Summary
الإهداب الأولية هي هياكل خارج الخلية المرتبطة بالهيكل المركزي. الكشف عن الإهداب الأولية عن طريق تلطيخ الفلوروس المناعة هو إجراء بسيط نسبيا أن النتائج في صور عالية الجودة للغاية. في هذا البروتوكول، كانت الخلايا الليفية التي تعبر عن أهداب أولية ثابتة، ومثبطة للمناعة، ومصوّبة في مجهر فلوري أو مجهري.
Abstract
يتم تنظيم الإهداب الأولية ديناميكيًا أثناء تطور دورة الخلية ، وتحديدًا خلال مراحل G0/G1 من دورة الخلية ، ويتم إعادة ترسبها قبل الانقسام. يمكن تصور الإهداب الأولية بطرق متطورة للغاية ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني للإرسال ، والتصوير ثلاثي الأبعاد ، أو استخدام برامج للكشف التلقائي عن الأهداب الأولية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى تلطيخ من الإهداب الأولية لإجراء هذه الطرق. يصف هذا المنشور بروتوكولًا للكشف السهل عن أهداب الأولية في المختبر عن طريق تلطيخ أسيتيلات ألفا توبولين (axoneme) وa توبولين غاما (الجسم القاعدي). هذا البروتوكول الملطّف بالفلورات الملطّف بسيط نسبيًّا وينتج صورًا عالية الجودة. يصف هذا البروتوكول كيف أن أربعة خطوط خلايا (C2C12، MEF، NHLF، والخلايا الليفية الجلدية) التي تعبر عن الأهداب الأولية كانت ثابتة ومثبطة للمناعة وصورة مع مجهر فلوري أو مجهري.
Introduction
الإهداب الأولية هي الحسية، الانفرادي، الغشاء ملزمة، الهياكل غير المبتدئ المرتبطة بالهيكل المركزي الأم للخلية. تم العثور على أهداب الأولية في معظم الخلايا الفقارية باستثناء خلايا الدم الحمراء، adipocytes1، وخلايا2. تتشكل الأهداب الأولية كمحور ممدود يتكون من ميكروتومات، المكون الرئيسي لها هو α-tubulin. ينمو الفأس من الجسم القاعدي، الذي يتم تنظيمه من γ-tubulin. ويتراوح طول الأهداب الأولية بين 2-10 ميكرومتر؛ ومع ذلك، يمكن أن تتغير أبعاده أثناء الجليسيليشن، والتجويع، ونقص الأكسجة، والإجهاد السام للخلايا، أو بعد التعرض للإشعاع المؤين3،4،5،6،7. عادة, الخلايا لديها واحد فقط cilium الابتدائي, التي تشارك في morphogenesis والخلايا إشارات مسارات هامة لانتشار الخلايا والتمايز8,,9.
يتم تنظيم أهداب الابتدائية بشكل ديناميكي خلال تطور دورة الخلية ، وتحديدا خلال مراحل G0/G1 ، وإعادة ترسب قبل دخول الانقسام في عملية مرتبطة بفك الacetylation tubulin بوساطة HDAC6 (histone deacetylase 6)10. الدقيقة لحظة سيليا resorption الأساسي يعتمد على نوع الخلية والتعبير عن الجينات المشاركة مباشرة في هذه العملية، مثل أورورا A، Plk1، TcTex-11،11,12،,13. اعتمادا على نوع الخلية، والإهداب الأولية التعبير عن أنواع مختلفة من المستقبلات، والقنوات الأيونية، ومسارات الإشارات النشطة. وتشمل هذه أهم مستقبلات الإشارات التي تؤثر على الانتشار والبقاء على قيد الحياة، EGFR، PDGFR، وFGFR. وشملت أيضا بعض المسارات الإشارات التي قد تؤثر على وظيفة واحد أو أكثر من الأجهزة، بما في ذلك القنفذ، نوتش، وWNT. وبفضل هذه المستقبلات ومسارات الإشارات، والأهداب الأولية أيضا أداء وظيفة العلاج الكيميائي. هذه الوظيفة تسمح أهداب الأولية للكشف عن يغاند محددة لرقم, الهرمونات, والمواد النشطة بيولوجيا مثل السيروتونين أو سوماتوستاتين. وتشمل الوظائف المحددة الأخرى التي تظهر من قبل أهداب الابتدائية من أطوال مختلفة رد فعل للتغيرات في درجة الحرارة, الجاذبية, وosmolality14.
