우리는 환자 유래 내피와 전혈 상호 작용을 조사하기 위하여 체외 혈관 질병 모형을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 상황에서 1 차적인 내피 세포의 혈전 생성 특성의 연구를 허용합니다. 이 방법은 응고의 상이한 단계 도중 시혈전증 및 항응고 요법에서 평가하기위하여 특히 적합합니다.
혈전의 형성은 내피 세포, 그들의 근본적인 매트릭스, 각종 혈액 세포 및 단백질 사이 복잡한 상호 작용을 관련시킵니다. 내피는 혈소판 응집, 응고 및 세혈을 제어하는 많은 주요 혈전 성 분자의 주요 소스입니다. 혈전증의 기계장치가 수십 년 동안 조사되었지만, 체외 연구는 주로 체내 성 매트릭스가 노출되는 혈관 손상의 상황 또는 단일 혈액 성분을 가진 세포 간의 상호 작용에 초점을 맞춥니다. 우리의 방법은 전혈과 손상되지 않은, 컨할 수 있는 혈관 세포 네트워크 사이의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.
1 차적인 인간 내피 세포를 이용함으로써, 이 프로토콜은 혈전 역학에 내피 세포의 영향을 연구하고 혈전증 질병의 병생리학에 귀중한 통찰력을 제공하는 유일한 기회를 제공합니다. 맞춤형 미세 유체 흐름 채널을 사용하면 질병별 혈관 기하학을 적용하고 특정 형태학적 혈관 변화를 모델링할 수 있습니다. 혈소판 부착 및 피브린 증착을 특징으로 하는 혈소판 의 발달은 실시간으로 기록된다. 변경된 혈전 역학에서 내피 기능의 효과는 특정 분자의 면역 형광 염색을 통해 사후 분석에 의해 결정됩니다.
대표적인 결과는 실험 적인 설정, 데이터 수집 및 데이터 분석을 설명합니다. 연구 질문에 따라 세포 유형, 전단 속도, 채널 지오메트리, 약물 치료 및 사후 분석 절차를 포함하여 모든 섹션에 대한 매개 변수를 조정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 만성 혈전색전성 질환 환자의 폐 동맥 내피성상에 혈전 형성을 정량화함으로써 검증된다.
내피는 혈관의 내세포 층을 형성하고 주변 조직으로부터 혈액을 분리합니다. 그것은 적극적으로 마이크로 환경을 조절하고 외부 자극1에반응동적 기관으로 설명되었다. 흐르는 혈액과의 직접적인 접촉으로 인해 내피는 혈전및 혈전증의 조절에 중추적인 역할을 하며 혈소판 응집, 응고 및 세혈2를제어하는 많은 주요 규제 분자의 주요 공급원입니다. 건강하고, 비활성화되지 않는 내피 세포(EC)는 혈소판 활성화를 중화하고 프로스타시클린, 혈전보모둘린 또는 조직 인자 통로 억제제(TFPI)2,3과같은 혈류를 유지하기 위해 응고 및 혈전 형성을 방지하는 여러분자를 생산한다. 이것은 혈소판, 혈소판 응집 및 혈전 형성의 접착을 방지합니다. 혈관 벽의 부상 또는 활성화는 국소화된 혈소판 접착 및 응고 형성2,,4를시작하는 프로코아굴란트 내피타입을 초래한다. 내피 활성화 혈소판이 폰 윌레브란트 팩터(VWF)를 부착하면, EC에서 방출되는 다혈성 단백질또는 기본 서브엔도피알 매트릭스의 노출된 결합 부위에 부착된다. 이어서, 혈소판의 분자 변화와 조직인자(TF)에 대한 노출은 응고 시스템의 활성화를 개시하여, 이는 피브린중합제5,,6에의한 혈전 형성을 유도한다. 함께, 결과 응고는 재내피화7에의한 상처 폐쇄의 기초를 제공한다. 응고 시스템의 왜곡은 폰 윌레브란트 질병, 혈우병 또는 혈전증과 같은 출혈 장애를 초래할 수 있으며, 이는 종종 내피 성 혈전 경로2,,3의난독증 프로 및 항혈전성 균형에서 비롯된다.
