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Biology

Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans

Published: September 7, 2021 doi: 10.3791/61100
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center

Summary

El deterioro proteostático es un sello distintivo del envejecimiento, que facilita la aparición de enfermedades neurodegenerativas. Esbozamos un protocolo para medir cuantificablemente la proteostasis en dos tejidos diferentes de Caenorhabditis elegans a través de la expresión heteróloga de repeticiones de poliglutamina fusionadas a un reportero fluorescente. Este modelo permite un rápido análisis genético in vivo de la proteostasis.

Abstract

La capacidad de mantener la función adecuada y el plegamiento del proteoma (homeostasis de proteínas) disminuye durante el envejecimiento normal, lo que facilita la aparición de un número creciente de enfermedades asociadas a la edad. Por ejemplo, las proteínas con expansiones de poliglutamina son propensas a la agregación, como se ejemplifica con la proteína huntingtina y la aparición concomitante de la enfermedad de Huntington. El deterioro del proteoma asociado a la edad ha sido ampliamente estudiado mediante el uso de Caenorhabditis elegans transgénicos que expresan repeticiones poliQ fusionadas a una proteína fluorescente amarilla (YFP). Este modelo animal transgénico polyQ::YFP facilita la cuantificación directa de la disminución asociada a la edad del proteoma a través de imágenes de la formación progresiva de focos fluorescentes (es decir, agregados de proteínas) y la posterior aparición de defectos de locomoción que se desarrollan como resultado del colapso del proteoma. Además, la expresión del transgén polyQ::YFP puede ser impulsada por promotores específicos del tejido, lo que permite la evaluación de la proteostasis a través de los tejidos en el contexto de un organismo multicelular intacto. Este modelo es altamente susceptible de análisis genético, proporcionando así un enfoque para cuantificar el envejecimiento que es complementario a los ensayos de vida útil. Describimos cómo medir con precisión la formación de focos poliQ::YFP dentro de las neuronas o el músculo de la pared corporal durante el envejecimiento, y la posterior aparición de defectos de comportamiento. A continuación, destacamos cómo estos enfoques se pueden adaptar para un mayor rendimiento y posibles aplicaciones futuras utilizando otras estrategias emergentes para el análisis genético de C. elegans.

Introduction

La homeostasis proteica (proteostasis) se define como la capacidad celular para mantener la función adecuada y el plegamiento del proteoma. El desafío inherente a la proteostasis es garantizar que todas las proteínas se plieguen y mantengan adecuadamente en una conformación nativa, que se amplifica aún más por la naturaleza variada del tamaño de la proteína, la composición de aminoácidos, la conformación estructural, la estabilidad, la renovación, la expresión, la compartimentación subcelular y las modificaciones1. La proteostasis se mantiene a través de la acción coordinada de una gran red proteostática, que consta de aproximadamente 2000 proteínas únicas, que regulan la síntesis adecuada, el plegamiento, el tráfico y la degradación dentro del proteoma2,3. Los componentes del caballo de batalla de la red proteostática son nueve familias principales de chaperonas moleculares4. Cada tejido y tipo de célula utiliza preferentemente subconjuntos específicos de chaperonas moleculares, presumiblemente en alineación con las diferentes demandas de distintos proteomas5.

Un sello distintivo del envejecimiento normal del organismo es la disminución progresiva y el colapso de la proteostasis celular, que se cree que es una base subyacente para la aparición y progresión de un número creciente de enfermedades asociadas a la edad. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) comparten una característica común: en cada caso, la manifestación de la neurodegeneración es impulsada por alteraciones genéticas que predisponen a una proteína mutante a la agregación (amiloide-β / Tau, α-sinucleína, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1, respectivamente)6,7,8,9,10 . Durante el envejecimiento, la integridad y la inducibilidad de la red proteostática disminuyen, lo que resulta en la acumulación de agregados proteotóxicos que resultan en disfunción celular y neurodegeneración. Cabe destacar que las enfermedades conformacionales de proteínas no son exclusivas de las neuronas y ocurren en múltiples tejidos, como lo destacan la diabetes tipo II, el mieloma múltiple y la fibrosis quística11,12,13,14. Por lo tanto, dilucidar mecanismos capaces de preservar la proteostasis facilitará el desarrollo de intervenciones específicas para el tratamiento de la enfermedad y para promover un envejecimiento saludable.

El pequeño nematodo del suelo Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha sido fundamental en el descubrimiento de genes y vías de elucidación que alteran la proteostasis. Muchos componentes de la red proteostática y las vías de transducción de señales que regulan la proteostasis se conservan evolutivamente. Además, C. elegans ha reducido la complejidad y la redundancia en relación con los sistemas de vertebrados, lo que lo hace más susceptible al análisis genético y al descubrimiento de genes. Las ventajas adicionales de C. elegans que lo han llevado a ser ampliamente utilizado como un sistema modelo para estudiar la proteostasis incluyen: una poderosa genómica genética y funcional, un ciclo de vida corto (3 días) y una vida útil (3 semanas), un genoma compacto y bien anotado, la disponibilidad de una amplia variedad de mutantes genéticos y la facilidad de visualizar cambios específicos de tejidos en la biología celular utilizando reporteros fluorescentes.

