Summary
该协议描述了如何创建精确的拉明切除术，在小鼠模型中诱导稳定的转节型脊髓损伤，为脊髓损伤研究提供最小的附带损伤。
Abstract
脊髓损伤 （SCI） 在很大程度上导致不可逆转和永久性的功能丧失，最常见的是创伤的结果。正在研究一些治疗方案，如细胞移植方法，以克服SCI引起的使人衰弱的残疾。大多数临床前动物试验是在SCI的啮齿动物模型中进行的。虽然SCI的老鼠模型已经被广泛使用，但老鼠模型受到的关注较少，尽管老鼠模型比老鼠模型有显著的优势。老鼠体积小，比老鼠低动物维护成本，许多转基因小鼠模型的提供对许多类型的研究都有利。诱导动物的可重复和精确伤害是SCI研究的主要挑战，在小型啮齿动物中，需要高精度手术。过去十年来，转切型损伤模型一直是移植治疗研究中常用的损伤模型，但不存在诱导小鼠完全转切型损伤的标准化方法。我们开发了一种手术方案，用于诱导胸椎10级（T10）的C57BL/6小鼠出现完全转切型损伤。该程序使用小尖端钻头代替角膜来精确去除层，之后使用带圆切刃的薄刀片诱导脊髓转液。这种方法导致小啮齿动物的可重复转切型损伤，具有最小的附带肌肉和骨骼损伤，因此最大限度地减少混淆因素，特别是在行为功能结果分析的地方。
Introduction
脊髓损伤 （SCI） 是一个复杂的医疗问题，导致健康和生活方式的急剧变化。SCI没有治愈的方法，SCI的病理生理学也没有被彻底理解。动物SCI模型，特别是啮齿动物模型，为试验新疗法提供了宝贵的工具，并已被用于探索SCI几十年。迄今为止，超过72%的临床前SCI研究采用了老鼠模型，而只有16%的人使用过小鼠1。虽然大鼠由于体型较大，而且倾向于形成类似于人类SCI的蛀牙，传统上是研究新疗法的首选模型动物，但老鼠（包括许多转基因小鼠模型）现在正更频繁地用于研究SCI 2的细胞和分子机制。小鼠模型在比大鼠更容易处理、更快的生殖速率和更低的成本方面提供了额外的好处;小鼠也表现出高度的基因组相似性与人类1，2，3。小鼠模型的主要缺点是尺寸明显缩小，这给创建和治疗脊髓损伤的外科手术带来了挑战。
现有文献中存在差距，突出表明需要一种坚固且可重复的手术方案，以在小鼠模型中诱导稳定的 SCI。因此，我们提供了一种新颖和精确的手术方法，以克服这些限制。该协议提供了深入的指南，以诱导小鼠的转切型损伤，因为这种损伤类型已被确认为最合适的研究再生和退行性的变化后，伤害6，以及神经可塑性，神经电路和组织工程方法7。我们选择诱导损伤在较低的胸腔区域，因为胸腔水平SCI是最常用的文献1。
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Protocol
所有程序都是根据澳大利亚国家健康和医学研究理事会的指导方针，经格里菲斯大学动物伦理委员会（ESK/04/16 AEC 和 MSC/04/18 AEC）的批准进行的。
1. 手术的动物设置程序
- 麻醉和稳定动物。
- 使用8~10周大的雌性C57BL/6只小鼠。在 1 L/min 氧气中使用 5% 异氟兰进行麻醉诱导。为了维持麻醉，在1升/分钟氧气中使用1.5~2%异氟。通过确定尾部和后爪缺乏疼痛反射，确认适当的麻醉。
- 为镇痛和苯丙沙星（10毫克/千克体重）管理丁丙诺啡（0.03毫克/千克体重），用于抗生素覆盖，根据体重进行皮下治疗。Meloxicam（2毫克/千克体重）可给予长期镇痛（如果需要）。
- 使用加热垫将动物的体温稳定在 37°C
- 剃光背部毛皮，露出背脊椎的手术区域。在消毒切口部位之前，先从手术区域取出剃光的毛皮。用浸泡在波维酮碘防腐剂液和手术精神中的无菌棉签消毒剃光区域。
- 将鼠标的爪子固定到手术区域以稳定动物（图1A）。将椭圆形窗口窗帘放在鼠标上（图 1B）。
2. 拉明切除术
- 使用手术手术刀在T10椎骨水平上进行垂直中线切口。
