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Neuroscience

चूहों में पूर्ण ट्रांसेक्शन-टाइप स्पाइनल कॉर्ड इंजरी का प्रेरण

Published: May 6, 2020 doi: 10.3791/61131
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 2,3, 2,3, *1,2,3, *2,3
1Griffith Institute for Drug Discovery, Griffith University, 2Menzies Health Institute Queensland, Griffith University, 3Clem Jones Centre for Neurobiology and Stem Cell Research, Griffith University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल बताता है कि माउस मॉडल में स्थिर ट्रांसेक्शन-प्रकार रीढ़ की हड्डी की चोट को शामिल करने के लिए एक सटीक लेमिनेक्टॉमी कैसे बनाया जाए, रीढ़ की हड्डी की चोट अनुसंधान के लिए न्यूनतम संपाश्र्वक क्षति के साथ।

Abstract

रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) काफी हद तक कार्य के अपरिवर्तनीय और स्थायी नुकसान की ओर ले जाती है, जो आमतौर पर आघात के परिणामस्वरूप होती है। एससीआई से उत्पन्न होने वाली दुर्बल विकलांगता को दूर करने के लिए सेल प्रत्यारोपण विधियों जैसे कई उपचार विकल्पों पर शोध किया जा रहा है । अधिकांश पूर्व नैदानिक पशु परीक्षण एससीआई के कृंतक मॉडल में आयोजित किए जाते हैं। जबकि एससीआई के चूहे मॉडल व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, माउस मॉडल कम ध्यान प्राप्त किया है, भले ही माउस मॉडल चूहा मॉडल पर महत्वपूर्ण लाभ हो सकता है । चूहों का छोटा आकार चूहों की तुलना में पशु रखरखाव लागत को कम करने के बराबर है, और कई ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की उपलब्धता कई प्रकार के अध्ययनों के लिए लाभप्रद है। जानवरों में दोहराने योग्य और सटीक चोट को प्रेरित करना एससीआई अनुसंधान के लिए प्राथमिक चुनौती है, जो छोटे कृंतक में उच्च सटीक सर्जरी की आवश्यकता होती है। ट्रांसेक्शन-प्रकार की चोट मॉडल प्रत्यारोपण आधारित चिकित्सीय अनुसंधान के लिए पिछले दशक में एक आमतौर पर इस्तेमाल किया चोट मॉडल रहा है, लेकिन चूहों में एक पूर्ण ट्रांसेक्शन प्रकार की चोट उत्प्रेरण के लिए एक मानकीकृत विधि मौजूद नहीं है । हमने C57BL/6 चूहों में एक पूर्ण ट्रांसेक्शन प्रकार की चोट को वक्ष कशेरुकी स्तर 10 (T10) पर उत्प्रेरित करने के लिए एक शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल विकसित किया है। प्रक्रिया ठीक लेमिना को हटाने के लिए रोंगर्स के बजाय एक छोटी टिप ड्रिल का उपयोग करती है, जिसके बाद रीढ़ की हड्डी के ट्रांसेक्शन को प्रेरित करने के लिए गोल अत्याधुनिक के साथ एक पतली ब्लेड का उपयोग किया जाता है। इस विधि से न्यूनतम संपाश्र्वक मांसपेशी और हड्डी की क्षति के साथ छोटे कृन्तकों में प्रजनन योग्य ट्रांसेक्शन-प्रकार की चोट होती है और इसलिए जटिल कारकों को कम करता है, विशेष रूप से जहां व्यवहार कार्यात्मक परिणामों का विश्लेषण किया जाता है।

Introduction

रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) एक जटिल चिकित्सा समस्या है जिसके परिणामस्वरूप स्वास्थ्य और जीवनशैली में भारी परिवर्तन होता है। एससीआई के लिए कोई इलाज नहीं है, और एससीआई के रोगविज्ञान को अच्छी तरह से नहीं समझा जाता है। पशु विज्ञान मॉडल, विशेष रूप से कृंतक मॉडल में, नए उपचार के परीक्षण के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैं, और दशकों के लिए एससीआई का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । आज तक, पूर्व-नैदानिक एससीआई अध्ययनों के 72% से अधिक चूहों मॉडलों को नियोजित किया है, जबकि चूहों का उपयोग करने वाले महज 16% की तुलना में1। यद्यपि चूहों, उनके बड़े आकार और मानव SCIs के समान गुहाओं के रूप में प्रवृत्ति के कारण, पारंपरिक रूप से उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण का अध्ययन करने के लिए पसंदीदा मॉडल जानवर रहे हैं, चूहों (कई ट्रांसजेनिक माउस मॉडल सहित) अब एससीआई2के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए अधिक बार उपयोग किया जा रहा है। माउस मॉडल आसान हैंडलिंग, तेज प्रजनन दर और चूहों की तुलना में कम लागत के मामले में अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है; चूहों ने मनुष्यों के साथ उच्च स्तर की जीनोमिक समानता भी प्रदर्शित की1,2,3 माउस मॉडल के प्रमुख नुकसान की पहचान काफी छोटे आकार के रूप में की गई है जो रीढ़ की हड्डी की चोटों के निर्माण और इलाज के लिए शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप के लिए चुनौतियां पैदा करता है4, 5,5.

