Summary
Introduzimos uma abordagem interna do tubo da técnica de manguito para transplante de coração heterotópico cervical do rato para ajudar a everter o vaso sobre a braçadeira. Descobrimos que a cooperação entre dois cirurgiões experientes diminui significativamente o tempo de operação.
Abstract
O transplante cardíaco de Murine é realizado há mais de 40 anos. Com os avanços na microcirurgia, algumas novas técnicas têm sido usadas para melhorar a eficiência cirúrgica. Em nosso laboratório, otimizamos a técnica da braçadeira com dois passos principais. Primeiro, utilizamos a técnica do tubo interno para inserir um tubo interno temporário na veia jugular externa e no vaso sanguíneo da artéria carótida para facilitar a eversão do vaso sobre a braçadeira. Em segundo lugar, realizamos transplante cardíaco heterotópico completo através da colaboração de dois cirurgiões experientes. Essas modificações efetivamente reduziram o tempo de operação para 25 minutos, com uma taxa de sucesso de 95%. Neste relatório, descrevemos esses procedimentos em detalhes e fornecemos um vídeo suplementar. Acreditamos que este relatório sobre a técnica aprimorada da braçadeira oferecerá orientação prática para transplante de coração heterotópico murine e aumentará a utilidade deste modelo de camundongos para pesquisa básica.
Introduction
O estabelecimento de transplante de coração heterotópico de camundongos por meio de anastomose de ponta a ponta no abdômen em 1973 foi um marco importante na pesquisa básica de imunologia de transplante1. Este modelo forneceu uma ferramenta importante e válida para a análise dos mecanismos de isquemia de reperfusãolesão 2,rejeição imunológica e tolerância3,4. No entanto, a natureza complexa e demorada da cirurgia, bem como o potencial de infecções podem resultar em aderências abdominais perioperatórias graves e reações inflamatórias, resultando em baixa eficiência para o modelo heterotópico de transplante cardíaco.
A técnica de transplante de coração heterotópico cervical foi descrita pela primeira vez por Chen em 19915. Neste modelo, a veia jugular externa do receptor é anastomosada à artéria pulmonar do enxerto e a artéria carótida é anastomosada à aorta ascendente. As principais vantagens desse método são a conveniência de monitorar e reduzir o trauma ao receptor. No mesmo ano, Matsuura descreveu uma técnica melhorada, na qual a extremidade da veia jugular externa e da artéria carótida foram sempre sempre realizadas sobre um manguito de Teflon e fixadas com uma ligadura de seda circunferencial6. Alguns pesquisadores também fixaram a braçadeira na artéria pulmonar direita no coração doador antes de inserir o manguito na veia jugular externa do receptor7. Até agora, a técnica da braçadeira tem sido amplamente aplicada em vários modelos de transplante de pediculo vascular, incluindo os do pulmão8, fígado9e transplante renal10.
Até o momento, existem várias dificuldades associadas à técnica da braçadeira. Por exemplo, a artéria carótida é difícil de eterncar sobre a braçadeira devido à elasticidade adicional, resultando na inversão do tecido. Assim, uma prática adicional e um dilador microcirúrgico podem ser necessários para completar esta etapa. Além disso, a preparação do vaso cervical pode levar até 25 minutos.
Para resolver esses problemas, introduzimos a técnica do tubo interno, que é baseada na técnica da braçadeira e inclui a fixação da braçadeira na veia jugular externa e na artéria carótida usando um tubo interno para ajudar na eversão da parede do vaso. Além disso, com treinamento simples, a preparação do receptor é reduzida para 15,5 minutos. Esta técnica reduz a complexidade da operação e não requer prática adicional ou o uso de um dilatador vascular. Pode ser aplicado em todas as pesquisas imunológicas de transplante, especialmente para verificar a tolerância imune de terceiros durante a qual o receptor recebe dois arófilos cardíacos, um dentro do abdômen e outro no pescoço11. Também recomendamos a cooperação entre dois cirurgiões qualificados para estabelecer esse modelo, com um cirurgião preparando o animal receptor e o outro colhendo e implantando o coração doador. Tal colaboração pode reduzir o tempo de operação para 25 minutos. Utilizando este procedimento otimizado, estabelecemos modelos de transplante de coração de camundongos síngênicos, aogênicos12,,13,,14,,15,,16,,17,,18,,19e xenogênicos de transplante de coração decamundongos 20.