- 找到T10椎骨的旋转过程，以确定拉明切除术的位点。椎骨的身体稍微颅骨位于旋转过程8 的尖端（见图 2）。尖端大约位于T11椎骨8的中点。
- 使切口长约2.5厘米，使T10椎骨的脊椎大约在切口长度的中间。
- 用缩回器反射皮肤和缩回。
- 使用直钳将皮肤从底层筋膜上提起。这将为缩回器的放置创建空间;这些将保持手术场开放。
- 对皮下组织和筋膜进行钝解剖，以暴露旋转过程。
- 使用手术刀的钝边在皮下组织和下皮筋膜中做一个小中线切口，以暴露T9+T11椎骨的脊椎。使用细尖钳（非锐化）进行钝解剖并反射筋膜。
- 分割和分离准旋转肌肉，以暴露跛脚。
- 使用手术刀的钝尖沿T9+T11椎骨的脊椎分割背部躯干肌肉和准旋转肌肉。使用钝细尖钳对层中的肌肉进行钝解剖，并暴露椎骨的跛脚。这应该尽量减少任何出血。
注：如果有任何出血，使用加热盐水（37°C）灌溉和棉签来控制它，并清除手术场的血液。 - 使用相同的钳子在 T10 椎骨的横向过程周围制作小口袋。使用弯曲钳子在创建的口袋中钩住 T10 椎骨体（图1C）。
- 用温暖的盐水彻底冲洗T10层，然后用棉签轻轻擦拭干净，以清楚地可视化骨质表面。确保表面没有肌肉/韧带附件保持双边。
- 使用手术刀的钝尖沿T9+T11椎骨的脊椎分割背部躯干肌肉和准旋转肌肉。使用钝细尖钳对层中的肌肉进行钝解剖，并暴露椎骨的跛脚。这应该尽量减少任何出血。
- 使用具有细尖端（直径 0.55 mm，7 mm 长度）的钻头，以双边作用打破层。
- 使用钻头沿 T10 层角追踪从 T9+T10 椎间空间到 T10+T11 椎间空间的垂直路径，而无需打开钻头。这是为了确保钻头不会捕获任何组织（图1D）。
- 现在打开钻头，慢慢地小心翼翼地在T10椎骨的右层上挖一条垂直沟。这部分的拉明切除术应创建一个精确的手术缺陷，整个骨骼的厚度在一条直线上。保持弯曲钳子的抓地力，以保持椎骨骼稳定。
- 确保钻头不会穿透骨骼并损伤脊髓。在层压的左侧重复相同的过程，用弯曲的钳子保持椎骨稳定。用温暖的盐水灌溉，洗去任何剩余的骨头碎片。
- 提起并移除神经拱门的后部（图1F）。
- 使用倾斜的细尖钳抓住旋转过程，并拆下由双边钻孔分隔的层的整个支脚段。如果有任何出血，再次灌溉和拭子，以清楚地可视化暴露在拉明切除术窗口下的脊髓（图1E）。
3. 转位
- 通过用刀片的一片转露线诱导脊髓损伤。
- 使用窄圆切边刀片切开拉明切除术窗口中心的线。确保扫描脊柱的横向凹槽，以诱发完全的转液损伤（图1G）。
- 使用钝细尖端钳确认转节损伤的完整，并删除转流场址上的任何剩余连接。
- 在关闭手术层之前，控制出血（如果有）。
- 使用温暖的盐水灌溉和清除从横贯的脐带桩发生的出血。如果需要，使用棉签施加温和的压力，以达到下性。注意不要压缩脊髓。
4. 关闭和立即进行术后护理
- 将肌肉聚集在一起，缝合在一层。
- 一旦在转节站点上达到异位，释放 T10 椎骨上的弯曲钳子抓地力。将解剖肌肉的边缘沿中线聚集在一起，以达到良好的位置。
- 使用 5-0 聚加糖 910 可吸收缝合缝合层中的肌肉。确保脊柱的自然曲率不会引起缝合线的任何张力或打开缝合线，暴露拉明切除术位点。
- 关闭皮下组织和皮肤。
- 使用 5-0 不可吸收的丝线缝合线关闭皮肤切口。在关闭之前，请确保皮肤下没有出血、血块或碎屑。在此步骤中，可能需要用温暖的盐水进行最后的灌溉。
- 停止麻醉。观察动物10~30分钟，直到恢复。动物应在此持续时间内保持在加热垫上。在笼子里提供水凝胶和水合食品。
- 对于术后护理，包括丁丙诺啡（每天两次），环境黄沙星（每天一次）在头两天预防。此外，每天至少两次手动排空膀胱，遵守动物伦理委员会的准则。
注：本实验中的动物每天被评估两次，评估其一般健康和福祉，其中包括检查持续疼痛（给予额外的剂量的丁丙诺啡）或感染（额外的四氟沙星），他们的营养和水化状态（如果脱水时给予可注射的液体）和任何自体切除术的迹象（如果轻微的自体切除术提供伤口护理）。强烈建议在机构动物伦理委员会的指导下确定术后护理的这些方面，包括安乐死决定。
