Summary
記載は、期末新生児ラットにおける気管内注射を介した間葉間質間質細胞(MSC)の気管内移植を行うためのプロトコルである。この技術は、幹細胞および薬物を新生児ラット肺に送達し、その有効性を評価するための臨床的に実行可能な選択肢である。
Abstract
高濃度の酸素への長期暴露は、炎症および急性肺損傷を引き起こし、これはヒト気管支肺異形成(BPD)に似ています。未熟児では、界面活性剤療法、最適な換気戦略、および非侵襲的な陽圧換気の早期使用にもかかわらず、BPDは主要な合併症である。肺の炎症はBPDの病因において重要な役割を果たすため、コルチコステロイドの使用はそれを防ぐための1つの潜在的な治療法である。それにもかかわらず、全身性コルチコステロイド治療は、長期的な悪影響のために早産児に通常推奨されません。前臨床試験およびヒト第1相臨床試験は、高酸素誘発性肺傷害および早産児における間葉間質間質細胞(MSC)の使用が安全で実現可能であることを実証した。気管内および静脈内MSC移植は、新生児高酸素性肺損傷から保護することが示されている。そこで、幹細胞の気管内投与と複合界面活性剤とグルココルチコイド治療が、新生児を呼吸器疾患で治療する新しい戦略として登場した。出生時のラット肺の発達段階は、妊娠26-28週のヒト肺のそれと同等である。したがって、新生児ラットは、その有効性を評価するために呼吸困難を有する早産児に対する気管内投与を研究するのに適している。この気管内植え付け技術は、幹細胞および薬物を肺に送達するための臨床的に実行可能な選択肢である。
Introduction
補助酸素は、多くの場合、呼吸窮迫を有する新生児を治療するために必要とされる1.しかし、乳児の高酸素療法は長期的に悪影響を及ぼす。高濃度の酸素への長期暴露は、炎症および急性肺損傷を引き起こし、これはヒト気管支肺異形成(BPD)22に似ている。BPDは、早期の界面活性剤療法、最適な換気手順、および未熟児における非侵襲的陽圧換気の使用の増加にもかかわらず起こり得る高酸素治療の主要な合併症である。BPD3に対する多くの治療戦略が報告されているが、既知の治療法は、この合併症を軽減できない。
コルチコステロイドの使用は、肺の炎症がその病因において重要な役割を果たすため、BPDを予防するための1つの潜在的な治療法である。しかし、全身性コルチコステロイド療法は、通常、長期の悪影響44,55のために早産児に推奨されない。
間葉間質細胞(MFc)は多能性を有し、骨、軟骨、脂肪組織、筋肉、腱6を含む様々な細胞タイプに分化することができる。MSCは、免疫調節作用、抗炎症作用、および再生効果7を有し、動物学的研究は、げっ歯類における高oxia誘発性肺損傷におけるMSCおよびその分泌成分の治療上の利点を示す。気管内および静脈内MSC移植は、新生児高酸素性肺損傷から保護することが示されている。したがって、幹細胞の気管内投与と界面活性剤とコルチコステロイド療法を組み合わせることは、新生児を呼吸器疾患で治療するための潜在的な治療戦略である可能性がある。前臨床試験は、新生児ラット10、11、12,11における幹細胞およびアデノ関連ウイルスの気管内投与を用いた。しかし、移植した幹細胞の技術とインビボ追跡の段階的な提示は利用できない。新生児ラットは、出生時のラット肺の嚢胞期が妊娠13週の26-28週のヒト肺のそれと同等であるため、呼吸困難児を有する早産児に対する気管内投与の影響を研究するのに適している。ラット気管への投与のための効果的な方法は、肺の分布を成功させるために重要です.ここで提示される技術は、ヒトのモデルとしてラットを使用して新生児肺疾患の治療のための細胞および/または薬物の気管内投与の研究を可能にする。
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Protocol
この手順は、台北医科大学動物のケアと使用委員会によって承認されました.