A justificativa para o desenvolvimento da técnica do tubo interno foi reduzir o tempo de operação para o estabelecimento de um modelo de transplante de coração de camundongos com alta taxa de sucesso. A otimização do modelo de transplante cardíaco cervical facilita a aquisição de altas taxas de sucesso em um curto período de tempo de cirurgia em comparação com a técnica tradicional de sutura e manguito21. Além disso, o modelo de cooperação pode reduzir ainda mais o tempo isquêmico quente do coração doador em comparação com as cirurgias realizadas com um único operador.
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Protocol
Os animais (BALB/c, C57BL/6, macho, 8-12 semanas) estão alojados em uma instalação específica sem patógenos no Centro de Animais do Laboratório da Universidade de Xiamen. C57BL/6 é usado como receptor e BALB/c é usado como doador. Todos os procedimentos são realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC).
NOTA: Um conjunto de instrumentos microcirúrgicos, incluindo micro tesoura, micro fórceps retos, micro fórceps curvos e micro-agulhas, são necessários para a operação (Tabela e Materiais, Figura 1B, C, D, E). Um par de grampos bulldog de uso único (Figura 1F) é necessário. Duas algemas para a veia jugular externa e artéria carótida são preparadas cortando os tubos de poliamida personalizados com um bisturi nº 10 sob um microscópio. O diâmetro da veia e da braçadeira da artéria é de 0,9 mm e 0,55 mm, respectivamente. Além disso, o diâmetro do tubo interno para o manguito venoso correspondente é de 0,6 mm, e estes do tubo interno para o manguito artéria correspondente é de 0,28 mm(Figura 1G).
1. Preparação do destinatário
- Anestesiar o mouse receptor com pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Use cortadores mecânicos atrauáticos para remover o cabelo na região cervical lateral direita.
- Use um aplicador de ponta de algodão estéril para limpar a área cirúrgica com antisséptico de iodo seguido de 70% de etanol.
- Coloque o mouse na posição supina na plataforma de operação. Cubra o mouse com gaze estéril.
- Use uma tesoura oftálmica para fazer uma incisão transversal da linha média inferior de um terço do pescoço até a articulação ombro-clavícula direita.
- Isole a veia jugular externa direita com micro fórceps curvos para expor o comprimento suficiente, corte os galhos através de eletrocoagulação e liga o vaso na extremidade distal usando uma sutura de seda 6-0.
- Fixar a veia jugular externa proximalmente usando um grampo bulldog e, em seguida, transectar a veia proximalmente para a ligadura usando uma micro tesoura.
- Lave o lúmen do vaso com 100 U/mL 0-4 °C salina heparinizada para remover qualquer sangue residual.
- Puxe a veia jugular externa através do manguito da veia usando micro fórceps retos; inserir o tubo interno da veia no lúmen como um stent, e evertir a parede do vaso sobre o punho com micro fórceps retos(Figura 2A).
- Fixar o endotélio do vaso sempreado na extremidade proximal da braçadeira usando um 8-0 circunferencial sutura de seda(Figura 2B).
- Use micro fórceps retos para retirar o tubo interno da veia do vaso venoso.
- Realize dissecção contundente com micro fórceps curvos para isolar a artéria carótida direita adjacente à borda interna da esteocleidomastoide.
- Fixar a artéria carótida direita proximicamente usando um grampo buldogue, ligar a artéria carótida distally usando uma sutura de seda 6-0, e usar uma micro tesoura para transectar a artéria carótida proximally para a ligadura.
- Lave a artéria carótida com 100 U/mL 0-4 °C salina heparinizada para remover qualquer sangue residual.
- Passe a artéria carótida através do manguito da artéria e insira o tubo interno da artéria no vaso da artéria usando micro fórceps retos(Figura 2C).
- Everta o vaso sobre o manguito usando micro fórceps retos; corrigir o endotélio vaso everted usando um circunferencial 8-0 sutura de seda(Figura 2D).
- Retire o tubo interno da artéria do vaso da artéria com micro fórceps retos.
NOTA: Preserve a glândula submandibular do destinatário.
