En protokol til at udføre afstamning sporing og funktionel genetisk analyse af kandidat gener på et enkelt celleniveau ved hjælp af mosaik analyse med dobbelt markører (MADM) præsenteres. MADM klonale analyse giver en kvantitativ ramme til at måle proliferativ adfærd, cellulære output, og afstamning forholdet mellem de enkelte stamceller og deres datter celler.
Begyndende fra en begrænset pulje af stamfader, pattedyr hjernebarken danner meget organiseret funktionelle neurale kredsløb. Men, de underliggende cellulære og molekylære mekanismer, der regulerer afstamning overgange af neurale stamceller (NSCs) og eventuel produktion af neuroner og glia i udviklingslandene neuroepithelium er fortsat uklart. Metoder til at spore NSC division mønstre og kortlægge afstamning af klonalt relaterede celler har avancerede dramatisk. Men mange moderne afstamning sporing teknikker lider af manglen på cellulære opløsning af afkom celle skæbne, som er afgørende for dechifrering stamfader celledeling mønstre. Præsenteret er en protokol ved hjælp af mosaik analyse med dobbelt markører (MADM) til at udføre in vivo klonal analyse. MADM manipulerer samtidig individuelle stamceller og visualiserer præcise divisionsmønstre og afstamningsprogression ved hidtil uset enkeltcelleopløsning. MADM-baserede interkromonomiske rekombinationshændelser under G2-X-fasen af mitose giver sammen med tidsmæssigt inducerende CreERT2nøjagtige oplysninger om klonernes fødselsdatoer og deres divisionsmønstre. Madm lineage sporing giver således hidtil usete kvalitative og kvantitative optiske udlæsninger af spredningsmåden for stamcellesvindere på enkeltcelleniveau. MADM giver også mulighed for undersøgelse af mekanismer og funktionelle krav til kandidatgener i NSC lineage progression. Denne metode er unik i, at sammenlignende analyse af kontrol og mutante subkloner kan udføres i samme vævsmiljø in vivo. Her er protokollen beskrevet i detaljer, og eksperimentelle paradigmer til at ansætte MADM til klonal analyse og afstamning sporing i udviklingslandene hjernebarken er påvist. Vigtigere er det, kan denne protokol tilpasses til at udføre MADM klonal analyse i enhver murine stamcelle niche, så længe CreERT2 driveren er til stede.
Hjernebarken er en meget organiseret struktur bestående af seks forskellige lag. Cortex indeholder en bred vifte af celletyper, herunder neuroner og glia, som interagerer til at danne funktionelle neurale kredsløb. De fleste, hvis ikke alle, kortikale excitatoriske projektion neuroner og glia er afledt af en fælles pulje af neurale stamceller (NSCs) kendt som radiale glia stamfædre (RGPs)1,2,3. RGPs selv er afledt af neuroepithelial stamceller (NESCs) komponere den tidlige embryonale neuroepithelium. Ved embryonal dag 9 (E9) i mus begynder NESC’er at skifte til RGPs4. RGP afstamning progression kræver præcis tidsmæssig og rumlig regulering, og når denne proces er hindret, alvorlige neurologiske lidelser såsom megalencephaly, microcephaly, lissencephaly, eller funktionsnedsættelser såsom skizofreni og autisme kan resultere5,6. På E10, de fleste RGPs gennemgå symmetriske proliferative divisioner, hvilket resulterer i en udvidelse af neurale stamfade pool4,7. RGPs i sidste ende begynder at opdele asymmetrisk, producerer kortikale projektion neuroner i en tidsmæssigt defineret måde. Gennem på hinanden følgende bølger af neurogenese, nyfødte neuroner migrere ind i kortikale plade danner kortikal laminae med tidlige født neuroner besætter dybe lag og senfødte neuroner bosat i de overfladiskelag 8,9,10. Fordi klonalt relaterede pyramideformede neuroner migrerer radialt ind i cortex med meget lidt tangential dispersion, datterceller tendens til at danne en kolonne eller kegle formet struktur benævnt en neuronal radial enhed4,11,12,13. Ved E17, embryonale neurogene ekspansion er komplet i mus14. RGPs kan også producere ependymale celler og nogle klasser af glia, herunder astrocytter og oligodendrocytes1,15,,16,17,18,19. RGI’ernes potentiale til at give anledning til både neuroner og astrocytter synes at være konsistent i alle kortikaleregioner 18, hvor ca. 1/6 af neurogene RGPs også producerer glia11.
