Summary
전립선성 감소는 노화의 특징입니다, 신경 퇴행성 질환의 발병을 촉진. 우리는 형광 기자에게 융합 된 폴리 글루타민 반복의 이종 발현을 통해 두 가지 다른 Caenorhabditis elegans 조직에서 프로테오스타시스를 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 프로테오스타증의 생체 내 유전 적 분석을 빠르게 허용합니다.
Abstract
프로테오메(단백질 항상성)의 적절한 기능과 접이식 기능을 유지하는 능력은 정상적인 노화 시 감소하여 점점 증가하는 연령 관련 질병의 발병을 용이하게 합니다. 예를 들어, 폴리글루타민 팽창을 가진 단백질은 헌팅턴 병의 헌팅틴 단백질과 수반되는 발병으로 예시되는 것처럼 응집되기 쉽습니다. 프로테오메의 노화와 관련된 악화는 황색 형광 단백질(YFP)에 융합된 폴리Q 반복을 발현하는 트랜스제닉 Caenorhabditis elegans의 사용을 통해 널리 연구되고 있다. 이러한 폴리Q:YFP 형질형 동물 모델은 형광 포시의 점진적 형성(즉, 단백질 골재)의 점진적 형성과 프로테오메의 붕괴로 인해 발생하는 운동 결함의 후속 개시를 이미징을 통해 프로테오메의 노화와 관련된 쇠퇴의 직접적인 정량화를 용이하게 한다. 또한, polyQ:YFP 트랜스진의 발현은 조직별 프로모터에 의해 구동될 수 있으며, 손상되지 않은 다세포 유기체의 맥락에서 조직 전반에 걸친 프로테오스타시스의 평가를 허용한다. 이 모델은 유전 분석에 매우 적합하므로 수명 분석에 보완되는 노화를 정량화하는 접근 법을 제공합니다. 우리는 정확하게 polyQ를 측정하는 방법을 설명합니다: YFP foci 형성 중 뉴런 또는 노화 중 신체 벽 근육, 그리고 행동 결함의 후속 개시. 다음으로, 우리는 이 접근이 더 높은 처리량, 및 C. elegans 유전 분석을 위한 그밖 신흥 전략을 사용하여 잠재적인 미래 응용을 위해 어떻게 적응될 수 있는지 강조합니다.
Introduction
단백질 항상성 (proteostasis)은 프로테오메의 적절한 기능과 접기를 유지하는 세포 능력으로 정의됩니다. 프로테오스타증에 대한 내재된 과제는 모든 단백질이 단백질 크기, 아미노산 조성, 구조적 형태, 안정성, 회전율, 발현, 서브 셀룰러 구획화 및 변형1의다양한 특성에 의해 더욱 증폭되는 토착 형태에서 제대로 접혀 유지되도록 하는 것이다. 프로테오스타증은 프로테오메2,3내에서 적절한 합성, 접기, 인신 매매 및 분해를 조절하는 약 2,000개의 고유 단백질로 구성된 대형 프로테온성 네트워크의 조정된 작용을 통해 유지된다. 프로테오톤 네트워크의 주력 성분은 분자 샤페론4의9개 주요 패밀리입니다. 모든 조직 및 세포 유형은 분자 보호자의 특정 하위 집합을 우선적으로 활용하며, 아마도 뚜렷한프로테옴(5)의 다른 요구와 일치한다.
정상적인 유기체 노화의 한 가지 특징은 세포 프로테오스타증의 점진적 쇠퇴와 붕괴이며, 이는 점점 더 많은 연령 관련 질병의 발병 및 진행을 위한 근본적인 기초로 여겨진다. 예를 들어, 알츠하이머 병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증(ALS)은 공통적인 특성을 공유합니다: 각 경우 신경변성 증상은 돌연변이 단백질을 응집(아밀로이드-β/타우, α-시뉴클레인, HTT,FUS/TBD/1, 10, 10, 10, 10, 73/ SOD, 10, SOD/10) . 노화 하는 동안, 무결성 및 프로 테 오 정성 네트워크의 유도 감소, 세포 기능 장애 및 신경 변성을 초래 하는 proteotoxic 집계의 축적 결과. 참고, 단백질 형성 질환은 뉴런에 만전지지 않으며, 타입 II 당뇨병, 다발성 골수종 및낭포성 섬유증(11,12,13,14)에의해 강조되는 바와 같이 여러 조직에 걸쳐 발생합니다. 따라서, 프로테오스타증을 보존할 수 있는 해명기들은 질병의 치료를 위한 표적 개입의 개발을 용이하게 하고 건강한 노화를 촉진할 것이다.
작은 토양 선충 천골 Caenorhabditis elegans (C. elegans)는유전자를 발견하고 proteostasis를 변경하는 경로를 해명하는 데 중요한 역할을하고있다. 프로테오스타시스를 조절하는 프로테오스테아시스의 많은 구성 요소와 신호 변환 경로는 진화적으로 보존된다. 더욱이, C. elegans는 척추 동물 시스템에 비해 복잡성과 중복성을 감소시켜 유전자 분석 및 유전자 발견에 더 많은 의무를 다합니다. 프로테오스타증을 연구하기 위한 모델 시스템으로 널리 사용되는 C. elegans의 추가 장점은 다음과 같습니다: 강력한 유전 및 기능적 유전체학, 짧은 수명 주기(3일) 및 수명 기간(3주), 작고 잘 기름부음게놈, 유전 돌연변이의 넓은 구색의 가용성, 및 세포 생물학을 이용한 시각적 조직 별 변화의 용이성 등이 있습니다.
