Summary
Este protocolo describe cómo crear una laminectomía precisa para la inducción de lesiones medulares estables de tipo transección en el modelo de ratón, con un daño colateral mínimo para la investigación de lesiones de la médula espinal.
Abstract
La lesión de la médula espinal (SCI) conduce en gran medida a la pérdida irreversible y permanente de la función, más comúnmente como resultado de un trauma. Se están investigando varias opciones de tratamiento, como los métodos de trasplante celular, para superar las discapacidades debilitantes derivadas del SCI. La mayoría de los ensayos preclínicos en animales se llevan a cabo en modelos de roedores de SCI. Mientras que los modelos de ratas de SCI han sido ampliamente utilizados, los modelos de ratón han recibido menos atención, a pesar de que los modelos de ratón pueden tener ventajas significativas sobre los modelos de ratas. El pequeño tamaño de los ratones equivale a reducir los costos de mantenimiento animal que para las ratas, y la disponibilidad de numerosos modelos de ratón transgénicos es ventajosa para muchos tipos de estudios. Inducir lesiones repetibles y precisas en los animales es el principal desafío para la investigación de SCI, que en pequeños roedores requiere cirugía de alta precisión. El modelo de lesión de tipo transección ha sido un modelo de lesión de uso común durante la última década para la investigación terapéutica basada en trasplantes, sin embargo, no existe un método estandarizado para inducir una lesión completa de tipo de transección en ratones. Hemos desarrollado un protocolo quirúrgico para inducir una lesión de tipo de transección completa en ratones C57BL/6 a nivel vertebral torácico 10 (T10). El procedimiento utiliza un pequeño taladro de punta en lugar de rongeurs para eliminar con precisión la lámina, después de lo cual se utiliza una hoja delgada con filo de corte redondeado para inducir la transección de la médula espinal. Este método conduce a lesiones reproducibles de tipo transección en pequeños roedores con un daño muscular y óseo colateral mínimo y, por lo tanto, minimiza los factores de confusión, específicamente cuando se analizan los resultados funcionales conductuales.
Introduction
La lesión de la médula espinal (SCI) es un problema médico complejo que resulta en cambios drásticos en la salud y el estilo de vida. No existe una cura para la SCI, y la fisiopatología de sci no se entiende a fondo. Los modelos animal SCI, en particular los modelos de roedores, ofrecen una herramienta invaluable para probar nuevos tratamientos, y se han utilizado para explorar SCI durante décadas. Hasta la fecha, más del 72% de los estudios preclínicos de SCI han empleado modelos de ratas, en comparación con sólo un 16% que han utilizado ratones1. Aunque las ratas, debido a su mayor tamaño y tendencia a formar caries similares a los ICA humanos, han sido tradicionalmente los animales modelo preferidos para el estudio de nuevos enfoques terapéuticos, los ratones (incluyendo muchos modelos de ratón transgénicos) ahora se utilizan con más frecuencia para estudiar los mecanismos celulares y moleculares del SCI2. El modelo de ratón ofrece beneficios adicionales en términos de manejo más fácil, tasas de reproducción más rápidas y costos más bajos que las ratas; los ratones también presentan un alto grado de similitud genómica con los seres humanos1,2,3. La principal desventaja del modelo de ratón se ha identificado como el tamaño significativamente más pequeño que crea desafíos para las intervenciones quirúrgicas para la creación y el tratamiento de lesiones de la médula espinal4,5.
Hay una brecha en la literatura existente que pone de relieve la necesidad de un protocolo quirúrgico robusto y reproducible para inducir SCI estable en el modelo de ratón. Por lo tanto, proporcionamos un enfoque quirúrgico novedoso y preciso en este protocolo para superar estas limitaciones. Este protocolo proporciona directrices en profundidad para inducir una lesión de tipo transección en ratones, ya que este tipo de lesión ha sido reconocido como el más adecuado para estudiar los cambios regenerativos y degenerativos después de una lesión6,así como la neuroplasticidad, los circuitos neuronales y los enfoques de ingeniería tisular7. Hemos optado por inducir la lesión en la región torácica inferior, ya que el SCI de nivel torácico se utiliza más comúnmente en la literatura1.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de ética animal de la Universidad Griffith (ESK/04/16 AEC y MSC/04/18 AEC) bajo las directrices del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia.