I øjeblikket er de genetiske og epigenetiske faktorer, der regulerer tidsmæssig progression af en stamcelle langs dens afstamning, for det meste ukendte. Tidsmæssige mønstre for genekspression kan have betydelig indvirkning på lineage beslutninger i RGPs20,21,22,23,24. Hvordan dette tæt sammentømrede forhold mellem tidsmæssige og rumlige mønstre fører til den molekylære mangfoldighed af voksne neuronale typer på tværs af kortikale områder vides ikke. Ligeledes er, hvordan det individuelle stamcellepotentiale og dets cellulære output moduleres på celle- og molekylært niveau, et vigtigt ubesvaret spørgsmål. Fremtidige undersøgelser vil forhåbentlig behandle nogle af disse spørgsmål, i sidste ende at udvide vores forståelse af funktionelle kortikale kredsløb dannelse.
Udviklingsmæssige neurobiologi søger at forstå afstamning forholdet, at celler i hjernen deler med hinanden. I første omgang var der meget få forskningsværktøjer til rådighed til dette, og mange tidlige undersøgelser var baseret på visuelle observationer af division mønstre i gennemsigtige organismer såsom Caenorhabditis elegans25. I de seneste årtier er der i de seneste årtier været en dramatisk stigning i antallet og raffinementet af de tilgængeligeteknikker 13,26,27,28,29. Fremkomsten af CRISPR-Cas9-genomredigeringssystemet giver mulighed for syntetisk rekonstruktion af cellelinjerelationer ved at indføre dna-stregkoder, der udviklersig 27,30. To nylige eksempler på stregkodestrategier omfatter brugen af homing guide RNA, der dirigerer CRISPR-Cas9 til specifikke DNA-stregkode loci eller en cytidin deaminase fusioneret med nickase Cas9 at målrette endogene afbrudt gentage regioner31,32. Disse teknologier giver meget multiplekserede tilgange gennem indførelse af stregkoder, der gradvist og stabilt akkumulerer unikke mutationer over tid. Genom redigering tilgange er meget værdifulde, fordi de tillader tilbagevirkende analyse af forholdet mellem to celler baseret på den fælles arv af disse stregkoder. Men for at læse stregkoderne i de enkelte celler, væv normalt skal afbrydes, og derfor oplysninger om position, morfologi, og absolutte celletal fra en individuel stamfader er tabt.
Kombinationsmærkningsparadigme bevarer geografisk information og gør det i princippet også muligt at skelne mellem tæt lokaliserede eller endog overlappendekloner 33,34. For at en afstamningssporingsmetode kan være informativ, skal den mærke de enkelte stamfædre og deres afkom på en sparsom og uudslettelig måde. Især Brainbow35 og Confetti36,37 tilgange bruger stokastiske flerfarvede Cre rekombinering-baserede journalister, der udtrykker en kombination af fluorescerende proteiner fra en enkelt locus. Det omfattende antal samtidige farvekombinationer, der kan opnås in vivo, gør dette til et kraftfuldt værktøj, når du sporer kortikale RGP-kloner ogastrocytter 34. Der er også udviklet transpersoner , der giver stabil genomisk integration af transgenes, derkodner fluorescerende reportere40,og som gør det muligt at spore kortikale forfædre med afstamningaf38,39,kortikale forfædre.33 Transposon-baserede systemer har en ekstra fordel i, at journalisten konstruerer stabilt integrere i genomet, og dermed pålideligt mærke linjeligt relaterede datterceller. For at spore astrocyt slægter specifikt, en række metoder er blevet udviklet, der involverer elektroporation af piggyBac transposases herunder Star Track, som gør brug af en kombination af konstruktioner kodning forskellige fluorescerende proteiner40,42. En anden tilgang, MAGIC markører, introducerer Brainbow vektorer som transposable transgener. Dette er med succes blevet brugt til at spore embryonale neurale og astrocyt stamfader34,43. For nylig, mosaik analyse af dobbelt rekombineret-medieret kassette udveksling (MADR) blev fundet at stabilt mærke mutantceller udtrykker transgene elementer fra præcist definerede kromosomale loci44. Disse kraftfulde in vivo combinatorial mærkning teknikker har givet mange indsigter i afstamning dynamik af stamceller. Disse analyser udføres dog på fast væv, hvilket giver et øjebliksbillede af individuelle kloner på et defineret udviklingsstadiet. For at observere ændringer i enkelte kloners afstamningsdynamik over tid skal der anvendes kroniske in vivo-billeddannelsesmetoder svarende til dem, der udføres i den voksne dentategyrus.
