Summary
Primaire trilharen zijn extracellulaire structuren geassocieerd met de centriole. Primaire trilharendetectie door immunofluorescente kleuring is een relatief eenvoudige procedure die resulteert in beelden van zeer hoge kwaliteit. In dit protocol werden fibroblasten die primaire trilharen uitdrukken, vastgehouden, en afgebeeld in een fluorescerende of confocale microscoop.
Abstract
Primaire trilharen worden dynamisch gereguleerd tijdens de progressie van de celcyclus, met name tijdens de G0/G1-fasen van de celcyclus, die opnieuw worden bedhuisig vóór mitose. Primaire trilharen kunnen worden gevisualiseerd met zeer geavanceerde methoden, waaronder transmissie elektronenmicroscopie, 3D-beeldvorming, of met behulp van software voor de automatische detectie van primaire trilharen. Immunofluorescente kleuring van primaire trilharen is echter nodig om deze methoden uit te voeren. Deze publicatie beschrijft een protocol voor de eenvoudige detectie van primaire trilharen in vitro door het beitsen van geacetyleerde alfa tubuline (axoneme) en gamma tubuline (basaal lichaam). Dit immunofluorescente kleuringsprotocol is relatief eenvoudig en resulteert in beelden van hoge kwaliteit. Het huidige protocol beschrijft hoe vier cellijnen (C2C12, MEF, NHLF en huidfibroblasten) die primaire trilharen uitdrukken, werden vastgesteld, immunostained en afgebeeld met een fluorescerende of confocale microscoop.
Introduction
Primaire trilharen zijn zintuiglijke, solitaire, membraangebonden, niet-moge structuren geassocieerd met de moeder van de cel centriole. Primaire trilharen worden gevonden op de meeste gewervelde cellen, met uitzondering van rode bloedcellen, adipocyten1, en hepatocyten2. Primaire trilharen worden gevormd als een langwerpig axoneme samengesteld door microtubuli, waarvan de belangrijkste component α-tubuline is. De axoneme groeit uit het basale lichaam, dat is gestructureerd uit γ-tubuline. De lengte van de primaire trilharen varieert tussen 2-10 μm; de afmetingen kunnen echter veranderen tijdens glycyleratie, honger, hypoxie, cytotoxische stress of na blootstelling aan ioniserende straling3,4,5,6,7. Meestal hebben cellen slechts één primair cilium, dat betrokken is bij morfogenese en celsignaleringstrajecten die belangrijk zijn voor celproliferatie en differentiatie8,9.
Primaire trilharen worden dynamisch gereguleerd tijdens de progressie van de celcyclus, met name tijdens de G0/G1-fasen, en resorbed voordat ze mitose ingaan in een proces dat gepaard gaat met tubuline-deacetylatie bemiddeld door HDAC6 (histone deacetylase 6)10. Het exacte moment van primaire cilia resorptie is afhankelijk van het celtype en de expressie van genen die direct betrokken zijn bij dit proces, zoals Aurora A, Plk1, TcTex-11111,12,13. Afhankelijk van het celtype, de primaire trilharen uitdrukken verschillende soorten receptoren, ionkanalen, en actieve signalering trajecten. Deze omvatten de belangrijkste signaleringreceptoren die proliferatie en overleving beïnvloeden, EGFR, PDGFR en FGFR. Ook inbegrepen zijn enkele van de signalering trajecten die de functie van een of meer organen kunnen beïnvloeden, met inbegrip van Hedgehog, Notch, en Wnt. Dankzij deze receptoren en signalering trajecten, de primaire trilharen ook een chemosensorische functie uit te voeren. Deze functie maakt het mogelijk primaire trilharen om specifieke liganden voor Notch, hormonen, en biologisch actieve stoffen zoals serotonine of somatostatine detecteren. Andere specifieke functies tentoongesteld door primaire trilharen van verschillende lengtes zijn reactie op veranderingen in temperatuur, zwaartekracht en osmolaliteit14.
Primaire trilharen kunnen worden gevisualiseerd door middel van verschillende methoden, zoals live visualisatie, transmissie elektronenmicroscopie, 3D-beeldvorming, of door software voor de automatische detectie van primaire trilharen5,,15,,16,17. Echter, deze methoden zijn zeer gespecialiseerd en voortdurend onderzoek moet fundamentele, snelle en eenvoudige methoden voor het beitsen van primaire trilharen in elke fase van het onderzoek. Beschreven is een eenvoudige en nuttige methode voor de detectie van primaire trilharen in gekweekte cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van cultuurmedia, oplossingen en gerechten
- Autoclave de coverslips (22 x 22 mm). Bereid 6 goed platen. Dooi foetaal runderserum (FBS) en antibiotica penicilline/streptomycine en verwarmen het kweekmedium tot kamertemperatuur (RT). Gebruik trypsin-EDTA (0,25%) en 1x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium) om de cellen door te geven.