मौजूदा साहित्य में एक अंतर है जो माउस मॉडल में स्थिर एससीआई को प्रेरित करने के लिए एक मजबूत और प्रजनन योग्य सर्जिकल प्रोटोकॉल की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। इसलिए, हम इन सीमाओं को दूर करने के लिए इस प्रोटोकॉल में एक उपन्यास और सटीक शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल चूहों में ट्रांसेक्शन-प्रकार की चोट को प्रेरित करने के लिए गहन दिशानिर्देश प्रदान करता है, क्योंकि इस चोट प्रकार को चोट6के बाद पुनर्योजी और अपक्षयी परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त माना गया है, साथ ही न्यूरोप्लास्टी, तंत्रिका सर्किटरी और ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण7। हमने निचले वक्ष क्षेत्र में चोट को प्रेरित करने के लिए चुना है, क्योंकि छाती के स्तर का एससीआई का उपयोग साहित्य 1 में सबसे अधिक कियाजाताहै।

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Protocol

ऑस्ट्रेलिया की राष्ट्रीय स्वास्थ्य एवं चिकित्सा अनुसंधान परिषद के दिशा-निर्देशों के तहत ग्रिफ़िथ विश्वविद्यालय पशु आचार समिति (ईएसके/04/16 एईसी और एमएससी/04/18 एईसी) के अनुमोदन से सभी प्रक्रियाएं की गईं ।

1. सर्जरी के लिए पशु सेट-अप प्रक्रिया

  1. जानवर को एनेस्थेटाइज और स्थिर करें।
    1. 8-10 सप्ताह पुरानी मादा C57BL/6 चूहों का प्रयोग करें। संज्ञाहरण को शामिल करने के लिए 1 एल/मिन ऑक्सीजन में 5% आइसोफ्लुन का उपयोग करें। एनेस्थीसिया के रखरखाव के लिए, 1 एल/मिन ऑक्सीजन में 1.5-2% आइसोफ्लारेन का उपयोग करें। पूंछ और हिंद पंजे में दर्द पलटा की कमी की स्थापना के द्वारा उचित एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें।
  2. एंटीबायोटिक कवर के लिए एनाल्जेसिया और एन्रोफ्लॉक्सासिन (10 मिलीग्राम/किलो शरीर के वजन) के लिए बुप्रेनोरफिन (0.03 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन) प्रशासित करें, शरीर के वजन के अनुसार चमड़े के रूप में। जरूरत पड़ने पर मेलोक्सीकम (2 मिलीग्राम/किलो बॉडी वेट) लॉन्ग टर्म एनाल्जेसिया के लिए दिया जा सकता है।
  3. एक हीटिंग पैड के साथ जानवर के शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रखें
    1. पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी पर सर्जिकल क्षेत्र का पर्दाफाश करने के लिए वापस फर दाढ़ी। चीरा साइट को स्टरलाइज करने से पहले सर्जिकल क्षेत्र से मुंडा फर निकालें। पॉविडोन आयोडीन एंटीसेप्टिक लिक्विड और सर्जिकल स्पिरिट में भिगोए हुए बाँझ कपास झाड़ू के साथ मुंडा क्षेत्र को स्टरलाइज करें।
  4. जानवर को स्थिर करने के लिए शल्य चिकित्सा क्षेत्र के लिए माउस के पंजे टेप(चित्रा 1A)। माउस(चित्रा 1B)पर एक अंडाकार खिड़की का कपड़ा रखें।

