Summary
סיליה העיקרית היא מבנים extracellular הקשורים centriole. זיהוי cilia ראשוני על ידי כתם immunofluorescent הוא הליך פשוט יחסית שתוצאות תמונות באיכות גבוהה מאוד. בפרוטוקול זה, פיברובלסטים המבטאים cilia ראשוני תוקנו, immunostained, ותמונה במיקרוסקופ פלורסנט או confocal.
Abstract
cilia הראשי מוסדרים באופן דינמי במהלך התקדמות מחזור התא, במיוחד במהלך שלבי G0/G1 של מחזור התא, להיות resorbed לפני המיטוזה. ניתן לדמיין cilia הראשי עם שיטות מתוחכמות מאוד, כולל מיקרוסקופאלקטרונים שידור, הדמיה 3D, או שימוש בתוכנה לזיהוי אוטומטי של cilia הראשי. עם זאת, כתמי חיסון של cilia הראשי יש צורך לבצע שיטות אלה. פרסום זה מתאר פרוטוקול לזיהוי קל של cilia הראשי במבחנה על ידי הכתמת אצטילאט אלפא טובולין (אקסואנם) וגמא טובולין (גוף בזל). פרוטוקול כתמים חיסוני זה הוא פשוט יחסית ומביא לתמונות באיכות גבוהה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד ארבעה קווי תאים (C2C12, MEF, NHLF, ופיברובלסטים בעור) המבטאים cilia ראשי תוקנו, immunostained, ותמונה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal.
Introduction
cilia העיקריים הם חושיים, בודדים, קרום כבול, מבנים לא מוזגים הקשורים צנטריול אמו של התא. cilia העיקרי נמצאים על רוב תאי החוליות למעט תאי דם אדומים, adipocytes1, ו hepatocytes2. cilia הראשי נוצרים כמו אקסואנם מוארך מורכב על ידי microtubules, שהרכיב העיקרי שלהם הוא α-tubulin. האקסואנם גדל מגוף הבסאלי, המוערך מ-0.0. אורכו של cilia הראשי משתנה בין 2-10 μm; עם זאת, ממדיו יכולים להשתנות במהלך גליצילציה, רעב, היפוקסיה, מתח ציטוקוקס, או לאחר חשיפה לקרינהמיוננת 3,4,,5,6,7. בדרך כלל, תאים יש רק סיליום ראשוני אחד, אשר מעורב morphogenesis ותא איתות מסלולים חשובים להתפשטות תאיםובידול 8,9.
cilia הראשי מוסדרים באופן דינמי במהלך התקדמות מחזור התא, במיוחד במהלך שלבי G0/G1, וororbed לפני הזנת מיטוזה בתהליך המשויך deacetylation טובלין בתיווך HDAC6 (histone deacetylase 6)10. הרגע המדויק של ספיגת cilia הראשי תלוי סוג התא ואת הביטוי של גנים המעורבים ישירות בתהליך זה, כגון אורורה A, Plk1, TcTex-111,,12,13. בהתאם לסוג התא, cilia הראשי לבטא סוגים שונים של קולטנים, ערוצי יון, ומסלולי איתות פעילים. אלה כוללים את קולטני האיתות החשובים ביותר המשפיעים על התפשטות והישרדות, EGFR, PDGFR ו- FGFR. כלולים גם כמה מסלולי איתות שעשויים להשפיע על הפונקציה של איברים אחד או יותר, כולל קיפוד, חריץ, ו Wnt. הודות קולטנים אלה ומסלולי איתות, cilia הראשי גם לבצע פונקציה chemosensory. פונקציה זו מאפשרת cilia הראשי לזהות ליגנדים ספציפיים עבור חריץ, הורמונים, וחומרים פעילים ביולוגית כגון סרוטונין או somatostatin. פונקציות ספציפיות אחרות המוצגות על ידי cilia ראשוני של אורכים שונים כוללים תגובה לשינויים בטמפרטורה, כוח המשיכה, osmolality14.