1. Procedimiento de instalación animal para la cirugía
- Anestesar y estabilizar al animal.
- Utilice ratones C57BL/6 hembras de 8 a 10 semanas de edad. Utilice 5% de isoflurano en 1 L/min de oxígeno para la inducción de la anestesia. Para el mantenimiento de la anestesia, utilice 1.5–2% de isoflurano en 1 L/min de oxígeno. Confirme la anestesia apropiada estableciendo una falta de reflejo de dolor en la cola y las patas traseras.
- Administrar buprenorfina (0,03 mg/kg de peso corporal) para analgesia y enrofloxacino (10 mg/kg de peso corporal) para la cobertura de antibióticos, por vía subcutánea según el peso corporal. Meloxicam (2 mg/kg de peso corporal) se puede administrar para la analgesia a largo plazo si es necesario.
- Mantenga la temperatura corporal del animal a 37 oC con una almohadilla calefactora
- Afeitar el pelaje de la espalda para exponer el área quirúrgica sobre la columna dorsal. Retire el pelaje afeitado del área quirúrgica antes de esterilizar el lugar de la incisión. Esterilice la zona afeitada con hisopos de algodón estéril empapados en líquido antiséptico de yodo povidona y espíritu quirúrgico.
- Pegue las patas del ratón en el área quirúrgica para estabilizar al animal (Figura 1A). Coloque una cortina de ventana ovalada sobre el ratón (Figura 1B).
2. Laminectomía
- Haga una incisión vertical en la línea media a nivel vertebral T10 usando un bisturí quirúrgico.
- Localice el proceso espinoso de la vértebra T10 para determinar el sitio de laminectomía. El cuerpo de la vértebra se encuentra ligeramente craneal en la punta del proceso espinoso8 (ver Figura 2). La punta descansa aproximadamente en el punto medio de la vértebra T118.
- Haga la incisión de 2,5 cm de largo, de modo que la columna vertebral de la vértebra T10 esté aproximadamente en la mitad de la longitud de la incisión.
- Reflejar la piel y retraer con retractores.
- Utilice los fórceps rectos para levantar la piel de la fascia subyacente. Esto creará espacio para que se coloquen los retractores; mantendrán abierto el campo quirúrgico.
- Realizar la disección contundente del tejido subcutáneo y la fascia para exponer los procesos espinosos.
- Utilice el borde romo del bisturí para hacer una pequeña incisión de línea media en el tejido subcutáneo y la fascia subyacente para exponer las espinas de las vértebras T9–T11. Utilice los fórceps de punta fina (no afilados) para realizar una disección contundente y reflejar la fascia.
- Divide y separa los músculos para-espinosos para exponer las láminas.
- Usa la punta contundente del bisturí para dividir los músculos del tronco dorsal y los músculos para-espinosos a lo largo de las espinas de las vértebras T9-T11. Utilice los fórceps finos contundentes para realizar la disección contundente de los músculos en capas y exponer las láminas de las vértebras. Esto debería minimizar cualquier sangrado.
NOTA: Si hay algún sangrado, utilice riego de solución salina caliente (37 oC) y hisopos de algodón para controlarlo y eliminar la sangre del campo quirúrgico. - Utilice los mismos fórceps para hacer pequeños bolsillos alrededor de los procesos transversales de la vértebra T10. Utilice los fórceps curvos para estabilizar el cuerpo vertebral T10 enganchando sus puntas bajo los procesos transversales, en los bolsillos creados (Figura 1C).
- Enjuague bien las láminas T10 con solución salina tibia y limpie suavemente con hisopos de algodón para visualizar claramente la superficie ósea. Asegúrese de que no queden accesorios musculares y ligamentos a lo largo de la superficie bilateralmente.
- Usa la punta contundente del bisturí para dividir los músculos del tronco dorsal y los músculos para-espinosos a lo largo de las espinas de las vértebras T9-T11. Utilice los fórceps finos contundentes para realizar la disección contundente de los músculos en capas y exponer las láminas de las vértebras. Esto debería minimizar cualquier sangrado.