Mosaikanalyse med dobbelte markører (MADM) er en kraftfuld metode til dobbelt farvemærkning , der muliggør in vivo-afstamningssporing af individuelle stamceller imus 46,47. To komponenter er nødvendige for, at MADM-mærkningshændelser kan forekomme: For det første skal MADM-kassetter målrettes mod identiske loci på homologe kromosomer. Kassetter består af to kimære fluorescerende reporter gener, eGFP (grøn, [G]) og tandem dimer Tomat (rød, tdT [T]). GT kassetten indeholder N-endestationen for eGFP og C-endestationen for tdT, adskilt af en intron, der indeholder et loxP-sted. TG kassetten er konstrueret omvendt, med N-endestation af tdT og C-endestation af eGFP. For det andet er det vigtigt at udtrykke Recombinase i den samme celle, der indeholder de målrettede MADM-kassetter. I mangel af Creudtrykker de kimære kassetter ikke funktionelle eGFP eller tdT, fordi deres kodningssekvenser afbrydes. LoxP-stederne tjener som mål for Cre-medieret interkromosom rekombination, hvilket resulterer i rekonstituering af begge udtrykskassetter samtidigt. Hvis der opstår rekombination i G2-fasen af cellecyklussen efterfulgt af X segregation (G2-X), vil de to datterceller hver udtrykke et af de to fluorescerende proteiner. Tidsmæssig regulering af CreERT2-aktiviteten ved hjælp af tamoxifen (TM) giver præcise oplysninger om fødselsdatoen for MADM-kloner og opdelingsmønstrene for deres afkom (figur 1A)29,46,47.
MADM kan potentielt systematisk mærke individuelle kloner med høj enkeltcelleopløsning i musehjernen svarende til traditionelle, men uspecifikke og besværlige metoder som Golgi farvning48 ellerfarvestoffyldning 49. Da det kun er promotoren, der driver CreERT2 , der bestemmer celletypes specificiteten af klonal MADM-mærkning , kan MADM i princippet anvendes til sporing af klonlinjen i alle murineorganer ogvæv 47,50,51,52. Undersøgelser har faktisk allerede anvendt MADM til at afsløre slægtsrelationer hos kloner, der stammer fraforskellige væv 47,50,51,52,53,54,5555,56,57,58,59. MADM eksperimentelle paradigmer er blevet anvendt til at studere afstamning i kortikale projektionsneurner, glia og postnatale stamceller i de udviklende neocortex7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM er også blevet anvendt til at studere celleslægte i den voksne dentate gyrus, thalamus, cerebellar granulatceller og interneurner på klonniveau (se tabel 1 for en komplet liste)47,53,54,56,57,66.