La desintegración progresiva de la proteostasis durante el envejecimiento se puede cuantificar fácilmente en C. elegans. El laboratorio Morimoto demostró por primera vez que una expansión de poliglutamina fusionada con la proteína fluorescente amarilla(polyQ::YFP)podría usarse para cuantificar la disminución proteostática en C. elegans durante el envejecimiento15,16,17,18. Las fusiones de YFP a 35 repeticiones de glutamina o más resultan en una formación asociada a la edad de focos fluorescentes junto con signos de patología celular. Cabe destacar que este rango de expansión de glutamina refleja la longitud del tracto de poliglutamina de la proteína Huntingtina en la que la patología de la enfermedad de Huntington comienza a observarse en humanos (típicamente >35 repeticiones CAG)19. Se han utilizado cepas con expresión de polyQ::YFP dentro de las células musculares, intestinales o neuronales para confirmar que la disminución de la proteostasis asociada a la edad ocurre en diferentes tipos de células y tejidos. La expresión de poliQ::YFP específica del músculo (es decir, unc-54p::Q35::YFP)ha sido el reportero específico de tejido más utilizado, ya que los focos fluorescentes acumulados son fáciles de cuantificar durante los primeros días de la edad adulta utilizando un microscopio de disección fluorescente simple(Figura 1A-1B). Además, los animales se paralizan durante la mediana edad, ya que el proteoma dentro del músculo colapsa debido al efecto proteotóxico del reportero(Figura 1C). Del mismo modo, la disminución asociada a la edad en la proteostasis neuronal puede ser seguida (rgef-1p::Q40::YFP) cuantificando directamente la formación de focos/agregados y las disminuciones asociadas a la edad en las curvas coordinadas del cuerpo después de colocar a los animales en líquido(Figura 2).

Aquí, presentamos un protocolo detallado sobre cómo medir la progresión dependiente de la edad de la acumulación de agregados proteicos y la proteotoxicidad asociada inducida por la expresión de repeticiones de poliglutamina dentro del tejido neuronal y muscular en C. elegans. Proporcionamos ejemplos de resultados típicos generados utilizando estas cepas y métodos. Además, mostramos cómo hemos utilizado estos métodos para estudiar la regulación transcripcional de la red proteostática. Discutimos formas adicionales en que estos reporteros pueden integrarse fácilmente con otros reactivos existentes o adaptarse para pantallas más grandes.

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Protocol

1. Preparación de reactivos

  1. Seleccionar genes de interés para ser inactivados a través de RNAi basado en la alimentación. Comprar existencias de HT115 E. coli que contengan el clon de ARNi de interés20. Alternativamente, subclone el ADNc del gen de interés en el sitio multiclonación del plásmido L4440.
    NOTA: Para prevenir la degradación de dsRNA dentro de las bacterias, use la cepa HT115. Se trata de una cepa de E. coli deficiente en RNasa III con actividad de la polimerasa T7 inducible por IPTG. Para los estudios de proteostasis que no utilizan ARNi basado en la alimentación, se puede utilizar HT115 u OP50 E. coli en placas NGM estándar.
  2. Prepare placas de 5 x 6 cm por condición de prueba. Para experimentos con ARNi, inducir la producción de dsRNA en HT115 E. colitransformada. Para los estudios sin ARNi, se puede utilizar OP50 E. coli en placas NGM estándar (consulte el Archivo Suplementario 1 para recetas estándar de placas NGM y RNAi).
    NOTA: Las placas de ARNi se pueden almacenar a 4 °C durante varios meses antes de sembrar con bacterias.
  3. Cultivar cultivos de E. coli durante la noche (16-20 h) a 37 °C en una incubadora de agitación a 220 rpm. Cultivar HT115 E. coli en caldo de Luria (LB) con ampicilina (50 μg/mL).
    NOTA: OP50 E. coli estándar no es resistente a los antibióticos, pero también están disponibles variantes resistentes a la estreptomicina.
    1. Concentrar las bacterias por centrifugación a 2.400 x g durante 15-20 min en una centrífuga de sobremesa, aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 1/10 del volumen inicial (es decir, concentración de 10x) de LB con ampicilina para HT115, o LB sin ampicilina para OP50 estándar.
    2. Alícuota 200 μL de bacterias concentradas 10x a cada placa (3-4 réplicas por condición de prueba, con 2 placas de respaldo adicionales, para ser utilizadas en caso de contaminación).
    3. Permita que las placas abiertas se sequen en un ambiente limpio, como un banco de flujo laminar hasta que todo el líquido haya sido absorbido o permita que las placas cubiertas se sequen en un banco de laboratorio durante la noche.
  4. Para las placas de ARNi con semillas secas en una campana, guarde las placas secas dentro de una caja de gusanos durante la noche (hasta 24 horas) a temperatura ambiente. Después de 1 día en RT, las placas se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas en una bolsa sellada (para evitar que las placas se sequen). Antes de su uso, permita que las placas almacenadas a 4 °C vuelvan a temperatura ambiente dentro de la bolsa con cierre hermético para evitar que la condensación introduzca contaminantes fúngicos en el aire.
    1. Cuando use ARNi a base de alimentación, deje las bacterias HT115 con semillas en placas de ARNi a temperatura ambiente durante al menos 12 horas antes de agregar C. elegans. Las placas de ARNi contienen IPTG, que induce la producción de dsRNA. Alternativamente, IPTG se puede agregar a los cultivos líquidos al final del paso 1.3.1, 2 horas antes de la siembra.
    2. Evite el almacenamiento a largo plazo de las placas HT115 con semillas a temperatura ambiente (más de unos pocos días) para evitar el agrietamiento del agar que hará que C. elegans se excave en el agar.

2. Sincronización de C. elegans

NOTA: Elija si desea sincronizar C. elegans mediante el tratamiento con hipoclorito alcalino de adultos grávidos o la puesta de huevos.