Cilia הראשי ניתן לדמיין באמצעות שיטות שונות, כגון הדמיה חיה, מיקרוסקופאלקטרון שידור, הדמיה 3D, או על ידי תוכנה לזיהוי אוטומטי של cilia הראשי5,15,16,17. עם זאת, שיטות אלה הן מאוד מיוחדים ומתמשך מחקר צריך בסיסי, מהיר, ושיטות קלות להכתים cilia הראשי בכל שלב של המחקר. מתואר היא שיטה קלה ושימושית לזיהוי cilia הראשי בתאים תרבותיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מדיה תרבות, פתרונות ומנות
- Autoclave את כיסויי (22 x 22 מ"מ). הכינו 6 צלחות טובות. להפשיר סרום עוף עוברי (FBS) ופניצילין אנטיביוטי / סטרפטומיצין ולחמם את טמפרטורת התרבות בינונית לחדר (RT). השתמש ב- trypsin-EDTA (0.25%) ו- 1 PBS (פוספט אגירה תמיסת מלח עם סידן ומגנזיום) כדי לעבור את התאים.
- להכין טרי 4% paraformaldehyde (PFA) ב dH2O (800 מ"ג של PFA ב 20 מ"ל של dH2O). PFA חייב להיות מוכן טרי לכל ניסוי. מערבבים ומחמים את התמיסה ב-55 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות במכסה המנוע. להתקרר ב RT. להוסיף 1 M נתרן הידרוקסיד עד הפתרון מתבהר (pH = 7.2–7.4). יש לאחסן ב-4°C עד שבוע אחד.
הערה: PFA רעיל; תמיד ללבוש ציוד מגן אישי הולם ולהתכונן בשכונה כימית. - להכין 500 מ"ל של מדיה תרבות, DMEM (Dulbecco של שונה הנשר של מדיום) המכיל 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 2% גלוטמין.
- להכין 13 מ"ל של 1% פתרון ג'לטין ב dHסטרילי 2O (130 מ"ג של ג'לטין ב 13 מ"ל של dH2O). השתמש 2 מ"ל של 1% ג'לטין עבור כל באר בצלחת 6 באר. תמשיך להיות סטרילי.
- נקה את מכסה המנוע של זרימת ה למינאר באמצעות 70% אתנול. מניחים את החומר הנדרש בתוך מכסה המנוע של זרימת ה למינאר לפני תחילת הניסוי.
2. תרבות תאים להכתמת אימונוציטוכימיה
- להפשיר את התאים (במחקר זה C2C12, MEF, NHLF, ופיברובלסטים בעור) באמצעות טכניקות סטנדרטיות וצלחת אותם במבחנות T75 בתוספת ~ 10-12 מ"ל של התקשורת המוכנה. דגירה ב 37 °C / 5% CO2/ 90% לחות יחסית (RH) עד התאים להגיע 70% confluence.
- מוציאים את התאים מהאינקובטור ומניאים אותם בכסה המנוע של זרימת ה למינאר. הסר את מדיית התרבות ושטוף את התאים לזמן קצר פי 2 עם PBS אחד. הוסף ~ 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לתוך בקבוקון T75 דגירה ב 37 ° C עבור ~ 5 דקות. בדוק מעת לעת את המיקרוסקופ ההפוך כדי לפקח על ניתוק התא.
הערה: זמן הדגירה תלוי בקו התא ולכן יש לקבוע אותו באופן אמפירי. - בעדינות respenpent התאים ב 10 מ"ל של מדיה תרבות, pipetting בזהירות כדי ליצור מתלה תא יחיד. יש לשטוף את הבקבוקון שוב במידת הצורך.
- הנח את מתלי התא בצינור חסונים 50 מ"ל וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב ~ 200 x g. לשמן את supernatant, להוסיף 10 מ"ל של מדיה תרבות, בעדינות respenpen את הכדור. קח 20 μL של מתלה התא ולערבב יחס 1:1 עם טריפאן כחול לספור ציטומטר בעקבות השיטה הסטנדרטית.
- מניחים כיסוי אחד בתוך כל באר של צלחת 6 באר באמצעות פינצטה. לכסות את כיסויי עם ג'לטין על ידי שפיכת ~ 2 מ"ל לתוך בארות. כך יעזור לתאים לצרף את הכיסויים. מסירים את תמיסת הג'לטין ולתת לאוויר להתייבש לכמה דקות. כיסויי הכיסוי מוכנים כעת לטיפוח התאים. התחל את הטיפוח מיד.