يمكن تصور الإهداب الأولية من خلال طرق مختلفة ، مثل التصور الحي ، والمجهر الإلكتروني انتقال ، التصوير ثلاثي الأبعاد ، أو عن طريق برنامج للكشف التلقائي عن الإهدابالابتدائية 5،15،16،17. ومع ذلك، هذه الأساليب هي متخصصة للغاية والبحث المستمر يحتاج إلى أساليب أساسية وسريعة وسهلة لتلوين أهداب الأولية في كل مرحلة من مراحل البحث. وصفها هو وسيلة سهلة ومفيدة للكشف عن أهداب الأولية في الخلايا المستزرعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد وسائل الإعلام الثقافية والحلول والأطباق
- اُتّمَفّف الأغطية (22 × 22 مم). إعداد 6 لوحات جيدا. ذوبان مصل الأبقار الجنين (FBS) والمضادات الحيوية البنسلين / ستربتوميسين ودفء الثقافة المتوسطة لدرجة حرارة الغرفة (RT). استخدام التربسين-EDTA (0.25%) و 1x PBS (الفوسفات المخزنة المالحة مع الكالسيوم والمغنيسيوم) لتمرير الخلايا.
- إعداد 4% paraformaldehyde (PFA) في dH2O (800 ملغ من PFA في 20 مل من dH2O). يجب أن يكون PFA إعدادا حديثا لكل تجربة. يُحرّك المحلّل ويُحرّكه عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في غطاء محرك السيارة. يبرد في RT. أضف 1 M هيدروكسيد الصوديوم حتى يصبح الحل واضحًا (pH = 7.2-7.4). يُخزن عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.
ملاحظة: PFA هي سامة; دائما ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، وإعداد في غطاء محرك السيارة الكيميائية. - إعداد 500 مل من وسائل الإعلام الثقافة, DMEM (Dulbecco's تعديل النسر المتوسط) تحتوي على 10% FBS, 1% البنسلين/ستريبتوميسين, و 2% الجلوتامين.
- إعداد 13 مل من 1% محلول الجيلاتين في dH2O معقمة (130 ملغ من الجيلاتين في 13 مل من dH2O). استخدام 2 مل من 1٪ الجيلاتين لكل بئر في لوحة 6 جيدا. الحفاظ على العقيمة.
- تنظيف غطاء محرك تدفق لارينار باستخدام 70٪ الإيثانول. ضع المواد المطلوبة داخل غطاء تدفق الفارني قبل بدء التجربة.
2. ثقافة الخلية لتلوين الكيمياء المناعية
- ذوبان الخلايا (في هذه الدراسة C2C12, MEF, NHLF, والجلد الليفية) باستخدام التقنيات القياسية وطبق لهم في قارورة T75 تكمل مع ~ 10-12 مل من وسائل الإعلام المعدة. احتضان في 37 درجة مئوية / 5 ٪ CO2/ 90 ٪ الرطوبة النسبية (RH) حتى الخلايا تصل إلى 70 ٪ التقاء.
- إزالة الخلايا من الحاضنة ووضعها في غطاء محرك التدفق المفارق. إزالة وسائل الإعلام والثقافة وشطف الخلايا لفترة وجيزة 2x مع 1X PBS. أضف ~ 2 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA في قارورة T75 واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحقق بشكل دوري على المجهر المقلوب لمراقبة انفصال الخلايا.
ملاحظة: وقت الحضانة يعتمد على خط الخلية وبالتالي يجب أن يتم تحديد تجريبيا. - بلطف resuspend الخلايا في 10 مل من وسائل الإعلام الثقافة، pipetting بعناية لخلق تعليق خلية واحدة. شطف القارورة مرة أخرى إذا لزم الأمر.
- ضع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 50 مل وطاردة مركزية لمدة 5 دقائق في ~ 200 × ز. Decant فائقة ، إضافة 10 مل من وسائل الإعلام الثقافة ، وإعادة بلطف بيليه. خذ 20 ميكرولتر من تعليق الخلية واخلطها بنسبة 1:1 مع زرقة تريبان وعد في مقياس الخلايا باتباع الطريقة القياسية.