  1. Sincronizar animales mediante el tratamiento con hipoclorito de animales adultos grávidos para promover la liberación de embriones22.
    1. Para el tratamiento con hipoclorito, lave los hermafroditas grávidos 2 veces con tampón M9, luego resuspenda en solución de hipoclorito de 5 ml (3,25 ml de solución de hipoclorito, 1 ml de tampón M9 y 0,75 ml de 5 M NaOH) durante 5 minutos, agitando a los animales resuspendidos cada minuto. Después de 5 minutos, gire hacia abajo a los animales y lávese 3 veces con el amortiguador M9.
      NOTA: Se ha postulado que el tratamiento con hipoclorito afecta a la proteostasis21.
    2. Después del tratamiento con hipoclorito, deje que los embriones eclosionen durante la noche en 3 ml de solución M9 con rotación a 20 ° C.
    3. Calcule la densidad de los animales L1 (o alternativamente, embriones) por μL dejando caer 10 μL de solución L1 3x en una placa de 6 cm y contando el número de animales L1 para calcular el número promedio de animales L1 por μL. Los animales L1 se asentarán con el tiempo. Por lo tanto, mezcle periódicamente las soluciones L1 para evitar la sedimentación.
    4. Sembrar 50 animales L1 por placa, contar y registrar el número de semillas, y mover las placas a una incubadora de 20 °C. Es importante conocer el número real de animales en cada plato al comienzo del ensayo.
      NOTA: La sincronización de los animales L1 mediante la eclosión nocturna en M9 se utiliza de forma rutinaria, ya que minimiza la heterogeneidad del desarrollo después de colocar a los animales en los alimentos. Sin embargo, la sincronización ocurre a través de la detención del desarrollo en respuesta a las señales de inanición, que para algunos estudios deben evitarse (ver23 para una discusión adicional). Como alternativa, se pueden obtener animales aproximadamente sincronizados a través de una puesta de huevos, véase 2.2.
    5. Congele y almacene los animales L1 sobrantes en nitrógeno líquido o en un congelador de -80 °C. De esta manera, se conserva una muestra de cada cepa en el momento de la configuración experimental, creando un recurso valioso para futuros estudios y mejorando la reproducibilidad.
      NOTA: Consulte el Archivo suplementario 1 para obtener recetas de solución de hipoclorito y M9.
  2. Para sincronizar a los animales a través de la puesta de huevos, coloque 20 animales adultos grávidos jóvenes (día 1 de la edad adulta) en cada plato durante 4-6 horas, y permítales poner huevos hasta que haya aproximadamente 50 huevos por plato. Retire todos los adultos grávidos y mueva las placas con huevos a una incubadora de 20 ° C.
    NOTA: Los animales adultos grávidos deben sincronizarse al primer día de la edad adulta. Los animales más viejos pueden poner huevos que han sido retenidos en el útero, causando la liberación de huevos que se encuentran en una etapa de desarrollo más avanzada.

3. Producción de progenie

NOTA: Se deben tomar medidas para prevenir la producción de progenie o para separar a la población inicial sincronizada de su progenie. La prevención de la producción de progenie se puede lograr químicamente con la adición de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR) a las placas, que se describe aquí. Algunos estudios han reportado que FUdR puede alterar la proteostasis24,25. A continuación se analizan enfoques alternativos para prevenir la producción de progenie.

  1. Haga una solución de stock 1000x de FUdR disolviendo 1 g de FUdR en 10 mL de H2O ultrapuro. Esterilice el material FUdR con un filtro de 0,2 μm y una jeringa de 10 ml. Alícuota 1 mL de caldo en un tubo estéril de 1,5 mL. Congelar y conservar a -20 °C.
  2. Cultivar animales a 20 °C hasta la etapa L4. Los animales N2 criados a partir de L1 sincronizados procedentes del tratamiento con hipoclorito requieren aproximadamente 40 horas de crecimiento a 20 °C para alcanzar L4. Las tasas de crecimiento de otras cepas deben probarse empíricamente antes de la experimentación. Para obtener más información sobre cómo organizar con precisión C. elegans, véase26.
    1. A cada placa de 6 cm con animales L4, agregue 100 μL de 80x FUdR. Es fundamental agregar FUdR en la etapa L4.
  3. Devuelva las placas a una caja de gusanos y coloque la caja en una bolsa con cierre hermético. Regrese a la incubadora apropiada.

4. Medición de la disminución de la proteostasis en el tejido muscular mediante el uso de animales que expresan poliglutamina

NOTA: Se pueden utilizar dos métodos para identificar la disminución de la proteostasis en las células musculares: obtener imágenes de la formación de agregados de proteínas durante el envejecimiento (4.1) y medir la proteotoxicidad que estos agregados causan con la edad hasta el inicio de la parálisis (4.2).