Et unikt træk ved MADM er evnen til at genetisk link mutationer distale til en MADM kassette, og dermed skabe en genetisk mosaik (Figur 1B og Figur 2). Dette resulterer i vilde type datter celler mærket med en fluorescerende markør (tdT i figur 1B) og homozygot mutant søskende med den anden (eGFP i figur 1B) i en ikke-mærket heterozygot miljø. MADM er unik i den sammenlignende analyse af kontrol og mutante subkloner kan udføres i samme vævsmiljø in vivo. Oprindeligt, MADM kassetter blev målrettet ind i Rosa26 locus47, men MADM analyse af genfunktion var begrænset til gener distalt for locus. For at overvinde (i hvert fald delvis) denne begrænsning og udvide mulighederne for MADM-baserede genanalyser blev MADM-kassetter slået ind tæt på centromere af Chr. 751, Chr. 1146og Chr. 1251. Målretning alle 19 mus autosomes med MADM kassetter er i gang, og vil give mulighed for stort set ethvert gen, der skal undersøges i fremtiden, hvilket giver en enestående platform for studiet af udviklingsmæssige afstamning relationer i kombination med funktionel genetisk analyse.
En metode til at bruge MADM til at spore celle afstamning af de enkelte RGI’er in vivo i udviklingslandene neocortex er beskrevet. Når madm-hændelser kombineres med TM-inducerelige CreERT2,kan de være præcist timede, hvilket giver en meget kvalitativ og kvantitativ visuel udlæsning af stamcelledelingsmønstre på enkeltcelleniveau. Ved at titrere den leverede dosis TM kan der i en ideel situation opnås et gennemsnit på mindre end én klon pr. kortikale halvkugle, hvilket giver tilstrækkelig rumlig adskillelse til entydigt at skelne mellem individuelle kloner. Ved at opretholde vævsintegritet, denne metode også indfanger væsentlige oplysninger om position, morfologi, og absolutte cellenumre. MADM kassetter på Chr. 117,11,12,46,56,57, på Chr. 751, og den oprindelige MADM på Rosa2647,53,59 er blevet anvendt i MADM klonale analyseundersøgelser.56 De enkelte cellers høje opløsning giver et hidtil uset indblik i både morfologi og dattercellernes klonale forhold og muliggør levende billeddannelse af prolifererende stamceller og nye kloner46,52.
Kejsersnit og fremme af hvalpe til analyse af kloner på postnatale tidspunkter er et nødvendigt og kritisk skridt i protokollen. Afhængigt af sundhedstilstanden af DEN TM-behandlede drægtige dæmning, kan det ikke være nødvendigt at udføre en kejsersnit. Men, hæve hvalpene med en plejemor er stadig påkrævet, fordi TM-behandlede mor kan have problemer med at ammende. Der er ikke konstateret forskelle i behovet for at fremme med forskellige CreERT2-chauffører. Både MADM linjer og plejemødre opretholdes på en outbred CD-1 baggrund. Hvis kejsersnit ikke er nødvendigt, kan den TM-behandlede drægtige moderdyr, der anvendes til at generere forsøgshvaler, genbruges til yderligere forsøgsavler i overensstemmelse med principperne i 3R (bemærk, at dette kun kan ske, hvis dyreforsøgslicenser godkender denne praksis). Foster mødre kan bruges til at fremme hvalpe inden for 2 dage efter fødslen, men højere succesrater er blevet observeret, når plejemødre føder på samme dag som de eksperimentelle mus, der skal fremmes. Derfor er det vigtigt at oprette tidsfornemmte parringer for plejemødre parallelt med forsøgs parret i trin 1.1. Fastholdelse af en lignende kuld nummer som den oprindelige plejemors kuld kan forbedre overlevelsesraten for plejet unger, og derfor fjernelse af nogle til alle de oprindelige kuld kan være nødvendigt. Yderligere trin, der kan forbedre fremme omfatter gnide eksperimentatorens handsker med strøelse og mad (for at fjerne duften af handsker); gnide hvalpene forsigtigt efter kejsersnit med fragmenter af plejemoderens snavsede kuld og rede; og placering af ungerne i tæt kontakt med pleje moderens unger forud for deres placering i plejemus buret.