노화 중 프로테오스타증의 점진적 붕괴는 C. 엘레간에서 쉽게 정량화될 수 있다. 모리모토 연구소는 먼저 노란 형광 단백질(polyQ::YFP)에융합된 폴리글루타민 팽창이 노화15,16,17,18동안 C. 예르간에서 프로티온성 감소를 정량화하는 데 사용될 수 있음을 입증하였다. 35글루타민반복에 YFP 융합은 세포 병리학의 표시와 더불어 형광 포시의 나이 관련 형성귀착됩니다. 참고, 글루타민 팽창의 이 범위는 헌팅턴병 병리학이 인간에서 관찰되기 시작하는 헌팅틴 단백질의 폴리글루타민 관의 길이를 반영한다(일반적으로 >35 CAG 반복)19. polyQ의 발현을 가진 긴장: 근육 내의 YFP, 장, 또는 신경 세포는 proteostasis의 나이 관련 쇠퇴가 다른 세포 및 조직 모형에 걸쳐 생기는다는 것을 확인하기 위하여 이용되었습니다. 근육별 폴리Q::YFP 발현(즉, unc-54p:Q35::YFP)은형광포를 축적하는 것이 단순 형광 해부 현미경(그림 1A-1B)을사용하여 성인기의 처음 며칠 동안 정량화하기쉽기 때문에 가장 널리 사용되는 조직별 기자입니다. 또한, 동물은 중년 동안 마비되고, 근육 내의 프로테오메가리포터(도 1C)의프로테오독성 효과로 인해 붕괴된다. 유사하게, 뉴런 프로테오스타증의 연령과 관련된 쇠퇴는 동물을 액체로 배치한 후 조정된 신체 굽힘에서 포시/골재 형성 및 연령과 관련된 감소를 직접 정량화함으로써 따를 수있다(그림2).
여기서, 우리는 C. elegans내뉴런 및 근육 조직 내에서 폴리글루타민 반복의 발현에 의해 유도된 단백질 골집 축적 및 관련 프로테오독성의 연령 의존적 진행을 측정하는 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이러한 균주와 방법을 사용하여 생성된 일반적인 결과의 예를 제공합니다. 또한, 우리는 우리가 프로테오틱 네트워크의 전사 적 규제를 연구하기 위해 이러한 방법을 활용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 이러한 기자가 다른 기존 시약과 쉽게 통합되거나 더 큰 화면에 적응 할 수있는 추가 방법에 대해 논의합니다.
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Protocol
1. 시약 준비
- 먹이 기반 RNAi를 통해 비활성화 될 관심의 유전자를 선택합니다. HT115 E. 대장균의 주식 을 인수하여 RNAi 클론을 함유하고있다 20. 대안적으로, L4440 플라스미드의 다중 클론 부위로 관심 있는 유전자의 cDNA를 아복제한다.
참고: 박테리아 내의 dsRNA의 분해를 방지하려면 HT115 균주를 사용하십시오. 이는 IPTG 유도 T7 폴리머라제 활성을 가진 RNase III-결핍 E. 대장균 균주이다. 공급 기반 RNAi를 사용하지 않는 프로테오스타증 연구의 경우 표준 NGM 플레이트에서 HT115 또는 OP50 대장균을 사용할 수 있습니다. - 테스트 조건당 5 x 6cm 플레이트를 준비합니다. RNAi를 이용한 실험의 경우, 변형된 HT115 대장균에서 dsRNA 생산을 유도한다. RNAi가없는 연구의 경우 표준 NGM 플레이트의 OP50 E. 대장균을 사용할 수 있습니다 (표준 NGM 및 RNAi 플레이트 조리법에 대한 보충 파일 1 참조).
참고 : RNAi 플레이트는 박테리아로 파종하기 전에 몇 달 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다. - 220 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 37°C에서 대장균의 하룻밤(16-20h)의 배양을 성장시다. 암피실린 (50 μg/mL)을 가진 루리아 브로스 (LB)에서 HT115 대장균을 성장시다.
참고: 표준 OP50 대장균은 항생제 내성이 아니지만 연쇄상 구균 내성 변이체도 사용할 수 있습니다.- 원심분리에 의한 원심분리에 의한 박테리아를 벤치탑 원심분리기에서 15-20분 동안 2,400x g로 농축하고, 슈퍼나탄을 흡습하고, HT115용 암피실린을 함유한 LB의 시작부(즉, 10배 농도)에서 펠릿을 다시 중단시키거나, 표준 OP50에 대한 LB를 위한 LB의 시작량(즉, 10배 농도)으로 재중단한다.
- 각 플레이트에 농축 된 10x 박테리아의 Aliquot 200 μL (오염 시 사용할 2 개의 추가 백업 플레이트와 함께 테스트 조건당 3-4 복제).
- 모든 액체가 흡수될 때까지 라미나르 플로우 벤치와 같은 깨끗한 환경에서 열린 플레이트를 건조시키거나 덮여 있는 플레이트가 실험실 벤치에서 하룻밤 사이에 건조되도록 하십시오.
- 후드에 말린 종자 RNAi 플레이트의 경우 실온에서 하룻밤(최대 24시간) 웜 박스 내에 말린 접시를 보관하십시오. RT에서 1 일 후, 플레이트는 밀봉 된 가방에 최대 2 주 동안 4 °C에서 보관 할 수 있습니다 (플레이트가 건조되는 것을 방지하기 위해). 사용하기 전에 4°C에 저장된 플레이트가 지퍼 잠금 가방 내의 실온으로 되돌려 응축이 공중 곰팡이 오염을 도입하지 못하도록 허용하십시오.
- 먹이 기반 RNAi를 사용 하는 경우, C. elegans를 추가 하기 전에 적어도 12 시간 동안 실온에 RNAi 접시에 시드 HT115 박테리아를 둡니다. RNAi 플레이트에는 dsRNA 생산을 유도하는 IPTG가 포함되어 있습니다. 대안적으로, IPTG는 파종 2시간 전 1.3.1단계 끝에 액체 배양에 첨가될 수 있다.
- C. 엘레간이 한천에 잠복하는 원인이 되는 한고의 균열을 피하기 위해 실온(며칠 이상)에서 시드 HT115 플레이트를 장기간 보관하지 마십시오.
2. C. 예인자의 동기화
참고: 중력 성인의 알칼리성 하이포클로리트 트리트먼트또는 알래그 레이를 동기화할지 선택합니다.
- 그라비드 성인 동물의 하이포클로리트 처리로 동물을 동기화하여배아(22)의방출을 촉진한다.