  1. Imágenes de la formación de agregados de poliglutamina en el músculo durante el envejecimiento
    NOTA: La progresión dependiente de la edad de la agregación de proteínas en las células musculares se toma como imagen utilizando repeticiones de poliglutamina (polyQ) fusionadas a una proteína fluorescente amarilla (YFP). Este protocolo describe el uso de la cepa AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP], pero también se pueden utilizar otras cepas variantes de poliglutamina. El transgén polyQ::YFP se expresa en el músculo utilizando el promotor específico del músculo unc-54. Los animales sincronizados unc-54p::p olyQ::YFP que expresan se visualizan en los días 1, 2, 3 y 4 de la edad adulta. Para visualizar los agregados unc-54p::p olyQ::YFP, utilice un microscopio compuesto equipado para fluorescencia o un microscopio de disección fluorescente. AM140 está disponible en el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) en: https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
    1. En los días de imagen (día 1, 2, 3 y 4 de la edad adulta), elija 20 animales y monte en una configuración de portaobjetos de microscopio con una almohadilla de agarosa al 3% y una gota de 5 μL de azida de sodio de 10 mM (diluida en tampón M9).
    2. Después de que todos los animales sean inmovilizados por azida de sodio (~ 5 minutos), imagine el cuerpo completo de los animales usando una lente de aumento de 10x(Figura 1A). Para la obtención de imágenes, use un filtro FITC y la misma exposición para cada animal. Deseche las diapositivas después de la obtención de imágenes.
      NOTA: Alternativamente, los focos de YFP también se pueden cuantificar directamente en las placas, pero el movimiento debe inhibirse aplicando una corriente de dióxido de carbono en la placa mientras se califica. Este método alternativo es el más apropiado cuando se detec un gran número de afecciones (consulte la discusión para obtener más detalles).
    3. Después de la adquisición de imágenes, cuente el número de focos en los músculos de la pared del cuerpo de todo el animal. Los focos son señales puntuadas más brillantes que se pueden diferenciar de la señal soluble de atenuación en el fondo.
    4. Trazar la progresión de la acumulación de focos de YFP a partir de los días 1, 2, 3 y 4. Grafique un gráfico XY donde X representa los días de la edad adulta e Y representa el número de focos unc-54p::p olyQ::YFP (Figura 1B). El número de focos en la condición experimental (por ejemplo, regulación a la baja o sobreexpresión de genes) se compara con los animales de control. Realizar análisis estadísticos entre los grupos en cada punto de tiempo observado para cada ensayo.
      1. Al comparar los recuentos de focos para solo dos condiciones, realice una prueba t de muestra independiente en cada punto de tiempo.
      2. Al comparar los recuentos de focos para más de dos condiciones, realice un análisis ANOVA unidireccional ómnibus para cada punto de tiempo, incluidos los datos de todas las condiciones en ese punto de tiempo. Si el ANOVA ómnibus arroja un valor p significativo (es decir, p < 0,005), realice un análisis post-hoc con pruebas t de muestra independientes por pares para determinar las condiciones específicas entre las cuales se detectó una diferencia significativa en los focos (por ejemplo, para los grupos A, B y C comparar A & B, A & C, y B & C).
  2. Medición de las tasas de parálisis animal como sustituto de la toxicidad por poliglutamina en las células musculares
    NOTA: El aumento dependiente de la edad de los agregados de polyQ en el músculo causa la disminución de la función muscular que impulsa la locomoción. Este defecto en la locomoción se puede determinar midiendo la tasa progresiva de parálisis en animales que expresan poliQ. Para el ensayo de parálisis, los animales sincronizados que expresan unc-54p: :p olyQ:: YFP se califican en los días 3, 5, 7 y 9 de la edad adulta. Agregue puntos de tiempo adicionales, según sea necesario para ampliar el rango de puntuación, de modo que pueda evaluar el efecto de la perturbación genética.
    1. En los días de puntuación (día 3, 5, 7 y 9 de la edad adulta), mire las placas de 6 cm que contienen 50 animales y registre el número de animales paralizados. Retire los animales paralizados del plato. Si los animales se han arrastrado fuera del plato, o han muerto, deben ser censurados; registrar el evento para que pueda ser contabilizado en el análisis.
      NOTA: Se considera que un animal está paralizado cuando no se observa ningún movimiento después de exponerlo a estímulos ligeros o de tacto suave. La actividad de bombeo faríngeo se utiliza para determinar si los animales que no se están en movimiento están vivos o muertos.
    2. Al finalizar el experimento, calcule la tasa de parálisis para cada condición. Haga esto en cada punto de tiempo dividiendo la fracción de animales paralizados por el número total de animales observados para esa condición en ese momento. Si observa varias placas por condición por punto de tiempo (es decir, placas replicantes), calcule la relación por separado para cada réplica.
    3. Trazar la progresión de la tasa de parálisis en un gráfico XY (diagrama de dispersión). X representa los días de la edad adulta e Y representa las tasas de parálisis. La tasa de parálisis de los animales unc-54p::p olyQ::YFP se compara con los animales de control (Figura 1C). Realizar análisis estadísticos entre los grupos; para ensayos múltiples, tratar los ensayos de forma independiente. Utilice la regresión de riesgos proporcionales de Cox y la prueba de Wald. La mayoría de las herramientas de análisis de datos que apoyan el análisis de supervivencia también admiten el modelado de Cox.
      1. Transformar los datos: cada condición debe tener dos columnas, una para el tiempo y otra para el "evento". En cada punto de tiempo observado, agregue una fila con "0" para cada animal paralizado y un "1" para cada animal censurado. El número total de filas debe ser igual al número de animales de partida en el plato para esa condición.
      2. Realice el modelado de cox proporcionales-peligros, seguido de la prueba de Wald, de acuerdo con las instrucciones de su software estadístico. Un modelo univariado será apropiado para los diseños de experimentos típicos. Para más de dos condiciones, si una prueba con todas las condiciones incluidas indica un resultado significativo (es decir, p < 0,005), se pueden realizar pruebas por pares entre condiciones para determinar el par o pares significativos específicos de condiciones.
        NOTA: El modelo de Cox se basa en la suposición de que las condiciones de prueba modulan la probabilidad de un evento proporcionalmente a lo largo del tiempo. Esto significa, por ejemplo, que el modelo de Cox no sería apropiado para comparar una condición bajo la cual la mayoría de los animales están paralizados en el día 1 con una condición bajo la cual la mayoría de los animales están paralizados en el día 9. Las extensiones del modelo de Cox, y otros enfoques para comparar proporciones paralizadas en cada punto temporal, están disponibles para los casos en que la suposición de riesgos proporcionales no se mantiene, ver27,28,29,30.