5. 伤害模型的评估
- 确定电机功能的丧失。
- 使用巴索小鼠比例表（BMS）评估受伤小鼠在开放场受伤后2、7、14、21和28天的运动行为，以确定功能9 的丧失（图3C+E）。
- 组织学上确认的伤害
- 安乐死后用椎柱收获受伤的脊髓（经动物伦理委员会批准，在本次实验中用二氧化碳完成）。
- 通过隔夜淹没4%半甲醛，并在3周内用20%乙胺四乙酸（EDTA）进行治疗，将骨骼解毒，每48小时更换一次新鲜EDTA，从而修复组织。
- 准备脱膜脊柱进行低温切块，并切成30 μm厚的部分。
- 在明胶涂层玻璃幻灯片上安装部分，用于使用抗 GFAP 抗体和 Hoechst 33342 进行免疫染色。
- 在荧光显微镜上拍摄幻灯片（图3A），并使用图像分析软件（例如，尼康分析软件 - NIS 元素 +图 3B+）测量损伤大小。
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Representative Results
图 1中描述的方法涉及小鼠的充分稳定（图 1A）和脊柱和准视组织（图1B） 的可视化。旋转过程和层压可以清楚地可视化与最小的肌肉解剖和失血（图1C，高亮区）。精细尖端钻孔按图 1D所示执行，以创建如矩形所示的拉明切除术窗口。由此产生的拉明切除术窗口是明确的，并允许直接可视化和访问脊髓（图1E，高亮区域）。图 1F 中解释了此过程 的原理图概念。狭窄的转切刀片可以很容易地通过离散的拉明切除术窗口（图1G）安装，在平滑的滑动运动中，可以创建一个完整的转切型损伤（图1H+I）。因此，这种方法导致最小的肌肉解剖，最小的附带骨损伤，并导致一个稳定的完全转切型损伤与最小的失血。尽管在动物中诱导了严重的SCI，但外科手术和术后护理导致动物的存活率很高。所有为这份手稿报道的动物在脊髓手术中幸存下来;我们实验室随后的手术使存活率达到 +gt;99%。
为了评估这种在小鼠中诱导转切型SCI的方法是否可重复和一致，我们使用组织学/免疫组织化学和行为测试（n= 8动物）分析了受伤的脊髓（图2）。对星细胞标记胶质纤维酸蛋白（GFAP）的免疫标记划定了完整脊髓的边界，损伤点位是线桩之间的区域，当用纵向部分查看时（图3A）。在转流位点上诱导了一致大小的缺陷，平均最小距离为 550.4 ± 17.3 μm（图 3B）。在一次开放现场测试中，部署Basso小鼠量表（BMS）9的行为数据显示，受伤的小鼠在受伤后没有表现出后肢运动（图3C）。这表示在 BMS 上的分数为 0，在受伤后最多 28 天。因此，该协议产生完整和可靠的转节型损伤，导致功能完全丧失，低于损伤水平，不会导致瘫痪的自发逆转（图3D，E）。
图 1：转切损伤协议中的关键步骤。 （A） 手术前动物的建立和稳定。显示手术的示意图和照片。（B） 显示切口、缩回器放置和钝解剖以暴露深层肌肉层的示意图和照片。（C） 用钳子稳定脊柱，露出T10椎骨的毛骨。照片中的矩形突出了 T10 椎骨的跛脚和旋转过程。（D） 精细尖端钻进行拉明切除术.这张照片中的矩形跟踪拉明切除术窗口。（E） 由矩形突出显示的完整拉明切除术窗口，其中脊髓清晰可见。（F） 显示钻孔概念的示意图系列，以横截面方向进行完整的拉明切除术。（G） 这张照片描绘了使用细刀片转切刀进行完全转切型损伤，在 （ H ）中，整个损伤在矩形内可见，作为一条穿过脊髓的深红色横线。（I） 显示拉明切除术和损伤场址的整体视图的示意图。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：解释T10椎骨地标识别的示意图。 T10椎骨的自旋过程是胸椎的自然曲率中最突出的里程碑之一。此时，自旋过程改变形态，使自旋过程的尖端从T10点颅骨，从T10点颅面旋转过程的提示。