- זרע 100,000 פיברובלסטים לתוך כל באר ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה תרבות. דגירה התאים במשך 24 שעות ב 37 ° C / 5% CO2/ 90% RH. בשלב זה, ניתן לטפל בתאים בהתאם לצרכי המשתמש. טיפולים כדי לגרום ciliation תוארו בעבר4,5.
הערה: מספר הזרעה הראשוני תלוי בזמן ההכפלה של התאים ויש לקבוע אותו בהתאם.
3. כתמי חיסון של סיליה ראשונית במבחנה
- לחמם את 4% paraformaldehyde ל RT. להכין פיפטות פסטר, 1x PBS (RT), מיכל פסולת, 15 מ"ל צינורות חסינים, micropipettes (0.5-10 μL, 20-200 μL, ו 100-1,000 μL) וטיפים. קח את התאים מהאינקובטור והניח אותם על הספסל.
הערה: אין צורך לבצע את הליך ההכתמה בתנאים סטריליים. כל הפתרונות חייבים להיות ב-RT. - הסר מדיה מכל באר. השאר את כיסוי הכיסוי בתוך הבאר. בעדינות רבה לשטוף את התאים 3x עם 2 מ"ל של 1x PBS. באמצעות פיפטה פסטר, להוסיף 2 מ"ל של 4% PFA לתוך כל באר כדי לתקן את התאים. דגירה במשך 10 דקות ב- RT. הסר את PFA ולשטוף 3x עם PBS 1x.
הערה: השתמש תמיד בנפח מספיק כדי לכסות את כל כיסוי במהלך תקופות הדגירה. לעולם אל תיתן לתאים להתייבש. לעולם אל תשפוך את הפתרונות ישירות על מכסה. - הכן 0.5% Triton X-100 ב- 13 מ"ל של 1x PBS 10 דקות לפני השימוש. מוסיפים 2 מ"ל לכל באר. דגירה במשך 15 דקות. יש לשטוף בעדינות פי 4 עם PBS אחד.
הערה: Triton X-100 אינו מסיס PBS ב RT. לחמם את פתרון 0.5% Triton X-100 כדי 37 ° C באמבט מים כדי להמיס אותו. - להפשיר סרום עז 5 דקות לפני השימוש. לדלל את סרום העזים ב 1x PBS ביחס 1:20 כפתרון חסימה. להוסיף 150 μL לכל כיסוי ותרגם במשך 20 דקות ב RT.
הערה: להאריך את תקופת החסימה עד 60 דקות במידת הצורך. אין לשטוף את התאים לאחר חסימה עם סרום עזים. - להפשיר את הנוגדנים העיקריים (כלומר, נגד אצטילאט אלפא טובלין ואנטי גמא טובלין) 5 דקות לפני השימוש. לדלל את הנוגדנים בנפרד ב 1x PBS כדלקמן: עכבר נגד אצטילאט אלפא טובלין ביחס 1:800 וארנב נגד גמא טובלין ביחס 1:300. הסר את פתרון החסימה. אל תתרחץ. להוסיף 150 μL של שני דילולנים נוגדנים לכיסויים ומדגם במשך 60 דקות ב RT.
הערה: אם דגירה בן לילה להשתמש 500-1,000 μL של פתרונות נוגדנים העיקריים, לאטום את צלחת 6 באר עם סרט פרפין, ולאחסן ב 4 ° C. לחלופין, להשתמש 150 μL של נוגדנים דגירה בתא לחות. - הסר את הנוגדנים הראשיים. לשטוף את כיסויי בעדינות רבה 3x עם 2 מ"ל של PBS 1x. הכן את הנוגדנים המשניים ב- PBS 1x על-ידי דילול נפרד של כבשים Cy3 נגד עכבר ואלכסה Fluor488 עז נגד ארנב ביחס 1:300. להוסיף 150 μL של שני דילולנים משניים לכיסויים. דגירה במשך 45 דקות ב RT בחושך.
הערה: דגירה בחושך כדי למנוע פוטו-בליך. שילובים אחרים של נוגדנים משניים יכולים לשמש כצורך. - הכן פתרון DAPI (4', 6-diamidino-2-פנילידול) בהתאם להוראות היצרן. לאחסן את האליציטוטים העודפים ב-20°C. דילול 10 μL מ aliquot מניות (1:5,000) ב 50 מ"ל של 1x PBS. הוסף 2 מ"ל של דילול זה לכיסויים. דגירה במשך 5 דקות ב RT בחושך.