2. लेमिनेक्टॉमी

  1. सर्जिकल स्केलपेल का उपयोग करके टी10 कशेरुकी स्तर पर एक ऊर्ध्वाधर मिडलाइन चीरा बनाएं।
    1. लेमिनेक्टॉमी की साइट निर्धारित करने के लिए T10 कशेरुका की स्पिनस प्रक्रिया का पता लगाएं। कशेरुका का शरीर स्पिनस प्रक्रिया 8 की नोक परथोड़ा कपाल है (चित्रा 2देखें)। यह टिप टी11 कशेरुका8के मध्य में टिकी हुई है ।
    2. चीरा ~ 2.5 सेमी लंबा बनाओ, ताकि T10 कशेरुका की रीढ़ लगभग चीरा की लंबाई के बीच में है।
  2. त्वचा को प्रतिबिंबित करें और रिट्रैक्टर्स के साथ वापस लें।
    1. अंतर्निहित प्रावरणी से त्वचा को उठाने के लिए सीधे संदंश का उपयोग करें। यह रिट्रैक्टर्स को रखने के लिए जगह बनाएगा; ये सर्जिकल फील्ड को खुला रखेंगे।
  3. स्पिनस प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए चमड़े के नीचे के ऊतकों और प्रावरणी के कुंद विच्छेदन करें।
    1. स्केलपेल के कुंद किनारे का उपयोग करके टी 9-टी11 कशेरुकी के कताई को बेनकाब करने के लिए चमड़े के नीचे के ऊतकों और अंतर्निहित प्रावरणी में एक छोटा मिडलाइन चीरा बनाया जा सके। कुंद विच्छेदन करने और प्रावरणी को प्रतिबिंबित करने के लिए ठीक टिप संदंश (गैर-तेज) का उपयोग करें।
  4. लैमिना को बेनकाब करने के लिए पैरा-स्पाइनस मांसपेशियों को विभाजित करें और अलग करें।
    1. T9-T11 कशेरुकी के कताई के साथ पृष्ठीय ट्रंक मांसपेशियों और पैरा-स्पिनस मांसपेशियों को विभाजित करने के लिए स्केलपेल के कुंद टिप का उपयोग करें। परतों में मांसपेशियों के कुंद विच्छेदन प्रदर्शन और कशेरुकी के लैमिना का पर्दाफाश करने के लिए कुंद ठीक टिप संदंश का प्रयोग करें। यह किसी भी रक्तस्राव को कम करना चाहिए।
      नोट: यदि कोई रक्तस्राव हो रहा है, तो इसे नियंत्रित करने और सर्जिकल क्षेत्र से रक्त को साफ करने के लिए गर्म नमकीन (37 डिग्री सेल्सियस) सिंचाई और कपास झाड़ू का उपयोग करें।
    2. T10 कशेरुका की ट्रांसवर्स प्रक्रियाओं के आसपास छोटी जेब बनाने के लिए एक ही संदंश का उपयोग करें। निर्मित जेब(चित्रा 1C)में, ट्रांसवर्स प्रक्रियाओं के तहत अपने शूल को हुक करके T10 कशेरुका शरीर को स्थिर करने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें।
    3. गर्म नमकीन के साथ टी10 लैमिना को अच्छी तरह से कुल्ला करें और बोनी सतह को स्पष्ट रूप से कल्पना करने के लिए कपास झाड़ू के साथ धीरे-धीरे साफ करें। सुनिश्चित करें कि कोई मांसपेशी/स्नायु अनुलग्नक द्विपक्षीय रूप से सतह के साथ रहते हैं ।
  5. द्विपक्षीय रूप से लैमिना को तोड़ने के लिए एक ठीक टिप (0.55 मिमी व्यास, 7 मिमी लंबाई) के साथ एक ड्रिल का उपयोग करें।
    1. ड्रिल को चालू किए बिना, टी 9-टी 10 इंटरवर्टेब्रल स्पेस से टी10-टी11 इंटरवर्टेब्रल स्पेस तक एक ऊर्ध्वाधर पथ का पता लगाने के लिए ड्रिल की नोक का उपयोग करें। यह सुनिश्चित करना है कि ड्रिल बिट किसी भी ऊतक(चित्रा 1D)को पकड़ नहीं है।
    2. अब ड्रिल को चालू करें, धीरे-धीरे और ध्यान से टी 10 कशेरुका के दाहिने लैमिना पर एक ऊर्ध्वाधर खाई खोदें। लेमिनेक्टॉमी के इस हिस्से को सीधे ऊर्ध्वाधर रेखा में हड्डी की मोटाई के दौरान एक सटीक सर्जिकल दोष बनाना चाहिए। कशेरुका को स्थिर रखने के लिए घुमावदार संदंश के साथ पकड़ बनाए रखें।
  6. सुनिश्चित करें कि ड्रिल की नोक हड्डी के माध्यम से प्रवेश नहीं करती है और रीढ़ की हड्डी को घायल करती है। घुमावदार संदंश के साथ कशेरुका को स्थिर रखते हुए, लैमिना के बाईं ओर एक ही प्रक्रिया दोहराएं। किसी भी शेष हड्डी के टुकड़ों को धोने के लिए गर्म नमकीन के साथ सिंचाई करें।
  7. तंत्रिका आर्क(चित्रा 1F)के पीछे के हिस्से को उठाएं और हटा दें।
    1. स्पिनस प्रक्रिया को पकड़ने और द्विपक्षीय ड्रिलिंग द्वारा अलग किए गए लैमिना के पूरे पृष्ठीय खंड को हटाने के लिए कोण वाले ठीक टिप संदंश का उपयोग करें। सिंचाई और फिर से झाड़ू अगर कोई खून बह रहा है, स्पष्ट रूप से लेमिनेक्टॉमी खिड़की(चित्रा 1E)के तहत उजागर रीढ़ की हड्डी कल्पना करने के लिए ।