- Utilice un taladro con una punta fina (0,55 mm de diámetro, 7 mm de longitud) para romper las láminas bilateralmente.
- Utilice la punta de la broca para trazar un camino vertical desde el espacio intervertebral T9–T10 hasta el espacio intervertebral T10–T11 a lo largo de ambas láminas T10, sin encender el taladro. Esto es para asegurarse de que la broca no captura ningún tejido (Figura 1D).
- Ahora encendiendo el taladro, cavar lentamente y cuidadosamente una zanja vertical en la lámina derecha de la vértebra T10. Esta parte de la laminectomía debe crear un defecto quirúrgico preciso en todo el grosor del hueso en una línea vertical recta. Mantenga el agarre con los fórceps curvos para mantener la vértebra estable.
- Asegúrese de que la punta del taladro no penetre a través del hueso y lesione la médula espinal. Repita el mismo proceso en el lado izquierdo de la lámina, manteniendo la vértebra estable con los fórceps curvos. Irrigar con solución salina tibia para lavar los fragmentos óseos restantes.
- Levante y retire la parte posterior del arco neural (Figura 1F).
- Utilice los fórceps de punta fina en ángulo para agarrar el proceso espinoso y eliminar todo el segmento dorsal de las láminas separados por la perforación bilateral. Irrigar y frotar de nuevo si hay algún sangrado, para visualizar claramente la médula espinal expuesta debajo de la ventana de laminectomía(Figura 1E).
3. Transección
- Inducir la lesión de la médula espinal mediante la transección de la cuerda expuesta con una sola rebanada de la hoja.
- Utilice la hoja estrecha y redonda para cortar el cordón en el centro de la ventana de laminectomía. Asegúrese de barrer los huecos laterales de la columna vertebral para inducir una lesión de transección completa(Figura 1G).
- Confirme la integridad de la lesión por transección utilizando los fórceps de punta fina contundentes y retire las conexiones restantes en el sitio de transección.
- Controle el sangrado si existe, antes de cerrar las capas quirúrgicas.
- Utilice la solución salina caliente para regar y eliminar cualquier sangrado que se produzca de los tocones del cordón transectado. Use un hisopo de algodón para aplicar una presión suave para lograr hemostasia si es necesario. Tenga cuidado de no comprimir la médula espinal.
4. Cierre y atención postoperatoria inmediata
- Reúne los músculos y sutura en capa.
- Una vez que se logra la hemostasia en el sitio de la transección, libere el agarre de los fórceps curvos en las vértebras T10. Reúne los bordes de los músculos diseccionados a lo largo de la línea media para lograr una buena aposición.
- Suturar los músculos en una capa usando 5-0 poliglactin 910 suturas absorbibles. Asegúrese de que la curvatura natural de la columna vertebral no cause ninguna tensión en la línea de sutura o abra las suturas, exponiendo el sitio de laminectomía.
- Cierre el tejido subcutáneo y la piel.
- Utilice 5-0 suturas de seda no absorbibles para cerrar la incisión de la piel. Asegúrese de que no haya sangrado, coágulos o restos debajo de la piel antes del cierre. Un riego final con solución salina caliente puede ser necesario en este paso.
- Detengan la anestesia. Observar al animal durante 10-30 minutos hasta la recuperación. El animal debe permanecer en la almohadilla de calentamiento durante este tiempo. Proporcione gel de agua y alimentos hidratados en la jaula.
- Para la atención postoperatoria, incluya buprenorfina (dos veces al día), enrofloxacino (una vez al día) durante los dos primeros días de profilácticamente. Además, vacíe manualmente la vejiga al menos dos veces al día, adhiriéndose a las directrices del comité de ética animal.
NOTA: Los animales de este experimento fueron evaluados dos veces al día por su salud y bienestar general, que incluían la comprobación de dolor persistente (para dar dosis adicionales de buprenorfina) o infección (enrofloxacino adicional), su estado de nutrición e hidratación (dar líquido inyectable si está deshidratado) y cualquier signo de autotomía (proporcionar cuidado de la herida si autotomía menor). Se recomienda encarecidamente que estos aspectos de la atención postoperatoria, incluidas las decisiones de eutanasia, se determinen con la orientación del comité institucional de ética animal.