2. Preparação do doador
- Anestesiar o rato doador com pentobarbital (60 mg/kg, i.p). Use cortadores mecânicos atrauáticos para remover os cabelos na região abdominal.
- Coloque o mouse na posição supina na plataforma de operação. Cubra o mouse com gaze estéril.
- Use um aplicador de ponta de algodão estéril para limpar a área cirúrgica com antisséptico de iodo seguido de 70% de etanol.
- Faça uma incisão abdominal midline com uma tesoura oftálmica e exponha a cavidade abdominal.
- Use micro fórceps curvos para expor a veia cava inferior, e então injete por via intravenosa 200 μL de 100 U/mL 0-4 °C salina heparinizada por 20 g de peso corporal através da cava vena inferior.
- Faça toracotomia com tesoura oftálmica, corte as costelas através das incisões bilaterais da linha midaxillary, vire a parede do peito anterior para fora para expor a cavidade torácica.
- Extirpe o timo com micro fórceps curvos.
- Exponha a aorta e, em seguida, perfunda 200 μL de 100 U/mL 0-4 °C salina heparinizada até a artéria coronária através do arco aórtico.
NOTA: Evite perfundar quaisquer bolhas de gás no coração do doador. - Use uma micro tesoura para transectar a aorta ascendente no início do arco aórtico.
- Transecte a artéria pulmonar no início dos dois ramos principais com uma micro tesoura.
- Liga a veia cava superior e a veia cava inferior proximally usando uma sutura de seda 6-0 e use uma micro tesoura para transectar a veia distally para a ligadura.
- Ligate as veias pulmonares juntas, circunferencialmente, usando uma única sutura de seda 6-0, e corte os ramos da veia distally à ligadura usando uma micro tesoura.
- Remover o enxerto cardíaco dos tecidos moles circundantes; preservá-lo em salina heparinizada de 0-4 °C.
3. Implantação cardíaca
- Coloque o coração doador de cabeça para baixo na região do pescoço direito do receptor.
- Insira a artéria pulmonar do coração doador para um laço de seda 6-0 com micro fórceps retos.
- Enrole o lúmen do vaso ao redor do manguito da veia e, em seguida, aperte os laços de sutura de seda 6-0 ao redor da braçadeira para a banda da junta do vaso.
- Realize a anastomose da aorta do enxerto e da braçadeira da artéria seguindo as etapas descritas na etapa 3.2.
- Solte a veia jugular fixa seguida da artéria jugular fixada. Mantenha a articulação do vaso sem fiação e certifique-se de que o fluxo sanguíneo está desobstruído.
NOTA: O ritmo sinusal voltando a mais de 200 vezes dentro de 1 min é considerado normal. - Umedeça o coração doador usando soro fisiológico quente (37 °C) e inspecione se o enxerto está sangrando. Coloque o enxerto cardíaco pulsante no espaço subcutâneo e, em seguida, sutura a incisão.
4. Avaliação de Cuidados Pós-Operatórios e Enxertos
- Regisse o tempo para o ritmo sinusal normal e a preservação do ritmo sinusal normal por pelo menos 5 minutos após a liberação do grampo para monitorar a função de enxerto pós-operatório.
- Coloque o destinatário sozinho em um cobertor quente até que o destinatário acorde da anestesia. Administrar analgesia de buprenorfina, 0,05 mg/kg, s.c, no final da cirurgia e a cada 12 horas durante 72 horas após a cirurgia.
- Regisso o estado de recuperação do peso e pós-operatório do destinatário diariamente. No caso de perda de peso de >15% em relação à data da cirurgia, paralisia hemplégica ou infecção, eutanize o receptor via inalação terminal isoflurane21.
- Monitore a sobrevivência do enxerto por palpação diariamente. A cirurgia é considerada bem sucedida se o alusão murina sobreviver por >72 horas. Classificar a função do enxerto, conforme relatado anteriormente22: Escala 3 - pulsar vigorosamente e frequência; Escala 2 - menos pulsar; Escala 1- fibrilação e rejeição iminente; ou Escala - 0, perda de batimento cardíaco e rejeição completa.