5. Medición de la disminución de la proteostasis en el tejido neuronal mediante el uso de animales que expresan poliglutamina.

NOTA: Se utilizan dos métodos complementarios para analizar la disminución de la proteostasis en las neuronas (1) cuantificando la formación de agregados de proteínas (focos fluorescentes) durante el envejecimiento y (2) midiendo la disminución asociada a la edad en el proteoma neuronal a través de un ensayo basado en el movimiento.

  1. Imágenes de la formación de agregados de poliglutamina en las neuronas durante el envejecimiento
    NOTA: Similar al ensayo ya discutido en el tejido muscular, la progresión dependiente de la edad de la agregación de proteínas en las neuronas se imagina expresando una proteína de fusión polyQ::YFP impulsada por el promotor pan-neuronal específico del tejido de rgef-1. Concretamente utilizamos AM101: rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP],una fusión de cuarenta glutaminas a YFP16. Para visualizar rgef-1p::p olyQ::YFP, utilice un microscopio compuesto equipado para la fluorescencia con una lente de aumento de 40x. AM101 está disponible en el CGC en: https://cgc.umn.edu/strain/AM101.
    1. En los días de imagen (día 4, 6, 8 y 10 de la edad adulta), elija 20 animales y monte en un portaobjetos de microscopio que contenga una almohadilla de agarosa al 3% con una caída de 5 μL de azida de sodio de 10 mM (diluida en tampón M9).
    2. Después de que todos los animales sean inmovilizados por azida de sodio (~ 5 minutos), tome imágenes de la pila z de la cabeza de los animales usando una lente de aumento de 40x(Figura 2A). Deseche las diapositivas después de la obtención de imágenes.
    3. Después de la adquisición de imágenes, procese las pilas z para obtener la máxima proyección y utilice para cuantificar el número de focos en las neuronas ubicadas en el área del anillo nervioso. Los focos son señales puntuadas más brillantes que se pueden diferenciar de la señal soluble de atenuación en el fondo.
      NOTA: Seleccionamos específicamente el área del anillo nervioso para cuantificar los agregados de rgef-1p::p olyQ::YFP, ya que esta es la región donde convergen la mayoría de las neuronas para hacer conexiones sinápticas. Sin embargo, para medir los niveles de formación de agregados en las neuronas motoras, se pueden cuantificar los agregados rgef-1p::p olyQ::YFP ubicados en el cordón nervioso dorsal o ventral.
    4. Trazar la progresión de la acumulación de focos de YFP de D4, D6, D8 y D10. Haga esto en un gráfico XY donde X representa los días de la edad adulta e Y representa el número de focos rgef-1p::p olyQ::YFP (Figura 2B). El número de focos en la condición experimental (por ejemplo, regulación a la baja o sobreexpresión de genes) se compara con los animales de control. El análisis estadístico de los recuentos de focos para las neuronas se realiza de la misma manera que para los focos poliQ musculares; consulte los pasos 4.1.4 y las notas asociadas.
  2. Medición de las curvas corporales como una medida sustituta de la proteotoxicidad de la poliglutamina en las neuronas.
    NOTA: El estrés proteotóxico inducido por la acumulación agregada progresiva de polyQ neuronal se determina observando los defectos de las neuronas motoras a través de un ensayo de golpeo. Cuantificar el número de curvas del cuerpo en un período de 30 segundos mientras está suspendido en el tampón fisiológico M9 (Archivo suplementario 1).
    1. En el día 2 de la edad adulta, recoja 10 animales sincronizados de la placa y colóquelos en una gota de 10 μL de tampón M9 en un portaobjetos de microscopio. Repita este paso al menos cuatro veces para obtener una muestra de 40 o más animales.
    2. Graba en vídeo el movimiento de los 10 animales colocados en el portaobjetos del microscopio con 10 μL de búfer M9 durante un período de 30 s en un estereomicroscopio con una cámara con capacidad de vídeo. Repita este paso 4 veces para un número total de muestra de 40. El zoom y la posición deben ajustarse de tal manera que todos los animales sean visibles en el marco durante los 30 segundos completos.
    3. Una vez grabados todos los vídeos con los animales a analizar, reproduce el vídeo y puntúa las curvas corporales de cada animal. Una curva del cuerpo se define como cuando la vulva del animal va de un lado al opuesto y todo el camino de regreso a la posición inicial.
      NOTA: Encontramos que los animales de tipo salvaje suelen tener 49 ± 0,79 curvas corporales en 30 segundos.
    4. Traza el número de curvas del cuerpo para cada animal en un gráfico de columnas donde cada punto representa el número de curvas del cuerpo en 30 s (eje Y) con las diferentes condiciones probadas en el eje X. El número de curvas corporales de los animales unc-54p::p olyQ::YFP se compara con los animales de control (Figura 2C). Realizar análisis estadísticos entre los grupos de forma independiente para cada ensayo; si el ensayo se repite en varios puntos de tiempo, analice los datos de forma independiente para cada punto de tiempo.
      1. Cuando considere solo dos condiciones, realice una prueba t de muestra independiente.
      2. Al considerar más de dos condiciones a la vez, primero realice un análisis ANOVA unidireccional ómnibus, que incluya los datos de todas las condiciones en ese contrarreloj / punto de tiempo. Si el ANOVA ómnibus arroja un valor p significativo (es decir, p < 0,005), realice un análisis post-hoc con pruebas t de muestra independientes por pares para determinar las condiciones específicas entre las cuales se detectó una diferencia significativa en el recuento de curvas corporales.