- 하이포클로염 치료를 위해, M9 버퍼로 중력 헤르마프로디테를 2회 세척한 다음, 5mL 하이포염용액(하이포염용 3.25mL, M9 완충 1mL, M9 완충 0.75mL)으로 5분 간 재중단된 동물을 흔들어 보아매를 한다. 5 분 후, 동물을 스핀 다운M9 버퍼로 3 번 씻어.
참고: 저염염 치료는프로테오스타증(21)에영향을 미치기 위해 양산되었다. - 하이포염 처리 후에, 배아는 20°C에서 회전하는 M9 용액의 3mL에서 하룻밤 부화할 수 있습니다.
- L1용액 의 10μL을 6cm 플레이트에 3배 떨어뜨리고 L1 동물의 수를 계산하여 시간이 지남에 따라 정착할 L1 동물의 평균 수를 계산하여 ΜL당 L1 동물(또는 대안적으로, 배아)의 밀도를 계산한다. 따라서 L1 솔루션을 주기적으로 혼합하여 침전을 방지합니다.
- 플레이트 당 50 L1 동물을 시드하고, 시드 번호수를 카운트 및 기록하고, 플레이트를 20°C 인큐베이터로 이동합니다. 분석의 시작 부분에 각 접시에 동물의 실제 수를 아는 것이 중요합니다.
참고: M9에서 하룻밤 부화를 통해 L1 동물을 동기화하는 것은 동물을 음식에 넣은 후 발달 이질성을 최소화하기 때문에 일상적으로 사용됩니다. 그러나, 동기화는 기아 단서에 응하여 발달 체포를 통해 생깁니다, 일부 연구에 대 한 피해 야 한다 (참조23 추가 토론에 대 한). 대안으로, 대략 동기화 된 동물은 계란 평신도를 통해 얻을 수 있습니다, 참조 2.2. - 남은 L1 동물을 액체 질소 또는 -80°C 냉동고에 보관하십시오. 이러한 방식으로 실험 설정 시 각 변형의 샘플이 보존되어 향후 연구를 위한 귀중한 리소스를 만들고 재현성을 향상시직합니다.
참고: 하이포염 및 M9 솔루션 레시피의 보충 파일 1을 참조하십시오.
- 하이포클로염 치료를 위해, M9 버퍼로 중력 헤르마프로디테를 2회 세척한 다음, 5mL 하이포염용액(하이포염용 3.25mL, M9 완충 1mL, M9 완충 0.75mL)으로 5분 간 재중단된 동물을 흔들어 보아매를 한다. 5 분 후, 동물을 스핀 다운M9 버퍼로 3 번 씻어.
- 달걀 평신도를 통해 동물을 동기화하려면 4-6 시간 동안 각 접시에 20 명의 젊은 중력 성인 동물 (성인 1 일)을 배치하고 접시 당 약 50 개의 알이 있을 때까지 알을 낳을 수 있습니다. 모든 중력 성인을 제거하고 20 °C 인큐베이터에 계란접시를 이동합니다.
참고 : 중력 성인 동물은 성인의 첫날에 동기화해야합니다. 오래된 동물은 자궁에 보관된 계란을 낳을 수 있습니다, 더 진보된 발달 단계에 있는 계란의 방출을 일으키는 원인이 되는.
3. 자손 생산
참고: 자손 생산을 방지하거나 동기화된 시작 인구를 자손으로부터 분리하기 위한 조치를 취해야 합니다. 자손 생산을 방지하는 것은 여기에 기재되는 플레이트에 5-플루오로-2'-deoxyuridine (FUdR)를 추가하여 화학적으로 달성 될 수 있습니다. 일부 연구는 FUdR proteostasis를 변경할 수 있다고보고24,25. 자손 생산을 방지하기 위한 대체 접근법은 아래에서 논의됩니다.
- 0.2 μm 필터와 10mL 주사기로 FUdR 1g을 10mL의 초순수 H2O. 필터 살균 스톡 FUdR로 용해시켜 FUdR의 1000배 스톡 솔루션을 만드세요. 알리쿼트 1 mL의 스톡을 멸균 1.5 mL 튜브로 넣습니다. 동결 및 -20 °C에서 저장합니다.
- L4 단계까지 20 °C에서 동물을 성장시다. hypochlorite 처리에서 동기화된 L1s에서 제기된 N2 동물은 L4에 도달하기 위하여 20°C에서 약 40 시간의 성장이 필요합니다. 다른 균주의 성장률은 실험 전에 경험적으로 테스트되어야 합니다. C. elegans를 정확하게 무대에 올리는 방법에 대한 자세한 내용은26을참조하십시오.
- L4 동물이 있는 각 6cm 플레이트에 80x FUdR의 100 μL을 추가합니다. L4 단계에서 FUdR을 추가하는 것이 중요합니다.
- 접시를 웜 박스에 반환하고 상자를 지퍼 잠금 가방에 넣습니다. 적절한 인큐베이터로 돌아갑니다.
4. 폴리글루타민 발현 동물을 사용하여 근육 조직의 프로테오스타증 감소 측정
참고: 두 가지 방법은 근육 세포의 프로테오스타증 감소를 식별하는 데 사용할 수 있습니다: 노화 중 단백질 골재의 형성을 이미징(4.1) 마비발병을 통해 나이가 들면서 이러한 골재가 노화로 야기되는 프로테오독성을 측정한다(4.2).
- 노화 중 근육의 폴리글루타민 골형성 을 이미징
참고: 근육 세포에서 단백질 응집의 연령 의존적 진행은 폴리글루타민(polyQ)을 사용하여 이미지화되어 노란색 형광 단백질(YFP)에 융합된 반복이다. 이 프로토콜은 변형 AM140 rmIs132 [unc-54p: Q35::YFP]사용을 간략하게 설명하지만 다른 폴리글루타민 변형 균주도 사용할 수 있습니다. 폴리Q::YFP 트랜스진은 unc-54 근육 특이적 프로모터를 사용하여 근육에서 발현된다. 동기화되지 않은 c-54p::p olyQ::YFP 표현 동물은 성인기의 1일, 2, 3 및 4일째에 시각화됩니다. unc-54p::p olyQ::YFP 골재를 시각화하려면 형광 또는 형광 해부 현미경을 위해 장착된 복합 현미경을 사용하십시오. AM140은 caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)에서 사용할 수 있습니다: https://cgc.umn.edu/strain/AM140.- 이미징 일(성인의 1일, 2일, 3, 4일)에는 20마리의 동물을 선택하고 현미경 슬라이드 셋업에 3% 아가로즈 패드와 10mM 나트륨 아지드의 5μL 드롭(M9 완충제에서 희석)을 장착합니다.