3. ट्रांसेक्शन

  1. ब्लेड के एक टुकड़े के साथ उजागर कॉर्ड के ट्रांसेक्शन द्वारा रीढ़ की हड्डी की चोट को प्रेरित करें।
    1. लेमिनेक्टॉमी खिड़की के केंद्र में कॉर्ड को टुकड़ा करने के लिए संकीर्ण, गोल काटने वाले ब्लेड का उपयोग करें। एक पूर्ण ट्रांसेक्शन चोट(चित्रा 1G)को प्रेरित करने के लिए रीढ़ की हड्डी के कॉलम के पार्श्व अवकाश को स्वीप करना सुनिश्चित करें।
  2. कुंद ठीक टिप संदंश का उपयोग कर ट्रांसेक्शन चोट की पूर्णता की पुष्टि करें और ट्रांसेक्शन साइट पर किसी भी शेष कनेक्शन को हटा दें ।
  3. सर्जिकल परतों को बंद करने से पहले रक्तस्राव को नियंत्रित करें।
  4. सिंचाई और किसी भी रक्तस्राव है कि ट्रांसेक्टेड कॉर्ड स्टंप से होता है साफ करने के लिए गर्म खारा का प्रयोग करें । जरूरत पड़ने पर हेमोसेसिस हासिल करने के लिए कोमल दबाव लागू करने के लिए कपास झाड़ू का उपयोग करें। रीढ़ की हड्डी को सेक न करने का ध्यान रखें।

4. बंद करने और तत्काल पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल

  1. मांसपेशियों को एक साथ लाएं और परत में सीवन करें।
    1. एक बार ट्रांसेक्शन साइट पर हेमोसेसिस हासिल हो जाने के बाद, टी10 कशेरुकी पर घुमावदार संदंश पकड़ जारी करें। अच्छे अपोजिशन को प्राप्त करने के लिए मिडलाइन के साथ विच्छेदित मांसपेशियों के किनारों को एक साथ लाएं।
    2. 5-0 पॉलीग्लेक्टिन 910 अवशोषित टांके का उपयोग करके एक परत में मांसपेशियों को सीवन करें। सुनिश्चित करें कि रीढ़ की प्राकृतिक वक्रता सीवन लाइन पर किसी भी तनाव का कारण नहीं है या टांके खोलने, टुकड़े टुकड़े साइट को उजागर ।
  2. चमड़े के नीचे के ऊतकों और त्वचा को बंद करें।
    1. त्वचा चीरा बंद करने के लिए 5-0 गैर-अवशोषित रेशम टांके का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि बंद होने से पहले त्वचा के नीचे कोई रक्तस्राव, थक्के या मलबे शेष नहीं है। इस कदम पर गर्म नमकीन के साथ एक अंतिम सिंचाई आवश्यक हो सकती है।
  3. संज्ञाहरण बंद करो। वसूली तक 10-30 मिनट के लिए जानवर का निरीक्षण करें। जानवर को इस अवधि के लिए हीटिंग पैड पर रहना चाहिए। पिंजरे में वाटर जेल और हाइड्रेटेड खाना उपलब्ध कराएं।
  4. पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल के लिए, पहले दो दिनों के लिए बुप्रेनोरफिन (दो बार दैनिक), एन्रोफ्लोक्सासिन (एक बार दैनिक) शामिल करें। इसके अतिरिक्त, पशु आचार समिति के दिशा-निर्देशों का पालन करते हुए, मूत्राशय को कम से कम दो बार दैनिक रूप से मैन्युअल रूप से खाली करें।
    नोट: इस प्रयोग में जानवरों को उनके सामान्य स्वास्थ्य और भलाई के लिए दैनिक रूप से मूल्यांकन किया गया था, जिसमें दर्द के लिए जांच करना (बुप्रेनोरफिन की अतिरिक्त खुराक देना) या संक्रमण (अतिरिक्त एन्रोफ्लोक्सेसिन), उनके पोषण और जलयोजन स्थिति (निर्जलित होने पर इंजेक्शन तरल पदार्थ देना) और ऑटोटॉमी के किसी भी संकेत (मामूली ऑटोटॉमी होने पर घाव की देखभाल प्रदान करना) शामिल था। यह पुरजोर सिफारिश की जाती है कि इच्छामृत्यु के फैसलों सहित पोस्ट-ऑपरेटिव केयर के इन पहलुओं का निर्धारण संस्थागत पशु आचार समिति के मार्गदर्शन से किया जाना चाहिए ।

