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Biology

Quantification du déclin protéostatique spécifique aux tissus chez Caenorhabditis elegans

Published: September 7, 2021 doi: 10.3791/61100
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center

Summary

Le déclin protéostatique est une caractéristique du vieillissement, facilitant l’apparition de maladies neurodégénératives. Nous décrivons un protocole pour mesurer quantifiablement la protéostase dans deux tissus différents de Caenorhabditis elegans par l’expression hétérologue de répétitions de polyglutamine fusionnées à un rapporteur fluorescent. Ce modèle permet une analyse génétique in vivo rapide de la protéostasie.

Abstract

La capacité de maintenir le bon fonctionnement et le repliement du protéome (homéostasie des protéines) diminue au cours du vieillissement normal, facilitant l’apparition d’un nombre croissant de maladies associées à l’âge. Par exemple, les protéines avec des expansions de polyglutamine sont sujettes à l’agrégation, comme en témoigne la protéine huntingtine et l’apparition concomitante de la maladie de Huntington. La détérioration du protéome associée à l’âge a été largement étudiée grâce à l’utilisation de Caenorhabditis elegans transgénique exprimant des répétitions polyQ fusionnées à une protéine fluorescente jaune (YFP). Ce modèle animal transgénique polyQ::YFP facilite la quantification directe du déclin du protéome associé à l’âge en imageant la formation progressive de foyers fluorescents (c.-à-d. les agrégats de protéines) et l’apparition subséquente de défauts de locomotion qui se développent à la suite de l’effondrement du protéome. De plus, l’expression du transgène polyQ::YFP peut être entraînée par des promoteurs spécifiques aux tissus, ce qui permet d’évaluer la protéostase à travers les tissus dans le contexte d’un organisme multicellulaire intact. Ce modèle se prête très bien à l’analyse génétique, fournissant ainsi une approche pour quantifier le vieillissement qui est complémentaire aux tests de durée de vie. Nous décrivons comment mesurer avec précision la formation de foyers polyQ::YFP dans les neurones ou les muscles de la paroi corporelle pendant le vieillissement, et l’apparition ultérieure de défauts de comportement. Ensuite, nous soulignons comment ces approches peuvent être adaptées pour un débit plus élevé et des applications futures potentielles en utilisant d’autres stratégies émergentes pour l’analyse génétique de C. elegans.

Introduction

L’homéostasie protéique (protéostasie) est définie comme la capacité cellulaire à maintenir le bon fonctionnement et le repliement du protéome. Le défi inhérent à la protéostasie est de s’assurer que toutes les protéines sont correctement repliées et maintenues dans une conformation native, qui est encore amplifiée par la nature variée de la taille des protéines, de la composition en acides aminés, de la conformation structurelle, de la stabilité, du renouvellement, de l’expression, du compartimentation subcellulaire et des modifications1. La protéostasie est maintenue grâce à l’action coordonnée d’un grand réseau protéostatique, composé d’environ 2000 protéines uniques, qui régulent la synthèse, le repliement, le trafic et la dégradation appropriés dans le protéome2,3. Les composants de travail du réseau protéostatique sont neuf grandes familles de chaperons moléculaires4. Chaque type de tissu et de cellule utilise préférentiellement des sous-ensembles spécifiques de chaperons moléculaires, probablement en alignement avec les différentes exigences de protéomes distincts5.

L’une des caractéristiques du vieillissement normal de l’organisme est le déclin progressif et l’effondrement de la protéostasie cellulaire, qui est considérée comme une base sous-jacente pour l’apparition et la progression d’un nombre croissant de maladies associées à l’âge. Par exemple, la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington et la sclérose latérale amyotrophique (SLA) partagent une caractéristique commune: dans chaque cas, la manifestation de la neurodégénérescence est entraînée par des altérations génétiques qui prédisposent une protéine mutante à l’agrégation (amyloïde-β / Tau, α-synucléine, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1, respectivement)6,7,8,9,10 . Au cours du vieillissement, l’intégrité et l’inductibilité du réseau protéostatique diminuent, ce qui entraîne l’accumulation d’agrégats protéotoxiques qui entraînent un dysfonctionnement cellulaire et une neurodégénérescence. Il convient de noter que les maladies conformationnelles protéiques ne sont pas uniques aux neurones et se produisent dans plusieurs tissus, comme en témoignent le diabète de type II, le myélome multiple et la fibrose kystique11,12,13,14. Par conséquent, l’élucidation des mécanismes capables de préserver la protéostasie facilitera le développement d’interventions ciblées pour le traitement de la maladie et pour favoriser un vieillissement en bonne santé.

Le petit nématode du sol Caenorhabditis elegans (C. elegans) a joué un rôle déterminant dans la découverte de gènes et l’élucidation des voies qui modifient la protéostase. De nombreux composants du réseau protéostatique et les voies de transduction du signal qui régulent la protéostasie sont conservés de manière évolutionaire. En outre, C. elegans a réduit la complexité et la redondance par rapport aux systèmes vertébrés, ce qui le rend plus propice à l’analyse génétique et à la découverte de gènes. Parmi les autres avantages de C. elegans qui lui ont permis d’être largement utilisé comme système modèle pour étudier la protéostase, citons : une génomique génétique et fonctionnelle puissante, un cycle de vie court (3 jours) et une durée de vie (3 semaines), un génome compact et bien annoté, la disponibilité d’un large assortiment de mutants génétiques et la facilité de visualiser les changements spécifiques aux tissus en biologie cellulaire à l’aide de rapporteurs fluorescents.

La désintégration progressive de la protéostase au cours du vieillissement peut être facilement quantifiée chez C. elegans. Le laboratoire Morimoto a d’abord démontré qu’une expansion de polyglutamine fusionnée à une protéine fluorescente jaune (polyQ::YFP) pouvait être utilisée pour quantifier le déclin protéostatique de C. elegans au cours du vieillissement15,16,17,18. Les fusions YFP à 35 répétitions de glutamine ou plus entraînent une formation associée à l’âge de foyers fluorescents ainsi que des signes de pathologie cellulaire. Il convient de noter que cette plage d’expansion de la glutamine reflète la longueur du tractus polyglutaminique de la protéine huntingtine à laquelle la pathologie de la maladie de Huntington commence à être observée chez l’homme (généralement >35 CAG se répète)19. Des souches avec expression de polyQ::YFP dans les cellules musculaires, intestinales ou neuronales ont été utilisées pour confirmer que le déclin de la protéostase associé à l’âge se produit dans différents types de cellules et de tissus. L’expression polyQ::YFP spécifique aux muscles (c.-à-d. unc-54p::Q35::YFP) a été le rapporteur spécifique aux tissus le plus largement utilisé, car les foyers fluorescents accumulés sont faciles à quantifier au cours des premiers jours de l’âge adulte à l’aide d’un simple microscope à dissection fluorescente(Figure 1A-1B). De plus, les animaux deviennent paralysés au milieu de leur vie, car le protéome dans le muscle s’effondre en raison de l’effet protéotoxique du rapporteur(Figure 1C). De même, le déclin associé à l’âge de la protéostase neuronale peut être suivi (rgef-1p::Q40::YFP) en quantifiant directement la formation de foyers / agrégats et les déclins associés à l’âge dans les courbures corporelles coordonnées après avoir placé les animaux dans un liquide (Figure 2).

Ici, nous présentons un protocole détaillé sur la façon de mesurer la progression dépendante de l’âge de l’accumulation d’agrégats de protéines et la protéotoxicité associée induite par l’expression de répétitions de polyglutamine dans le tissu neuronal et musculaire chez C. elegans. Nous fournissons des exemples de résultats typiques générés à l’aide de ces souches et méthodes. De plus, nous montrons comment nous avons utilisé ces méthodes pour étudier la régulation transcriptionnelle du réseau protéostatique. Nous discutons d’autres façons dont ces rapporteurs peuvent être facilement intégrés à d’autres réactifs existants ou adaptés pour des écrans plus grands.

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Protocol

1. Préparation des réactifs

  1. Sélectionner les gènes d’intérêt à inactiver via l’ARNi basé sur l’alimentation. Acheter des stocks de HT115 E. coli contenant le clone d’ARNi d’intérêt20. Alternativement, sous-clonez l’ADNc du gène d’intérêt dans le site de multicloning du plasmide L4440.
    REMARQUE: Pour éviter la dégradation de l’ARNds dans les bactéries, utilisez la souche HT115. Il s’agit d’une souche d’E. coli déficiente en RNase III avec une activité polymérase T7 inductible IPTG. Pour les études de protéostasie qui n’utilisent pas d’ARNi à base d’alimentation, HT115 ou OP50 E. coli sur des plaques NGM standard peuvent être utilisés.
  2. Préparez 5 plaques de 6 cm par condition d’essai. Pour les expériences utilisant l’ARNi, induire la production d’ARNd dans HT115 E. colitransformé. Pour les études sans ARNi, OP50 E. coli sur des plaques de NGM standard peut être utilisé (voir le fichier supplémentaire 1 pour les recettes d’assiettes de NGM et d’ARNi standard).
    REMARQUE: Les plaques d’ARNi peuvent être conservées à 4 °C pendant plusieurs mois avant l’ensemencement avec des bactéries.
  3. Cultiver des cultures d’E. coli pendant la nuit (16-20 h) à 37 °C dans un incubateur à agitation à 220 tr/min. Cultivez HT115 E. coli dans un bouillon Luria (LB) avec de l’ampicilline (50 μg/mL).
    REMARQUE: OP50 E. coli standard n’est pas résistant aux antibiotiques, mais des variantes résistantes à la streptomycine sont également disponibles.
    1. Concentrer les bactéries par centrifugation à 2 400 x g pendant 15 à 20 min dans une centrifugeuse de paillasse, aspirer le surnageant et suspendre la pastille dans 1/10e du volume de départ (c’est-à-dire 10x concentration) de LB avec ampicilline pour HT115, ou LB sans ampicilline pour OP50 standard.
    2. Aliquote 200 μL de bactéries concentrées 10x dans chaque plaque (3-4 répliques par condition d’essai, avec 2 plaques de secours supplémentaires, à utiliser en cas de contamination).
    3. Laissez sécher les plaques ouvertes dans un environnement propre tel qu’un banc à écoulement laminaire jusqu’à ce que tout le liquide ait été absorbé ou laissez les plaques couvertes sécher sur un banc de laboratoire pendant la nuit.
  4. Pour les plaques d’ARNi ensemencées séchées dans une hotte, conservez les plaques séchées dans une boîte à vers pendant la nuit (jusqu’à 24 heures) à température ambiante. Après 1 jour à TA, les assiettes peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 2 semaines dans un sac scellé (pour éviter que les plaques ne se dessèchent). Avant utilisation, laissez les plaques entreposées à 4 °C revenir à la température ambiante dans le sac à fermeture à glissière afin d’éviter que la condensation n’introduise de contaminants fongiques en suspension dans l’air.
    1. Lorsque vous utilisez de l’ARNi à base d’alimentation, laissez les bactéries HT115 ensemencées sur des plaques d’ARNi à température ambiante pendant au moins 12 heures avant d’ajouter C. elegans. Les plaques d’ARNi contiennent de l’IPTG, qui induit la production d’ARNds. Alternativement, IPTG peut être ajouté aux cultures liquides à la fin de l’étape 1.3.1, 2 heures avant l’ensemencement.
    2. Évitez le stockage à long terme des plaques HT115 ensemencées à température ambiante (supérieure à quelques jours) pour éviter la fissuration de la gélose qui entraînera l’enfouissement de C. elegans dans la gélose.

2. Synchronisation de C. elegans

REMARQUE: Choisissez de synchroniser C. elegans par un traitement à l’hypochlorite alcalin des adultes gravides ou par la ponte.