注:ヒトMSCは、緑色蛍光タンパク質(GFP)およびホタルルシメラーゼ遺伝子(Fluc)を安定的にトランスフェクトし、商業会社(材料表)から入手した。
1. ホタルルシファーゼと緑色蛍光タンパク質を用いたヒトMSCの特性評価
- GFPおよびFlucにトランスフェクトされたヒトMSCを完全な培地(最小必須培地-α修飾[αMEM]、10-15%ウシ血清[FBS]、2 mM L-グルタミン、1 ng/mL塩基性FGF、およびPSFを補う)を37°Cで飽和湿度および5%CO2で維持する。合流度70-90%の通路細胞。
- 蛍光位相コントラスト顕微鏡(図1A)でMSCを観察し、FlucとGFP14の発現レベルを解析する。
- フローサイトメトリーを用いてCD44、CD73、CD90、CD105を含むCDマーカーの発現を解析して、MSCを特徴付ける(図1B)。葉細胞、軟骨細胞、および骨細胞に対する幹細胞の三分化を誘導し、かつ、フォン・コッサによる三分分化(図1C)、オイルレッドO、およびアルシアンブルー染色を確認し、市販プロトコル15,16,16に従う。
2. ラットの子犬の麻酔
- 期間内に膣を出産する日付の妊娠スプレイグ -ドーリーラットを許可します。.
- 出生後5日目にケージからラットの子犬を取り除きます。
- 麻酔室でガス麻酔(すなわち、2%イソフルラン)を使用してラットの子犬を麻酔します。
- 呼吸と反射を確認して、適切な麻酔を確認します。
注:呼吸は浅くなり、反射神経は減少するはずです。ラットの子犬は、このイオブルラン濃度で少なくとも〜10分間無意識のままです。
3. 気管内の内清
- 麻酔が行われたら、ラットの子犬を約60°の角度で挿管スタンドで拘束し、4本の手足すべてに実験室のラベリングテープで子犬を所定の位置に保持します。
- 鼻の下にテープを貼って頭を固定し、頸部を穿刺気管切開術のピンポイントで突き止めます。
- 75%アルコール準備パッドで切開部(すなわち首)を消毒する。
- 頸動脈を損傷しないように、マイクロシザーで気管の上に0.3cm垂直中線頸部を切開します。
- 脂肪と筋肉の層を解剖して、フックなしで湾曲した先端テーパーピンセットで気管を見つけます。
- 湾曲した先端の先細りのピンセットで気管を持ちます。
- 100 μL のシリンジを直立に保持し、刺激段階で 30 G 針注射器を通して、正常な生理食音 (制御) または Fluc-GFP ラベル付き MSFC (1 x 105 細胞) の 30 μL を気管にゆっくりと注入します。
- 1つの6-0シルクステッチで切開を閉じ、結び目をできるだけ小さく結び、できるだけ短く端を切ります。
- ラットを赤外線の下または加熱パッドの上に置いて暖かく保ち、麻酔から回復できるようにします。
- ラットが暖かく、ピンク色で、ラットをケージに戻す前に自発的な動きができることを確認してください。
4. MSCの肺分布のモニタリング
- 移植したヒトMSCを追跡するために、腹腔内にリン酸緩衝生理食塩(PBS)に、MSC注射後15分の体重125mg/kgの用量でルシフェリンカリウム塩をラットに注入する。
- 鼻コーンを通して2%イオブルランを使用してラットを麻酔する。
- ミディアムビニング、1 f/ストップ、小動物イメージングシステムを使用した視野26cm(材料表)を用いてルシフェリン投与後10分で5~15の間隔で順次画像を取得する(
- イメージングソフトウェア(材料表)17を用いて、対象となる自動領域に基づいて肺からの発光活性を定量化する。
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Representative Results
新生児ラットという用語における幹細胞の気管内点眼の肺分布は、ホタルルシファーゼ(Fluc)標識幹細胞によって決定された。MCCはFlucで標識され、レンチウイルス伝達を通じて緑色蛍光タンパク質でタグ付けされた。図1AはヒトMSCにおける高レベルのGFP発現を示し、集団の93.7%がフローサイトメトリーによって検出されたGFP陽性発現を示した。MSCは、CDマーカー(すなわち、CD44、CD73、CD90、およびCD105)の発現および骨細胞、軟骨細胞およびジポサイトへの三分化の能力を分析することによって特徴づけられた(図1B,C)。インビボで移植されたヒトMSCを追跡するために、ラットの発光イメージングを小動物イメージングシステムを用いて行った。測定は腹孔に測定された。ラットを粘着テープで固定し、その後、体重125mg/kgの用量でPBS中のルシフェリンカリウム塩30mg/mLの腹腔内注射を投与した。ルシメラーゼはルシフェリン、酸素、およびATPと結合し、化学反応を通して光を発生させ、生物発光118をもたらす。