5. चोट मॉडल का मूल्यांकन

  1. मोटर फ़ंक्शन के नुकसान की स्थापना।
    1. घायल चूहों पर मोटर व्यवहार का आकलन 2, 7, 14, 21 और 28 दिनों के बाद एक खुले मैदान में चोट के बाद Basso माउस स्केल (बीएमएस) का उपयोग कर समारोह9 (चित्रा 3सी-ई)के नुकसान का निर्धारण करने के लिए ।
  2. चोट की हिस्टोलॉजिकल पुष्टि
    1. इच्छामृत्यु के बाद कशेरुकी स्तंभों के साथ घायल रीढ़ की हड्डी की कटाई (इस प्रयोग में कार्बन डाइऑक्साइड के साथ किया, जैसा कि पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित) ।
    2. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में रात भर पनडुब्बी से ऊतक को ठीक करें और 3 सप्ताह में 20% एथिलीन डायामाइन टेट्राएसेटिक एसिड (EDTA) के साथ उपचार द्वारा हड्डियों को कम करें, हर 48 घंटे में ताजा ईडीटीए की जगह लें।
    3. क्रायो-सेक्शनिंग के लिए डिक्लेमिफाइड कताई तैयार करें और उन्हें 30 माइक्रोन मोटी धाराओं में काट लें।
    4. एंटी-जीएफएपी एंटीबॉडी और होचस्ट 33342 के साथ इम्यूनो-धुंधला करने के लिए जिलेटिन-लेपित ग्लास स्लाइड पर वर्गों को माउंट करें।
    5. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप(चित्रा 3A)पर स्लाइड छवि और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर चोट के आकार के माप प्रदर्शन (जैसे, Nikon विश्लेषण सॉफ्टवेयर-एनआईएस तत्व[चित्रा 3B])।

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Representative Results

परिणामस्वरूप विधि के रूप में चित्रा 1में चित्रित, माउस के पर्याप्त स्थिरीकरण(चित्रा 1A)और रीढ़ और परजीवी ऊतक(चित्रा 1B)के अच्छे दृश्य शामिल है । स्पिनस प्रक्रिया और लैमिना को न्यूनतम मांसपेशियों के विच्छेदन और रक्त हानि(चित्रा 1C,हाइलाइट किए गए क्षेत्र) के साथ स्पष्ट रूप से कल्पना की जा सकती है। ठीक टिप ड्रिलिंग के रूप में चित्रा 1Dमें दिखाया गया है, एक टुकड़े टुकड़े खिड़की बनाने के रूप में आयत द्वारा दिखाया गया है । परिणामस्वरूप लेमिनेक्टॉमी विंडो स्पष्ट है और रीढ़ की हड्डी(चित्रा 1E,हाइलाइट किए गए क्षेत्र) तक प्रत्यक्ष दृश्य और पहुंच की अनुमति देती है। इस प्रक्रिया की योजनाबद्ध अवधारणा को चित्र 1एफमें समझाया गया है । संकीर्ण ट्रांसेक्शन ब्लेड असतत लेमिनेक्टॉमी विंडो(चित्रा 1G)के माध्यम से आसानी से फिट हो सकता है और एक चिकनी स्वाइप गति में, एक पूर्ण ट्रांसेक्शन प्रकार की चोट(चित्रा 1एच-I)बनाया जा सकता है। इस प्रकार, इस विधि से न्यूनतम मांसपेशियों के विच्छेदन, न्यूनतम संपाश्र्वक हड्डी क्षति होती है, और परिणामस्वरूप न्यूनतम रक्त हानि के साथ एक स्थिर पूर्ण ट्रांसेक्शन प्रकार की चोट होती है। जानवरों में गंभीर एससीआई के शामिल होने के बावजूद, शल्य चिकित्सा प्रक्रिया और पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल के परिणामस्वरूप जानवरों की उच्च जीवित रहने की दर हुई। इस पांडुलिपि के लिए रिपोर्ट किए गए सभी जानवर रीढ़ की हड्डी की सर्जरी से बच गए; और हमारी प्रयोगशाला द्वारा बाद की सर्जरी के परिणामस्वरूप 99% की जीवित रहने की दर हुई है।

