Summary
原发性西莉亚是与中环相关的细胞外结构。通过免疫荧光染色进行初级西莉亚检测是一个相对简单的过程，可产生极高质量的图像。在该协议中，表达原发性西莉亚的成纤维细胞被固定、免疫化，并在荧光或共合显微镜中成像。
Abstract
原生性细胞在细胞周期进展期间动态调节，特别是在细胞周期的G0/G1阶段，在分粒之前被重新吸收。通过高度复杂的方法（包括传输电子显微镜、3D 成像或使用软件自动检测原发cilia）可以可视化原发cilia。然而，需要免疫荧光染色原发性西莉亚执行这些方法。本出版物描述了通过染色乙酰化α管状图布图林（axoneme）和伽马图布林（基础体）在体外轻松检测原发性西莉亚的协议。这种免疫荧光染色方案相对简单，可产生高质量的图像。本协议描述了表达原发性西莉亚的四个细胞系（C2C12、MEF、NHLF和皮肤成纤维细胞）如何固定、免疫，以及如何用荧光或共体显微镜成像。
Introduction
原发性胆汁是感觉，孤独，膜绑定，非mo动结构与细胞的母亲中心。除红血球、脂肪细胞1和肝细胞2外，大多数脊椎动物细胞都发现了原发性细胞。原发性西莉亚形成为由微管组成的拉长轴酮，其主要成分为β-管状素。斧头从基底体生长，基底体由+-tubulin组成。主西莉亚的长度在2~10μm之间变化;,然而，在糖化、饥饿、缺氧、细胞毒性应激或暴露于电离辐射3、4、5、6、7,4之后，5,6其尺寸可能会发生变化。通常，细胞只有一个原发性，它涉及形态生成和细胞信号通路对细胞增殖和分化88，9至关重要。
原发性cilia在细胞周期进展期间，特别是在G0/G1阶段，在与HDAC6（组蛋白去乙酰酶6）调解的细胞脱乙酰化相关过程中，在进入线粒体之前重新生长。原发性西莉亚吸收的确切时刻取决于细胞类型和直接参与这个过程的基因的表达，如极光A、Plk1、TcTex-111、12、13。11,12,13根据细胞类型，原发性cilia表达不同类型的受体、离子通道和有源信号通路。其中包括影响增殖和生存的最重要的信号受体、EGFR、PDGFR 和 FGFR。还包括一些可能影响一个或多个器官功能的信号通路，包括刺猪、诺奇和Wnt。 由于这些受体和信号通路，主要细胞也执行化学感觉功能。此功能允许原发性西莉亚检测诺奇、激素和生物活性物质（如血清素或生长激素）的特定配体。不同长度的原发性西莉亚所表现出的其他特定功能包括对温度、重力和渗透性14的变化的反应。
原发cilia可以通过各种方法进行可视化，如实时可视化、传输电子显微镜、3D成像，或通过软件自动检测原发cilia5、15、16、17。5,15,16,17然而，这些方法是高度专业化和持续的研究需要基本，快速，简单的方法染色原发性西莉亚在研究的每个阶段。描述是一种简单而有用的方法，用于检测培养细胞中的原发性西莉亚。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 文化媒体、解决方案和菜肴的准备
- 自动保存盖玻片（22 x 22 mm）。准备6个井板。解冻胎儿牛血清（FBS）和抗生素青霉素/链霉素，并加热培养中到室温（RT）。使用 trypsin-EDTA （0.25%）和1x PBS（磷酸盐缓冲盐水与钙和镁）通过细胞。
- 在 dH 2 O 中准备新鲜 4% 的甲状甲醛 （PFA）（20mL 的 dH2O 中为 800 毫克的 PFA）。PFA 必须为每个实验进行新鲜准备。在 55°C 下搅拌并加热溶液，在发动机罩中加热 30 分钟。在RT冷却时，加入1M氢氧化钠，直到溶液变清（pH = 7.2±7.4）。在4°C下储存长达1周。
注意：PFA 是有毒的;始终穿戴足够的个人防护装备，并在化学罩中准备。 - 准备500 mL的培养基，DMEM（杜尔贝科的改良鹰的培养基）含有10%的FBS，1%青霉素/链霉素和2%谷氨酰胺。
- 在无菌 dH2O 中准备 13 mL 的 1% 明胶溶液（13 mL dH2O 中的 130 毫克明胶）。在6井板中，每一个井使用2 mL的1%明胶。保持无菌。