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Representative Results

En C. elegans,el modelo de repetición de poliglutamina ha sido fundamental para la identificación de genes que regulan la red proteostática. Por ejemplo, anteriormente demostramos que la proteína quinasa que interactúa con el homeodominio(hpk-1),un cofactor transcripcional, influye en la proteostasis durante el envejecimiento al regular la expresión de la autofagia y las chaperonas moleculares31. Encontramos que la pérdida de hpk-1,ya sea por silenciamiento de ARNi o en animales mutantes nulos hpk-1(pk1393), aumenta el número de agregados Q35::YFP que se acumulan durante el envejecimiento. Los animales de control adultos del día 2 muestran 18.0 ± 2.7 agregados, mientras que los animales mutantes nulos hpk-1 (pk1393) y hpk-1 RNAi tratados Q35::YFP promediaron 28 ± 5.3 y 26.0 ± agregados de 5.1, respectivamente (Figura 3A-D). Del mismo modo, para el día 8 de la edad adulta, el 77-78% de los animales hpk-1 (RNAi) y hpk-1 (pk1393) estaban paralizados, mientras que el 50% de los animales de control Q35::YFP estaban paralizados (Figura 3E). Además, HPK-1 es suficiente para regular la formación de agregados de proteínas, ya que la sobreexpresión ubicua de hpk-1 reduce el número de focos Q35::YFP en el tejido muscular y protege a los animales envejecidos de Q35:: Parálisis asociada aYFPdurante el envejecimiento(Figura 3E). En conjunto, estos resultados demuestran que HPK-1 regula la proteostasis y destaca cómo el modelo polyQ::YFP se puede utilizar para el análisis genético inverso de los cambios en la proteostasis durante el envejecimiento.

Figure 1
Figura 1: La expresión de polyQ::YFP dentro del músculo C. elegans resulta en acumulación progresiva de focos y parálisis durante el envejecimiento. (A) Expresión de C. elegans unc-54p::Q35::YFP en los días 1 y 4 de la edad adulta (panel superior e inferior, respectivamente). Las flechas indican focos representativos. (B) Cuantificación de focos fluorescentes durante los primeros 4 días de la edad adulta. Los focos son resistentes a FRAP15,32,33,consistentes con un agregado proteico insoluble. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) (C) unc-54p::Q35::YFP los animales se paralizan durante el envejecimiento. Las barras de error representan el error estándar de proporción. Los datos brutos para (B-C) se proporcionan en la Tabla suplementaria 1. La barra de escala representa 100 μm en todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La expresión de polyQ::YFP dentro de las neuronas de C. elegans da como resultado la acumulación progresiva de focos y la interrupción de las curvas normales del cuerpo. (A, arriba) Imagen DIC de la C. elegans anterior. La faringe es una estructura bilobulada en la cabeza del animal, que está rodeada por el anillo nervioso, un grupo interconectado de 180 neuronas. Los corchetes rojos indican la región para puntuar los focos dentro de las neuronas de la cabeza. (A, medio) rgefp-1::Q40::YFP fluorescencia en el día 2 de la edad adulta. Tenga en cuenta que la expresión de YFP es en gran medida difusa, con la excepción de un agregado ocasional (flecha). (A, abajo) rgefp-1::Q40::YFP fluorescencia en el día 10 de la edad adulta. Se indican focos/agregados (flecha roja). (B) Cuantificación de focos fluorescentes durante los primeros 10 días de la edad adulta. Los focos son resistentes a FRAP15,32,33,consistentes con un agregado proteico insoluble. Las barras de error representan el error estándar de la media (C) Frecuencia típica de curvas corporales de tipo salvaje y rgef-1p::Q40::YFP animales mantenidos a 20°C alimentándose de RNAi vectorial vacío (L4440) en los días 2 de la edad adulta. El aumento de la expansión de la glutamina se correlaciona con defectos de movimiento15. Las barras de error representan el error estándar de la media. Los datos brutos para (B-C) se proporcionan en la Tabla suplementaria 1. La barra de escala representa 20 μm en todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: HPK-1 promueve la proteostasis. (A-C) La actividad de hpk-1 afecta la acumulación de focos Q35::YFP en las células musculares. Se muestran imágenes representativas de animales Punc-54::p olyQ::YFP tratados con (A) RNAi de control o (B) HPk-1 RNAi, y (C) animales transgénicos que sobreexpresan hpk-1 (Psur-5::HPK-1::CFP). (D) Curso temporal de la acumulación de focos poliQ::YFP junto con: tratamiento con RNAi de control (círculos negros), HPK-1 RNAi (círculos blancos), hpk-1(pk1393) (cuadrados blancos) o sobreexpresión de hpk-1 (triángulos abiertos). Los puntos de datos muestran la media ± desviación estándar (DE) de al menos 15 animales por réplica biológica; se realizaron al menos 5 experimentos independientes. (E) Curso temporal de la parálisis de los animales Punc-54::p olyQ::YFP junto con: tratamiento con RNAi de control (círculos negros), HPK-1 RNAi (círculos blancos), hpk-1 (pk1393) (cuadrados blancos) o sobreexpresión de hpk-1 (triángulos abiertos). Los datos trazados muestran los resultados de un único ensayo representativo. Esta figura se reimprime de la referencia31 con permiso a través de una licencia Creative Commons Attribution (CC BY). La barra de escala representa 100 μm en todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla suplementaria 1: Datos brutos de resultados. La tabla incluye datos de focos, parálisis y curvatura corporal de la Figura 2 y la Figura 3. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Expediente suplementario 1: Reactivos comunes para el trabajo rutinario de C. elegans. Los reactivos comunes incluyen recetas para preparar varios tipos de platos y tampones. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El envejecimiento se caracteriza por una disminución gradual de la proteostasis. La proteostasis es mantenida por un sistema complejo, la red proteostática, para el control coordinado, dinámico y sensible al estrés del plegamiento, la degradación y la traducción de proteínas. Por qué la proteostasis falla en el curso del envejecimiento es poco conocida, pero un epigenoma en descomposición, la disminución de la inducibilidad de las respuestas al estrés y la pérdida de diafonía compensatoria coinciden con esta ruptura. En C. elegans, la inducibilidad transcripcional de múltiples formas de respuesta al estrés disminuye rápidamente dentro de unas pocas horas después del inicio de la reproducción debido a la formación de marcas represivas de cromatina en los loci2,34,35. El colapso de la proteostasis es un problema clínico masivo, ya que subyace al desarrollo de enfermedades de plegamiento erróneo de proteínas. Por lo tanto, tener un método adecuado para el análisis genético para cuantificar la proteostasis celular in vivo es esencial para obtener una visión mecanicista más profunda de cómo los organismos mantienen el plegamiento y la función adecuados del proteoma.