hemostasis의 과정은 동맥 및 정맥 순환 모두에서 발생합니다. 그러나, 동맥 및 정맥 혈전증의 근본적인 기계장치는 근본적으로 다릅니다. 동맥 혈전증은 허혈성 심장 질환에서 볼 수 있듯이, 주로 높은 전단 스트레스의 조건에서 죽상 경화성 플라크의 파열에 의해 구동되지만, 정맥 혈전증은 주로 정지8,,9,,10의조건에서 내피 손상의 부재에서 발생합니다. 깊은 정맥 혈전은 폐 색전증을 일으키는 폐 동맥쪽으로 색전및 여행할 수 있습니다. ,이는 만성 혈전색전성 폐고혈압(CTEPH)11,12,13,14의발달을 포함하여 초닉 폐 질환의 발달을 촉진할 수 있는 유의한 기능성 용량으로 이어지는 만성 혈관 방해가 발생할 수있다., CTEPH는 혈전색전성 물질에 의한 폐동맥의 방해로 인한 높은 폐압이 특징이며, 적어도 3개월간의 항응고요법(15)에따른다. 폐 색전증 이외에, 폐 내피는 CTEPH에서 혈전증과 폐 동맥의 만성 장애물을 용이하게 하는 in situ 보혈증 환경을 제공한다고 가정되어 궁극적으로 치료되지 않은경우 16,,17.
지난 몇 년 동안, 다양한 연구는 혈소판 기능 및 응고 를 측정하여 혈전 형성을 검사하는 애약의 개발을 주도하고있다18. 그러나, 그들 대부분은 콜라겐 또는 피브린과 같은 단일 세포 외 매트릭스 구성 요소와 전혈의 상호 작용을 연구하거나 내피 혈소판 또는 내피 -백혈구 상호 작용19,,20,,21,,22와같은 단일 혈액 성분과의 상호 작용에서 내피 기능을 연구한다. 이러한 분석서는 이러한 세포가 쉽게 얻을 수 있기 때문에 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)로 가장 일반적으로 수행됩니다. 그러나, 혈전성 유전자는 혈관나무, 혈관 유형 및 장기시스템(23,,24)을통해 분화되어, 이는 HUVEC를 사용하여 동맥 혈전증 또는 폐 색전증에 관여하는 내피 세포를 나타내게한다(23).
EC 가소성 이외에, 질병 별 혈역학적 변화 및 혈관 형태에 있는 변경은 일반적인 내피성(25)에서혈전 형성을 촉진할 수 있습니다. 높은 전단 속도, 때문에 국소 혈관 수축 또는 혈관 기하학의 변화, 예를 들어, 급성 혈전 형성을 초래할 수 있습니다, 혈류의 중단을 가속화 협착증을 일으키는(26). 맞춤형 마이크로 엔지니어링 유량 채널을 사용하면 (patho) 생물학을 대표하는 혈관 기하학을 구체적으로 설계할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 건강하거나 병든EC(27)에대한 국소 생체역학력의 효과를 연구할 수 있다.
응고 폭포에 있는 다른 단계 및 분자를 표적으로 하기 위하여 유효한 항응고 치료가 있습니다, 이는 모든 특정 무질서에 특정한 특정 한 리스크 및 이득을 제기합니다. 이 논문에 설명된 질병 모델링의 접근은 혈전 역학에 대한 다양한 항응고 및 항혈소판 치료의 효과를 테스트하는 데 특히 적합합니다.
목표는 1 차적인 IC를 포함하는 혈전증의 모형을 제시하는 것입니다, 사용된 1 차적인 IC의 모형에 따라 혈전증의 각종 양식의 분석에 적합한 다목적 모형을 산출하는 것입니다. 그림으로, 우리는 혈전 형성에 관여하는 모든 구성 요소 (혈소판, 백혈구, 적혈구, 응고 단백질 및 공동 인자)를 포함하는 전체 인간 혈액과 상호 작용에 CTEPH 환자에서 폐 동맥 내피 세포를 사용했다. 이 방법은 상업적 병렬 흐름 채널 또는 특정 혈관 설계를 가진 맞춤형 미세 유체 흐름 채널에 적용될 수 있습니다. 이와 같이, 모델은 결국 혈전 형성 및 해상도의 연구, 질병 모델링의 염증 반응 평가, 항혈소판 또는 항응고 요법, 궁극적으로 개인화 된 의학에 사용될 수 있습니다.