यह आकलन करने के लिए कि क्या चूहों में ट्रांसेक्शन-प्रकार एससीआई को प्रेरित करने के लिए यह विधि प्रजनन योग्य और सुसंगत थी, हमने हिस्टोलॉजी/इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और व्यवहार परीक्षण (एन = 8 जानवरों)(चित्रा 2)का उपयोग करके घायल रीढ़ की हड्डी का विश्लेषण किया। एस्ट्रोसाइट मार्कर ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (GFAP) के खिलाफ इम्यूनोबेलिंग ने बरकरार रीढ़ की हड्डी की सीमा का सीमांकन किया, चोट साइट कॉर्ड स्टंप के बीच का क्षेत्र होने के साथ जब देशांतर वर्गों(चित्रा 3 ए)के साथ देखा जाता है । ट्रांसेक्शन साइट पर एक सुसंगत आकार का दोष प्रेरित किया गया था, जिसमें 550.4 ± 17.3 माइक्रोन(चित्रा 3 B) कीऔसत न्यूनतम दूरी थी। एक खुले मैदान परीक्षण के बासो माउस स्केल (बीएमएस)9 की तैनाती व्यवहार डेटा से पता चला है कि घायल चूहों चोट के बाद कोई हिंद अंग आंदोलन प्रदर्शन(चित्रा 3C)। यह चोट के बाद 28 दिनों तक बीएमएस पर 0 के स्कोर से प्रतिनिधित्व करता है। इस प्रकार, प्रोटोकॉल पूर्ण और विश्वसनीय ट्रांसेक्शन-प्रकार की चोट पैदा करता है जिसके परिणामस्वरूप चोट के स्तर से नीचे कार्य की पूरी हानि होती है और पक्षाघात(चित्र 3डी, ई)के सहज उलट-फेर का कारण नहीं बनता है।