5. Evaluación del modelo de lesión
- Establecimiento de la pérdida de la función motora.
- Evaluar el comportamiento motor en los ratones lesionados 2, 7, 14, 21 y 28 días después de la lesión en un campo abierto utilizando la Escala de Ratón Basso (BMS) para determinar la pérdida de la función9 (Figura 3C–E).
- Confirmación histológica de lesiones
- Cosechar las médulas espinales lesionadas con las columnas vertebrales después de la eutanasia (hecho con dióxido de carbono en este experimento, según lo aprobado por el comité de ética animal).
- Fijar el tejido por inmersión durante la noche en 4% de paraformaldehído y descalcificar los huesos mediante tratamiento con 20% de ácido tetraacético de etileno diamina (EDTA) durante 3 semanas, reemplazando EDTA fresca cada 48 h.
- Preparar las espinas descalcificadas para la crio-sección y cortarlas en secciones de 30 m de espesor.
- Monte las secciones en portaobjetos de vidrio recubiertos de gelatina para inmunomantelación con anticuerpos anti-GFAP y Hoechst 33342.
- Imagen de las diapositivas en un microscopio fluorescente (Figura 3A) y realizar mediciones del tamaño de la lesión utilizando el software de análisis de imágenes (por ejemplo, el software de análisis Nikon - NIS Elements [Figura 3B]).
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Representative Results
El método resultante, tal como se muestra en la Figura 1,implica una estabilización adecuada del ratón (Figura 1A) y una buena visualización de la columna vertebral y el tejido paraspinos (Figura 1B). El proceso espinoso y las láminas se pueden visualizar claramente con una mínima disección muscular y pérdida de sangre(Figura 1C,zona resaltada). La perforación de punta fina se realiza como se muestra en la Figura 1D,para crear una ventana de laminectomía como se muestra en el rectángulo. La ventana de laminectomía resultante es clara y permite la visualización directa y el acceso a la médula espinal(Figura 1E,zona resaltada). El concepto esquemático de este proceso se explica en la Figura 1F. La hoja de transección estrecha puede caber fácilmente a través de la ventana de laminectomía discreta (Figura 1G) y en un movimiento de deslizamiento suave, se puede crear una lesión de tipo de transección completa (Figura 1H–I). Por lo tanto, este método causa una disección muscular mínima, un daño óseo colateral mínimo y resulta en una lesión estable de tipo de transección completa con una pérdida de sangre mínima. A pesar de la inducción de SCI grave en los animales, el procedimiento quirúrgico y el cuidado postoperatorio dieron lugar a altas tasas de supervivencia de los animales. Todos los animales reportados para este manuscrito sobrevivieron a la cirugía de la médula espinal; y las cirugías posteriores por nuestro laboratorio han dado lugar a una tasa de supervivencia de >99%.
Para evaluar si este método para inducir sci de tipo transección en ratones era reproducible y consistente, analizamos la médula espinal lesionada utilizando histología/inmunohistoquímica y pruebas conductuales (n.o 8 animales)(Figura 2). El inmunoetiquetado contra el marcador de astrocitos de proteína ácida fibribrilaria fibribrilativa (GFAP) demarcaba el límite de la médula espinal intacta, siendo el lugar de la lesión la región entre los tocones de la cuerda cuando se ve con secciones longitudinales (Figura 3A). Se indujo un defecto de tamaño consistente en el lugar de la transección, con una distancia mínima media de 550,4 ± 17,3 m(Figura 3B). Los datos conductuales que despliegan la Basso Mouse Scale (BMS)9 de una prueba de campo abierto mostraron que los ratones lesionados no presentan ningún movimiento de las extremidades posteriores después de la lesión (Figura 3C). Esto está representado por una puntuación de 0 en el BMS hasta 28 días después de la lesión. Por lo tanto, el protocolo produce un daño completo y fiable de tipo de transección que resulta en una pérdida completa de la función por debajo del nivel de lesión y no conduce a la reversión espontánea de la parálisis (Figura 3D,E).