이 연구는 1 차적인 인간 폐 동맥 내피 세포의 격리를 기술합니다. 다른 1차 인체 내피 세포 유형의 분리를 위해, 우리는 폐 미생물 내피세포(25),인간 배빌루칼 정맥 내피세포(28)및 혈액 순환 내피 내피 세포 형성 세포를 포함하는 이전에 발표된 방법을 지칭한다.29
응고는 내피 성분과 혈액 성분 사이의 복잡하고 일시적으로 조절된 상호 작용의 결과입니다. 이 시험관 내 분석법은 내피 세포의 혈전 생성 특성을 실시간으로 조사하는 방법을 제시한다. 1 차적인 인간 내피 세포의 각종 모형은 기관 및 환자 특정 방식으로 시투 혈전증에서 촉진하는, 이용될 수 있습니다. 이 연구에서는, 우리는 CTEPH 환자 대 건강한 기증자에서 고립된 PAECs의 혈전 생성 특성을 비교하는 이 프로토콜의 사용을 설명했습니다. 살아있는 혈전 형성은 히스타민 활성화 내피를 통해 건강한 과목에서 전혈의 관류에 의해 연구되었다, DOAC의 효과는 항 혈전제로 테스트하는 동안.
대표적인 결과에 도시된 바와 같이 상업적으로 이용 가능한 마이크로 채널을 사용하는 것 외에도, 맞춤형 마이크로 유체 채널의 도입은 혈전 형성에 대한 혈관 기하학 변화의 영향에 대한 연구를 가능하게 한다. 예를 들어, 분기점이나 협착에서 의 흐름이 감소하면 전단 응력증가및 혈소판활성화(36)가증가한다. 그러나, 이러한 맞춤형 마이크로유체 채널의 상당한 제한은 2.3.2 단계에서 설명된 바와 같이 안정적인 단일레이어를 형성하기 위한 높은 세포 수의 요구 사항이다. 이것은 환자 유래 세포가 부족할 때 제한적인 인자를 제출할 수 있습니다. 시판되는 마이크로슬라이드의 강점은 표면영역이 세포 배양에 맞게 변형되고 성장 영역이 더 커서 EC가 컨실릭하고 안정적인 단층층을 형성할 수 있다는 것이다. 반면에, 더 큰 표면적으로 인해 더 큰 루멘이 생성됩니다. 방정식 1에따르면, 이것은 사용자 정의 된 미세 유체에서와 유사한 유량에 도달하기 위해 더 높은 혈액 볼륨을 필요로한다.
이 프로토콜의 개선은 실시간 EC 손실 또는 장벽 무결성의 변화를 조사하는 것입니다. 이 프로토콜의 EC 손상은 실험이 끝날 때만 측정됩니다. 라이브 트래킹의 경우, 예를 들어37mCherryVE-cadherin으로 EC에 태그를 지정할 수 있습니다. 그러나, 이것은 효율적인 바이러스 형질과 고도로 최적화 된 프로토콜을 필요로 하므로, 전기 세포 기질 임피댄스 감지 (ECIS) 내피 무결성 및 장벽 기능을 연구하는 대안으로 사용될 수있다(38). 특수 ECIS 흐름 채널에 대한 관류를 통해 흐름 하에서 내피 장벽 무결성을 세로 모니터링할 수 있습니다. 이러한 특정 ECIS 기능을 사용하면 내피 장벽 특성 및 혈전 형성의 병렬 측정이 가능합니다. 병렬 EC 장벽 측정을 위한 대체 방법, 특히 사용자 정의 된 배열에서 형광 덱스트랜스의 사용을 포함, 이는 루멘에서 확산, EC 장벽 특성에 따라.
설명된 프로토콜의 한계는 IC가 인체에서 제거되고 조직 배양 플라스틱에 배양되어 뻣뻣하고 인공기판이 된다는 것입니다. 세포는 그들의 생물 물리학 환경에 적응합니다. 이것은 혈소판 활성화와 벽강성(39)사이의 연관성이 있기 때문에 혈소판 활성화에 대한 내피 반응에 영향을 미칠 수 있다. 배양 플라스틱에 이러한 적응에도 불구하고, 세포는 혈액 관류의 5 분 후에 혈소판 접착 및 fibrin 증착의 다른 패턴을 발휘하는 대조군, CTEPH-PAEC 및 HUVEC와 같이 건강한 기증자에서 파생된 IC와 직접 비교에서 확인할 수 있는 질병 특정 특성을 유지합니다.
다른 프로토콜과는 달리, 이 시스템은 전혈을 사용하는 반면, 다른 시스템은 혈소판 및백혈구(19,,20,,21)와같은 단일 혈액 성분과 EC 상호 작용을 연구한다. 둥근 혈관 기하학 및 부드러운 세포외 매트릭스를 가진 혈관 모형에 있는 내피 기능의 연구를 허용하는 더 진보된 미세 유체 모형이 개발되었습니다. 그러나, 이들은 HUVEC40,,41,,42로최적화됩니다. 설명된 프로토콜의 참신은 전혈전과 결합된 1차 IC의 사용으로, 생체 내 에서 한 걸음 더 가까이 시투 혈전증의 모델링을 가져오는 것이다. 환자 유래 EC 및 환자 유래 혈액의 사용을 위한 프로토콜을 최적화한 결과 시험관 내질병 모델링을 더욱 최적화하여 개인화된 혈전 형성 및 약물 치료를 평가할 수 있습니다.