- مكان واحد coverslip داخل كل بئر من 6 لوحة جيدا باستخدام ملاقط. معطف الأغطية مع الجيلاتين عن طريق صب ~ 2 مل في الآبار. وهذا سيساعد الخلايا على إرفاق إلى الأغطية. إزالة الحل الجيلاتين والسماح للهواء الجاف لبضع دقائق. الأغطية جاهزة الآن لزراعة الخلايا. بدء زراعة على الفور.
- بذور 100،000 الخلايا الليفية في كل بئر وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة. احتضان الخلايا ل 24 ساعة في 37 درجة مئوية / 5 ٪ CO2/ 90 ٪ RH. في هذه المرحلة، يمكن التعامل مع الخلايا وفقا لاحتياجات المستخدم. وقد وصفت سابقا العلاجات للحث على ciliation4,5.
ملاحظة: يعتمد عدد البذر الأولي على وقت مضاعفة الخلايا ويجب تحديدها وفقًا لذلك.
3. تلوين المناعة من أهداب الأولية في المختبر
- قم بتدفئة الـ 4% من الـ paraformaldehyde إلى RT. قم بإعداد ماصات باستور، 1x PBS (RT)، حاوية النفايات، 15 مل أنابيب مخروطية، ميكروبيبتات (0.5-10 ميكرولتر، 20-200 ميكرولتر، و 100-1000 ميكرولتر) ونصائح. خذ الخلايا من الحاضنة ووضعها في مقاعد البدلاء.
ملاحظة: لا يلزم إجراء التلطخ في ظروف معقمة. يجب أن تكون جميع الحلول في RT. - إزالة الوسائط من كل بئر. اترك الغطاء داخل البئر. غسل بلطف جدا الخلايا 3x مع 2 مل من 1X PBS. باستخدام ماصة باستور، إضافة 2 مل من 4٪ PFA في كل بئر لإصلاح الخلايا. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة PFA وغسل 3x مع 1X PBS.
ملاحظة: استخدم دائماً وحدة تخزين كافية لتغطية الغطاء بأكمله خلال فترات الحضانة. لا تدع الخلايا تجف أبداً أبدا صب أي من الحلول مباشرة على الأغطية. - إعداد 0.5٪ تريتون X-100 في 13 مل من 1X برنامج تلفزيوني 10 دقيقة قبل الاستخدام. إضافة 2 مل في كل بئر. احتضان لمدة 15 دقيقة. غسل بلطف 4x مع 1X PBS.
ملاحظة: تريتون X-100 غير قابلة للذوبان في برنامج تلفزيوني في RT. الحرارة 0.5% تريتون X-100 حل إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي لإذابته. - ذوبان مصل الماعز 5 دقائق قبل الاستخدام. تمييع مصل الماعز في 1X PBS في نسبة 1:20 كحل حظر. أضف 150 ميكرولتر لكل غطاء واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
ملاحظة: إطالة فترة الحجب تصل إلى 60 دقيقة إذا لزم الأمر. لا تغسل الخلايا بعد حجبها بمصل الماعز. - ذوبان الأجسام المضادة الأولية (أي، المضادة للأسيتيل ألفا tubulin ومضادات غاما tubulin) 5 دقائق قبل الاستخدام. تمييع الأجسام المضادة بشكل منفصل في 1x PBS على النحو التالي: الماوس المضادة للأسيتيل ألفا tubulin في نسبة 1:800 والأرانب المضادة للغاما tubulin في نسبة 1:300. إزالة الحل حظر. لا تغسل. أضف 150 ميكرولتر من كل من تخفيفات الأجسام المضادة إلى الأغطية واحتضان لمدة 60 دقيقة في RT.
ملاحظة: إذا كان الاحتضان بين عشية وضحاها استخدام 500-1،000 ميكرولتر من الحلول المضادة الأولية، وختم لوحة 6 جيدا مع فيلم البارافين، وتخزينها في 4 درجة مئوية. بدلا من ذلك، استخدم 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة واحتضان في غرفة الرطوبة. - إزالة الأجسام المضادة الأساسية. غسل الأغطية 3x بلطف جدا مع 2 مل من 1X برنامج تلفزيوني. إعداد الأجسام المضادة الثانوية في 1X PBS عن طريق تخفيف بشكل منفصل Cy3 الأغنام المضادة للماوس واليكسا Fluor488 الماعز المضادة للأرنب في نسبة 1:300. أضف 150 ميكرولتر من كل من تخفيفات الأجسام المضادة الثانوية إلى الأغطية. احتضان لمدة 45 دقيقة في RT في الظلام.