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Representative Results
Tempo de operação cirúrgica
Após o treinamento, um cirurgião qualificado pode realizar a operação com sucesso dentro de 35 minutos usando a técnica do tubo interno, onde aproximadamente 15,5 minutos são necessários para a preparação do receptor, 10,9 minutos são necessários para a preparação do doador e 4,4 minutos são necessários para anastomoses cardíacos doadores. O tempo de isquemia fria e quente (da preparação do doador à implantação do coração) é reduzido para 15,3 minutos em comparação com a operação utilizando a técnica de manguito sem a técnica de tubo interno e técnica de sutura(Tabela 1)21.
Projetamos um modelo de cooperação para melhorar ainda mais a eficiência da operação. Como mostrado no esquema (Figura 3), um cirurgião começa a realizar a preparação do receptor primeiro, seguido pelo início da preparação do doador por um segundo cirurgião após 4-5 minutos. Após 15-16 minutos, o primeiro cirurgião deveria ter terminado a preparação do receptor, momento em que o segundo cirurgião ter terminado a colheita do coração doador, deve começar a anastomosing o coração doador dentro do receptor. Este modelo de cooperação exige que cada cirurgião seja treinado em apenas uma única parte da técnica da braçadeira e encurta ainda mais o tempo total de operação para aproximadamente 25 minutos. Uma análise dos transplantes heterotópicos de murinas de >600 realizados por meio de cooperação entre dois cirurgiões nos últimos dois anos no Instituto de Transplante de Órgãos da Universidade de Xiamen indica uma taxa de sucesso para transplante cardíaco usando essa técnica de até 95%.
Sobrevivência do Major Histocompatibilidade Complexa Incompatibilidade Cardíaca Incompatível e Enxertos Cardíacos Combinados
O Complexo de Histocompatibilidade Maior (MHC), designado "H-2", tem sido usado para determinar disparidades genéticas e semelhanças. Antígenos MHC incompatíveis com doadores podem desencadear a rejeição do enxerto interagindo diretamente com as células T receptoras ou indiretamente como peptídeos derivados do MHC do doador expressos nas moléculas de MHC receptoras23. Um coração de alusão totalmente MHC incompatível (H-2d)pode ser rejeitado, com um tempo médio de sobrevivência de 7,5 dias após o transplante em camundongos receptores C57BL/6 (H-2b)(Figura 4A). Em nossos estudos, os transplantes de coração sintérico sobreviveram mais de 100 dias, exceto em um caso raro devido a uma perda de peso de 15% em comparação com o peso normal antes da operação.
Aloenxertos cardíacos podem ser colhidos para exame histopatológico no momento da rejeição. A Figura 4B mostra o aparecimento de características de rejeição marcadas mediadas por células, como infiltração celular inflamatória, edema tecidual e oclusão microvascular. Enxertos síndicos estão quase normais sem evidência de necrose de miócito ou infiltração de células inflamatórias.
Efeito do tubo interno no endotélio vascular
Para avaliar os danos no endotélio vascular após a inserção do tubo interno no lúmen, 100 dias após o transplante de coração singênico, o endotélio vascular do sítio de anastomose pode ser coletado e manchado por imunofluorescente. Nesta análise, não foram observados nenhum estreitamento óbvio da parede vascular, trombose ou espessamento da intimação(Figura 4C). A imagem microscópica eletrônica revelou que um endotélio liso e uma formação regular de crista longitudinal, com as células endoteliais dispostas de forma limpa e próxima, sem sedimentos óbvios na superfície(Figura 4D).
Figura 1: Um conjunto de instrumentos cirúrgicos estéreis:
(A) Fórceps finos e tesoura oftálmica; (B) Fórceps micro curvados; (C) Micro fórceps retos; (D) Micro suportes de agulhas; (E) Micro tesoura; (F) Grampos bulldog; (G) Um tubo interno da artéria (seta pontilhada vermelha) e manguito (seta vermelha sólida), juntamente com um tubo interno de veia (seta pontilhada preta) e punho (seta preta sólida). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação do destinatário.