기술된 프로토콜은 환자 유래 세포에 대한 항응고 요법의 효과를 연구하기 위해 적용될 수 있다. 우리는 혈전 형성을 억제하기 위해 다비가트란을 사용했지만, 응고 폭포에서 인자 Xa를 직접 억제하는 리바록사반과 같은 다른 항응고제를 사용할 수 있습니다. 클로피도그렐 또는 아스피린과 같은 직접 혈소판 억제제는 혈소판이 IC에 결합하는 헤모스티스의 1차 단계에 작용하기 때문에 연구될 수 있습니다. 궁극적으로, 환자의 혈액과의 상호 작용에서 환자 특정 ECs의 혈전 생성 용량은 개별 환자에 대한 항 응고 치료의 개인적인 효과를 예측하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 특정 단백질의 녹다운은 추가 적인 기능 정보를 제공할 수 있습니다.
성공적인 관류 실험에 중요한 설명된 프로토콜에는 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 1차 세포의 격리 중에 매우 순수한 EC 배양을 얻을 필요가 있다. 둘째, EC가 안정적인 컨실릭 모노레이어를 형성하는 것이 중요합니다. 그렇지 않은 경우, 전단 응력의 약간의 변화는 응고 캐스케이드의 내피 손상 및 활성화를 일으킬 수 있으며, 또는 혈소판은 지하 막에 결합을 시작할 수 있으며, 이는 거짓 양성 결과를 제공할 것이다. 셋째, 기포를 방지하는 것이 필수적이며, 이는 내피를 손상시키고 그 결과로 영향을 미칠 수 있기 때문에.
염화칼슘과 염화 마그네슘으로 정산 혈액을 재보정한 후, 즉시 관혈 실험을 시작하는 것이 중요하다. 회화는 혈소판 활성화 및 혈전 형성에 있는 급속한 반응을 유도하고, 견본에 있는 빠른 응고의 결과로.
결론적으로, 우리는 혈전증 도중 전체 혈액 내피 세포 상호 작용을 공부하기 위하여 고도로 다재다능한 프로토콜을 기술합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 플라즈마 단백질의 부서에서 얀 Voorberg 감사합니다, 산퀸 연구 및 랜드 스타이너 연구소, 암스테르담 UMC, 학술 의료 센터, 암스테르담, 네덜란드, 이 원고에 자신의 입력에 대한. 이 작품은 네덜란드 심장혈관 동맹 (DCVA) [2012-08, 2014-11]에 의해 지원되었다 파에드라와 다시 연결 컨소시엄뿐만 아니라 펄스 보조금 2018 파에드라 IMPACT 컨소시엄에 수여. 이러한 보조금에는 네덜란드 심장 재단, 네덜란드 대학 의료 센터 연맹, 네덜란드 건강 연구 개발 기구 및 네덜란드 왕립 과학 아카데미의 집단 기금이 포함됩니다. 또한, 이 작품은 고급 보조금 ‘VESCEL’프로그램에 따라 유럽 연구 위원회에 의해 지원되었다 (그랜트 번호: 669768). XDM은 네덜란드 암스테르담의 VU 대학 의료 센터에서 심장 혈관 연구 연구소 (ICaR-VU)의 연구 보조금에 의해 투자됩니다.
20 mL syringe | BD Plastipak | 300613 | |
20X objective | Olympus | ||
2-Propanol (IPA) | Boom | 76051455 . 5000 | |
Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
Alexa647 Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 0.180555556 |
Biopsy punch 1 mm diameter, Integra Miltex | Ted Pella | 15110-10 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A9647 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
Citric Acid | Merck | 244 | |
Collagen Typ I | Corning | 354249 | 0,1 mg/mL |
Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
Cross-flow hood | Basan | ||
Desiccator | Duran | 24 782 69 | |
D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F0895 | |
Flow tubings | ibidi | 10831, 10841 | |
Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
ibidi µ-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
ImageJ | ImageJ | v1.49 | |
KCl | Merck | 7447-40-7 | |
Lab oven | Quincy | 10GC | |
LS720 Fluorescent microscope | etaluma | LS720 | |
Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, and Female tube connectors |
MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | |
Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
sodium citrate blood collection tubes | BD Vacutainer | 363048 | |
trisodium citrate | Merck | 6448 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |