Summary
설명된 것은 기간 신생아 쥐의 장내 주사를 통해 중간기질 기질 세포(MSC)의 장내 이식을 수행하기 위한 프로토콜이다. 이 기술은 그들의 효험을 평가하기 위하여 신생아 쥐 폐로 줄기 세포 및 약의 납품을 위한 임상적으로 실행 가능한 선택권입니다.
Abstract
산소의 고농도에 장기간 노출은 염증과 급성 폐 손상으로 이어질, 이는 인간의 기관지 폐 이형성증과 유사 (BPD). 미숙아에서 BPD는 계면 활성제 치료, 최적의 환기 전략 및 비침습적 양압 환기를 조기에 사용했음에도 불구하고 주요 합병증입니다. 폐 염증은 BPD의 발병기유발에 중요한 역할을 하기 때문에, 코르티코 스테로이드 사용은 이를 예방하기 위한 하나의 잠재적 치료법이다. 그럼에도 불구 하 고, 전신 코르 티 코 스테로이드 치료는 일반적으로 장기 부작용으로 인해 조영아에 대 한 권장 되지 않습니다. 전임상 연구와 인간 단계 I 임상 시험은 hyperoxia 유도폐 상해및 조산유아에 있는 중간엽 기질 세포 (MSC)의 사용이 안전하고 가능하다는 것을 보여주었습니다. 내과 호흡 및 정맥 MSC 이식은 신생아 과옥성 폐 손상으로부터 보호하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 줄기 세포의 장내 투여및 결합계면활성제 및 글루코코르티코이드 치료는 호흡기 질환으로 신생아를 치료하는 새로운 전략으로 부상하고 있다. 출생시 쥐 폐의 발달 단계는 임신의 26-28 주에 인간 폐에 있는 것과 동일합니다. 따라서 신생아 쥐는 호흡 곤란을 가진 조산아에게 그 효능을 평가하기 위해 장내 투여를 연구하는 데 적합합니다. 이 장내 주입 기술은 줄기 세포와 약물을 폐로 전달하기위한 임상적으로 실행 가능한 옵션입니다.
Introduction
보충 산소는 종종 호흡 곤란으로 신생아를 치료하는 데 필요합니다1. 그러나, 유아에 있는 hyperoxia 치료는 불리한 장기 효력이 있습니다. 산소의 고농도에 장기간 노출은 염증과 급성 폐 손상으로 이어지며, 이는 인간 기관지 폐 이형성증(BPD)2와유사하다. BPD는 조기 계면활성제 치료, 최적의 환기 절차 및 미숙아의 비침습적 양압 환기 의 사용 증가에도 불구하고 발생할 수있는 hyperoxia 치료의 주요 합병증입니다. 많은 치료 전략이 BPD3에대해 보고되었지만 알려진 치료법은 이 합병증을 줄일 수 없습니다.
코르티코 스테로이드 사용은 BPD를 방지 하기 위해 하나의 잠재적인 치료, 폐 염증 그것의 병 인에 중요 한 역할을 하기 때문에. 그러나, 전신 코르티코 스테로이드 치료는 일반적으로 장기 부작용으로인해 조산 유아에 대 한 권장 하지 않습니다4,5.
중간엽 기질 세포(MSC)는 만능 특성을 가지며 뼈, 연골, 지방 조직, 근육 및 힘줄을 포함한 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있다6. MSP는 면역 조절, 항염증 및 재생 효과7을가지며, 동물 연구는 설치류8,,9에서과옥시아 유발 폐 손상에 대한 암조 및 분비 성분의 치료 이점을 보여준다. 내과 호흡 및 정맥 MSC 이식은 신생아 과옥성 폐 손상으로부터 보호하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 줄기 세포의 내과 실체 투여및 결합된 계면활성제 및 코르티코 스테로이드 치료는 호흡기 질환으로 신생아를 치료하는 잠재적인 치료 전략일 수 있다. 전임상 연구는 신생아 쥐10,,11, 12에서줄기 세포 및 아데노 관련 바이러스의 장내투여를사용하였다. 그러나, 이식된 줄기세포의 기술 및 생체 내 추적의 단계별 프리젠테이션은 유효하지 않다. 신생아 쥐는 출생 시 쥐 폐의 낭반 단계가 임신13의26-28 주에 인간 폐의 것과 동일하기 때문에 호흡 곤란을 가진 조산유아에 대한 내내 투여의 효과를 연구하는 데 적합합니다. 쥐 기관으로 투여하는 효과적인 방법은 성공적인 폐 분포에 매우 중요합니다. 여기에 제시된 기술은 인간을 위한 모형으로 쥐를 사용하여 신생아 폐 질병의 처리를 위한 세포 및/또는 약의 장내 투여의 연구를 허용합니다.
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Protocol
이 절차는 타이베이 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
참고: 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 반딧불 루시파제 유전자 (Fluc)로 안정적으로 전감염된 인간 MSP는 상업 회사(재료의 표)로부터수득되었다.
1. 반딧불 루시파라제와 녹색 형광 단백질을 가진 인간 MSC의 특성화
- 완전한 매체에서 GFP와 Fluc로 감염된 인간 MSC를 유지(최소 필수 매체 독수리-알파 수정[αMEM], 10-15% 태아 소 혈청 [FBS], 2mM L-글루타민, 1 ng/mL 기본 FGF 및2PSF로 보충) 포화 습도가 있는 37°C에서 5% CO2. ~70-90% 합류에서 통과 세포.
- 형광상 대비현미경(도 1A)하에서 MSC를 관찰하고 Fluc 및 GFP14의발현 수준을 분석한다.
- 유동 세포측정(도1B)을이용하여 CD44, CD73, CD90, CD105를 포함한 CD 마커의 발현을 분석하여 MSC를 특성화한다. 줄기세포의 탈량 분화를 세포세포, 연골세포 및 골세포로 유도하고, 폰 코사, 오일 레드 O 및 알시안 블루 염색에 의한 삼중 분화(도1C)를상용프로토콜(15,16)에16따른 확인한다.
2. 쥐 새끼의 마취
- 시간에 따라 임신 한 Sprague-Dawley 쥐가 기간에 질로 전달되도록 허용하십시오.
- 산후 5일째에 케이지에서 쥐 새끼를 제거합니다.
- 마취 챔버에서 가스 마취 (즉, 2 % 이소플루란)를 사용하여 쥐 새끼를 마취합니다.
- 호흡과 반사 신경을 확인 하 여 적절 한 마취를 확인 합니다.
참고: 호흡은 얕아져야 하며 반사 신경은 감소해야 합니다. 쥐 새끼는 이 이소플루란 농도로 적어도 ~10분 동안 의식을 잃은 채로 남아 있습니다.
3. 장내 주입
- 일단 마취되면, 쥐 새끼를 ~ 60°로 기울인 삽관 스탠드에 고정하고 네 개의 사지모두에 실험실 라벨 테이프로 새끼를 제자리에 고정시하십시오.
- 코를 아래로 테이프를 바르고 머리를 고정하고 구멍을 뚫기 위해 목을 정확히 찾아보세요.
- 75%의 알코올 준비 패드로 절개 부위(즉, 목)를 소독합니다.
- 경동맥을 손상시키지 않도록 마이크로시저로 기관 위 0.3cm 수직 중간선 목 절개를 만듭니다.
- 지방과 근육 층을 멀리 해부하여 후크없이 곡선 팁 테이퍼 핀셋으로 기관을 찾습니다.
- 구부러진 팁 테이퍼 핀셋으로 기관치를 잡습니다.
- 100 μL 주사기를 똑바로 잡고 30 μL 주사기를 똑바로 잡고 30 μL 주사기를 수직으로 잡고 30 μL 의 일반 식염수(즉, 제어) 또는 30 μL의 Fluc-GFP 라벨MSD(1 x 105 세포)를 30G 바늘 주사기를 통해 기관체에 천천히 주입한다.
- 6-0 실크 스티치 1개로 절개를 닫고 매듭을 가능한 한 작게 묶고 끝을 가능한 한 짧게 자른다.
- 쥐를 적외선 아래 또는 가열 패드에 두어 따뜻하게 유지하고 마취에서 회복할 수 있도록 하십시오.
- 쥐가 따뜻하고 분홍색이며 쥐를 케이지로 되돌리기 전에 자발적으로 움직일 수 있는지 확인합니다.
4. MSC의 폐 분포 모니터링
- 이식된 인간 MSC를 추적하기 위해, 인산염 완충식식염(PBS)에 루시페린 칼륨 소금을 함유한 쥐를 MSC 주입 후 15분 동안 125 mg/kg의 체중으로 주입한다.
- 코 콘을 통해 2% 이소플루란을 사용하여 쥐를 마취시합니다.
- 배지 비닝, 1f/스톱, 26cm 시야를 이용하여 루시페린 투여 후 10분 간격으로 순차적 이미지를획득한다(재료의 표).
- 이미징소프트웨어(재료표)17을사용하여 관심의 자동 영역에 기초하여 폐로부터의 발광 활성을 정량화한다.
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Representative Results
신생아 쥐라는 용어에서 줄기 세포의 내막 주입의 폐 분포는 반딧불 루시파라기(Fluc)-표지된 줄기 세포에 의해 결정되었다. MSP는 Fluc로 표지되고 렌즈피바이러스 변환을 통해 녹색 형광 단백질로 태그되었습니다. 도 1A는 인간 MSC에서 높은 수준의 GFP 발현을 나타내며, 인구의 93.7%가 유동 세포측정에 의해 검출된 GFP 양성 표현을 보였다. MSC는 CD 마커(즉, CD 44, CD73, CD90 및 CD105)의 발현과 골세포, 연골세포 및 아디포사이클로 의 분화의 세분화 기능을 분석하는 것이 특징이었다(도1B,C). 생체 내에서 이식된 인간 MSC를 추적하기 위해, 쥐의 발광 화상 진찰은 작은 동물 화상 진찰 시스템을 사용하여 수행되었다. 측정은 통풍이 잘 되었습니다. 쥐는 접착 테이프로 고정되었고, 그 후 PBS에서 루시페린 칼륨 소금 30 mg/mL의 인트라회 론 주사를 투여하였다 125 mg/kg의 체중이 투여되었다. 루시파라제는 루시페린, 산소 및 ATP와 결합하여 화학 반응을 통해 빛을 생성하여 생물 발광18을생성합니다. 이미징 시술 동안, 쥐는 코 콘을 통해 투여된 2% 이소플루란을 사용하여 마취하였다. 쥐 이미지는 루시피린 투여 후 10분 후에 획득되었습니다. 순차적 이미지는 5-15s 간격(시간 지연 없음)으로 최소 1분 동안 획득되었으며 중간 비닝, 1f/stop 및 26cm 시야필드가 있습니다. 서로 다른 파장(560-660 nm)에서 여과된 스펙트럼 이미지의 시퀀스로부터의 측정 데이터를 사용하여 생체 발광 기자의 깊이와 위치를 결정했습니다. 폐에서 발광 신호는 원 선택 모드에서 관심의 자동 영역에 따라 계산되었다. 정상 식염수 처리 동물의 평균 발광 강도는 하나의 값을 할당하고, 각 MSC 처리 동물에 대한 데이터는 정상 식염수 처리 동물의 것으로 정규화되었다.
도 2A는 쥐 폐에서 발광의 대표적인 이미지를 나타낸다. 정상적인 식염수로 치료된 쥐의 폐 부위에서는 발광이 관찰되지 않았다. MSC로 취급된 쥐는 기관 및 중앙 폐 지구에 있는 발광을 전시했습니다. 발광 강도의 정량화는 MSC로 처리된 쥐가 정상 식염수로 단독으로 취급된 쥐에 비해 발광 활성의 약 13배 증가를 나타냈다는 것을밝혔다(도 2B).
그림 1: 인간 MSP의 특성화.
(A)렌즈바이러스 트랜스듀션 후 인간 MSC에서 의 GFP 발현. (B)인간 MSC 특이CD 마커의 발현(즉, CD 44, CD73, CD90, CD105). (C)인간 MSC의 삼중 분화. Please click here to view a larger version of this figure.
그림 2: 작은 동물 화상 진찰 시스템을 사용하여 발광의 폐 분포의 감시.
(A)쥐에 표지된 MSC의 폐 분포의 대표적인 이미지. 정상적인 식염수로 치료된 쥐의 폐 부위에서는 발광이 관찰되지 않았다. 인간 적인 MSC로 취급된 쥐는 기관 및 폐 지구에 있는 발광을 전시했습니다. (b)쥐 폐내발광 활성의 정량화(n=4). 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 축은 Y 축의 광자/s/cm 2/sr입니다.2 **P&01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
호흡 곤란을 가진 신생아는 일반적으로 내추럴 계면활성제 및/또는 코르티코스테로이드 치료가필요합니다 19. 인간 상 I 임상 시험은 조산유아에서 내막 MSC의안전성(8)을입증했다. 이러한 연구는 약물의 장내 투여가 호흡 곤란을 가진 신생아에게 중요한 선택이라는 것을 시사합니다. 모델 기능이 인간과 직접 관련이 있는 경우 동물 모델 연구가 가장 유용합니다. 용어 신생아 쥐는 조산 폐 부상 및 개발 연구에 대 한 유용한 모델. 그러나, 신생아 쥐의 상부 기도는 성인쥐20에서수행된 것과 같이 직접 기관 삽관을 허용하기에는 너무 작습니다. 기관 절제술을 통한 장내 주입은 신생아 쥐 폐에 줄기 세포 또는 약물의 장내 투여를 위한 실행 가능한 대체 기술이다.
생체 내 생물 발광 화상 진찰은 이식된 줄기 세포의 운명에 대한 생체 내 및 생체 모니터링을 위한 귀중한 도구이며, 루시파라제 기자단백질(21)의구성식 발현으로 세포를 표지함으로써 달성된다. 루시파라제 효소는 기판(luciferin)의 산화를 촉매하고 반응의 산물로서 빛을 방출한다. 생물 발광을 통한 시각적 이미징은 살아있는 유기체의 질병 프로세스에 대한 비침습적이고 실시간 분석을 허용합니다. 생물 발광 이미징은 MSC22의이동, 생존 및 형태학적 분화의 생체 모니터링에 사용되었다. 이 연구는 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 폐에 있는 이식된 줄기 세포의 분포를 평가했습니다. 생체 내 생물 발광 이미징은 세포 함유 입자의 모니터링에 의존합니다. 이들은 세포 죽음에 phagocytosed 될 수 있기 때문에, 그것은 호스트 대식세포의 추적으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 발광은 루시페린 투여 후 10분 미만을 측정했다.
이 연구의 한계는 동물 간 변이가 IVIS 이미지에서 인식되었다는 것입니다. 따라서 폐에서 발광 신호는 관심의 자동 영역에 기초하여 계산되고 정상 식염수 처리 동물에서 평균 발광 강도를 1마리로 정상화하였다.
정확하고 효과적인 장내 부기는 신생아 쥐의 MSC 효능 평가에 필수적이지만 다른 약용 치료도 테스트하는 데 유용할 수 있습니다. 따라서, 이러한 쥐 모델 기술은 다양한 폐 응용 분야에 조절될 수 있다. 줄기 세포 또는 의약품의 장내 주입은 폐 질환의 비교적 쉽고 비용 효율적인 치료를 나타냅니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 부분적으로 메리디겐 생명 공학 (주 타이페이, 대만)의 보조금에 의해 지원되었다 (A-109-008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
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