(A) Inserir o tubo interno da veia no vaso da veia jugular externa; (B) Everta o vaso venoso sobre o manguito e fixe-o usando um 8-0 circunferencial sutura de seda; (C) Inserir o tubo interno da artéria no lúmen do vaso da artéria; (D) Everta o vaso venoso sobre o manguito e fixe-o usando um 8-0 circunferencial sutura de seda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Tempo de operação de cada passo no transplante heterotópico de murina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: (A) Tempo de Sobrevivência do enxerto cardíaco. Enredo de Kaplan-Meier mostrando a sobrevivência de andoenergrafos cardíacos (BALB/c) e enxertos síngênicos (C57BL/6) de camundongos doadores transplantados em camundongos receptores C57BL/6 (n=12 ratos/grupo); (B) Exame Microscópico de C57BL/6 (esquerda) Isoenerto e Lonoengrafto Tipo Selvagem (à direita) no dia 7 após transplante (Barras de escala, 50 hum; ampliação ×400); (C) Imunofluorescência (Barras de escala, 50 μm; ampliação ×400) (D) Microscopia eletrônica Escaneamento de Endotélio Vascular em Transplante (esquerda) e Receptor Ingênuo (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Técnica de anastomose | Tempo de preparação do destinatário | Tempo de preparação do doador | Tempo de implantação cardíaca | Tempo de isquemia fria e quente | Tempo total de operação | |
| 5 Heterotópico cervical | Sutura | N | N | N | < 45 min | N |
| 6 Heterotópico cervical | Algeme | 45 min. | 15 min. | 10 min. | N | N |
| 24 Heterotópico cervical | Algeme | 15 min. | 20 min. | 15 min. | 25-40 min | < 60 min |
| 25 Heterotópico do Abdômen | Sutura | N | N | N | N | 35 min. |
| 7 Heterotópico cervical | Algeme | N | 20 min. | N | 30 min. | 35 min. |
| 26 Heterotópico cervical | Algeme | N | 20 min. | 20 min. | < 35 min | N |
| 4 Heterotópico do Abdômen | Sutura | 60-70 min | 6-7 min | N | N | 75 min. |
| 21 Heterotópico cervical | Algeme | N | N | 7 min. | 20 min. | 45 min. |
| 27 Heterotópico do Abdômen | Sutura | N | 10-15 min | N | N | 45-60 min |
| 28 Heterotópico cervical | Algeme | 25 min. | 20 min. | 15 min. | 20 min. | 60 ± 8 min |
| 29 Heterotópico cervical | Algeme | 31,9 min. | 21,1 min. | 5,1 min. | 28,5 min. | 57,8±3,9 min |
| 29 Heterotópico cervical | Sutura | 25,2 min. | 20,5 min. | 30,8 min. | 51,3 min. | 83,9±2,9 min |
| Heterotópico cervical em nosso protocolo | Algeme | 15,5 min. | 10,9 min. | 4,4 min. | 15,3 min. | 35 min. |
| (Operação Única) | ||||||
| 23 min. | ||||||
| (Cooperação) |
Tabela 1: Comparação do Tempo de Diferentes Fases em Diferentes Técnicas de Transplante de Coração de Rato.
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Discussion
Modelos de transplante de coração de rato são ferramentas importantes para a pesquisa em imunologia de transplante, pois ferramentas e materiais para avaliar os mecanismos imunológicos deste modelo e um grande número de camundongos modificados por genes estão disponíveis. No entanto, desafios técnicos microcirúrgicos, como sutura e eversão de vasos, limitaram seu uso generalizado. No presente estudo, investigamos certos desafios técnicos fundamentais do transplante de coração murino e obtivemos bons resultados. Um passo crítico do protocolo a inserção de um tubo interno no lúmen como um stent para evitar a parede do vaso sobre a braçadeira. Esta etapa de otimização resolve o desafio técnico de everting do vaso da artéria devido à necessidade de um extenso trecho. Indivíduos sem habilidade microcirúrgica podem começar a realizar a técnica após dois meses de treinamento, o que também ajudará na ampla aplicação desse modelo.
Em nossa experiência, um tubo interno apropriado melhorará os resultados do transplante. O diâmetro externo do tubo interno deve ser ligeiramente menor do que o diâmetro interno do vaso sanguíneo receptor. Além disso, tubos de polipropileno contundente ou cilindros com superfície escorregadia devem ser usados como núcleos internos temporários para evitar danificar o endotélio vascular. Em nossas mãos, não ocorreu trombose nos 5% dos modelos que falharam, embora o trombo seja um fator importante para o fracasso após a anastomose usando a técnica de sutura. Utilizando esses modelos maduros, nossos laboratórios publicaram diversos artigos básicos de pesquisa que foram reconhecidos pelos revisores por pares14,15,16,,17,,18,19.