Los transgénicos C. elegans con expresión tisular específica de un reportero fluorescente de poliglutamina son un método efectivo y robusto para estudiar la disminución de la proteostasis dependiente de la edad. Los dos beneficios más destacados del modelo de poliglutamina son: (1) la expresión específica del tejido combinada con una poderosa genética y genómica funcional permite el descubrimiento y la caracterización de los reguladores de la proteostasis en el contexto de un organismo multicelular intacto, y (2) la visualización de la formación de focos permite la cuantificación directa de la disminución proteostática asociada a la edad in vivo. . Si bien en muchos casos existe una correlación entre la acumulación agregada y el aumento de la proteotoxicidad, en algunos casos, estos dos fenotipos se correlacionan negativamente. Por ejemplo, la disminución de la señalización de la insulina aumenta la vida útil y la resistencia al estrés: los animales mutantes de daf-2 (una pérdida hipomórfica de la función en el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina / insulina 1), muestran una mayor carga agregada al tiempo que mejoran la capacidad de proteostasis mediante la regulación ascendente de un mecanismo de protección que evita la formación de especies agregadas tóxicas33,36 , 37,38,39 . Por lo tanto, en algunos casos la formación de agregados es protectora al secuestrar especies de proteínas dañinas del resto del proteoma. Dado que las lecturas de la proteotoxicidad celular se pueden evaluar junto con la formación de agregados, se pueden probar correlaciones inversas para identificar las interacciones genéticas involucradas en los mecanismos de secuestro protector. Por último, los reporteros fluorescentes de poliglutamina se pueden combinar con el derribo específico del tejido (por ejemplo, clásicamente a través de la expresión de RNAi o HORQUILLA de ARN específico del tejido) y, más recientemente, a través de la degradación de proteínas específicas del tejido, como el sistema Tir1-auxina40,o con la sobreexpresión específica del tejido de un gen de interés utilizando reporteros específicos del tejido, obteniendo así información sobre la regulación de la proteostasis dentro y a través de las células y tejidos.

Los métodos para medir los cambios en la proteostasis durante el envejecimiento requieren animales cronológicamente emparejados. Por lo tanto, es necesario evitar la producción de crías o separar a los animales de partida. En el protocolo, describimos cómo usar FUdR para prevenir la producción de progenie, pero algunos estudios han informado que FUdR puede alterar la proteostasis24,25. Alternativamente, se pueden usar antecedentes genéticos feminizados (por ejemplo, fer-15 (b26); fem-1 (hc17)41). Por último, los animales adultos se pueden mover a placas de ARNi frescas lejos de la progenie. Esto simplifica las consideraciones de fondo a expensas del rendimiento. Mover periódicamente a los animales a alimentos frescos tiene las ventajas adicionales de renovar la exposición al dsRNA y prevenir una posible inanición.

Debido a que los focos fluorescentes se cuantifican a través de la observación visual, se debe ser preciso y consistente en la identificación de los focos. Se ha verificado experimentalmente que los focos de C. elegans polyQ::YFP son agregados de proteínas in vivo a través de la recuperación de fluorescencia después del fotobleaching (FRAP)15,32,33. Se pueden utilizar enfoques bioquímicos adicionales para evaluar la agregación de proteínas42. Es importante tener en cuenta que para el día 3 de la edad adulta, los focos tempranos se hacen más grandes y comienzan a acumular lo que aparecen como focos satelitales (análogos a las lunas alrededor de un planeta). Es esencial decidir antes de comenzar si contar estos focos satelitales como agregados separados, o ser más conservadores y considerar el área colectiva como un solo agregado, y luego permanecer consistentes al puntuar a lo largo de todos los experimentos. Preferimos lo segundo; extiende el rango dinámico durante el cual se puede evaluar la formación de focos, pero incluso con estas estimaciones más conservadoras, para el día 4 – 5 hay un aparente efecto de meseta. En realidad, la proteostasis continúa disminuyendo, pero los focos son tan numerosos que ya no es posible cuantificar el número con precisión a simple vista. Para mejorar la reproducibilidad a través de ensayos biológicos, entre individuos y entre laboratorios, es fundamental definir lo que se está calificando como focos.