ملاحظة: احتضان في الظلام لتجنب photobleaching. ويمكن استخدام مجموعات أخرى من الأجسام المضادة الثانوية حسب الحاجة. - إعداد DAPI (4'، 6-diamidino-2-فينيليندول) حل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تخزين aliquots الزائدة في -20 درجة مئوية. تمييع 10 ميكرولتر من aliquot الأسهم (1:5,000) في 50 مل من 1X PBS. إضافة 2 مل من هذا التخفيف إلى الأغطية. احتضان لمدة 5 دقائق في RT في الظلام.
ملاحظة: من المهم احتضان الخلايا في الظلام لتجنب التحسس الضوئي. يمكن تخزين تخفيف DAPI في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر. - إعداد 2 الإبر والشرائح، والملاقط، والوسائط المتصاعدة. تسمية الشرائح.
- إزالة حل DAPI من الآبار. غسل 3x مع 1X برنامج تلفزيوني. وضع قطرة واحدة من وسائط متزايدة على كل شريحة. استخدم الإبرة لرفع الغطاء بلطف من أسفل البئر. اقلب الغطاء باستخدام الملاقط ووضعها بلطف فوق قطرة الوسائط المتصاعدة. إزالة بعناية أي فقاعات.
- حماية الشرائح من الضوء وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- استخدم مجهر الفلورسنت أو الميكون مع التكبير العالي لتصور الأهداب الأولية.
ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إن تلطيخ الإهداب الأولية هو إجراء بسيط نسبيًا ينتج عنه صور عالية الجودة. في هذه التجارب، كانت الخلايا الليفية التي تعبر عن أهداب أولي ثابتة، ومثبطة للمناعة، ومصوّبة في مجهر فلوري أو مجهري متوازٍ باتباع البروتوكول الموصوف أعلاه. تم الكشف عن السيليوم الابتدائي باستخدام أسيتيل α-tubulin و γ-tubulin. ويمكن إجراء تقييم الأهداب الأولية على مختلف المستويات، ويمكن ربط أي تغيير في هذا الصدد بالتعرض للإشعاع المؤين، أو استقلاب الخلايا (مثل الجوع)، أو العلاج الكيميائي (مثل cytostatics)5،,18.
وقد تمت دراسة تأثير الإشعاع المؤين على الإهداب الأولية في مختلف خطوط الخلايا (على سبيل المثال، خط الخلية العضلية C2C12)، التي تم إشعاعها (2، 6، 10، و 20 جي) والتغيرات في حدوث الإهداب الأولية التي تم تحليلها. وفقا ل Filipova في al.4, جرعات الإشعاع منخفضة لا تعدل حدوث أهداب أولي واحد في الخلايا C2C12. ومع ذلك، فإن جرعات أعلى من الإشعاع المؤين (أي 20 Gy) تسببت في ظهور أهداب أولية متعددة(الشكل 1A, B, C). وبالمثل، عندما تم إشعاع خلايا النيفور في 2 Gy تم الكشف عن أهداب الأولية بواسطة immunofluorescence (الشكل 2).
ومن المعروف أيضا الإجهاد الأيضي لزيادة وتيرة الإهداب الابتدائية19. في هذه الحالة، كانت تجويع الخلايا الليفية MEF وتحليلها للتغيرات في الإصابة سيليه الأولية(الشكل 3).
كشفت وصمة المناعة التي تلطخ أن الخلايا الليفية تحمل أهداب أولي بعد العلاج مع دوكسيوروبين و تاكسول. تلك الخلايا الليفية التي تم علاجها مع 120 nM doxorubicin أعرب عن سيليوم واحد الابتدائي(الشكل 4); جرعات أعلى تسبب في ظهور الإهداب الابتدائية متعددة (الشكل 5). العلاج مع 1.25 nM تاكسول كما أدى إلى وجود cilium الأولية واحدة (الشكل 6). على النقيض من العلاج مع دوكسوروبيسين، لم يتم الكشف عن العديد من أهداب بعد العلاج مع جرعات أعلى من تاكسول5.