  1. Synchroniser les animaux par traitement à l’hypochlorite des animaux adultes gravides pour favoriser la libération d’embryons22.
    1. Pour le traitement à l’hypochlorite, laver les hermaphrodites gravides 2 fois avec un tampon M9, puis ressuspenter dans une solution d’hypochlorite de 5 mL (3,25 mL de solution d’hypochlorite, 1 mL de tampon M9 et 0,75 mL de NaOH) pendant 5 min, en agitant les animaux resuspendés toutes les minutes. Après 5 min, faites tourner les animaux et lavez 3 fois avec un tampon M9.
      REMARQUE: Le traitement à l’hypochlorite a été postulé pour affecter la protéostasie21.
    2. Après le traitement à l’hypochlorite, laisser éclore les embryons pendant la nuit dans 3 mL de solution de M9 avec rotation à 20 °C.
    3. Calculer la densité des animaux L1 (ou alternativement, des embryons) par μL en déposant 10 μL de solution L1 3x sur une plaque de 6 cm et en comptant le nombre d’animaux L1 pour calculer le nombre moyen d’animaux L1 par μL. Les animaux L1 s’installeront au fil du temps. Par conséquent, mélangez périodiquement les solutions L1 pour éviter la décantation.
    4. Ensemencez 50 animaux L1 par plaque, comptez et enregistrez le nombre d’animaux ensemencés et déplacez les plaques vers un incubateur à 20 °C. Il est important de connaître le nombre réel d’animaux sur chaque plaque au début de l’essai.
      REMARQUE: La synchronisation des animaux L1 par éclosion nocturne dans M9 est couramment utilisée car elle minimise l’hétérogénéité du développement après avoir placé des animaux sur des aliments. Cependant, la synchronisation se produit par arrêt du développement en réponse à des signaux de famine, ce qui, pour certaines études, devrait être évité (voir23 pour plus de discussion). Comme alternative, des animaux grossièrement synchronisés peuvent être obtenus par une ponte, voir 2.2.
    5. Congeler et conserver les restes d’animaux L1 dans de l’azote liquide ou dans un congélateur à -80 °C. De cette façon, un échantillon de chaque souche au moment de la configuration expérimentale est préservé, créant ainsi une ressource précieuse pour les études futures et améliorant la reproductibilité.
      REMARQUE: Voir le fichier supplémentaire 1 pour les recettes d’hypochlorite et de solution M9.
  2. Pour synchroniser les animaux via la ponte, placez 20 jeunes animaux adultes gravides (jour 1 de l’âge adulte) sur chaque assiette pendant 4 à 6 heures et laissez-les pondre jusqu’à ce qu’il y ait environ 50 œufs par assiette. Retirez tous les adultes gravides et déplacez les assiettes avec les œufs dans un incubateur à 20 °C.
    REMARQUE: Les animaux adultes gravides doivent être synchronisés le premier jour de l’âge adulte. Les animaux plus âgés peuvent pondre des œufs qui ont été retenus dans l’utérus, provoquant la libération d’œufs qui sont à un stade de développement plus avancé.

3. Production de descendance

REMARQUE: Des mesures doivent être prises pour empêcher la production de progéniture ou pour séparer la population de départ synchronisée de leur progéniture. La prévention de la production de descendance peut être obtenue chimiquement avec l’ajout de 5-Fluoro-2'-désoxyuridine (FUdR) aux plaques, qui est décrit ici. Certaines études ont rapporté que FUdR peut altérer la protéostasie24,25. D’autres approches pour prévenir la production de progéniture sont discutées ci-dessous.

  1. Faire une solution mère 1000x de FUdR en dissolvant 1 g de FUdR dans 10 mL de H2O ultrapur. Filtrer le FUdR sur papier avec un filtre de 0,2 μm et une seringue de 10 mL. Aliquote 1 mL de bouillon dans un tube stérile de 1,5 mL. Congeler et conserver à -20 °C.
  2. Faire pousser les animaux à 20 °C jusqu’au stade L4. Les animaux N2 élevés à partir de L1 synchronisés issus d’un traitement à l’hypochlorite ont besoin d’environ 40 heures de croissance à 20 °C pour atteindre L4. Les taux de croissance d’autres souches doivent être testés empiriquement avant l’expérimentation. Pour plus de détails sur la façon de mettre en scène avec précision C. elegans, voir26.
    1. À chaque plaque de 6 cm avec des animaux L4, ajoutez 100 μL de 80x FUdR. Il est essentiel d’ajouter FUdR au stade L4.
  3. Retournez les plaques dans une boîte à vis sans fin et mettez la boîte dans un sac à fermeture à glissière. Retournez à l’incubateur approprié.

4. Mesurer le déclin de la protéostasie dans le tissu musculaire en utilisant des animaux exprimant la polyglutamine

NOTE: Deux méthodes peuvent être utilisées pour identifier le déclin de la protéostasie dans les cellules musculaires: l’imagerie de la formation d’agrégats de protéines au cours du vieillissement (4.1) et la mesure de la protéotoxicité que ces agrégats provoquent avec l’âge jusqu’au début de la paralysie (4.2).