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：C57BL/6小鼠诱导的转节型损伤的代表性结果。 （A） 脊髓的纵向部分显示完全转节型损伤。组织被成像在倒置的显微镜上。抗 GFAP 免疫标签标签星细胞 （红色）， 而核标有 Hoechst 33342 （蓝色）.使用最短点线性测量的伤害间隙为 550 μm。比例杆 = 200 μm. 是 = 伤害部位， IVd = 椎间盘， SC = 脊髓， Vb = 椎体身体。（B） 损伤大小以8种动物为单位进行测量.平均损伤大小为550.4±17.3μm，最大为577.8μm，最小为525.4μm。（C ）在Basso小鼠体重秤（BMS）上，运动行为评分为9，在受伤前所有小鼠中为9，受伤后4周内保持在0，表明损伤点以下的运动功能完全丧失（n = 8只小鼠）。（D） 受伤前对一只健康老鼠说三分。（E） 受伤后同一只老鼠的步态. 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这种方法在小鼠T10椎位诱发完全转切型损伤，导致动物完全截瘫，低于损伤水平。总体而言，此方法可导致最小出血、可忽略不计的附带损害和稳定的可重复伤害。与之前公布的无兰胺切除术10的转治方法相比，该方法在直接可视化方面提供了好处，无需操纵脊柱的曲率，更好地控制损伤的完成，增强了控制出血和实现止血的能力。这种方法的优点是，该协议可以修改，用于任何其他椎骨水平，但T10，以及执行其他伤害类型，如半截，部分后转节，后根外阴，粉碎和青葱。
该协议的一个主要组成部分是，它使用细尖钻头。虽然使用钻头可能需要高技能水平和更广泛的培训，它实现了一个干净和完整的拉明切除术。另一个关键因素是使用窄刃刀进行转切，而不是微剪刀。与使用剪刀相比，这会导致较少的附带损害。相反，如果施加太多的横向压力，刀片会对椎骨造成一些伤害。所述协议可能要求外科医生执行一些故障排除。如果拉明切除术没有正确进行，可能有骨刺剩余，这可能限制进入拉明切除术窗口。插入细尖钳的一爪可以使外科医生抓住并切断任何剩余的骨刺。然而，必须注意不要在这个过程中伤害暴露的脊髓。如果拉明切除术导致骨边缘锯齿状，可以再次进行钻孔以拉明切除术边缘拉直。如果拉明切除术窗口已经足够宽，那么，在不篡改拉明切除术的位点的情况下，进行转切手术可能是不切实际的。
强烈建议使用者在尝试活体存活手术之前，在相关脊柱水平进行至少 8~10 次的拉明切除术。虽然，钻机保持和操纵技术很简单，但可能需要用户熟悉设备。在这里，我们还提供了一些有用的建议，以帮助在钻井过程中脊柱和手部稳定。如果用户是右手，应使用左手弯曲钳子来稳定脊柱，使钳子从颅面接近脊柱。这样，脊柱的骨面保持清晰，才能在右侧（或主要）手中进行钻头。钻头应在拇指、食指和中指之间用钳子夹持。手应该沿着手腕的中侧边缘和伸出的第五根手指很好地支撑。保持手臂完全紧，使肘部接触身体，有助于在练习过程中更好地控制钻头抓地力。钻孔动作应只涉及手指握住钻头，而不是手腕的运动，这与使用笔书写没什么两样。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了格里菲斯大学国际学生（PhD）津贴的R，佩里交叉基金会赠款JE和JSJ，克莱姆琼斯基金会赠款JSJ和JE，昆士兰州汽车事故保险委员会赠款JSJ和JE的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril injectable 50 mg/mL, 50 mL | Provet | BAYT I | Post-operative care drug |
| Betadine 500 mL | Provet | BETA AS | Consumable |