- Bereid verse 4% paraformaldehyde (PFA) voor in dH2O (800 mg PFA in 20 mL dH2O). De PFA moet voor elk experiment vers worden bereid. Roer en verwarm de oplossing op 55 °C gedurende 30 minuten in de kap. Koel af bij RT. Voeg 1 M natriumhydroxide toe totdat de oplossing duidelijk wordt (pH = 7.2–7.4). Bewaar tot 1 week bij 4 °C.
Opmerking: PFA is giftig; draag altijd voldoende persoonlijke beschermingsmiddelen en bereid u voor in de chemische kap. - Bereid 500 mL cultuurmedia, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 2% glutamine.
- Bereid 13 mL van 1% gelatineoplossing in steriele dH2O (130 mg gelatine in 13 mL dH2O). Gebruik 2 mL van 1% gelatine voor elke put in een 6 put plaat. Blijf steriel.
- Reinig de laminaire stroomkap met 70% ethanol. Plaats het benodigde materiaal in de laminaire stroomkap voordat u met het experiment begint.
2. Celkweek voor immunocytochemie kleuring
- Ontdooi de cellen (in deze studie C2C12, MEF, NHLF en huidfibroblasten) met behulp van standaardtechnieken en plaat ze in een T75 kolf aangevuld met ~ 10-12 mL van de voorbereide media. Incubeer bij 37 °C/5% CO2/90% relatieve vochtigheid (RH) tot de cellen 70% samenvloeiing bereiken.
- Verwijder de cellen uit de couveuse en plaats ze in de laminaire stroomkap. Verwijder de kweekmedia en spoel de cellen kort 2x met 1x PBS. Voeg ~2 mL van 0,25% trypsin-EDTA toe aan de T75-kolf en incubeer bij 37 °C voor ~5 min. Controleer periodiek op de omgekeerde microscoop om celloslating te controleren.
OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de cellijn en moet daarom empirisch worden bepaald. - Voorzichtig resuspend de cellen in 10 mL van de cultuur media, pipetting zorgvuldig om een enkele cel suspensie te creëren. Spoel de kolf indien nodig opnieuw af.
- Plaats de celsuspensie in een conische buis van 50 mL en centrifuge gedurende 5 minuten op ~200 x g. Decanteer de supernatant, voeg 10 mL cultuurmedia toe en verbouw de pellet voorzichtig. Neem 20 μL van de celsuspensie en meng in een 1:1-verhouding met trypanblauw en tel in een cytometer volgens de standaardmethode.
- Plaats een coverslip in elke put van een 6 goed plaat met behulp van een pincet. Coat de coverslips met gelatine door het gieten ~2 mL in de putten. Dit zal helpen de cellen hechten aan de coverslips. Verwijder de gelatineoplossing en laat de lucht enkele minuten drogen. De coverslips zijn nu klaar voor de teelt van de cellen. Start de teelt onmiddellijk.
- Zaad 100.000 fibroblasten in elke put en voeg 2 mL van cultuur media. De cellen 24 uur uitbroeden bij 37 °C/5% CO2/90% RH. Op dit punt kunnen de cellen worden behandeld op basis van de behoeften van de gebruiker. Behandelingen om ciliatie te veroorzaken zijn eerder beschreven4,5.
OPMERKING: Het initiële zaainummer is afhankelijk van de verdubbelingstijd van de cellen en moet dienovereenkomstig worden bepaald.
3. Immunofluorescente kleuring van primaire trilharen in vitro
- Verwarm de 4% paraformaldehyde tot RT. Bereid Pasteur pipetten, 1x PBS (RT), afvalcontainer, 15 mL conische buizen, micropipettes (0,5–10 μL, 20-200 μL en 100-1.000 μL) en tips. Neem de cellen uit de couveuse en leg ze in de bank.