Si bien detallamos los métodos para enfoques genéticos inversos simples para probar un conjunto limitado de condiciones para los cambios en la proteostasis utilizando el reportero unc-54p::Q35::YFP, hemos desarrollado métodos con mayor rendimiento donde los cambios en la proteostasis se pueden cuantificar para hasta 100 condiciones (por ejemplo, clones de ARNi) simultáneamente. Este método implica el uso de conjuntos de réplicas, que hemos utilizado ampliamente para cuantificar los cambios en la vida útil después de la perturbación genética. Brevemente, las muestras independientes derivadas de una gran población isogénica se puntúan en cada punto de tiempo, en lugar de una sola muestra a lo largo del tiempo. Este enfoque se adapta fácilmente para evaluar los cambios proteotóxicos asociados a la edad, como la parálisis (utilizando el poli-Q::YFP con el promotor muscular) o las curvas corporales (a través del promotor neuronal). La puntuación del conjunto de réplicas de esta manera implica agregar líquido a los pozos de una placa de múltiples pozos, lo que estimula a C. elegans a moverse. Un enfoque análogo se puede aplicar fácilmente a la formación de focos dentro de las células musculares. Anteriormente, identificamos 159 genes necesarios para una vida útil normal (tipo salvaje) o el aumento de la vida útil de los animales mutantes con receptores de insulina / IGF1 disminuidos, y cuantificamos los cambios en la duración de la salud y la vida útil. De estos, 103 inactivaciones de genes resultan en un fenotipo progerico, con animales que muestran uno o más signos de envejecimiento prematuro43. En una pantalla secundaria utilizando el reportero unc-54p::Q35::YFP y un enfoque de puntuación de conjunto de réplicas, pudimos identificar aproximadamente 50 inactivaciones de genes progéricos que produjeron una formación acelerada de focos (resultados no publicados de A.V.S.), lo que posteriormente facilitó estudios mecanicistas enfocados donde identificamos un papel crítico tanto para la red Myc de factores de transcripción como para el cofactor transcripcional HPK-1 en el mantenimiento de la proteostasis31, 44. Una descripción detallada del método del conjunto de réplicas se puede encontrar en23.

Los métodos descritos aquí para el análisis estadístico de los focos de polyQ a través de las condiciones se centran en comparar las condiciones dentro de cada punto de tiempo, sin embargo, puede haber casos en los que la tendencia a través del tiempo sea de más interés que una comparación en un solo punto. Si es posible rastrear animales individuales a lo largo del tiempo, como si los animales están unidos en pozos de placas de múltiples pozos o dispositivos microfluídicos, sería apropiado un ANOVA de medidas repetidas relativamente simple. Sin embargo, la mayoría de las veces los animales se mantienen a granel en placas de Petri, lo que hace que dicho seguimiento individual sea inviable y, por lo tanto, se necesitan diferentes métodos. Se espera que los datos de recuento agregado de polyQ se autocorrelacionen entre puntos de tiempo (por ejemplo, los recuentos de focos solo deben aumentar, haciendo que las observaciones para una condición dada no sean independientes entre los puntos de tiempo), lo que requiere un enfoque de análisis estadístico que pueda manejar adecuadamente el error correlacionado, como ARIMA.

Tanto la formación de focos como los defectos de movimiento son características moleculares bien definidas y cuantificables del envejecimiento que son tratables para el análisis genómico genético y / o funcional. Por ejemplo, un cribador genético avanzado utilizando C. elegans que expresa Q35::YFP dentro de las células musculares identificó una agregación mejorada después de la pérdida de unc-30,un factor de transcripción específico de la neurona que regula la síntesis del neurotransmisor inhibidor ácido gamma-aminobutírico (GABA)32. El desarrollo de ARNi basado en la alimentación en C. elegans también condujo a un período de descubrimiento de genes en proteostasis: una pantalla de ARNi de todo el genoma de C. elegans que expresa Q35::YFP identificó aproximadamente 340 modificadores genéticos que mejoran o inhiben la red proteostática y, por lo tanto, aumentan o disminuyen la agregación poliQ39,42.

Si bien las pantallas genómicas funcionales sencillas revelaron una red proteostática central, estas cepas siguen siendo un recurso fenotípico invaluable. La expresión tisular específica de los reporteros fluorescentes de poliglutamina en Caenorhabditis elegans es un sistema ideal en el que se pueden aplicar herramientas genómicas genéticas y funcionales establecidas a través de potenciadores, supresores o pantallas sintéticas para identificar nuevas interacciones genéticas45,46. La proteostasis celular, y la miríada de sistemas fisiológicos que operan para preservar o desafiar la homeostasis general de las proteínas, está emergiendo como una imagen biológica y endocrina celular complicada. La proteostasis no está representada por una sola vía biológica, complejo proteico u orgánulo. En cambio, la proteostasis es el producto de la acción masiva de múltiples vías, máquinas y sistemas biológicos intrincados e interdependientes, y es desafiada por innumerables factores estresantes ambientales. Los estudios futuros que utilicen el modelo polyQ::YFP serán esenciales para desentrañar la complejidad de cómo las células mantienen la función adecuada y el plegamiento del proteoma.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a los miembros pasados y presentes del laboratorio Samuelson por su ayuda en el refinamiento de este método y / o discusión que ayudó al desarrollo de este manuscrito. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio RF1AG062593 y R21AG064519. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
2 mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
96-pin plate replicator Nunc 250520
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
bacto-peptone VWR 90000-368
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
Glass microscope cover slips VWR 48404-455
Glass microscope slides VWR 160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
Sodium Azide, CAS #26628-22-8 Sigma-Aldrich S2002
Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software Zeiss unknown
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope Zeiss unknown

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Biología Número 175 proteostasis poliglutamina polyQ::YPC, C. elegans,envejecimiento biomarcador homeostasis de proteínas análisis genético genómica funcional
Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en <em>Caenorhabditis elegans</em>
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