Figura 1: Pasos clave en el protocolo de lesión de transección. (A) Configuración y estabilización de animales antes de la cirugía. Se muestran los esquemas y la fotografía de la cirugía. (B) Esquemática y fotografía que muestra incisión, colocación del retractor y disección contundente para exponer las capas musculares profundas. (C) Estabilización de la columna vertebral con fórceps y exposición de láminas de vértebra T10. El rectángulo de la fotografía resalta el proceso de láminas y espinosos de la vértebra T10. (D) Taladro de punta fina para realizar laminectomía. El rectángulo de esta fotografía traza la ventana de laminectomía. (E) Ventana completa de laminectomía resaltada por el rectángulo, dentro del cual la médula espinal es claramente visible. (F) Serie de dibujos esquemáticos que muestran el concepto de perforación para realizar una laminectomía completa, en una orientación transversal. (G) Esta fotografía muestra el uso de un cuchillo de transección de hoja fina para realizar la lesión completa del tipo de transección, y en (H) la lesión completa es visible dentro del rectángulo, como una línea transversal de color rojo oscuro a través de la médula espinal. (I) Esquema que muestra la visión general del sitio de laminectomía y lesión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Un esquema que explica la identificación del punto de referencia vertebral para T10. El proceso espinoso de la vértebra T10 es uno de los puntos de referencia más prominentes que se pueden palpar en la curvatura natural de la columna torácica. En este punto los procesos espinosos cambian la morfología de modo que las puntas de los procesos espinosos cranealmente a partir del punto T10 caudalmente, y las puntas de los procesos espinosos caudales a partir de T10 punto cranially. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos de lesiones de tipo de transección inducidas en ratones C57BL/6. (A) Una sección longitudinal de la médula espinal revela la lesión completa del tipo de transección. El tejido fue objeto de una imagen en un microscopio invertido. Las etiquetas de inmunoetiquez anti-GFAP etiquetan los astrocitos (rojos) mientras que los núcleos están etiquetados con Hoechst 33342 (azul). La brecha de lesión utilizando una medición lineal del punto más corto fue de 550 m. Barra de escala a 200 m. IS - sitio de la lesión, IVD - disco intervertebral, SC - médula espinal, VB - cuerpo vertebral. (B) El tamaño de las lesiones se midió en 8 animales. El tamaño medio de la lesión fue de 550,4 ± 17,3 m con un máximo de 577,8 m y un mínimo de 525,4 m. (C) Comportamiento motor puntuado en Basso Mouse Scale (BMS), que fue 9 en todos los ratones antes de la lesión y permaneció en 0 durante 4 semanas después de la lesión, lo que indica una pérdida completa de la función motora por debajo del sitio de la lesión (n a 8 ratones). (D) Gait de un ratón sano antes de la lesión. (E) Gait del mismo ratón después de la lesión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este método induce una lesión completa del tipo de transección a nivel vertebral T10 en ratones, lo que resulta en una paraplejia completa del animal, por debajo del nivel de lesión. En general, este método resulta en un sangrado mínimo, daños colaterales insignificantes y una lesión estable y reproducible. En comparación con los métodos de transección publicados anteriormente sin laminectomía10,este método ofrece los beneficios en términos de visualización directa sin manipular la curvatura de la columna vertebral, un mejor control sobre la integridad de la lesión, y una mayor capacidad para controlar el sangrado y lograr la hemostasia. La ventaja de este método es que el protocolo se puede modificar para su uso en cualquier otro nivel vertebral que no sea T10, así como para realizar otros tipos de lesiones como hemi-secciones, transeccións dorsales parciales, avulsiones de raíz dorsal, aplastamiento y contusiones.