イメージング手順の間、ラットを鼻コーンを介して投与された2%イオブルランを使用して麻酔を行った。ラット画像はルシフェリン投与後10分に取得した。シーケンシャル画像は、少なくとも1分間、5~15分間隔(時間遅延なし)で取得され、ミディアムビニング、1 f/ストップ、26 cmの視野が得られました。異なる波長(560~660nm)でフィルタリングされたスペクトル画像のシーケンスからの測定データを用いて、生物発光レポーターの深さと位置を決定しました。肺からの発光信号は、円選択モードにおける対象の自動領域に基づいて計算した。正常生理生理的な動物の平均発光強度には1の値を割り当て、MSC処理動物ごとのデータを正常生理的に処理した動物のものに正規化した。
図2Aは、ラット肺における発光の代表的な画像を示す。正常生理的に処理されたラットの肺領域では発光は認められなかった。MSCで処理したラットは、気管および中央肺領域において発光を示した。発光強度の定量化により、MSCで処理したラットは、通常の生理活性を単独で処理したラットと比較して、発光活性の約13倍の増加を示すことが明らかになった(図2B)。
図1:ヒトのMSCの特性
(A) レンチウイルス導入後のヒトMSCにおけるGFP発現(B) ヒトMSC特異的CDマーカー(すなわち、CD44、CD73、CD90、CD105)の発現。(C) ヒトのMCの三分法. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:小動物イメージングシステムを用いた発光の肺分布のモニタリング
(A) ラットにおける標識されたMSCの肺分布の代表的な画像である。正常生理的に治療されたラットの肺領域では発光は認められなかった。ヒトMSCで治療したラットは、気管および肺領域において発光を示した。(B)ラット肺における発光活性の定量化(n=4)。誤差範囲は標準偏差を表します。スケールは Y 軸のフォトン/s/cm2/sr です。**P < 0.01. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
呼吸困難を有する新生児は、一般的に気管内界面活性剤および/またはコルチコステロイド治療19を必要とする。ヒト第I相臨床試験は、早産児における気管内MSPの安全性を実証した8.これらの研究は、薬物の気管内投与が呼吸困難を持つ新生児にとって重要な選択肢であることを示唆している。動物モデルの研究は、モデルの特徴が人間に直接関係する場合に最も役立ちます。用語新生児ラットは、早産の肺損傷および発達研究に有用なモデルである。しかし、新生児ラットの上気道は、成体ラット20で行われるように直接気管挿管を可能にするには小さすぎる。気管切開術による気管内内植え出しは、新生児ラット肺に幹細胞または薬物を気管内投与するための実行可能な代替技術である。
生体発光イメージングは、移植した幹細胞の運命をインビトロおよびインビボモニタリングするための貴重なツールであり、ルシファーゼレポータータンパク質21の構成発現を有する細胞を標識することによって達成される。ルシファーゼ酵素は、基質(ルシフェリン)の酸化を触媒し、反応の産物として光を放出する。生物発光による視覚イメージングは、生物における疾患プロセスの非侵襲的かつリアルタイムな分析を可能にする。生物発光イメージングは、MSCs22の移動、生存、および形態学的分化のインビボモニタリングに使用された。本研究では、インビボイメージングシステムを用いて肺に移植した幹細胞の分布を評価した。生体内生物発光イメージングは、細胞含有粒子のモニタリングに依存する。これらは細胞死時に貪食する可能性があるため、宿主マクロファージの追跡につながる可能性があります。従って、ルシフェリン投与後10分未満の発光を測定した。
この研究の限界は、動物間の変動がIVIS画像で知覚されたということです。したがって、肺からの発光信号は、対象の自動領域に基づいて計算され、正常な生理的な動物の1に平均発光強度を正常化した。
正しく効果的な気管内内点眼の点眼は、新生児ラットにおけるMSC有効性の評価に不可欠であるが、他の薬効治療の検査にも有用である。したがって、このラットモデル技術は、種々の肺用途に調整可能であり得る。幹細胞または医薬品の気管内点眼の点眼は、肺疾患の比較的容易で費用対効果の高い治療を表します。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究の一部は、メリディゲンバイオテック株式会社台湾台北(A-109-008)からの助成金によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
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