- 모든 동물이 아지드 나트륨(~5분)에 의해 고정된 후, 10배율렌즈(도 1A)를사용하여 동물의 전신을 이미지화한다. 이미징의 경우 FITC 필터와 모든 동물에 대해 동일한 노출을 사용하십시오. 이미징 후 슬라이드를 삭제합니다.
참고: 또는 YFP 포시도 플레이트에 직접 정량화될 수 있지만, 점수 매기기 동안 플레이트에 이산화탄소 스트림을 적용하여 움직임을 억제해야 합니다. 이 대체 방법은 많은 수의 조건을 검사할 때 가장 적합합니다(자세한 내용은 토론 참조). - 이미지를 수집 한 후, 전체 동물의 신체 벽 근육에 초점의 수를 계산합니다. Foci는 백그라운드의 조광 용해 신호와 차별화될 수 있는 더 밝은 구두점 신호입니다.
- 일 1, 2, 3 및 4일로부터 YFP 포시 축적의 진행을 플롯합니다. X가 성년일및 Y의 수를 나타내는 XY 그래프를 플롯합니다.:p olyQ:YFP foci(그림 1B). 실험 조건(예를 들어, 유전자 다운규제 또는 과발현)에서의 포시의 수는 대조동물과 비교된다. 각 평가판에 대해 관찰된 각 시점의 그룹 간의 통계 분석을 수행합니다.
- 두 가지 조건에 대해서만 foci 수를 비교할 때 각 시점에서 독립적인 샘플 t-테스트를 수행합니다.
- 두 개 이상의 조건에 대한 foci 수를 비교할 때 해당 시점의 모든 조건에 대한 데이터를 포함하여 각 시간 지점에 대한 옴니버스 단방향 ANOVA 분석을 수행합니다. 옴니버스 ANOVA가 상당한 p-값(즉, p < 0.005)을 산출하는 경우, 쌍방향 독립적인 샘플 t-테스트와 함께 사후 분석을 수행하여 foci의 현저한 차이가 검출된 특정 조건을 결정합니다(예: A, B 및 C는 A&B, A 및 C, B&C를 비교합니다).
- 근육 세포에서 폴리글루타민 독성에 대한 대리로 동물 마비 율 측정
참고: 근육에 있는 polyQ 집계의 나이 의존적인 증가는 운동을 구동하는 근육 기능의 쇠퇴를 일으키는 원인이 됩니다. 이러한 운동 결함은 폴리Q 표현 동물의 마비의 진행 속도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 마비 분석의 경우, 동기화되지 않은 c-54p::p olyQ::YFP 표현 동물은 성인기의 3일, 5, 7 및 9일째에 득점됩니다. 점수 범위를 확장하는 데 필요한 시간 점을 추가하여 유전 적 혼란의 효과를 평가할 수 있습니다.- 점수 매기기 일 (성인의 3 일, 5, 7 및 9)에서는 50 마리의 동물이 들어있는 6cm 플레이트를보고 마비 된 동물의 수를 기록하십시오. 접시에서 마비된 동물을 제거합니다. 동물이 접시에서 기어 나오거나 죽은 경우 검열해야합니다. 분석을 설명할 수 있도록 이벤트를 기록합니다.
참고: 동물은 가볍거나 부드러운 터치 자극에 노출된 후 움직임이 관찰되지 않을 때 마비된 것으로 간주됩니다. 인두 펌핑 활동은 움직이지 않는 동물이 살아 있는지 또는 죽었는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다. - 실험이 완료되면 각 조건에 대한 마비 속도를 계산합니다. 그 때 그 조건에 관찰된 동물의 총 수로 마비된 동물의 분수를 나누어 매 시점에서 이렇게 하십시오. 시간당 조건당 여러 플레이트를 관찰하는 경우(즉, 플레이트 복제), 각 복제에 대해 별도로 비율을 계산합니다.
- XY 그래프(분산플롯)에서 마비 속도의 진행을 플롯합니다. X는 성인기의 날을 나타내고 Y는 마비율을 나타냅니다. unc-54p::p olyQ::YFP 동물의 마비율은 대조동물(도1C)과비교된다. 그룹 간의 통계 분석을 수행합니다. 여러 번의 시험을 위해, 독립적으로 시험을 취급하십시오. 콕스 비례 위험 회귀및 Wald 테스트를 사용합니다. 생존 분석을 지원하는 대부분의 데이터 분석 도구는 Cox 모델링을 지원합니다.
- 데이터 변환: 각 조건에는 시간별로 두 개의 열과 "이벤트"에 대한 열이 있어야 합니다. 관찰된 각 시점에서 마비된 동물각각에 대해 "0"이 있는 행과 각 검열된 동물에 대해 "1"을 추가합니다. 행의 총 수는 해당 조건에 대한 플레이트의 시작 동물의 수와 같아야 합니다.
- 통계 소프트웨어에 대한 지침에 따라 Cox 비례 위험 모델링을 수행한 다음 Wald 테스트를 수행합니다. 단변형 모델은 일반적인 실험 설계에 적합합니다. 두 가지 이상의 조건에 대해, 포함된 모든 조건을 가진 시험이 중요한 결과(즉, p < 0.005)를 나타내는 경우 조건 간의 쌍별 테스트를 수행하여 조건의 특정 유의한 쌍을 결정할 수 있습니다.