| Castroviejo needle holder, locking | ProSciTech | T149C | Reusable |
| Ceramic zirconia blade, round with sharp sides, single edge, angled | ProSciTech | TXD101A-X | Reusable |
| Cotton swabs (5pcs) | Multigate | 21-893 | Consumable |
| Dremel Micro | DREMEL | 8050-N/18 | Cordless rotary tool |
| Dressing forceps fine | Multigate | 06-306 | Single use disposable |
| Drill bits | Kemmer Präzision | SM 32 M 0550 070 | Reusable |
| Dumont #7b forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | Reusable |
| Dumont tweezers, style 5 | ProSciTech | T05-822 | Reusable |
| Fur trimmer | WAHL | WA9884-312 | Zero Overlap Hair Trimmer |
| Iris scissors, Ti, sharp tips, straight, 90mm | ProSciTech | TY-3032 | Reusable |
| Isoflurane isothesia NXT 250 | Provet | ISOF 00 HS | Anaesthetic agent |
| Colibri Retractor - 4cm | Fine Science Tools | 17000-04 | Reusable |
| Scalpel handle | ProSciTech | T133 | Reusable |
| Signature latex surgical gloves size 7.5 | Medline | MSG5475 | Consumable |
| Sodium Chloride 0.9% | STS | PHA19042005 | Consumable |
| Sterile Dressing Pack | Multigate | 08-709 | Single use disposable |
| Sterile Fluid Impervious Drape 60x60 cm | Multigate | 29-220 | Single use disposable |
| Surgical spirit 100 mL | Provet | # SURG SP | Consumable |
| Suture Material - SILK BLK 45CM 5/0 FS-2 | Johnson & Johnson Medical | 682G | Silk Suture |
| Suture Material - Vicryl 70CM 5-0 S/A FS-2 | Johnson & Johnson Medical | VCP421H | Vicryl Suture |
| Temgesic 0.3 mg in 1 mL, x 5 ampoules (class S8 drug) | Provet | TEMG I | Post-operative care drug |
References
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