Figure 1
चित्रा 1: ट्रांसेक्शन इंजरी प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम। (A)सर्जरी से पहले एनिमल सेट अप और स्टेबिलाइजेशन । सर्जरी से योजनाबद्ध और तस्वीर दोनों को दिखाया गया है । (ख)योजनाबद्ध और तस्वीर गहरी मांसपेशियों की परतों को बेनकाब करने के लिए चीरा, रिट्रैक्टर प्लेसमेंट और कुंद विच्छेदन दिखा । (ग)रीढ़ की हड्डी का संदंश के साथ स्थिरीकरण और टी 10 कशेरुका के लैमिना को उजागर करना । तस्वीर में आयत T10 कशेरुका की लैमिना और स्पाइनल प्रक्रिया पर प्रकाश डाला गया है। (घ)लेमिनेक्टॉमी करने के लिए फाइन टिप ड्रिल । इस तस्वीर में आयत लेमिनेक्टॉमी खिड़की का निशान है। (ई)आयत द्वारा हाइलाइट की गई पूर्ण लेमिनेक्टॉमी विंडो, जिसके भीतर रीढ़ की हड्डी स्पष्ट रूप से दिखाई देती है। (एफ)योजनाबद्ध चित्रों की श्रृंखला जो ड्रिलिंग अवधारणा को एक क्रॉस-सेक्शनल ओरिएंटेशन में पूरी तरह से लेमिनेक्टॉमी करने के लिए दिखाती है। (जी)इस तस्वीर में पूरी तरह से ट्रांसेक्शन टाइप इंजरी को अंजाम देने के लिए फाइन ब्लेड ट्रांसेक्शन नाइफ के इस्तेमाल को दर्शाया गया है और(एच)में आयत के अंदर पूरी चोट दिखाई देती है, रीढ़ की हड्डी के पार गहरे लाल ट्रांसवर्स लाइन के रूप में । (I)योजनाबद्ध लेमिनेक्टॉमी और चोट साइट के समग्र दृश्य दिखा रहा है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: T10 के लिए कशेरुकी ऐतिहासिक पहचान समझा एक योजनाबद्ध । टी 10 कशेरुका की स्पिनस प्रक्रिया सबसे प्रमुख स्थलों में से एक है जिसे छाती की रीढ़ की प्राकृतिक वक्रता पर टटोलना जा सकता है। इस बिंदु पर स्पिनस प्रक्रियाएं आकृति विज्ञान को बदलती हैं ताकि स्पिनस प्रक्रियाओं की युक्तियां टी-10 पॉइंट से कपाल, और टी 10 बिंदु से कपाल की स्पिनस प्रक्रियाओं की युक्तियां कपाल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: C57BL/6 चूहों में प्रेरित ट्रांसेक्शन प्रकार की चोट से प्रतिनिधि परिणाम । (क)रीढ़ की हड्डी का एक देशांतर खंड पूर्ण ट्रांसेक्शन-प्रकार की चोट का पता चलता है । ऊतक एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर छवि थी। एंटी-जीएफएपी इम्यूनोलेबलिंग लेबल एस्ट्रोसाइट्स (लाल) जबकि नाभिक को होचस्ट 33342 (नीला) के साथ लेबल किया गया है। सबसे कम बिंदु के रैखिक माप का उपयोग कर चोट का अंतर 550 माइक्रोन था। स्केल बार = 200 माइक्रोन है= चोट साइट, आईवीडी = इंटरवर्टेब्रल डिस्क, अनुसूचित जाति = रीढ़ की हड्डी, वीबी = कशेरुकी शरीर। (ख)चोट का आकार 8 जानवरों में मापा गया था । औसत चोट का आकार 550.4 ± 17.3 माइक्रोन था जिसमें अधिकतम 577.8 माइक्रोन और न्यूनतम 525.4 माइक्रोन था।(ग)मोटर व्यवहार Basso माउस स्केल (BMS), जो चोट से पहले सभी चूहों में 9 था और चोट के बाद 4 सप्ताह के लिए 0 पर बने रहे, चोट साइट के नीचे मोटर समारोह की पूरी हानि का संकेत (एन = 8 चूहों) पर रन बनाए । (घ)चोट से पहले एक स्वस्थ माउस की चाल। (ई)चोट के बाद एक ही माउस की चाल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह विधि चूहों में टी 10 कशेरुकी स्तर पर एक पूर्ण ट्रांसेक्शन प्रकार की चोट को प्रेरित करती है, जिसके परिणामस्वरूप चोट के स्तर से नीचे जानवर की पूरी पैराप्लेजिया होती है। कुल मिलाकर, इस विधि के परिणामस्वरूप न्यूनतम रक्तस्राव, नगण्य संपाश्र्वक क्षति और एक स्थिर, प्रजनन योग्य चोट होती है। लेमिनेक्टॉमी10के बिना ट्रांसेक्शन के पहले प्रकाशित तरीकों की तुलना में, यह विधि रीढ़ की वक्रता में हेरफेर किए बिना प्रत्यक्ष दृश्य के संदर्भ में लाभ प्रदान करती है, चोट की पूर्णता पर बेहतर नियंत्रण, और रक्तस्राव को नियंत्रित करने और hemostasis प्राप्त करने की क्षमता को बढ़ाया। इस विधि का लाभ यह है कि प्रोटोकॉल को टी 10 के अलावा किसी अन्य कशेरुकी स्तरों पर उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है, साथ ही अन्य चोट प्रकार जैसे हेमी-सेक्शन, आंशिक पृष्ठीय ट्रांसेक्शन, पृष्ठीय रूट एवलसियन, क्रश और कॉन्टशन करने के लिए किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख घटक यह है कि यह एक ठीक टिप ड्रिल के उपयोग को रोजगार देता है। जबकि ड्रिल के उपयोग के लिए एक उच्च कौशल स्तर और अधिक व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता हो सकती है, यह एक स्वच्छ और पूर्ण लेमिनेक्टॉमी प्राप्त करता है। एक अन्य महत्वपूर्ण कारक माइक्रो-कैंची के बजाय ट्रांसेक्शन के लिए एक संकीर्ण ब्लेड वाले चाकू का उपयोग है। कैंची का उपयोग करने की तुलना में इसके परिणामस्वरूप कम अवांछित जमानत क्षति होता है। इसके विपरीत, हालांकि, यदि बहुत अधिक पार्श्व दबाव डाला जाता है, तो ब्लेड कशेरुका शरीर को कुछ चोट पहुंचा सकता है। वर्णित प्रोटोकॉल सर्जन को कुछ समस्या निवारण करने की आवश्यकता हो सकती है। यदि लेमिनेक्टॉमी ठीक से नहीं किया जाता है, तो हड्डी के स्पर्स शेष हो सकते हैं, जो लेमिनेक्टॉमी विंडो तक पहुंच को प्रतिबंधित कर सकते हैं। ठीक टिप संदंश के शूल में से एक डालने सर्जन समझ और किसी भी शेष हड्डी spurs तोड़ने के लिए सक्षम कर सकते हैं । हालांकि, इस प्रक्रिया में उजागर रीढ़ की हड्डी को घायल नहीं करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। यदि लेमिनेक्टॉमी के परिणामस्वरूप दांतेदार हड्डी बढ़त होती है, तो लेमिनेक्टॉमी मार्जिन को सीधा करने के लिए ड्रिलिंग फिर से की जा सकती है। यह अव्यावहारिक हो सकता है यदि लेमिनेक्टॉमी विंडो पहले से ही काफी चौड़ी है, जिस स्थिति में, लेमिनेक्टॉमी साइट के साथ छेड़छाड़ किए बिना ट्रांसेक्शन किया जाना चाहिए।