- 使用 70% 乙醇清洁层流罩。在开始实验之前，将所需材料放在层流罩内。
2. 免疫细胞化学染色的细胞培养
- 使用标准技术解冻细胞（本研究中 C2C12、MEF、NHLF 和皮肤成纤维细胞），并在 T75 烧瓶中镀上细胞，并辅以 ±10~12 mL 的已准备介质。在37 °C/5% CO2/90% 相对湿度 （RH） 下孵育，直到细胞达到 70% 汇合。
- 从培养箱中取出细胞，并将其放在层流罩中。取出培养培养剂，用1x PBS短暂冲洗细胞2x。将 ±2 mL 的 0.25% 的 trypsin-EDTA 加入 T75 烧瓶中，在 37 °C 下孵育 5 分钟。定期检查倒置显微镜以监测细胞分离。
注：孵育时间取决于细胞系，因此必须根据经验确定。 - 轻轻重新悬浮10mL培养的细胞，小心移液，形成单个细胞悬浮。如有必要，请再次冲洗烧瓶。
- 将电池悬浮液放在50 mL锥形管中，在±200 x g下离心5 分钟。去上一液，加入10mL的培养介质，轻轻重新暂停颗粒。以20 μL的细胞悬浮液，以1：1的比例与尝试蓝色混合，按照标准方法在细胞计中计数。
- 使用钳子将一个盖玻片放在 6 井板的每个井内。将 ±2 mL 倒入井中，用明胶覆盖盖玻片。这将有助于连接到盖玻片的单元格。取出明胶溶液，让空气干燥几分钟。盖玻片现在已准备好培养细胞。立即开始栽培。
- 种子100，000成纤维细胞到每一个井，并添加2mL的文化介质。在37 °C/5% CO 2 /90% RH 下孵育细胞24小时。此时，可以根据用户的需求处理单元格。诱导性细胞的治疗方法先前描述过4,4，5。
注：初始种子编号取决于细胞的翻倍时间，应相应地确定。
3. 体外原性西莉亚的免疫荧光染色
- 将 4% 的甲状甲醛加热至 RT，以制备巴斯德移液器、1x PBS （RT）、废物容器、15 mL 锥形管、微移管（0.5±10 μL、20~200 μL 和 100~1，000 μL）和尖端。从培养箱中取出细胞，放在长凳上。
注：染色过程不需要在无菌条件下进行。所有解决方案必须处于 RT。 - 从每个井中卸下介质。将盖玻片留在井内。非常轻轻地用 2 mL 的 1x PBS 洗涤细胞 3 倍。使用巴斯德移液器，将2 mL的4%PFA添加到每个井中以修复细胞。在 RT 孵育 10 分钟，取出 PFA，用 1x Pbs 洗涤 3x。
注：在孵化期间，始终使用足够的体积来覆盖整个盖玻片。永远不要让细胞干燥。切勿将任何溶液直接倒入盖玻片上。 - 使用前 10 分钟，在 13 mL 的 1x PBS 中准备 0.5% Triton X-100。在每个井中加入2 mL。孵育15分钟。用 1x PBS 轻轻清洗 4x。
注：Triton X-100在RT时不溶于PBS，将0.5%的Triton X-100溶液加热到37°C的水浴中溶解。 - 使用前5分钟解冻山羊血清。将山羊血清稀释为1x PBS，以1：20的比例作为阻断溶液。在每个盖玻片中加入 150 μL，并在 RT 中孵育 20 分钟。
注：如有必要，将阻塞时间延长到 60 分钟。用山羊血清阻断后不要清洗细胞。 - 使用前5分钟解冻原抗体（即抗乙酰化α管蛋白和抗伽马管蛋白）。在1x PBS中单独稀释抗体如下：小鼠抗乙酰化α图布蛋白在1：800比和兔子抗伽马图布林在1：300比。拆下阻塞溶液。不要洗。将两种抗体稀释 150 μL 添加到盖玻片中，并在RT下孵育60分钟。
注：如果孵育过夜使用500~1，000μL的原抗体溶液，用石蜡膜密封6井板，并储存在4°C。 或者，使用150μL的抗体，并在湿度室中孵育。 - 去除原抗体。用 2 mL 的 1x PBS 轻轻清洗盖玻片 3 倍。通过单独稀释Cy3绵羊抗小鼠和Alexa Fluor488山羊抗兔比例，在1xPBS中准备二级抗体。在盖玻片中加入150μL的两种二次抗体稀释。在黑暗中在 Rt 孵育 45 分钟。