Som i andre reporter-baserede afstamning sporing metoder, skal nøje overvejes, når du vælger den optimale CreERT2 driver til MADM klonale eksperimenter. For det første skal den anvendte promotor udtrykke rekombinen både tidsmæssigt og rumligt i den interesse forkomspopulation. Det kan være en udfordring at finde denne initiativtager, fordi nogle initiativtagere kan ændre udtryksmønstre eller blive bragt til tavshed på forskellige udviklingsstades. For at forbedre celletypespecikiteten er der blevet anvendt flere stedspecifikke rekombiner, der hver især drives af separate initiativtagere. Når den ene eller begge rekombiner udtrykkes i samme celle , mærker denne cellen og dens afkom med en fluorescerende reporter74,75,76,77. Sammenfattende er det vigtigt at vælge en CreERT2 driver, der er specifik for befolkningen af stamfødder bliver analyseret.
Det mest kritiske trin i denne metode er identifikationen af en klon, fordi alle celler skal udledes utvetydigt af en enkelt rekombinationshændelse (trin 8.1). Titrering af TM-koncentration sikrer mindre end én klynge af røde/grønne celler pr7,. Kloner bør kasseres, hvis tilstødende klynger af celler forekommer inden for 500 μm fra klonen af interesse. Derfor er det vigtigt at undersøge flere afsnit før og efter fremkomsten af en klon for at sikre, at der ikke er yderligere rekombinationshændelser i nærheden. På grund af svagere signal fra fluorophorerne er det nødvendigt at udføre immunhistokemi for eGFP og tdT i embryonale kloner (se afsnit 6). Dette anbefales kun til voksne kloner, hvis yderligere antigener vil blive kolmærket. Når billedkreptiske kloner, er det vigtigt at fange hele bredden af cortex, hvor klonen er placeret (dvs. fra pial overflade til corpus callosum; se trin 8.4) for ikke at gå glip af nogen celler. Dette letter også billedjusteringen under billedbehandling (afsnit 9). Afsnit 8 i protokollen kræver et omvendt konforosset mikroskop, men kan tilpasses afhængigt af det tilgængelige mikroskopopsætning. Epifluorescensmikroskopi kan anvendes, men konfokal mikroskopi anbefales, fordi dette fører til et fald i lysforurening udefra fokusplanet. Det er også vigtigt, at laserintensiteten og forstærkningen justeres, så grønne, røde og gule celler entydigt kan identificeres. Uanset opsætningen anbefales det at bruge et mål på mindst 20x for at sikre fuld rumlig adskillelse af tæt placerede celler. Ud over at registrere den kortikale dybde af alle celler (trin 8.6) skal kortikale områder, hvor klonerne er placeret, identificeres ved hjælp af et hjerneatlas som Allen Brain atlas eller andre stereotaxiske koordinatkort. En fil navngivning paradigme bør også vedtages for at sikre klon billeder er let identificerbare. Følgende oplysninger kunne indgå i navnet på filen: unikt billed-id, dato billede blev taget, genotype af dyr, alder induktion, alder af analyse, billednummer i forhold til resten af billederne fra samme klon.
Indførelse af en mutation distalt til en MADM kassette karakteristisk tillader generering af genetiske mosaikker71 og tillader dissektion af molekylære regulatorer af afstamning og celletype mangfoldighed på klonaleniveau 7,11,46,62. For at generere en genetisk mosaik med MADM skal MADM-kassetterne være meiotisk forbundet med det samme kromosom som det interessenske gen (se figur 2 for avlsordningen). Dette begrænser den nuværende klonale analyse med MADM til gener placeret på Chr. 751, Chr. 1146, Chr. 1251og Chr. 6 distal til Rosa26 locus47. Fremtidige undersøgelser vil bruge MADM kassetter målrettet til ethvert kromosom, tillader mosaik analyse af stort set alle gener af musen genom på klonale niveau.