As cirurgias realizadas em 35 minutos não foram significativamente diferentes em relação à técnica tradicional de manguito, mas o tempo de isquemia fria e quente foi significativamente menor do que outras técnicas(Tabela 1). O uso do modelo de cooperação reduz ainda mais o tempo médio de operação para 23-25 minutos, o que se reflete no tempo de anestesia do camundongo receptor e no tempo de implantação do coração do doador. Outra vantagem da técnica de manguito que limita o tempo isquêmico quente(Tabela 1). Como nenhum saco de gelo é usado para proteger o enxerto cardíaco da temperatura corporal quente do receptor do rato, o tempo isquêmico quente é equivalente ao tempo de anastomose. A técnica otimizada da braçadeira envolve a preparação de ambas as algemas no receptor para simplificar o procedimento de anastomose e, consequentemente, encurta o tempo de anastomose. Portanto, a técnica da braçadeira limita o tempo isquêmico quente a apenas 4,4 minutos em média.
No entanto, existem alguns passos fundamentais a serem observados com a nova técnica discutida. Certifique-se de preservar a glândula submandibular do camundongo receptor no transplante de coração heterotópico cervical30,pois a glândula submandibular pode ser usada para corrigir o enxerto cardíaco e evitar a torção dos vasos. Evite danificar o nervo vago ao isolar a veia jugular externa e a artéria carótida, pois a lesão pode levar à hemiplegia do pescoço no receptor. A pressão dos grampos do buldogue deve ser mantida em 20-25 gramas para evitar ferimentos de clipe ou vazamento do vaso. Lave o lúmen dos vasos e as algemas com salina heparinizada de 0-4 °C para remover quaisquer bolhas residuais de sangue e gás; isso previne embolia em enxertos após a reperfusão. Use uma seringa de 1 mL para perfumar o doador com soro fisiológico heparinizado de 0-4 °C e aumentar a velocidade para 50 μL por segundo para manter uma pressão adequada. Durante a anastomose, não bande o circunferencial 8-0 suturas (usadas para fixar o endotélio vascular everted nas algemas) no lúmen das artérias do enxerto.
Embora existam limitações ao modelo de cooperação, que incluem a necessidade de técnicas microcirúrgicas, a disponibilidade de dois microscópios simultâneos e o dobro do número de cirurgiões qualificados, tem se mostrado, no entanto, uma abordagem bem sucedida para a realização do transplante de órgãos vascularizados. Sua aplicação mais ampla pode contribuir ainda mais para o desenvolvimento de novos protocolos imunossupressores e o estudo dos mecanismos de rejeição aguda e crônica na área de transplante.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Fujian Provincial Health Education Joint Research Project (WKJ2016-2-20), a National Natural Science Foundation of China (81771271 e 81800664), o Programa Nacional de P&D da China (2018YFA0108304) e o Projeto de Educação e Pesquisa Científica para Professores Jovens e De Meia Idade na Província de Fujian (JAT170714), Fundação de Ciências Naturais da Província de Hunan da China (2019JJ50842) e Huxiang Jovens Talentos da Província de Hunan (2019RS2013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artery cuff | Self-made | Polyamide tube. diameter: 0.55 mm,length: 1.0 mm | |
| Artery inner tube | Self-made | Polyamide tube. Diameter: 0.28mm | |
| Micro curved forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA3050 | 1/8 arc, 0.3-mm tip without a hook |
| Micro needle holders | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA2050 | 0.2-mm tip |
| Micro scissors | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA1050 | Straight, blade length: 10 mm |
| Micro straight forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | WA3060 | 0.15-mm tip without a hook |
| Scanlan Vascu-Statt Bulldog Clamps | Scanlan International Inc | 1001-531 | Clamping pressure 20–25 grams |
| Vein cuff | Self-made | Polyamide tube. diameter: 0.9 mm,length: 1.2 mm | |
| Vein inner tube | Self-made | Polyamide tube. Diameter: 0.6 mm |
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