注：在黑暗中孵育，避免光漂白。可根据需要使用其他二级抗体组合。 - 根据制造商的说明准备 DAPI（4'、6-二米迪诺-2-苯酚）解决方案。将多余的等分储存在-20°C。 在 50 mL 的 1x PBS 中稀释 10 μL 从库存等分 （1：5，000） 中。在盖玻片中加入 2 mL 的稀释。在黑暗中在 Rt 孵育 5 分钟。
注：重要的是在黑暗中孵育细胞，以避免光漂白。DAPI 稀释可以储存在 4 °C 下长达 1 个月。 - 准备 2 个针头、幻灯片、钳子和安装介质。为幻灯片添加标签。
- 从油井中拆下 DAPI 溶液。用 1x PBS 清洗 3x。在每张幻灯片上放置一滴安装介质。使用针头轻轻地从井底提起盖玻片。使用钳子翻转盖玻片，轻轻将盖玻片放在安装介质的掉落上。小心地清除任何气泡。
- 保护幻灯片免受光线的光，并在 4 °C 下过夜存放。
- 使用具有高放大率的荧光或共和显微镜来可视化原色。
注：幻灯片可在黑暗中 4 °C 存储长达 2 个月。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
原发性西莉亚的免疫荧光染色是一个相对简单的过程，可以产生高质量的图像。在这些实验中，表达原发性西莉亚的成纤维细胞按照上述协议在荧光或共合显微镜中固定、免疫和成像。使用乙酰β-图布林和β-图布林检测出原发性柠檬。原发性西莉亚的评价可以在不同级别上进行，这方面的任何变化都可以与电离辐射、细胞代谢（如饥饿）或化学处理（如细胞静电）5、18,等有关。
电离辐射对原发性西莉亚的影响已经研究在各种细胞系（例如，肌细胞系C2C12），这些细胞系被照射（2、6、10和20Gy），并分析了原发性西莉亚发生率的变化。根据菲利波娃在al.4，低辐照剂量不改变在C2C12细胞中单一原发性cilia的发生。然而，高剂量的电离辐射（即20 Gy）诱发多个原发性西莉亚的出现（图1A，B，C）。同样，当NHLF细胞在2Gy照射时，通过免疫荧光检测到原发性西莉亚（图2）。
代谢应力也被称为增加原发性西莉亚19的频率。在这种情况下，MEF成纤维细胞被饿死，并分析原发性西莉亚发病率的变化（图3）。
免疫荧光染色显示，纤维细胞在用多氟素和甲醇治疗后携带原发性西莉亚。用120 nM多索鲁比辛治疗的成纤维细胞表示单一原发性柠檬（图4）;高剂量诱发多个原发性西莉亚的出现（图5）。1.25 nM 税醇的治疗也导致存在单个原发性柠檬 （图 6） 。与多索鲁比辛的治疗相比，使用高剂量的霉素5治疗后未检测到多西莉亚。
图1：辐照C2C12细胞中原发性西莉亚的发生。 C2C12 细胞中原发性西莉亚的代表性照片。初级西莉亚检测由免疫荧光进行。原发性西莉亚的轴酮（箭头）用乙酰化β-多布林抗体（红色）和基底体用β-tubulin抗体（箭头，绿色）进行评估。核沾了DAPI（蓝色）。（A） 和 （B） 在照射 20 Gy 后 72 小时观察到多个西莉亚.（C） 单主基利亚后 72 小时辐照与 20 Gy4. 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：在辐照NHLF细胞中检测原发性西莉亚。 NHLF 细胞中原发性西莉亚的代表照片。原发性西莉亚（箭头）检测由免疫荧光进行。原发性胆碱的轴酮被乙酰化β-多布林抗体（红色）和基底体与β-多布林抗体（绿色）染色。核沾了DAPI（蓝色）。单一原发性西莉亚在2Gy照射后24小时。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：血清饥饿引起的代谢应激后，MEF细胞中原发性西莉亚的发病率。 MEF 细胞中血清饥饿后 24 小时原发性西莉亚 （0.1% FBS） 的代表性照片。原发性西莉亚（箭头）检测由免疫荧光进行。Axonemes 标有乙酰化 α-tubulin 抗体（红色）。基础体沾有+-tubulin抗体（绿色）。