الشكل 1: حدوث الإهداب الأولية في خلايا C2C12 المشعة. صور تمثيلية من الإهداب الابتدائية في C2C12 الخلايا. تم الكشف عن الإهداب الأولية عن طريق الفلوروسين. تم تقييم الأكونيم (السهم) من أهداب الأولية مع أسيتيلات α-tubulin الأجسام المضادة (الأحمر) والجسم القاعدي بواسطة γ-tubulin الأجسام المضادة (السهم، الأخضر). كانت النوى ملطخة DAPI (الأزرق). (A) و (B) العديد من الأهداب لوحظ 72 ساعة بعد التشعيع مع 20 جي. (C) أهداب الابتدائية واحدة بعد 72 ح التشعيع مع 20 غي4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الكشف عن الإهداب الأولية في خلايا NHLF المشعة. صور تمثيلية من أهداب الابتدائية في خلايا NHLF. تم إجراء الكشف عن الإهداب (السهم) الأساسي عن طريق الفلوروسوم المناعي. كانت اجساط من أهداب الأولية ملطخة بآسيتيلات أسيتيل α-tubulin (الأحمر) والأجسام القاعدية مع الأجسام المضادة γ-tubulin (الأخضر). كانت النوى ملطخة DAPI (الأزرق). أهداب أولي واحد بعد 24 ساعة من التشعيع في 2 Gy. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: حدوث الإهداب الأولية في خلايا MEF بعد الإجهاد الأيضي الناجم عن تجويع المصل. صور تمثيلية من الإهداب الابتدائية 24 ساعة بعد تجويع المصل (0.1٪ FBS) في خلايا MEF. تم إجراء الكشف عن الإهداب (السهم) الأساسي عن طريق الفلوروسوم المناعي. تم تصنيف Axonemes مع أسيتيلات α-tubulin الأجسام المضادة (الأحمر). كانت أجسام القاعات ملوّناً بالأجسام المضادة γ-tubulin (الخضراء). كانت النوى ملطخة DAPI (الأزرق). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور تمثيلية من أهداب الابتدائية في الخلايا الليفية الجلدية. تم إجراء الكشف عن الإهداب (السهم) الأساسي عن طريق الفلوروسوم المناعي. كانت الأهداب الأولية ملطخة بآضاد α-tubulin (أحمر) ، في حين كانت الأجسام القاعدية ملطخة بالأجسام المضادة γ-tubulin (الأخضر). كانت النوى ملطخة DAPI (الأزرق). تم الكشف عن الإهداب الابتدائية 72 ساعة بعد العلاج مع 120 nM دوكسيوروبيسين5. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور تمثيلية من الأهداب متعددة في الخلايا الليفية الجلدية. تم إجراء الكشف عن الإهداب (السهم) الأساسي عن طريق الفلوروسوم المناعي. تم تسمية الأكونيميس من قبل أسيتيلات أسيتيلات α-tubulin الأجسام المضادة (الأحمر) وكانت ملطخة بالأجسام القاعدية مع الأجسام المضادة γ-tubulin (الأخضر). كانت النوى ملطخة DAPI (الأزرق). تم الكشف عن العديد من أهداب 72 ساعة بعد العلاج مع 120 nM دوكسوروبيسين5. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صور تمثيلية للأورام الليفية الجلدية المعالجة بالـ taxol. تم الكشف عن الإهداب الأولية (السهم) عن طريق الفلوروس. كانت الأهداب الأولية ملطخة بآستيتيلات α-tubulin الأجسام المضادة (الأحمر) ومع الأجسام المضادة γ-tubulin (الأخضر). كانت نواة أكسونيم ملطخة بـ DAPI (الأزرق). تم الكشف عن الأهداب الابتدائية 72 ساعة بعد العلاج مع 1.25 nM تاكسول5. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وصف العديد من المؤلفين أساليب متنوعة للكشف عن أهداب الأولية، وأحيانا أيضا وصف مختلف طرق التثبيت التي يمكن أن تؤثر على الكشف6،20،21،22. بغض النظر عن ذلك، من الصعب العثور على بروتوكول كامل ومباشر للكشف. ومما لا شك فيه أن التوافر الجاهز لمثل هذه الطريقة سيكون بمثابة مساعدة كبيرة لدراسة التحقيق الأولي في الإهداب، ولا سيما في المراحل الأولى من البحث أو لطريقة سريعة وسهلة لاختبار وجود أهداب أولي في خط خلوي مختار. ولذلك، يوصف هذا البروتوكول بأكبر قدر ممكن من التفصيل للكشف عن أهداب الأولية في المختبر بعد أنواع مختلفة من العلاج.