OPMERKING: De kleuringsprocedure hoeft niet in steriele omstandigheden te worden uitgevoerd. Alle oplossingen moeten bij RT zijn. - Verwijder media uit elke put. Laat de hoezen in de put. Was de cellen 3x heel voorzichtig met 2 mL 1x PBS. Voeg met behulp van een Pasteur pipet 2 mL van 4% PFA toe in elke put om de cellen te fixeren. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT. Verwijder de PFA en was 3x met 1x PBS.
LET OP: Gebruik altijd een voldoende volume om het volledige dekvlak tijdens de incubatieperioden te dekken. Laat de cellen nooit drogen. Giet nooit een van de oplossingen direct op de coverslip. - Bereid 0,5% Triton X-100 voor in 13 mL van 1x PBS 10 min voor gebruik. Voeg 2 mL in elke put. Incubeer gedurende 15 minuten. Was voorzichtig 4x met 1x PBS.
OPMERKING: Triton X-100 is onoplosbaar in PBS bij RT. Verwarm de 0,5% Triton X-100 oplossing tot 37 °C in een waterbad om het op te lossen. - Dooi geitenserum 5 min voor gebruik. Verdun het geitenserum in 1x PBS in een 1:20 verhouding als blokkerende oplossing. Voeg 150 μL toe aan elke coverslip en incubbate gedurende 20 minuten bij RT.
LET OP: Verleng de blokkeringsperiode indien nodig tot 60 min. Was de cellen niet na het blokkeren met geitenserum. - Ontdooi de primaire antilichamen (d.w.z. anti-acetylated alfa tubuline en anti-gamma tubuline) 5 min voor gebruik. Verdun de antilichamen afzonderlijk in 1x PBS als volgt: muis anti-acetylated alpha tubulin in een 1:800 verhouding en konijn anti-gamma tubuline in een verhouding van 1:300. Verwijder de blokkeringsoplossing. Niet wassen. Voeg 150 μL van beide antilichaamverdunningen toe aan de coverslips en incubeer gedurende 60 minuten bij RT.
OPMERKING: Als het uitbroeden 's nachts 500-1.000 μL van de primaire antilichaamoplossingen gebruikt, sluit u de 6 putplaat af met paraffinefolie en bewaar u bij 4 °C. U ook 150 μL antilichaam gebruiken en incubeer in een vochtigheidskamer. - Verwijder de primaire antilichamen. Was de covers 3x heel voorzichtig met 2 mL 1x PBS. Bereid de secundaire antilichamen in 1x PBS door afzonderlijk verdunnen Cy3 schapen anti-muis en Alexa Fluor488 geit anti-konijn in een 1:300 verhouding. Voeg 150 μL van beide secundaire antilichaamverdunningen toe aan de coverslips. Incubeer voor 45 minuten op RT in het donker.
OPMERKING: Incubeer in het donker om fotobleaching te voorkomen. Andere combinaties van secundaire antilichamen kunnen naar behoefte worden gebruikt. - Bereid een DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindole) oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het overtollige aliquots op -20 °C. Verdun 10 μL uit een voorraad aliquot (1:5.000) in 50 mL van 1x PBS. Voeg 2 mL van deze verdunning toe aan de coverslips. Incubeer voor 5 minuten op RT in het donker.
OPMERKING: Het is belangrijk om de cellen in het donker uit te broeden om fotobleekt te voorkomen. De DAPI verdunning kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard. - Bereid 2 naalden, dia's, pincet en montagemedia. Label de dia's.
- Verwijder de DAPI-oplossing uit de putten. Was 3x met 1x PBS. Zet een druppel montagemedia op elke dia. Gebruik de naald om de coverslip voorzichtig van de bodem van de put te tillen. Draai de coverslip met behulp van de pincet en plaats het voorzichtig over de druppel montagemedia. Verwijder voorzichtig eventuele bubbels.
- Bescherm de dia's tegen licht en bewaar ze 's nachts op 4 °C.
- Gebruik een fluorescerende of confocale microscoop met hoge vergroting om de primaire trilharen te visualiseren.
LET OP: De dia's kunnen maximaal 2 maanden in het donker bij 4 °C worden bewaard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De immunofluorescente kleuring van primaire trilharen is een relatief eenvoudige procedure die resulteert in beelden van hoge kwaliteit. In deze experimenten werden fibroblasten die primaire trilharen uitdrukken, in een fluorescerende of confocale microscoop in beeld gebracht volgens het hierboven beschreven protocol. Het primaire cilium werd gedetecteerd met behulp van acetylated α-tubuline en γ-tubuline. De evaluatie van primaire trilharen kan op verschillende niveaus worden uitgevoerd en elke verandering in dit verband kan worden gekoppeld aan blootstelling aan ioniserende straling, celmetabolisme (bijvoorbeeld honger) of chemische behandeling (bijvoorbeeld cytostatica)5,18.