참고: Cox 모델은 테스트 조건이 시간이 지남에 따라 이벤트의 확률을 비례적으로 조절한다는 가정에 의존합니다. 예를 들어 Cox 모델은 대부분의 동물이 1일째에 마비되는 상태를 대부분의 동물이 9일째에 마비되는 조건과 비교하는 데 적합하지 않다는 것을 의미합니다. Cox 모델의 확장 및 각 시점에서 마비된 비율을 비교하기 위한 다른 접근 방식은 비례 위험 가정이 보유하지 않는 경우27,28,29,30을참조하십시오.
- 점수 매기기 일 (성인의 3 일, 5, 7 및 9)에서는 50 마리의 동물이 들어있는 6cm 플레이트를보고 마비 된 동물의 수를 기록하십시오. 접시에서 마비된 동물을 제거합니다. 동물이 접시에서 기어 나오거나 죽은 경우 검열해야합니다. 분석을 설명할 수 있도록 이벤트를 기록합니다.
5. 동물발현화를 사용하여 신경 조직에서 프로테오스타증의 감소를 측정한다.
참고: 두 가지 보완적인 방법은 노화 중 단백질 골재(형광포)의 형성을 정량화하고 (2) 운동 기반 분석법을 통해 뉴런 프로테오메의 노화와 관련된 감소를 측정함으로써 뉴런(1)의 프로테오스타증 감소를 분석하는 데 사용된다.
- 노화 중 뉴런에서 폴리글루타민 골형성 을 이미징
참고: 이미 근육 조직에서 논의된 분석과 유사하게, 뉴런에서 단백질 응집의 연령 의존적 진행은 폴리Q를 발현함으로써 이미지::YFP 융합 단백질은 rgef-1의범뉴신경 조직 특이적 프로모터에 의해 구동된다. 특히 우리는 AM101을 사용: rmIs110 [rgef-1p::Q40:YFP],YFP16에40 글루타민 융합 . rgef-1p::p olyQ::YFP를 시각화하려면 40배배율 렌즈를 사용하여 형광을 위해 장착된 복합 현미경을 사용하십시오. AM101은 CGC에서 사용할 수 있습니다: https://cgc.umn.edu/strain/AM101.- 이미징 일(성인의 4일, 6일, 8, 10일)에는 20마리의 동물을 선택하고 10mM 나트륨 아지드(M9 완충제에서 희석)의 5μL 낙하가 있는 3% 아가로즈 패드를 포함하는 현미경 슬라이드에 장착합니다.
- 모든 동물이 아지드 나트륨(~5분)에 의해 고정된 후, 40x 배율렌즈(도 2A)를사용하여 동물의 머리의 z 스택 이미지를 가져 가라. 이미징 후 슬라이드를 삭제합니다.
- 이미지를 수집한 후 z-스택을 처리하여 최대 투영을 얻고 신경 링 영역에 위치한 뉴런의 포시 수를 정량화하는 데 사용합니다. Foci는 백그라운드의 조광 용해 신호와 차별화될 수 있는 더 밝은 구두점 신호입니다.
참고: 우리는 특히 rgef-1p::p olyQ:::YFP 골재를 정량화하기 위하여 신경 반지 지역을 선택했습니다 이것은 대부분의 뉴런이 시냅스 연결을 만들기 위하여 수렴하는 지역이기 때문에. 그러나, 모터 뉴런에서 의 골형성 수준을 측정하기 위해, rgef-1p::p olyQ:::Dorsal 또는 복부 신경코드에 위치한 YFP 골재는 정량화될 수 있다. - D4, D6, D8 및 D10에서 YFP 포시 축적의 진행을 플롯합니다. X가 성인의 날을 나타내고 Y가 rgef-1p::p olyQ::YFP foci(그림2B)의수를 나타내는 XY 그래프에서 이 작업을 수행합니다. 실험 조건(예를 들어, 유전자 다운규제 또는 과발현)에서의 포시의 수는 대조동물과 비교된다. 뉴런에 대한 포시 카운트의 통계 적 분석은 근육 폴리Q foci와 동일한 방식으로 수행됩니다. 단계 4.1.4 및 관련 메모를 참조하십시오.
- 측정 몸은 뉴런에서 폴리 글루타민 proteo 독성의 대리 측정으로 구부러.
참고: 뉴런 폴리Q의 점진적 인 골재 축적으로부터 유도된 프로테오독성 응력은 스래싱 분석과정을 통해 운동 뉴런 결함을 보고 결정된다. M9 생리적 완충(보충파일 1)에서일시 중단된 상태에서 30초의 기간에 몸의 굴곡 수를 정량화한다.- 성인 2일째에, 접시에서 동기화된 동물 10마리를 선택하고 현미경 슬라이드에 M9 버퍼 10μL 방울을 놓습니다. 40개 이상의 동물의 샘플을 얻으려면 이 단계를 적어도 4번 반복하십시오.
- 비디오는 비디오 지원 카메라가있는 스테레오 현미경에 30 초 동안 M9 버퍼 10 μL로 현미경 슬라이드에 배치 된 10 마리의 동물의 움직임을 기록합니다. 총 샘플 번호 40에 대해 이 단계를 4회 반복합니다. 모든 동물이 30초 동안 프레임에 표시될 수 있도록 줌 및 위치를 조정해야 합니다.
- 분석할 동물과 함께 모든 비디오가 녹화되면 비디오를 재생하고 각 동물의 신체 굴곡을 점수. 한 바디 굽힘은 동물의 외음부가 한쪽에서 반대로 그리고 시작 위치로 돌아갈 때로 정의됩니다.
참고: 야생형 동물은 일반적으로 30초 만에 49± 0.79개의 바디 굽힘이 있습니다. - 각 점이 X 축에서 테스트된 서로 다른 조건과 함께 30s(Y 축)의 바디 굽힘 수를 나타내는 컬럼 그래프에서 각 동물의 바디 굽힘 수를 플롯합니다. unc-54p::p olyQ::YFP 동물의 신체 굴곡 수는 대조동물(도2C)과비교된다. 각 평가판에 대해 그룹 간에 독립적으로 통계 분석을 수행합니다. 분석이 여러 시간 지점에서 반복되는 경우 각 시간 점에 대해 독립적으로 데이터를 분석합니다.