تم تعديل هذا البروتوكول للاستخدام على أساس يومي20،23،24. على سبيل المثال، تم استبدال 10٪ من الفورستين بنسبة 4٪ PFA، التي يوصى بإعدادها الجديد بسبب قصر عمر التخزين. PFA هو خيار جيد للحفاظ على مورفولوجيا الخلية ومناسبة بشكل خاص لتصور البروتينات المرتبطة بالغشاء. المذيبات العضوية، مثل الميثانول، لها تأثير الجفاف على الخلية وإزالة الجزيئات الصغيرة القابلة للذوبان والدهون أثناء عملية التثبيت، مما يجعلها غير صالحة للاستخدام في بعض السيناريوهات25. ويتحقق Permeabilization مع 0.5٪ تريتون X-100 في 1X برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. يتم استخدام مصل الماعز في تخفيف 1:20 في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 20 دقيقة كعامل حجب. يمكن احتضان كل من الأجسام المضادة الأولية ، الماوس المضادة للأسيتيل والأيستيلين والأرانب المضادة لل γ - tubulin ، في وقت واحد لمدة 60 دقيقة باستخدام 1:800 و 1:300 التخفيف في 1X PBS ، على التوالي20،21،23،24. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الأجسام المضادة الثانوية، المضادة للماوس IgG (جزيء كامل) F(ab′) 2 جزء-Cy3 الأجسام المضادة المنتجة في الأغنام وفلور 488 اليكسا AffiniPure F (ab')2 جزء الماعز المضادة للأرانب IgG، تم تخفيف 1:300 في 1X PBS. تم احتضانها في وقت واحد لمدة 45 دقيقة.
قد يكون من الضروري اتخاذ خطوات إضافية للتوحيد القياسي إذا تم احتضان الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها. خلال تطوير البروتوكول وجد أن الحضانة بين عشية وضحاها يحتاج إلى حجم ما لا يقل عن 500-1000 ميكرولتر من حل الأجسام المضادة الأولية، ويجب أن تكون لوحة 6 البئر مختومة مع parafilm، ويجب أن يكون التخزين عند 4 درجة مئوية لمنع التبخر.
والخطوات الأكثر أهمية لنجاح تلطيخ أهداب الأولية هي: 1) اختيار خط الخلية والممارسة المثلى لثقافة الخلية؛ 1) 2) استخدام الأغطية المطلية الجيلاتين؛ 3) الاستخدام المستمر ل 4٪ paraformaldehyde الطازجة؛ 4) حضانة الأجسام المضادة الثانوية وDAPI في الظلام؛ 5) أداء الوجه لطيف ووضع من coverlip على رأس تصاعد وسائل الإعلام في الشريحة.
ولا توجد أية قيود محتملة متوقعة في التطبيقات المستقبلية للبروتوكول. وعلاوة على ذلك، أصبحت البحوث الأولية أهداب أكثر أهمية في مجموعة متنوعة من المجالات، وسهلة وسريعة، وطرق الكشف عن الأهداب وموثوق بها ضرورية. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول سيسهل الدراسة المقبلة لالهياء الأولية في أنواع الخلايا التي تم فيها حتى الآن الإهداب الأولية لم يتم اكتشافها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفعنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل وزارة الدفاع في الجمهورية التشيكية - خطة تطوير المنظمة الطويلة الأجل الجوانب الطبية لأسلحة الدمار الشامل التابعة لكلية العلوم الصحية العسكرية، جامعة الدفاع؛ وزارة التعليم والشباب والرياضة، الجمهورية التشيكية (مشروع البحث المحدد رقم SV/FVZ201703) و PROGRES Q40/06. شكرا أيضا لدانييل دياز على مساعدته الرقيقة في مراجعة اللغة الإنجليزية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