  1. Imagerie de la formation d’agrégats de polyglutamine dans le muscle pendant le vieillissement
    REMARQUE: La progression dépendante de l’âge de l’agrégation des protéines dans les cellules musculaires est imagée à l’aide de répétitions de polyglutamine (polyQ) fusionnées à une protéine fluorescente jaune (YFP). Ce protocole décrit l’utilisation de la souche AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP], mais d’autres souches variantes de polyglutamine peuvent également être utilisées. Le transgène polyQ::YFP est exprimé dans le muscle à l’aide du promoteur spécifique au muscle unc-54. Synchronisé unc-54p::p olyQ::YFP exprimant les animaux sont visualisés aux jours 1, 2, 3 et 4 de l’âge adulte. Pour visualiser les agrégats unc-54p::p olyQ::YFP, utilisez un microscope composé équipé pour la fluorescence ou un microscope à dissection fluorescente. AM140 est disponible auprès du Caenorhabditis Genetics Center (CGC) à l’adresse suivante : https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
    1. Les jours d’imagerie (jour 1, 2, 3 et 4 de l’âge adulte), choisissez 20 animaux et montez-les sur une lame de microscope avec un tampon d’agarose à 3% et une goutte de 5 μL d’azide de sodium de 10 mM (dilué dans un tampon M9).
    2. Une fois que tous les animaux sont immobilisés par l’azide de sodium (~ 5 minutes), imagez le corps entier des animaux à l’aide d’une lentille de grossissement 10x (Figure 1A). Pour l’imagerie, utilisez un filtre FITC et la même exposition pour chaque animal. Ignorez les diapositives après l’imagerie.
      REMARQUE: Alternativement, les foyers YFP peuvent également être quantifiés directement sur les plaques, mais le mouvement doit être inhibé en appliquant un flux de dioxyde de carbone sur la plaque lors de la notation. Cette méthode alternative est la plus appropriée lors du dépistage d’un grand nombre de conditions (voir la discussion pour plus de détails).
    3. Après l’acquisition d’images, comptez le nombre de foyers dans les muscles de la paroi corporelle de l’animal entier. Les foyers sont des signaux ponctués plus lumineux qui peuvent être différenciés du signal soluble plus faible en arrière-plan.
    4. Tracez la progression de l’accumulation de foyers YFP à partir des jours 1, 2, 3 et 4. Tracez un graphique XY où X représente les jours de l’âge adulte et Y représente le nombre de foyers unc-54p::p olyQ::YFP (Figure 1B). Le nombre de foyers dans la condition expérimentale (p. ex., régulation négative des gènes ou surexpression) est comparé à celui des animaux témoins. Effectuer une analyse statistique entre les groupes à chaque point temporel observé pour chaque essai.
      1. Lorsque vous comparez le nombre de foyers pour seulement deux conditions, effectuez un test t d’échantillon indépendant à chaque point temporel.
      2. Lorsque vous comparez le nombre de foyers pour plus de deux conditions, effectuez une analyse ANOVA omnibus unidirectionnelle pour chaque point temporel, y compris les données de toutes les conditions à ce point temporel. Si l’ANOVA omnibus donne une valeur de p significative (c.-à-d. p < 0,005), effectuez une analyse post-hoc avec des tests t d’échantillon indépendants par paires pour déterminer les conditions spécifiques entre lesquelles une différence significative de foyers a été détectée (par exemple, pour les groupes A, B et C, comparez A & B, A & C et B & C).
  2. Mesurer les taux de paralysie animale comme substitut de la toxicité des polyglutamines dans les cellules musculaires
    REMARQUE: L’augmentation dépendante de l’âge des agrégats polyQ dans les muscles provoque le déclin de la fonction musculaire qui entraîne la locomotion. Ce défaut de locomotion peut être déterminé en mesurant le taux progressif de paralysie chez les animaux exprimant polyQ. Pour le test de paralysie, les animaux exprimant unc-54p::p olyQ::YFP synchronisés sont notés aux jours 3, 5, 7 et 9 de l’âge adulte. Ajoutez des points de temps supplémentaires, au besoin pour étendre la plage de notation, de sorte que vous puissiez évaluer l’effet de la perturbation génétique.
    1. Les jours de pointage (jour 3, 5, 7 et 9 de l’âge adulte), regardez les plaques de 6 cm contenant 50 animaux et enregistrez le nombre d’animaux paralysés. Retirez les animaux paralysés de l’assiette. Si des animaux ont rampé hors de l’assiette ou sont morts, ils devraient être censurés; enregistrer l’événement afin qu’il puisse être pris en compte dans l’analyse.
      REMARQUE: Un animal est considéré comme paralysé lorsqu’aucun mouvement n’est observé après l’avoir exposé à des stimuli légers ou doux au toucher. L’activité de pompage pharyngé est utilisée pour déterminer si les animaux immobiles sont vivants ou morts.
    2. À la fin de l’expérience, calculez le taux de paralysie pour chaque condition. Faites-le à chaque point temporel en divisant la fraction d’animaux paralysés par le nombre total d’animaux observés pour cette condition à ce moment-là. Si vous observez plusieurs plaques par condition et par point temporel (c.-à-d. des plaques répliquées), calculez le ratio séparément pour chaque répétition.
    3. Tracez la progression du taux de paralysie dans un graphique XY (nuage de points). X représente les jours de l’âge adulte et Y représente les taux de paralysie. Le taux de paralysie des animaux unc-54p::p olyQ::YFP est comparé à celui des animaux témoins(Figure 1C). Effectuer une analyse statistique entre les groupes; pour plusieurs essais, traiter les essais indépendamment. Utilisez la régression proportionnelle des risques de Cox et le test de Wald. La plupart des outils d’analyse de données qui prennent en charge l’analyse de survie prennent également en charge la modélisation de Cox.
      1. Transformez les données : chaque condition doit avoir deux colonnes, une pour le temps et une autre pour « événement ». À chaque point temporel observé, ajoutez une ligne avec « 0 » pour chaque animal paralysé et un « 1 » pour chaque animal censuré. Le nombre total de rangées devrait être égal au nombre d’animaux de départ sur la plaque pour cette condition.
      2. Effectuez la modélisation des risques proportionnels de Cox, suivie du test de Wald, conformément aux instructions de votre logiciel statistique. Un modèle univarié conviendra aux plans d’expérience typiques. Pour plus de deux conditions, si un essai avec toutes les conditions incluses indique un résultat significatif (c.-à-d. p < 0,005), des tests par paires entre les conditions peuvent être effectués pour déterminer la ou les paires de conditions significatives spécifiques.
        REMARQUE : Le modèle de Cox repose sur l’hypothèse que la ou les conditions d’essai modulent la probabilité d’un événement proportionnellement au fil du temps. Cela signifie, par exemple, que le modèle de Cox ne serait pas approprié pour comparer une condition dans laquelle la plupart des animaux sont paralysés au jour 1 à une condition dans laquelle la plupart des animaux sont paralysés au jour 9. Des extensions du modèle de Cox, et d’autres approches pour comparer les proportions paralysées à chaque point temporel, sont disponibles pour les cas où l’hypothèse des risques proportionnels ne tient pas, voir27,28,29,30.