- 두 가지 조건만 고려할 때 독립적인 샘플 t-테스트를 수행합니다.
- 두 개 이상의 조건을 한 번에 고려할 때 먼저 해당 시점의 모든 조건에 대한 데이터를 포함하여 옴니버스 단방향 ANOVA 분석을 수행합니다. 옴니버스 ANOVA가 상당한 p-값(즉, p < 0.005)을 산출하는 경우, 쌍방향 독립적인 샘플 t-테스트를 통해 사후 분석을 수행하여 신체 벤드 수의 현저한 차이가 검출된 특정 조건을 결정합니다.
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Representative Results
C. elegans에서,폴리 글루타민 반복 모델은 전립선 네트워크를 조절하는 유전자의 식별에 중요한 역할을하고있다. 예를 들어, 이전에는 동종 도메인상호작용 단백질 키나아제(hpk-1),전사 적 공동인이 노화 중 프로테오스타증에 영향을 미치는 것으로나타났다. 우리는 HPK-1의손실, RNAi 침묵 또는 hpk-1 (pk1393) null 돌연변이 동물의 손실, 노화 하는 동안 축적 하는 Q35::YFP 집계의 수를 증가 발견. 2일째 성인 대조군 동물은 18.0± 2.7개의 골재를 표시하고, hpk-1(pk1393) null 돌연변이및 hpk-1 RNAi 처리 Q35:YFP 동물은 평균 28± 5.3 및 26.0 ± 5.1 골재, 각각(그림 3A-D)를표시합니다. 마찬가지로, 성인 8일째에는 마크-1(RNAi) 및 hpk-1(pk1393) 동물이 마비된 반면, 대조군 Q35의50%는 ::YFP 동물이 마비되었다(그림3E). 또한, HPK-1은 hpk-1의 유비쿼터스 과발현이 Q35:YFP 포시의 수를 감소시키고 노화시 노화 동물을 보호하기 때문에 단백질 골재 형성을 조절하기에 충분하다::YFP-관련마비(도3E). 총체적으로, 이러한 결과는 HPK-1이 프로테오스타증을 조절하고 폴리Q:YFP 모델이 노화 중 프로테오스타증의 변화에 대한 역유전적 분석을 위해 어떻게 활용될 수 있는지를 강조합니다.
그림 1: 폴리Q::YFP 내의 신경통 근육은 노화 시 점진적인 포시 축적과 마비를 초래합니다. (A) C. elegans unc-54p::Q35:YFP 발현 성인의 1일과 4일 (각각 상하 패널). 화살표는 대표 포시를 나타냅니다. (B)성인기의 처음 4 일 동안 형광 초점의 정량화. Foci는 FRAP15,32,33에저항하며, 용해성 단백질 골재와 일치합니다. 오류 막대는 평균(SEM)(C) unc-54p::Q35::YFP 동물이 노화 중에 마비되는 표준 오류를 나타냅니다. 오류 막대는 표준 비율 오류를 나타냅니다. (B-C)에대한 원시 데이터는 보충 표 1에제공됩니다. 스케일 바는 모든 패널에서 100 μm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 폴리Q::YFP 내의 신경신경은 정상적인 신체 굴곡의 점진적인 포시 축적 및 중단을 초래합니다. (A, 상단) C. elegans 전방의 DIC 이미지. 인두는 180 개의 뉴런의 상호 연결된 클러스터인 신경 링으로 둘러싸인 동물의 머리에 있는 이중 로브 구조입니다. 빨간색 브래킷은 머리 뉴런 내에서 foci에 대한 점수를 나타내는 영역을 나타냅니다. (A, 중간) rgefp-1:Q40::YFP 형광 2 일째 성인기. YFP 식은 가끔 집계(화살표)를 제외하고 크게 확산됩니다. (A, 하단) rgefp-1:Q40::YFP 형광 일째 10 성인. 포시/집계가 표시됩니다(빨간색 화살표). (B)성인기의 첫 10일 동안형형의 적정화. Foci는 FRAP15,32,33에저항하며, 용해성 단백질 골재와 일치합니다. 오류 막대는 평균(C) 야생 유형 및 rgef-1p::Q40::YFP 동물의 평균 주파수의 표준 오차를 나타냅니다 2 성인기일 동안 빈 벡터 RNAi(L4440)에 20°C 공급에서 유지관리됩니다. 글루타민 팽창 증가는 운동결함(15)과상관관계가 있다. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. (B-C)에대한 원시 데이터는 보충 표 1에제공됩니다. 스케일 바는 모든 패널에서 20 μm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HPK-1은 프로테오스타시스를 촉진합니다. (A-C) hpk-1 활성은 근육 세포에서 Q35::YFP 초점의 축적에 영향을 미칩니다. 전시된 Punc-54::p olyQ::YFP 동물은(A)제어 RNAi 또는(B) hpk-1 RNAi, 및(C)형질형 동물들이 hpk-1(Psur-5:HPK-1:CFP)을 과발현하는 대표적인 이미지이다. (D)폴리Q의 시간 과정::YFP 포시 축적과 함께: 제어 RNAi (검은 원), hpk-1 RNAi (흰색 원), hpk-1 (pk1393) (흰색 사각형), 또는 hpk-1 과발현 (열린 삼각형)을 가진 치료. 데이터 포인트는 생물학적 복제당 최소 15마리의 동물의 평균 ± 표준 편차(S.D.)를 표시합니다. 적어도 5개의 독립적인 실험이 수행되었다. (E) Punc-54::p olyQ::YFP 동물과 함께: 제어 RNAi (검은 원), hpk-1 RNAi (흰색 원), hpk-1 (pk1393) (흰색 사각형), 또는 hpk-1 과발현 (열린 삼각형)을 가진 치료. 플롯된 데이터는 단일 대표 평가판에 대한 결과를 표시합니다. 이 그림은 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시(CC BY) 라이선스를 통해 참조31에서 재인쇄됩니다. 스케일 바는 모든 패널에서 100 μm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 결과의 원시 데이터. 표에는 도 2 및 도 3에서포시, 마비 및 바디 굽힘 데이터가 포함됩니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 일상적인 C. elegans 작업에 대 한 일반적인 시약. 일반적인 시약에는 다양한 유형의 플레이트 및 버퍼를 준비하기 위한 레시피가 포함됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
노화는 프로테오스타증의 점진적인 감소를 특징으로 합니다. 프로테오스타증은 단백질 접기, 분해 및 번역의 조정되고 역동적이며 스트레스 반응성이 뛰어난 제어를 위해 복잡한 시스템, 프로테오틱 네트워크로 유지됩니다. 왜 proteostasis 노화의 과정에서 실패 제대로 이해, 하지만 부패 후성 게놈, 스트레스 응답의 감소 유도성 감소, 그리고 보상 크로스 토크의 손실 모두이 고장과 일치. C. elegans에서, 응력 loci2,34,35에서억압적인 크로마틴 자국의 형성으로 인하여 재생산의 개시 후에 몇 시간 안에 응력 반응의 다중 형태의 전사 유도성이 급속히 감소한다. 프로테오스타증 붕괴는 단백질 오접기 질병의 발달의 근간이 되기 때문에 엄청난 임상 문제입니다. 따라서 생체 내에서 세포 프로테오스타시스를 정량화하기 위해 유전 분석에 적합한 방법을 갖는 것은 유기체가 프로테오메의 적절한 접이식 및 기능을 유지하는 방법에 대한 더 깊은 기계론적 통찰력을 얻는 데 필수적이다.