Un componente importante de este protocolo es que emplea el uso de un taladro de punta fina. Si bien el uso del taladro puede requerir un alto nivel de habilidad y un entrenamiento más extenso, logra una laminectomía limpia y completa. Otro factor crucial es el uso de un cuchillo de hoja estrecha para la transección, en lugar de micro-tijeras. Esto resulta en menos daños colaterales no deseados en comparación con el uso de tijeras. Por el contrario, sin embargo, si se ejerce demasiada presión lateral, la hoja puede causar alguna lesión en el cuerpo vertebral. El protocolo descrito puede requerir que el cirujano realice algunos problemas de solución de problemas. Si la laminectomía no se realiza correctamente, puede quedar espolón óseo, lo que puede restringir el acceso a la ventana de laminectomía. La inserción de una de las puntas de los fórceps de punta fina puede permitir al cirujano agarrar y romper cualquier espolón óseo restante. Sin embargo, se debe tener cuidado de no lesionar la médula espinal expuesta en el proceso. Si la laminectomía da como resultado un borde óseo irregular, la perforación se puede realizar de nuevo para enderezar el margen de laminectomía. Esto puede ser poco práctico si la ventana de laminectomía ya es lo suficientemente ancha, en cuyo caso, la transección se debe realizar sin manipular el sitio de laminectomía.
Se recomienda encarecidamente que los usuarios practiquen los procedimientos de laminectomía al menos 8-10 veces en el nivel espinal relevante en una disección cadavérica antes de intentar en una cirugía de supervivencia en vivo. Aunque, las técnicas de retención y maniobra de perforación son simples, pueden requerir que los usuarios se familiaricen con el equipo. Aquí, también proporcionamos algunos consejos útiles para ayudar con la estabilización de la columna vertebral y la mano durante el procedimiento de perforación. Si el usuario es diestro, la columna vertebral debe estabilizarse utilizando los fórceps curvos con la mano izquierda para que los fórceps se acerquen a la columna vertebral desde el aspecto craneal. Esto mantiene el aspecto caudal de la columna vertebral claro para acercarse con el taladro sostenido en la mano derecha (o predominante). El taladro debe mantenerse con un pinzamiento entre el pulgar, el índice y los dedos medios. La mano debe estar bien apoyada a lo largo del borde medial de la muñeca y el quinto dedo extendido. Mantener el brazo completamente agredido para que el codo toque el cuerpo puede ayudar a lograr un mejor control sobre el agarre de la broca durante la práctica. La acción de perforación sólo debe implicar movimiento en los dedos que sostienen el taladro y no en la muñeca, no muy diferente de usar una pluma para escribir.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por un estipendio de estudiante internacional (PhD) de la Universidad Griffith a RR, una beca de la Fundación Perry Cross a JE y JSJ, una beca de la Fundación Clem Jones a JSJ y JE, y una subvención de la Comisión de Seguros de Accidentes de Motor de Queensland a JSJ y JE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL | Provet | BAYT I | Post-operative care drug |
| Betadine 500 mL | Provet | BETA AS | Consumable |
| Castroviejo needle holder, locking | ProSciTech | T149C | Reusable |
| Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled | ProSciTech | TXD101A-X | Reusable |
| Cotton swabs (5pcs) | Multigate | 21-893 | Consumable |
| Dremel Micro | DREMEL | 8050-N/18 | Cordless rotary tool |
| Dressing forceps fine | Multigate | 06-306 | Single use disposable |
| Drill bits | Kemmer Präzision | SM 32 M 0550 070 | Reusable |
| Dumont #7b forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | Reusable |
| Dumont tweezers, style 5 | ProSciTech | T05-822 | Reusable |
| Fur trimmer | WAHL | WA9884-312 | Zero Overlap Hair Trimmer |
| Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm | ProSciTech | TY-3032 | Reusable |
| Isoflurane isothesia NXT 250 | Provet | ISOF 00 HS | Anaesthetic agent |
| Colibri Retractor - 4cm | Fine Science Tools | 17000-04 | Reusable |
| Scalpel handle | ProSciTech | T133 | Reusable |
| Signature latex surgical gloves size 7.5 | Medline | MSG5475 | Consumable |
| Sodium Chloride 0.9% | STS | PHA19042005 | Consumable |
| Sterile Dressing Pack | Multigate | 08-709 | Single use disposable |
| Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm | Multigate | 29-220 | Single use disposable |
| Surgical spirit 100 mL | Provet | # SURG SP | Consumable |
| Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2 | Johnson & Johnson Medical | 682G | Silk Suture |
| Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2 | Johnson & Johnson Medical | VCP421H | Vicryl Suture |
| Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug) | Provet | TEMG I | Post-operative care drug |
References
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