यह दृढ़ता से सिफारिश की जाती है कि उपयोगकर्ता लाइव सर्वाइवल सर्जरी में प्रयास करने से पहले एक कैडेवरिक विच्छेदन में प्रासंगिक रीढ़ की हड्डी के स्तर पर कम से कम 8-10 बार लेमिनेक्टॉमी प्रक्रियाओं का अभ्यास करते हैं। हालांकि, ड्रिल होल्डिंग और पैंतरेबाज़ी तकनीक सरल हैं, उन्हें उपयोगकर्ताओं को उपकरणों से परिचित होने की आवश्यकता हो सकती है। यहां, हम ड्रिलिंग प्रक्रिया के दौरान रीढ़ और हाथ स्थिरीकरण के साथ मदद करने के लिए कुछ उपयोगी सलाह भी प्रदान करते हैं। यदि उपयोगकर्ता सही हाथ है, तो बाएं हाथ से घुमावदार संदंश का उपयोग करके रीढ़ को स्थिर किया जाना चाहिए ताकि संदंश कपाल पहलू से रीढ़ की हड्डी तक पहुंच सके। यह रीढ़ की हड्डी के कौडल पहलू को सही (या प्रमुख) हाथ में आयोजित ड्रिल के साथ दृष्टिकोण करने के लिए स्पष्ट रखता है। ड्रिल अंगूठे, सूचकांक और मध्यम उंगलियों के बीच एक पिनर पकड़ के साथ आयोजित किया जाना चाहिए। हाथ को कलाई के मध्यीय किनारे और विस्तारित पांचवीं उंगली के साथ अच्छी तरह से समर्थित होना चाहिए। हाथ को पूरी तरह से एडेडेड रखते हुए ताकि कोहनी शरीर को छू सके अभ्यास के दौरान ड्रिल पकड़ पर बेहतर नियंत्रण प्राप्त करने में मदद कर सकता है। ड्रिलिंग कार्रवाई केवल ड्रिल पकड़े उंगलियों पर गति शामिल होना चाहिए और कलाई पर नहीं, लेखन के लिए एक कलम का उपयोग करने के विपरीत नहीं ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को आरआर को ग्रिफ़िथ यूनिवर्सिटी इंटरनेशनल स्टूडेंट (पीएचडी) वजीफा, जेई और जेएसजे को पेरी क्रॉस फाउंडेशन ग्रांट, जेएसजे और जेई को क्लेम जोन्स फाउंडेशन ग्रांट और जेएसजे और जेई को क्वींसलैंड ग्रांट का मोटर एक्सीडेंट इंश्योरेंस कमीशन मिला ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL Provet BAYT I Post-operative care drug
Betadine 500 mL Provet BETA AS Consumable
Castroviejo needle holder, locking ProSciTech T149C Reusable
Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled ProSciTech TXD101A-X Reusable
Cotton swabs (5pcs) Multigate 21-893 Consumable
Dremel Micro DREMEL 8050-N/18 Cordless rotary tool
Dressing forceps fine Multigate 06-306 Single use disposable
Drill bits Kemmer Präzision SM 32 M 0550 070 Reusable
Dumont #7b forceps Fine Science Tools 11270-20 Reusable
Dumont tweezers, style 5 ProSciTech T05-822 Reusable
Fur trimmer WAHL WA9884-312 Zero Overlap Hair Trimmer
Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm ProSciTech TY-3032 Reusable
Isoflurane isothesia NXT 250 Provet ISOF 00 HS Anaesthetic agent
Colibri Retractor - 4cm Fine Science Tools 17000-04 Reusable
Scalpel handle ProSciTech T133 Reusable
Signature latex surgical gloves size 7.5 Medline MSG5475 Consumable
Sodium Chloride 0.9% STS PHA19042005 Consumable
Sterile Dressing Pack Multigate 08-709 Single use disposable
Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm Multigate 29-220 Single use disposable
Surgical spirit 100 mL Provet # SURG SP Consumable
Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2 Johnson & Johnson Medical 682G Silk Suture
Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2 Johnson & Johnson Medical VCP421H Vicryl Suture
Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug) Provet TEMG I Post-operative care drug

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References

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JoVE में इस महीने अंक १५९ ट्रांसवर्स चोट प्रोटोकॉल लेमिनेक्टॉमी सर्जरी C57BL/6 चूहों न्यूरोट्रॉमा
चूहों में पूर्ण ट्रांसेक्शन-टाइप स्पाइनल कॉर्ड इंजरी का प्रेरण
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Reshamwala, R., Eindorf, T., Shah,… More

Reshamwala, R., Eindorf, T., Shah, M., Smyth, G., Shelper, T., St. John, J., Ekberg, J. Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice. J. Vis. Exp. (159), e61131, doi:10.3791/61131 (2020).

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