Het effect van ioniserende straling op primaire trilharen is onderzocht in verschillende cellijnen (bijvoorbeeld de myoblastcellijn C2C12), die werden bestraald (2, 6, 10 en 20 Gy) en de veranderingen in de primaire cilia-incidentie geanalyseerd. Volgens Filipova bij al.4wijzigen lage bestralingsdoses het optreden van een enkele primaire trilharen in C2C12-cellen niet. Hogere doses ioniserende straling (d.w.z. 20 Gy) veroorzaakten echter het verschijnen van meervoudige primaire trilharen(figuur 1A, B,C). Evenzo, toen NHLF-cellen werden bestraald op 2 Gy de primaire trilharen werden gedetecteerd door immunofluorescentie (figuur 2).
Metabole stress is ook bekend om de frequentie van primaire trilharen19te verhogen. In dit geval werden MEF-fibroblasten uitgehongerd en geanalyseerd op veranderingen in de primaire trilharenincidentie(figuur 3).
Immunofluorescentie vlekken bleek dat fibroblast cellen droegen primaire trilharen na behandeling met doxorubine en taxol. De met 120 nM doxorubicine behandelde fibroblasten uitgedrukt in één primair cilium (figuur 4); hogere doses veroorzaakten het verschijnen van meervoudige primaire trilharen (figuur 5). Behandeling met 1,25 nM taxol resulteerde ook in de aanwezigheid van één primair cilium (figuur 6). In tegenstelling tot de behandeling met doxorubicine werden meerdere trilharen niet gedetecteerd na behandeling met hogere doses taxol5.
Figuur 1: Optreden van primaire trilharen in bestraalde C2C12-cellen. Representatieve foto's van primaire trilharen in C2C12-cellen. Primaire trilharendetectie werd uitgevoerd door immunofluorescentie. Het axoneme (pijl) van de primaire trilharen werd beoordeeld met acetylated α-tubulineantilichaam (rood) en het basale lichaam door γ-tubulineantilichaam (pijl, groen). Kernen waren bevlekt met DAPI (blauw). (A) en (B) meerdere trilharen werden waargenomen 72 uur na bestraling met 20 Gy. (C) Enkele primaire trilharen na 72 uur bestraling met 20 Gy4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Detectie van primaire trilharen in bestraalde NHLF-cellen. Representatieve foto's van primaire trilharen in NHLF-cellen. Primaire trilharen (pijl) detectie werd uitgevoerd door immunofluorescentie. De axonemen van de primaire trilharen waren bevlekt met acetylated α-tubuline antilichaam (rood) en de basale lichamen met γ-tubuline antilichaam (groen). Kernen waren bevlekt met DAPI (blauw). Enkele primaire trilharen 24 uur na bestraling op 2 Gy. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Incidentie van primaire trilharen in de MEF-cellen na metabole stress veroorzaakt door serumverhongering. Representatieve foto's van primaire trilharen 24 uur na serumverhongering (0,1% FBS) in MEF-cellen. Primaire trilharen (pijl) detectie werd uitgevoerd door immunofluorescentie. Axonemes werden gelabeld met acetylated α-tubuline antilichaam (rood). Basale lichamen werden bevlekt met γ-tubuline antilichaam (groen). Kernen waren bevlekt met DAPI (blauw). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve foto's van primaire trilharen in huidfibroblasten. Primaire trilharen (pijl) detectie werd uitgevoerd door immunofluorescentie. Primaire trilharen werden bevlekt met acetylated α-tubuline antilichaam (rood), terwijl de basale lichamen waren bevlekt met γ-tubuline antilichaam (groen). Kernen waren bevlekt met DAPI (blauw). Primaire trilharen werden 72 uur na behandeling met 120 nM doxorubicine5ontdekt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Representatieve foto's van meerdere trilharen in huidfibroblasten. Primaire trilharen (pijl) detectie werd uitgevoerd door immunofluorescentie. De axonemes werden gelabeld door acetylated α-tubuline antilichaam (rood) en de basale lichamen waren bevlekt met γ-tubuline antilichaam (groen). Kernen waren bevlekt met DAPI (blauw). Meerdere trilharen werden 72 uur na behandeling met 120 nM doxorubicine5ontdekt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Representatieve foto's van huidfibroblasten die met taxol worden behandeld. Primaire trilharen (pijl) werden gedetecteerd door immunofluorescentie. Primaire trilharen werden bevlekt met acetylated α-tubuline antilichaam (rood) en met γ-tubuline antilichaam (groen). Axoneme kernen waren gekleurd met DAPI (blauw). Primaire trilharen werden 72 uur na behandeling met 1,25 nM taxol5ontdekt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende auteurs hebben diverse methoden beschreven voor de detectie van primaire trilharen, soms ook het beschrijven van verschillende fixatiemethoden die hun detectie kunnen beïnvloeden6,20,21,22. Hoe dan ook, het is moeilijk om een compleet en eenvoudig protocol voor detectie te vinden. De beschikbaarheid van een dergelijke methode zou ongetwijfeld van grote hulp zijn voor de studie van het primaire trilharenonderzoek, vooral in een vroeg stadium van onderzoek of voor een snelle en eenvoudige methode om de aanwezigheid van primaire trilharen in een gekozen cellijn te testen. Daarom wordt dit protocol zo gedetailleerd mogelijk beschreven voor de detectie van primaire trilharen in vitro na verschillende soorten behandeling.