5. Mesurer le déclin de la protéostasie dans le tissu neuronal en utilisant des animaux exprimant la polyglutamine.

NOTE: Deux méthodes complémentaires sont utilisées pour mesurer le déclin de la protéostasie dans les neurones (1) en quantifiant la formation d’agrégats de protéines (foyers fluorescents) au cours du vieillissement et (2) en mesurant le déclin associé à l’âge du protéome neuronal via un test basé sur le mouvement.

  1. Imagerie de la formation d’agrégats de polyglutamine dans les neurones pendant le vieillissement
    REMARQUE: Semblable au test déjà discuté dans le tissu musculaire, la progression dépendante de l’âge de l’agrégation des protéines dans les neurones est imagée en exprimant une protéine de fusion polyQ::YFP entraînée par le promoteur tissulaire pan-neuronal spécifique de rgef-1. Plus précisément, nous utilisons AM101: rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP], une fusion de quarante glutamines en YFP16. Pour visualiser rgef-1p::p olyQ::YFP, utilisez un microscope composé équipé pour la fluorescence avec une lentille de grossissement 40x. AM101 est disponible auprès de la CCG à l’adresse suivante : https://cgc.umn.edu/strain/AM101.
    1. Les jours d’imagerie (jours 4, 6, 8 et 10 de l’âge adulte), choisissez 20 animaux et montez sur une lame de microscope contenant un tampon d’agarose à 3 % avec une goutte de 5 μL d’azide de sodium de 10 mM (dilué dans un tampon M9).
    2. Une fois que tous les animaux sont immobilisés par l’azide de sodium (~ 5 minutes), prenez des images z-stack de la tête des animaux à l’aide d’une lentille de grossissement 40x (Figure 2A). Ignorez les diapositives après l’imagerie.
    3. Après l’acquisition d’images, traiter les piles z pour obtenir la projection maximale et l’utiliser pour quantifier le nombre de foyers dans les neurones situés sur la zone de l’anneau nerveux. Les foyers sont des signaux ponctués plus lumineux qui peuvent être différenciés du signal soluble plus faible en arrière-plan.
      REMARQUE: Nous avons spécifiquement sélectionné la zone de l’anneau nerveux pour quantifier les agrégats rgef-1p: :p olyQ: : YFP, car c’est la région où la plupart des neurones convergent pour établir des connexions synaptiques. Cependant, afin de mesurer les niveaux de formation d’agrégats dans les motoneurones, les agrégats rgef-1p::p olyQ::YFP situés sur le cordon nerveux dorsal ou ventral peuvent être quantifiés.
    4. Tracez la progression de l’accumulation de foyers YFP à partir de D4, D6, D8 et D10. Faites-le sur un graphique XY où X représente les jours de l’âge adulte et Y représente le nombre de foyers rgef-1p::p olyQ::YFP (Figure 2B). Le nombre de foyers dans la condition expérimentale (p. ex., régulation négative des gènes ou surexpression) est comparé à celui des animaux témoins. L’analyse statistique du nombre de foyers pour les neurones est effectuée de la même manière que pour les foyers polyQ musculaires; voir les étapes 4.1.4 et les notes associées.
  2. Mesure des courbures du corps comme mesure de substitution de la protéotoxicité de la polyglutamine dans les neurones.
    REMARQUE: Le stress protéotoxique induit par l’accumulation agrégée progressive de polyQ neuronal est déterminé en examinant les défauts des motoneurones à travers un test de battement. Quantifier le nombre de courbures du corps sur une période de 30 secondes en suspension dans le tampon physiologique M9 (Fichier supplémentaire 1).
    1. Le jour 2 de l’âge adulte, choisissez 10 animaux synchronisés dans la plaque et placez-les sur une goutte de 10 μL de tampon M9 sur une lame de microscope. Répétez cette étape au moins quatre fois pour obtenir un échantillon de 40 animaux ou plus.
    2. Enregistrez le mouvement vidéo des 10 animaux placés sur la lame du microscope avec 10 μL de tampon M9 pendant une période de 30 s sur un stéréomicroscope avec une caméra vidéo. Répétez cette étape 4 fois pour un nombre total d’échantillons de 40. Le zoom et la position doivent être ajustés de manière à ce que tous les animaux soient visibles dans le cadre pendant les 30 secondes complètes.
    3. Une fois que toutes les vidéos avec les animaux à analyser sont enregistrées, lisez la vidéo et notez les courbes du corps de chaque animal. Une courbure du corps est définie comme lorsque la vulve de l’animal passe d’un côté à l’autre et revient jusqu’à la position de départ.
      REMARQUE: Nous constatons que les animaux de type sauvage ont généralement 49 ± 0,79 courbure du corps en 30 secondes.
    4. Tracez le nombre de courbures du corps pour chaque animal dans un graphique à colonnes où chaque point représente le nombre de courbures du corps en 30 s (axe Y) avec les différentes conditions testées sur l’axe X. Le nombre de courbures corporelles des animaux unc-54p::p olyQ::YFP est comparé aux animaux témoins (Figure 2C). Effectuer une analyse statistique entre les groupes indépendamment pour chaque essai; si le test est répété à plusieurs moments, analysez les données indépendamment pour chaque point temporel.
      1. Si l’on ne considère que deux conditions, effectuez un test t sur échantillon indépendant.
      2. Lorsque vous considérez plus de deux conditions à la fois, effectuez d’abord une analyse ANOVA omnibus unidirectionnelle, y compris les données de toutes les conditions à ce point de contre-la-montre / chronométrage. Si l’ANOVA omnibus donne une valeur de p significative (c.-à-d. p < 0,005), effectuez une analyse post-hoc avec des tests t d’échantillon indépendants par paires pour déterminer les conditions spécifiques entre lesquelles une différence significative dans le nombre de courbures corporelles a été détectée.