폴리글루타민 형광 리포터의 조직 별 발현을 가진 트랜스제닉 C. 엘레간은 프로테오스타증의 연령 의존적 감소를 연구하는 효과적이고 견고한 방법입니다. 폴리글루타민 모델의 두 가지 가장 눈에 띄는 장점은 다음과 같습니다: (1) 강력한 유전학및 기능성 유전체학과 결합된 조직 특이적 발현은 손상되지 않은 다세포 유기체의 맥락에서 프로테오스타시스 조절자의 발견 과 특성화를 허용하고, (2) 포시 형성의 시각화는 생체내 노화와 관련된 프로테오정성 쇠퇴의 직접적인 정량화를 허용한다. . 많은 경우에 집계 축적과 증가된 proteo 독성 사이에서 상관 관계가 존재하지만, 어떤 경우에는 이 두 표현형이 부정적으로 상관관계가 있습니다. 예를 들어, 인슐린 신호 감소는 수명 및 스트레스 저항을 증가시킵니다: daf-2 돌연변이 동물(인슐린/인슐린과 같은 성장 인자 1 수용체에서 기능의 저형성 손실), 독성 골재 종의 형성을 방지하는 보호 메커니즘의 상향 조절에 의한 프로테오스타증 용량을 개선하면서 골적 부하가 증가됨 을 표시합니다33,36,37,38, 39 . 따라서, 어떤 경우에는 골체 형성이 프로테오메의 나머지 부분에서 유해한 단백질 종을 격리하여 보호된다. 세포 성 독성의 판독은 집계 형성과 함께 평가 될 수 있기 때문에, 하나는 보호 격리 메커니즘에 관련된 유전 상호 작용을 식별하기 위해 역 상관 관계에 대한 테스트 할 수 있습니다. 마지막으로, 폴리글루타민 형광 기자는 조직 특정 녹다운(예를 들어, 조직 특정 RNAi 또는 RNA 헤어핀 발현을 통해 고전적으로) 조직 별 단백질 분해를 통해 결합될 수 있으며, 최근에는 Tir1-auxin시스템(40)과같은 조직별 단백질 분해를 통해 또는 조직별 기자를 이용한 관심 유전자의 조직별 과발현을 통해 조직별 기자및 조직내 조절에 대한 통찰력을 얻을 수 있다.
노화 시 프로테오스타증의 변화를 측정하는 방법은 연대순으로 일치하는 동물이 필요합니다. 따라서 자손의 생산을 방지하거나 시작 동물을 분리할 필요가 있습니다. 프로토콜에서, 우리는 자손 생산을 방지하기 위해 FUdR을 사용하는 방법을 설명하지만, 일부 연구는 FUdR프로테오스타증을 변경할 수 있다고보고24,25. 대안적으로, 여성화 유전 배경은 사용될 수있다 (예를 들어, fer-15 (b26);fem-1 (hc17)41). 마지막으로, 성인 동물은 자손에서 멀리 신선한 RNAi 접시로 이동할 수 있습니다. 이렇게 하면 처리량을 희생하여 배경 고려 사항이 간소화됩니다. 동물을 신선 식품으로 주기적으로 옮기는 것은 dsRNA에 대한 노출을 갱신하고 가능한 기아를 방지하는 추가적인 이점이 있습니다.
형광 포시는 시각적 관찰을 통해 정량화되기 때문에, 하나는 foci의 식별에 정확하고 일관된해야합니다. C. elegans polyQ::YFP 포시는 광표백 후 형광 회복을 통해 생체 단백질 골거재(FRAP)15,32,33으로실험적으로 검증되었다. 추가생화학적 접근법은 단백질응집(42)을평가하는 데 사용될 수 있다. 3일째성성인이 되면 조기 포시가 커지고 위성 의 초점(행성 주변의 달과 유사)으로 나타나는 것을 축적하기 시작한다는 점에 유의해야 합니다. 이러한 위성 foci를 별도의 집계로 계산할지, 아니면 더 보수적이어야 할지, 아니면 집단 영역을 단일 집계로 간주하고, 모든 실험전반에 걸쳐 득점할 때 일관성을 유지할지 결정하는 것이 필수적입니다. 우리는 후자를 선호합니다. 그것은 foci 형성을 평가할 수 있는 동안 동적 범위를 확장, 하지만 이러한 더 보수적인 추정에도, 일 4 – 5 명백한 고원 효과. 실제로 프로테오스타증은 계속 감소하고 있지만, 포시는 너무 많아서 더 이상 눈으로 정확하게 숫자를 정량화할 수 없습니다. 생물학적 시험, 개인 간 및 실험실 간에 재현성을 향상시키기 위해, foci로 득점되는 것을 정의하는 것이 중요합니다.
