائح الدموية يمكن أن تبدأ ملزمة لغشاء الطابق السفلي، والتي سوف توفر نتائج إيجابية كاذبة. ثالثا، من الضروري منع فقاعات الهواء، لأن تلك يمكن أن تلحق الضرر بـ endothelium وبالتالي التأثير على النتائج.
بعد إعادة معايرة الدم المُسَتَلَد بكلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنسيوم، من المهم البدء فوراً في تجربة الضخ. يؤدي إعادة التكلس إلى استجابة سريعة في تنشيط الصفائح الدموية وتشكيل الخثرة ، مما يؤدي إلى تخثر سريع في العينة.
في الختام، نحن وصف بروتوكول تنوعا للغاية لدراسة تفاعلات الخلايا البطانية الدم كامل أثناء تجلط الدم.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر يان فوربرغ من قسم بروتينات البلازما، Sanquin Research ومختبر Landsteiner، أمستردام UMC، المركز الطبي الأكاديمي، أمستردام، هولندا، على إسهاماته في هذه المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل التحالف الهولندي للقلب الفاشه (DCVA) [2012-08، 2014-11] الذي مُنح لـ Phaedra واتحاد Reconnect وكذلك منحة Impulse لعام 2018 الممنوحة لكونسورتيوم فايدرا إمباكت. وتشمل هذه المنح التمويل الجماعي من قبل مؤسسة القلب الهولندية، والاتحاد الهولندي للمراكز الطبية الجامعية، والمنظمة الهولندية للبحوث الصحية والتنمية، وأكاديمية هولندا الملكية للعلوم. وعلاوة على ذلك، تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأوروبية في إطار برنامج المنح المتقدمة 'VESCEL' (رقم المنحة: 669768). يتم تمويل XDM من خلال منحة بحثية من معهد البحوث القلبية الوعائية (ICaR-VU) في المركز الطبي لجامعة VU، أمستردام، هولندا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| 20 mL syringe | BD | 300613 | |
| 20X objective | Olympus | N1492900 | LUCPLFLN20XPH/0.45 |
| 2-Propanol (IPA) | Boom | 760514555000 | |
| Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
| Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
| Alexa647-Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 1:100 |
| Biopsy punch 1 mm diameter | Ted Pella | 15110-10 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
| CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
| Citric Acid | Merck | 100244 | |
| Collagen Type I, rat tail | Corning | 354249 | 0.1 mg/mL |
| Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
| Cross-flow hood | Basan | ||
| Desiccator | Duran | 2478269 | |
| D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
| Fibronectin Human Plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Flow tubing | ibidi | 10831, 10841 | |
| Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
| micron-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
| ImageJ | NIH | v1.49 | |
| KCl | Merck | 7447-40-7 | |
| Lab oven | Quincy | 10GC | |
| LS720 Fluorescent microscope | Etaluma | LS720 | |
| Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, Female tube connectors |
| MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
| Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | no calcium or magnesium |
| Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
| sodium citrate blood collection tubes | BD | 363048 | |
| trisodium citrate | Merck | 106448 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
| VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |
References
- Yau, J. W., Teoh, H., Verma, S.
- Pearson, J. D. Endothelial cell function and thrombosis. Best Practice & Research: Clinical Haematology. 12 (3), 329-341 (1999).
- Bochenek, M. L., Schafer, K. Role of Endothelial Cells in Acute and Chronic Thrombosis. Hamostaseologie. 39 (2), 128-139 (2019).
- Swieringa, F., et al. Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 692-699 (2016).
- Macfarlane, R. G. An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier. Nature. 202, 498-499 (1964).
- Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H.
- Opneja, A., Kapoor, S., Stavrou, E. X. Contribution of platelets, the coagulation and fibrinolytic systems to cutaneous wound healing. Thrombosis Research. 179, 56-63 (2019).
- Tabas, I., Garcia-Cardena, G., Owens, G. K. Recent insights into the cellular biology of atherosclerosis. Journal of Cell Biology. 209 (1), 13-22 (2015).
- Karino, T., Motomiya, M. Flow through a venous valve and its implication for thrombus formation. Thrombosis Research. 36 (3), 245-257 (1984).
- ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Thrombosis Research. 134 (5), 931-938 (2014).
- Witkin, A. S. Acute and chronic pulmonary embolism: the role of the pulmonary embolism response team. Current Opinion in Cardiology. 32 (6), 672-678 (2017).
- Kim, N. H., et al.
- Zhang, M., Zhang, Y., Pang, W., Zhai, Z., Wang, C. Circulating biomarkers in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 9 (2), 2045894019844480 (2019).
- Giri, J., et al. Interventional Therapies for Acute Pulmonary Embolism: Current Status and Principles for the Development of Novel Evidence: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation. 140 (20), 774-801 (2019).
- Sharma, S., Lang, I. M. Current understanding of the pathophysiology of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis Research. 164, 136-144 (2018).
- Eisenberg, P. R., et al. Fibrinopeptide A levels indicative of pulmonary vascular thrombosis in patients with primary pulmonary hypertension. Circulation. 82 (3), 841-847 (1990).
- Bochenek, M. L., et al. From thrombosis to fibrosis in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 117 (4), 769-783 (2017).
- Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Swieringa, F. Use of microfluidics to assess the platelet-based control of coagulation. Platelets. 28 (5), 441-448 (2017).
- Barendrecht, A. D., et al. Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow. Journal of Visualized Experiments. (125), e55658 (2017).
- Vajen, T., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), e57009 (2018).
- Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albanez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. (126), e55917 (2017).
- Smeets, M. W. J., Mourik, M. J., Niessen, H. W. M., Hordijk, P. L. Stasis Promotes Erythrocyte Adhesion to von Willebrand Factor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), 1618-1627 (2017).
- Aird, W. C.
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation Research. 103 (9), 929-939 (2008).
- Szulcek, R., et al. Delayed Microvascular Shear Adaptation in Pulmonary Arterial Hypertension. Role of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Cleavage. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (12), 1410-1420 (2016).
- Casa, L. D., Deaton, D. H., Ku, D. N. Role of high shear rate in thrombosis. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1068-1080 (2015).
- Jain, A., et al. Assessment of whole blood thrombosis in a microfluidic device lined by fixed human endothelium. Biomedical Microdevices. 18 (4), 73 (2016).
- van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., van Hinsbergh, V. W. Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA. Circulation Research. 83 (11), 1115-1123 (1998).
- Smits, J., et al. Blood Outgrowth and Proliferation of Endothelial Colony Forming Cells are Related to Markers of Disease Severity in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3763 (2018).
- Tobias, M. D., Wambold, D., Pilla, M. A., Greer, F. Differential effects of serial hemodilution with hydroxyethyl starch, albumin, and 0.9% saline on whole blood coagulation. Journal of Clinical Anesthesia. 10 (5), 366-371 (1998).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M. C., Asphahani, F., Zhang, M. Short peptides enhance single cell adhesion and viability on microarrays. Langmuir-ACS. 23 (8), 4472-4479 (2007).
- Kuo, C. W., Chueh, D. Y., Chen, P. Investigation of size-dependent cell adhesion on nanostructured interfaces. Journal of Nanobiotechnology. 12, 54 (2014).
- McCormack, J. J., Lopes da Silva, M., Ferraro, F., Patella, F., Cutler, D. F. Weibel-Palade bodies at a glance. Journal of Cell Science. 130 (21), 3611-3617 (2017).
- Guilarte, M., Sala-Cunill, A., Luengo, O., Labrador-Horrillo, M., Cardona, V. The Mast Cell, Contact, and Coagulation System Connection in Anaphylaxis. Frontiers in Immunology. 8, 846 (2017).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (4), 1357-1362 (2013).
- Huveneers, S., et al. Vinculin associates with endothelial VE-cadherin junctions to control force-dependent remodeling. Journal of Cell Biology. 196 (5), 641-652 (2012).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Yamasaki, F., et al. Association between arterial stiffness and platelet activation. Journal of Human Hypertension. 19 (7), 527-533 (2005).
- Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. Journal of Clinical Investigation. 122 (1), 408-418 (2012).
- Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9342-9347 (2012).
- Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. Journal of Visualized Experiments. (64), e3958 (2012).