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Representative Results

Chez C. elegans, le modèle de répétition de la polyglutamine a joué un rôle déterminant dans l’identification des gènes qui régulent le réseau protéostatique. Par exemple, nous avons précédemment montré que la protéine kinase interagissant avec l’homéodomaine(hpk-1),un cofacteur transcriptionnel, influence la protéostase au cours du vieillissement en régulant l’expression de l’autophagie et des chaperons moléculaires31. Nous avons constaté que la perte de hpk-1,soit par silence de l’ARNi, soit chez les animaux mutants nuls hpk-1(pk1393), augmente le nombre d’agrégats Q35::YFP qui s’accumulent pendant le vieillissement. Les animaux témoins adultes du jour 2 présentent 18,0 ± 2,7 agrégats, tandis que les animaux hpk-1(pk1393) mutants nuls et hpk-1 traités à l’ARNi Q35::YFP affichaient en moyenne 28 ± 5,3 et 26,0 ± 5,1 agrégats, respectivement (Figure 3A-D). De même, au jour 8 de l’âge adulte, 77 à 78 % des animaux hpk-1 (ARNi) et hpk-1 (pk1393) étaient paralysés tandis que 50 % des animaux témoins Q35::YFP étaient paralysés(Figure 3E). En outre, HPK-1 est suffisant pour réguler la formation d’agrégats protéiques car la surexpression omniprésente de hpk-1 réduit le nombre de foyers Q35::YFP dans le tissu musculaire et protège les animaux vieillissants de Q35:: Paralysie associée auYFPpendant le vieillissement(Figure 3E). Collectivement, ces résultats démontrent que HPK-1 régule la protéostasie et met en évidence comment le modèle polyQ::YFP peut être utilisé pour l’analyse génétique inverse des changements dans la protéostasie au cours du vieillissement.

Figure 1
Figure 1 : L’expression de polyQ::YFP dans le muscle C. elegans entraîne une accumulation progressive de foyers et une paralysie au cours du vieillissement. (A) C. elegans unc-54p::Q35::YFP expression aux jours 1 et 4 de l’âge adulte (panneau supérieur et inférieur, respectivement). Les flèches indiquent des foyers représentatifs. (B) Quantification des foyers fluorescents au cours des 4 premiers jours de l’âge adulte. Les foyers sont résistants à FRAP15,32,33, compatible avec un agrégat protéique insoluble. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne (SEM)(C) unc-54p::Q35::YFP les animaux deviennent paralysés pendant le vieillissement. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de proportion. Les données brutes pour (B-C) sont fournies dans le tableau supplémentaire 1. La barre d’échelle représente 100 μm dans tous les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : L’expression de polyQ::YFP dans les neurones de C. elegans entraîne une accumulation progressive de foyers et une perturbation des courbures normales du corps. (A, en haut) Image DIC du C. elegans antérieur. Le pharynx est une structure bi-lobée dans la tête de l’animal, qui est entourée par l’anneau nerveux, un groupe interconnecté de 180 neurones. Les crochets rouges indiquent la région à marquer pour les foyers dans les neurones de la tête. (A, milieu) rgefp-1::Q40::YFP fluorescence au jour 2 de l’âge adulte. Notez que l’expression YFP est largement diffuse, à l’exception d’un agrégat occasionnel (flèche). (A, en bas) rgefp-1::Q40::YFP fluorescence au jour 10 de l’âge adulte. Les foyers/agrégats sont indiqués (flèche rouge). (B) Quantification des foyers fluorescents au cours des 10 premiers jours de l’âge adulte. Les foyers sont résistants à FRAP15,32,33, compatible avec un agrégat protéique insoluble. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne (C) Fréquence typique des courbures corporelles de type sauvage et rgef-1p::Q40::YFP animaux maintenus à 20°C se nourrissant d’ARNi vecteur vide (L4440) aux jours 2 de l’âge adulte. L’augmentation de l’expansion de la glutamine est en corrélation avec les défauts de mouvement15. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne. Les données brutes pour (B-C) sont fournies dans le tableau supplémentaire 1. La barre d’échelle représente 20 μm dans tous les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : HPK-1 favorise la protéostasie. (A-C) L’activité hpk-1 affecte l’accumulation de foyers Q35::YFP dans les cellules musculaires. On voit des images représentatives d’animaux Punc-54::p olyQ::YFP traités avec (A) de l’ARNi de contrôle ou(B) hpk-1 ARNi, et (C) des animaux transgéniques surexprimant hpk-1 (Psur-5::HPK-1::CFP). (D) Évolution temporelle de l’accumulation de foyers polyQ::YFP en conjonction avec: traitement avec ARNi de contrôle (cercles noirs), ARNi hpk-1 (cercles blancs), hpk-1 (pk1393) (carrés blancs) ou surexpression hpk-1 (triangles ouverts). Les points de données affichent l’écart-type moyen ± (S.D.) d’au moins 15 animaux par réplication biologique; au moins 5 expériences indépendantes ont été réalisées. (E) Évolution temporelle de la paralysie des animaux Punc-54::p olyQ::YFP en conjonction avec: traitement avec aRNi témoin (cercles noirs), ARNi hpk-1 (cercles blancs), hpk-1 (pk1393) (carrés blancs) ou surexpression hpk-1 (triangles ouverts). Les données tracées affichent les résultats d’un seul essai représentatif. Cette figure est réimprimée à partir de la référence31 avec autorisation via une licence Creative Commons Attribution (CC BY). La barre d’échelle représente 100 μm dans tous les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Données brutes des résultats. Le tableau comprend les données sur les foyers, la paralysie et la courbure du corps des figures 2 et 3. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichier supplémentaire 1 : Réactifs courants pour le travail de routine de C. elegans. Les réactifs courants comprennent des recettes pour préparer divers types d’assiettes et de tampons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Le vieillissement se caractérise par un déclin progressif de la protéostasie. La protéostasie est maintenue par un système complexe, le réseau protéostatique, pour le contrôle coordonné, dynamique et sensible au stress du repliement, de la dégradation et de la traduction des protéines. La raison pour laquelle la protéostase échoue au cours du vieillissement est mal comprise, mais un épigénome en décomposition, une diminution de l’inductibilité des réponses au stress et une perte de diaphonie compensatoire coïncident tous avec cette rupture. Chez C. elegans, l’inductibilité transcriptionnelle de multiples formes de réponse au stress diminue rapidement quelques heures après le début de la reproduction en raison de la formation de marques de chromatine répressives aux loci de stress2,34,35. L’effondrement de la protéostase est un problème clinique massif car il sous-tend le développement de maladies de mauvais repliement des protéines. Ainsi, disposer d’une méthode adaptée à l’analyse génétique pour quantifier la protéostasie cellulaire in vivo est essentiel pour obtenir une compréhension mécaniste plus approfondie de la façon dont les organismes maintiennent un repliement et une fonction appropriés du protéome.