Het huidige protocol werd aangepast voor dagelijks gebruik20,23,24. Zo werd 10% formaline vervangen door 4% PFA, waarvan de verse bereiding wordt aanbevolen vanwege de korte houdbaarheid. PFA is een goede keuze voor het behoud van celmorfologie en is vooral geschikt voor de visualisatie van membraangebonden eiwitten. Organische oplosmiddelen, zoals methanol, hebben een uitdrogend effect op de cel en verwijderen kleine, oplosbare moleculen en lipiden tijdens het fixatieproces, waardoor het ongeschikt is voor gebruik in bepaalde scenario's25. Permeabilisatie wordt bereikt met 0,5% Triton X-100 in 1x PBS gedurende 15 minuten. Geitenserum in een 1:20 verdunning in 1x PBS gedurende 20 min wordt gebruikt als blokkeermiddel. Zowel primaire antilichamen, muisanti-acetylated tubuline en konijn anti-γ-tubulin, kunnen gelijktijdig gedurende 60 minuten worden geïncubeerd met behulp van een verdunning van 1:800 en 1:300 in 1x PBS, respectievelijk20,21,23,24. Bovendien werden de secundaire antilichamen, anti-muis IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antilichaam geproduceerd bij schapen en Alexa Fluor488 AffiniPure F(ab')₂ fragment goat anti-rabbit IgG, verdund 1:300 in 1x PBS. Ze werden gelijktijdig voor 45 min geïncubeerd.
Het kan nodig zijn om extra standaardisatiestappen te nemen als de primaire antilichamen 's nachts worden geïncubeerd. Tijdens de ontwikkeling van het protocol werd vastgesteld dat een nachtelijke incubatie een volume van ten minste 500-1.000 μL primaire antilichaamoplossing nodig heeft, moet de 6 putplaat met parafilm worden verzegeld en moet de opslag bij 4 °C zijn om verdamping te voorkomen.
De meest kritische stappen voor de succesvolle kleuring van primaire trilharen zijn: 1) keuze van de cellijn en optimale celcultuur praktijk; 2) gebruik van gelatine gecoate coverslips; 3) consistent gebruik van verse 4% paraformaldehyde; 4) incubatie van het secundaire antilichaam en de DAPI in het donker; 5) het uitvoeren van een zachte flip en plaatsing van de coverslip op de top van de montage media in de dia.
Er zijn geen voorziene potentiële beperkingen in de toekomstige toepassingen van het protocol. Bovendien wordt primair trilharenonderzoek steeds relevanter op verschillende gebieden en zijn eenvoudige, snelle en betrouwbare ciliadetectiemethoden essentieel. Verder zal dit protocol de toekomstige studie van primaire trilharen in celtypen vergemakkelijken waarin primaire trilharen tot nu toe onopgemerkt zijn geweest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Defensie van de Tsjechische Republiek - Langetermijnorganisatie ontwikkelingsplan Medische aspecten van massavernietigingswapens van de faculteit Militaire Gezondheidswetenschappen, Universiteit van Defensie; het Ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport, Tsjechië (Specifiek Onderzoeksproject nr: SV/ FVZ201703) en PROGRES Q40/06. Dank ook aan Daniel Diaz voor zijn vriendelijke hulp in het Engels taalrevisie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