核沾了DAPI（蓝色）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：皮肤纤维细胞中原发性西莉亚的代表性照片。原发性西莉亚（箭头）检测由免疫荧光进行。原发性胆碱被乙酰-多布林抗体（红色）染色，而基体被染有β-多布林抗体（绿色）。核沾了DAPI（蓝色）。原发性西利亚被检测72小时后治疗与120 nM多索鲁比辛5。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：皮肤纤维细胞中多个西莉亚的代表性照片。原发性西莉亚（箭头）检测由免疫荧光进行。轴酮被乙酰化β-多布林抗体（红色）标记，基体被染色的β-多布林抗体（绿色）。核沾了DAPI（蓝色）。多个西莉亚被检测72小时后处理与120 nM多索鲁比辛5。请单击此处查看此图的较大版本。
图6：用甲醇治疗的皮肤成纤维细胞的代表性照片。通过免疫荧光检测到原发性西莉亚（箭头）。原发性西莉亚被染有乙酰化β-多布林抗体（红色）和β-多布林抗体（绿色）。轴酮核被染成DAPI（蓝色）。原发性西利亚被检测72小时后治疗与1.25 nM税醇5。请单击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
几位,作者描述了检测原发性西莉亚的不同方法，有时也描述了可能影响其检测6、20、21、2220,21的各种固定方法。6无论如何，很难找到一个完整而简单的检测协议。这种方法的可得性无疑对研究原发性西莉亚研究大有帮助，特别是在研究的早期阶段，或对测试所选细胞系中是否存在原发性西莉亚的迅速和简单的方法大有帮助。因此，在进行不同种类的治疗后，对本协议进行尽可能详细的描述，以检测体外原发性cilia。
本协议经修改后，每天,使用20、23、24。,2324例如，10% 的甲醛被 4% PFA 所取代，由于其存储寿命短，建议进行新的制备。PFA 是保存细胞形态的一个很好的选择，特别适用于膜结合蛋白的可视化。有机溶剂，如甲醇，对细胞有脱水作用，在固定过程中去除小的可溶性分子和脂质，因此不适合在某些情况下使用25。在 1x PBS 中，0.5% Triton X-100 实现渗透化，使用 15 分钟。山羊血清在1xPBS的1：20稀释20分钟被用作阻尼剂。两种原抗体，小鼠抗乙酰化多布林和兔抗-α-多布林，都可以在1x PBS中同时孵育60分钟，分别用1x PBS稀释1：800和1：300，分别20、21、23、24。20,21,23,24此外，在绵羊和亚历克萨氟488阿菲尼普尔F（ab'）2片段山羊抗兔IgG中，在1x PBS中稀释了继发抗体、抗小鼠IgG（全分子）F（ab+）2片段=Cy3抗体。它们同时孵育45分钟。
如果初级抗体在一夜之间孵育，可能需要采取额外的标准化步骤。在协议开发过程中发现，隔夜孵育需要至少500~1，000μL的原抗体溶液，6井板必须用准膜密封，储存温度必须为4°C，以防止蒸发。
成功染色原发性细胞的最关键步骤是：1）细胞系的选择和最佳细胞培养实践;2） 使用明胶涂层盖玻片;3） 持续使用新鲜4%的甲醛;4） 在黑暗中孵育二级抗体和DAPI;5） 在幻灯片中的安装介质上轻轻翻转和放置盖玻片。
协议的未来应用没有预见到的潜在限制。此外，初级西莉亚研究在各个领域越来越相关，简单、快速、可靠的西莉亚检测方法至关重要。此外，该协议将促进未来研究原发性西莉亚在细胞类型中，其中原发性西莉亚尚未被发现。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了捷克共和国国防部的支持 - 国防大学军事卫生科学系大规模毁灭性武器的长期组织发展计划医疗方面;捷克共和国教育、青年和体育部（具体研究项目号：SV/FVZ201703）和PROGRES Q40/06。也感谢丹尼尔·迪亚兹在英语修订方面提供的那种帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