Endelig er MADM ikke begrænset til analyse af stamceller i den udviklende neocortex. Undersøgelsen af mange stamcellenicher kunne drage fordel af evnen til at løse spatiotemporal arrangementer af klonalt beslægtede celler. Ved at anvende MADM på andre områder af hjernen, sygdomssygdomme (f.eks. kræft) eller i andrevæv 47,,50, 51,51,52, 53,54,55,55,56,57,58,59, undersøgelser afslørede afstamningsrelationer hos kloner, der stammer fra forskellige klasser af stam- og stamceller (se tabel 1 for den aktuelle liste over madm-kloningsundersøgelser). En anden interessant fremtidig anvendelse af MADM er at kombinere det med yderligere funktionelle eller subcellulære journalister, hvilket ville øge graden af information, der kan erhverves fra kloner.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle medlemmer af Hippenmeyer-laboratoriet for diskussion, Bioimaging Facility, Life Science Facility og Pre-Clinical Facility hos IST Austria for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af IST Austrias institutionelle fonde. R.B. modtog støtte fra Den Østrigske Videnskabsfond (FWF) Lise-Meitner-programmet (M 2416); N.A modtog støtte fra Den Østrigske Videnskabsfond (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC modtog støtte fra Den Europæiske Unions forsknings- og innovationsprogram horisont 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen nr. A.H. modtog støtte fra en ÖAW DOC (ph.d.-stipendiat ved det østrigske videnskabsakademi). Denne undersøgelse blev også støttet af Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under Den Europæiske Unions forsknings- og innovationsprogram Horisont 2020 (tilskudsaftale nr. 725780 LinPro) til S.H.
1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock) | Braun | 9204512N | |
1,4-diazabicyclooctane (DABCO) | Roth | 0718.2 | |
10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock) | Braun | 8508429N | |
15 mL conical centrifuge | Sarstedt | 65.554.502 | |
24 multi-well dishes | Roth/Greiner Bio-one | CE56.1 | |
27- gauge x 3/4 needle (Sterican) | Braun | 16010256E | |
Corn oil | Sigma | C8267-500ML | |
Coverslips (24 x 60 mm #1) | Thermo Fisher Scientific (Menzel) | 15747592 | |
Cryostat Cryostar NX70 | Thermo Fisher Scientific | 957000H | |
Dako Pen (Wax marker) | Agilent | S200230-2 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
Disposable microtome blade (MX35 Ultra) | Thermo Fisher Scientific | 705830 | |
Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
Glass anti-roll plate | Histocom | M 449980 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
LSM 800 Confocal | Zeiss | ||
Mounting medium | 25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5) | ||
Mowiol 4-88 | Roth | 0713.2 | |
Normal donkey serum | Innovative Research | IGDNSER100ML | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244-1KG | |
Peristaltic pump 323E/D 400RPM | Watson-Marlow | 036.3124.00A | |
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | |
Superfrost plus glass slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNT | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Tissue Embedding mold T-12 (22mm square) | Polysciences Inc. | 18986-1 | |
Tissue-Tek O.C.T | Sakura | 4583 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Trizma hydrochloride | Sigma | 93363 | |
Tween-20 | Sigma | P9416-100ML | |
Software and Plugins: | |||
Fiji | 1.52p | Fiji | |
MultiStackReg | 1.45 | Download link | |
TurboReg | EPFL Bioimaging | ||
Zen Blue | 2.6 | Zeiss | |
Experimental Models: Organisms/Strains: | |||
Mouse: Emx1-CreER | The Jackson Laboratory | JAX:027784 | |
Mouse: MADM-11-GT | The Jackson Laboratory | JAX:013749 | |
Mouse: MADM-11-TG | The Jackson Laboratory | JAX:013751 | |
Primary antibodies: | |||
Chicken anti-GFP 1:500 | Aves Labs | GFP-1020 | |
Goat anti-tdTomato 1:500 | Sicgen Antibodies | AB8181-200 | |
Rabbit anti-RFP 1:500 | MBL | PM005 | |
Secondary antibodies: | |||
Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500 | Jackson Immuno Research | 715-475-150 | |
Donkey Anti-Goat Cy3 1:500 | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | |
Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500 | Jackson Immuno Research | 711-165-152 |