우리는 unc-54p:::YFP 리포터를 사용하여 프로테오스타증의 변화에 대한 제한된 조건을 테스트하기 위한 간단한 역유전 접근법을 자세히 설명하지만, 프로테오스타시스의 변화가 동시에 100가지 조건(예: RNAi 클론)에 대해 정량화될 수 있는 더 높은 처리량을 가진 방법을 개발했습니다. 이 방법은 우리가 유전 적 동요 후 수명에 있는 변경을 정량화하기 위하여 광범위하게 이용한 복제 세트의 사용을 관련시킵니다. 간략하게, 큰 동소성 인구에서 파생된 독립적인 견본은 시간이 지남에 따라 단일 견본보다는 각 시점에서 채점됩니다. 이 접근법은 마비 (근육 프로모터와 폴리 Q ::YFP사용) 또는 신체 굴곡 (신경 프로모터를 통해)과 같은 노화와 관련된 프로테오독성 변화를 평가하기 위해 쉽게 적응됩니다. 이러한 방식으로 복제 세트 점수는 다중 웰 플레이트의 우물에 액체를 추가하여 C. elegans가 움직이도록 자극합니다. 유사한 접근법은 근육 세포 내의 포시 형성에 쉽게 적용될 수 있습니다. 이전에는 정상(야생형) 수명 또는 인슐린/IGF1 수용체 돌연변이 동물의 수명 증가, 건강 수명과 수명에 대한 정량화된 변화를 확인했습니다. 이들 중, 103개의 유전자 불활성화는 예후 표현형으로 귀착되는데, 동물들은 조기 노화의 하나 이상의 징후를나타낸다(43). Unc-54p::Q35::YFP 리포터와 복제 세트 채점 접근법을 이용한 이차 화면에서, 우리는 가속포시 형성(A.V.S. 미공개 결과)을 생성한 약 50개의 프로게릭 유전자 불활성화를 식별할 수 있었고, 이는 이후 동술학적인 인자 및 3K의 Myc네트워크 모두에 중요한 역할을 확인한 집중된 기계학 연구를 용이하게했습니다. 44. 복제본 집합 방법에 대한 자세한 설명은23에서찾을 수 있습니다.
조건 전반에 걸쳐 polyQ foci의 통계 분석을 위해 여기에 설명된 방법은 각 시간 점 내의 조건을 비교하는 데 초점을 맞추고 있지만, 시간 별 추세가 단일 지점에서 비교보다 더 관심이 있는 경우가 있을 수 있습니다. 동물이 다중 웰 플레이트 또는 미세 유체 장치의 우물에서 단독으로 되는 경우와 같이 시간이 지남에 따라 개별 동물을 추적할 수 있다면 비교적 간단한 반복 조치 ANOVA가 적절할 것입니다. 그러나, 대부분의 경우 동물은 페트리 플레이트에 대량으로 보관되어 개별 추적이 불가능하므로 다른 방법이 필요합니다. 폴리Q 집계 카운트 데이터는 시간 점 간에 자동 상호 연관될 것으로 예상됩니다(예: 포시 개수는 증가하여 시간 점 사이에 독립적이지 않은 조건에 대한 관찰을 해야 함), ARIMA와 같은 상관 관계 오류를 적절히 처리할 수 있는 통계 분석 접근 방식이 필요합니다.
foci 형성 및 운동 결함 은 유전 및 /또는 기능적 게놈 분석에 견딜 수있는 노화의 잘 정의되고 정량화 가능한 분자 특징입니다. 예를 들어, Q35::YFP를 이용한 전방 유전화면은 근육세포 내에서 강화된 응집력을확인하였습니다. C. elegans에 있는 공급 기지를 둔 RNAi의 발달은 또한 proteostasis에 있는 유전자 발견의 기간으로 이끌어 냈습니다: Q35를 표현하는 C. elegans의 게놈 넓은 RNAi 스크린: YFP는 proteostatic 네트워크를 강화하거나 억제하고 따라서 polyQ aggregation39,42를증가하거나 감소시키는 대략 340의 유전 수정자를 확인했습니다.
간단한 기능 적 게놈 화면은 핵심 전립선 네트워크를 공개하는 동안, 이러한 균주는 귀중한 현상 자원 남아있다. Caenorhabditis elegans에서 폴리글루타민 형광 기자의 조직 별 발현은 새로운 유전 적 상호 작용을 식별하기 위해 증강, 억제기 또는 합성 스크린을 통해 확립 된 유전 및 기능적 게놈 도구를 적용 할 수있는 이상적인 시스템입니다45,46. 세포 프로테오스타증, 그리고 전반적인 단백질 항상성을 보존하거나 도전하기 위하여 작동하는 무수한 생리 계통은 복잡한 세포 생물학 및 내분비 그림으로 부상하고 있습니다. 프로테오스타증은 단일 생물학적 통로, 단백질 복합체 또는 세포기관에 의해 표현되지 않는다. 대신, proteostasis는 다중 복잡하고 상호 의존적인 생물학 통로, 기계 및 시스템의 질량 행동의 산물이고, 무수한 환경 스트레스에 의해 도전됩니다. polyQ::YFP 모델을 활용한 향후 연구는 세포가 프로테오메의 적절한 기능과 접기를 유지하는 방법의 복잡성을 해소하는 데 필수적입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 이 원고의 개발을 도운 이 방법의 정교함 및/또는 토론에 도움을 준 새뮤얼슨 연구소의 과거와 현재 회원들에게 감사드립니다. 이 간행물에 보고된 연구는 상 번호 RF1AG062593 및 R21AG064519의 밑에 건강의 국가 학회에 의하여 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 2 mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| Glass microscope cover slips | VWR | 48404-455 | |
| Glass microscope slides | VWR | 160004-422 | |
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| Sodium Azide, CAS #26628-22-8 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software | Zeiss | unknown | |
| Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope | Zeiss | unknown |
References
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