Les C. elegans transgéniques avec l’expression tissulaire spécifique d’un rapporteur fluorescent polyglutamine sont une méthode efficace et robuste pour étudier le déclin de la protéostase dépendant de l’âge. Les deux avantages les plus importants du modèle de polyglutamine sont : (1) l’expression spécifique des tissus combinée à une génétique puissante et à une génomique fonctionnelle permet la découverte et la caractérisation des régulateurs de protéostasie dans le contexte d’un organisme multicellulaire intact, et (2) la visualisation de la formation de foyers permet une quantification directe du déclin protéostatique associé à l’âge in vivo . Bien que dans de nombreux cas, il existe une corrélation entre l’accumulation agrégée et l’augmentation de la protéotoxicité, dans certains cas, ces deux phénotypes sont négativement corrélés. Par exemple, la diminution de la signalisation de l’insuline augmente la durée de vie et la résistance au stress: les animaux mutants daf-2 (une perte hypomorphe de fonction dans le récepteur du facteur de croissance insuline / analogue à l’insuline 1), montrent une charge agrégée accrue tout en améliorant la capacité de protéostasie par la régulation à la hausse d’un mécanisme de protection qui empêche la formation d’agrégats toxiques espèces33, 36,37,38,39 . Ainsi, dans certains cas, la formation d’agrégats est protectrice en séquestrant les espèces de protéines nocives du reste du protéome. Étant donné que les lectures de la protéotoxicité cellulaire peuvent être évaluées en conjonction avec la formation d’agrégats, on peut tester les corrélations inverses pour identifier les interactions génétiques impliquées dans les mécanismes de séquestration protectrice. Enfin, les rapporteurs fluorescents à la polyglutamine peuvent être combinés soit avec un knockdown spécifique au tissu (par exemple, classiquement par l’expression de l’ARNi spécifique au tissu ou de l’arn en épingle à cheveux), et plus récemment par la dégradation des protéines spécifiques aux tissus, comme le système Tir1-auxin40- ou avec la surexpression spécifique au tissu d’un gène d’intérêt à l’aide de rapporteurs spécifiques aux tissus, obtenant ainsi un aperçu de la régulation de la protéostase à l’intérieur et entre les cellules et les tissus.

Les méthodes de mesure des changements dans la protéostasie au cours du vieillissement nécessitent des animaux appariés chronologiquement. Ainsi, il est nécessaire d’empêcher la production de progéniture ou de séparer les animaux de départ. Dans le protocole, nous décrivons comment utiliser FUdR pour prévenir la production de progéniture, mais certaines études ont rapporté que FUdR peut altérer la protéostasie24,25. Alternativement, des antécédents génétiques féminisés peuvent être utilisés (par exemple, fer-15 (b26); fem-1 (hc17)41). Enfin, les animaux adultes peuvent être déplacés vers des plaques d’ARNi fraîches loin de la progéniture. Cela simplifie les considérations d’arrière-plan au détriment du débit. Le déplacement périodique des animaux vers des aliments frais présente les avantages supplémentaires de renouveler l’exposition à l’ARNds et de prévenir une éventuelle famine.

Parce que les foyers fluorescents sont quantifiés par l’observation visuelle, il faut être précis et cohérent dans l’identification des foyers. Les foyers de C. elegans polyQ::YFP ont été vérifiés expérimentalement pour être des agrégats de protéines in vivo par récupération de fluorescence après photobleachage (FRAP)15,32,33. D’autres approches biochimiques peuvent être utilisées pour évaluer l’agrégation des protéines42. Il est important de noter qu’au jour 3 de l’âge adulte, les premiers foyers deviennent plus grands et commencent à accumuler ce qui apparaît comme des foyers satellites (analogues aux lunes autour d’une planète). Il est essentiel de décider avant de commencer s’il faut compter ces foyers satellites comme des agrégats distincts, ou être plus conservateur et considérer la zone collective comme un seul agrégat, puis rester cohérent lors de la notation tout au long de toutes les expériences. Nous préférons ce dernier; il étend la plage dynamique au cours de laquelle la formation de foyers peut être évaluée, mais même avec ces estimations plus prudentes, au jour 4 – 5, il y a un effet de plateau apparent. En réalité, la protéostasie continue de décliner, mais les foyers sont si nombreux qu’il n’est plus possible de quantifier le nombre avec précision à l’œil. Pour améliorer la reproductibilité entre les essais biologiques, entre les individus et entre les laboratoires, il est essentiel de définir ce qui est noté comme foyer.

Alors que nous détaillons des méthodes pour des approches génétiques inverses simples pour tester un ensemble limité de conditions pour les changements dans la protéostasie en utilisant le rapporteur unc-54p::Q35::YFP, nous avons développé des méthodes avec un débit plus élevé où les changements dans la protéostasie peuvent être quantifiés pour jusqu’à 100 conditions (par exemple, des clones d’ARNi) simultanément. Cette méthode implique l’utilisation d’ensembles de répliques, que nous avons largement utilisés pour quantifier les changements dans la durée de vie après une perturbation génétique. En bref, des échantillons indépendants provenant d’une grande population isogénique sont notés à chaque point temporel, plutôt qu’un seul échantillon au fil du temps. Cette approche est facilement adaptée pour évaluer les changements protéotoxiques associés à l’âge, tels que la paralysie (en utilisant le poly-Q::YFP avec le promoteur musculaire) ou les courbures du corps (via le promoteur neuronal). La notation de réplique de cette manière implique l’ajout de liquide aux puits d’une plaque multi-puits, ce qui stimule C. elegans à se déplacer. Une approche analogue peut être facilement appliquée à la formation de foyers dans les cellules musculaires. Auparavant, nous avons identifié 159 gènes nécessaires à une durée de vie normale (de type sauvage) ou à l’augmentation de la durée de vie des animaux mutants des récepteurs de l’insuline / IGF1, et quantifié les changements dans la durée de vie et la durée de vie. Parmi ceux-ci, 103 inactivations de gènes entraînent un phénotype progérique, les animaux présentant un ou plusieurs signes de vieillissement prématuré43. Dans un cribl secondaire utilisant le rapporteur unc-54p::Q35::YFP et une approche de notation de l’ensemble de répliques, nous avons pu identifier environ 50 inactivations de gènes progériques qui ont produit une formation accélérée de foyers (résultats non publiés A.V.S.), ce qui a ensuite facilité des études mécanistes ciblées où nous avons identifié un rôle critique pour le réseau Myc de facteurs de transcription et le cofacteur transcriptionnel HPK-1 dans le maintien de la protéostase31, 44. Une description détaillée de la méthode du jeu de réplicas se trouve dans23.

Les méthodes décrites ici pour l’analyse statistique des foyers polyQ à travers les conditions se concentrent sur la comparaison des conditions à l’intérieur de chaque point temporel, mais il peut y avoir des cas où la tendance à travers le temps est plus intéressante qu’une comparaison à un seul point. S’il est possible de suivre des animaux individuels au fil du temps, par exemple si des animaux sont isolés dans des puits de plaques multipuits ou de dispositifs microfluidiques, une ANOVA à mesures répétées relativement simple serait appropriée. Cependant, le plus souvent, les animaux sont gardés en vrac sur des plaques de Pétri, ce qui rend ce suivi individuel impossible, et donc différentes méthodes sont nécessaires. On s’attend à ce que les données de comptage agrégé polyQ soient autocorrélées entre les points temporels (p. ex., le nombre de foyers ne devrait qu’augmenter, ce qui rend les observations pour une condition donnée non indépendantes entre les points de temps), ce qui nécessite une approche d’analyse statistique qui peut gérer de manière appropriée les erreurs corrélées, comme ARIMA.

La formation de foyers et les défauts de mouvement sont des caractéristiques moléculaires bien définies et quantifiables du vieillissement qui sont traitables à l’analyse génétique et / ou fonctionnelle génomique. Par exemple, un criblage génétique avancé utilisant C. elegans exprimant Q35::YFP dans les cellules musculaires a identifié une agrégation améliorée après perte d’unc-30, un facteur de transcription spécifique aux neurones qui régule la synthèse du neurotransmetteur inhibiteur acide gamma-aminobutyrique (GABA)32. Le développement de l’ARNi basé sur l’alimentation chez C. elegans a également conduit à une période de découverte de gènes dans la protéostasie: un criblage d’ARNi à l’échelle du génome de C. elegans exprimant Q35::YFP a identifié environ 340 modificateurs génétiques qui améliorent ou inhibent le réseau protéostatique et augmentent ou diminuent ainsi l’agrégation polyQ39,42.

Bien que des écrans génomiques fonctionnels simples aient révélé un réseau protéostatique central, ces souches restent une ressource phénotypique inestimable. L’expression tissulaire spécifique des rapporteurs fluorescents de polyglutamine chez Caenorhabditis elegans est un système idéal dans lequel des outils génomiques génétiques et fonctionnels établis peuvent être appliqués via un amplificateur, un suppresseur ou des écrans synthétiques pour identifier de nouvelles interactions génétiques45,46. La protéostasie cellulaire, et la myriade de systèmes physiologiques qui fonctionnent soit pour préserver ou pour défier l’homéostasie globale des protéines, émerge comme une image biologique et endocrinienne cellulaire compliquée. La protéostase n’est pas représentée par une seule voie biologique, un seul complexe protéique ou un seul organite. Au lieu de cela, la protéostasie est le produit de l’action de masse de multiples voies, machines et systèmes biologiques complexes et interdépendants, et est remise en question par une myriade de facteurs de stress environnementaux. Les études futures utilisant le modèle polyQ::YFP seront essentielles pour démêler la complexité de la façon dont les cellules maintiennent le bon fonctionnement et le repliement du protéome.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier les anciens et actuels membres du laboratoire Samuelson pour leur aide dans le raffinement de cette méthode et / ou de la discussion qui a aidé au développement de ce manuscrit. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le National Institute on Aging des National Institutes of Health sous les numéros d’attribution RF1AG062593 et R21AG064519. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
2 mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
96-pin plate replicator Nunc 250520
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
bacto-peptone VWR 90000-368
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
Glass microscope cover slips VWR 48404-455
Glass microscope slides VWR 160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
Sodium Azide, CAS #26628-22-8 Sigma-Aldrich S2002
Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software Zeiss unknown
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope Zeiss unknown

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Biologie Numéro 175 protéostase polyglutamine polyQ::YPC C. elegans vieillissement biomarqueur homéostasie des protéines analyse génétique génomique fonctionnelle
Quantification du déclin protéostatique spécifique aux tissus chez <em>Caenorhabditis elegans</em>
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Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., … More

Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (175), e61100, doi:10.3791/61100 (2021).

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