הערה: חשוב לערר את התאים בחושך כדי למנוע פוטו-בליך. ניתן לאחסן את דילול DAPI ב- 4 °C למשך עד חודש אחד. - הכן 2 מחטים, שקופיות, פינצטה, ומדיה הרכבה. תייג את השקופיות.
- הסר את פתרון DAPI מהבארות. לשטוף 3x עם 1pBS. הצבת טיפה אחת של מדיה טעינה בכל שקופית. השתמש במחט כדי להרים בעדינות את הכיסוי מתחתית הבאר. הפוך את כיסוי הכיסוי באמצעות הפינצטה והינו אותו בעדינות על טיפת המדיה ההרכבה. בזהירות להסיר את כל בועות.
- הגן על השקופיות מפני אור ואחסן אותן למשך הלילה ב- 4°C.
- השתמש מיקרוסקופ פלורסנט או confocal עם הגדלה גבוהה כדי לדמיין את cilia הראשי.
הערה: ניתן לאחסן את השקופיות בחושך ב- 4 °C למשך עד חודשיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכתמה החיסונית של cilia הראשי הוא הליך פשוט יחסית שתוצאות תמונות באיכות גבוהה. בניסויים אלה, פיברובלסטים המבטאים cilia ראשוני תוקנו, immunostained, ותמונה במיקרוסקופ פלורסנט או confocal בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל. הסיליום הראשי זוהה באמצעות אצטילאט α-טובלין ו ơ-tubulin. ההערכה של cilia הראשי יכול להתבצע ברמות שונות וכל שינוי בהקשר זה יכול להיות קשור לחשיפה לקרינה מיוננת, חילוף חומרים של תאים (למשל, רעב), או טיפול כימי (למשל, cytostatics)5,,18.
ההשפעה של קרינה מיוננת על cilia הראשי נחקר הקווים תאים שונים (למשל, קו התא myoblast C2C12), אשר היו מוקרן (2, 6, 10, ו 20 Gy) ואת השינויים בשכיחות cilia הראשי נותח. על פי פיליפובה ב al.4, מינונים נמוכים הבהרה אינם משנים את המופע של cilia ראשי יחיד בתאי C2C12. עם זאת, מינונים גבוהים יותר של קרינה מיוננת (כלומר, 20 Gy) גרמו להופעתה של cilia ראשוני מרובה(איור 1A, B,C). באופן דומה, כאשר תאי NHLF הוקרן ב 2 Gy cilia העיקרי זוהו על ידי immunofluorescence (איור 2).
מתח חילוף החומרים ידוע גם כדי להגביר את התדירות של cilia הראשי19. במקרה זה, פיברובלסטים MEF היו מורעבים וניתחו לשינויים בשכיחות cilia העיקרית (איור 3).
כתמי חיסון גילה כי תאים פיברובלסט נשאו cilia ראשוני לאחר טיפול עם דוקסורובין ו- taxol. אלה פיברובלסטים שטופלו 120 nM דוקסוביצין הביעו cilium ראשוני יחיד (איור 4); מינונים גבוהים יותר גרמו למראה של cilia ראשוני מרובה (איור 5). טיפול עם 1.25 nM תבול גם הביא לנוכחות של cilium ראשוני יחיד(איור 6). בניגוד לטיפול עם דוקסורובינין, cilia מרובים לא זוהו לאחר טיפול במינונים גבוהים יותר של taxol5.
איור 1: התרחשות של cilia ראשי בתאי C2C12 מוקרן. תמונות מייצגות של cilia הראשי בתאי C2C12. זיהוי סיליה ראשוני בוצע על ידי אימונו-לורה. האקסואנם (חץ) של cilia הראשי הוערכו עם נוגדן אצטילאט α-tubulin (אדום) ואת הגוף בזל על ידי נוגדן ơ-tubulin (חץ, ירוק). גרעין היו מוכתם DAPI (כחול). (A)ו - (ב)cilia מרובים נצפו 72 שעות לאחר ההתרינות עם 20 Gy. (ג)סיליה ראשונית אחת לאחר 72 שעות הקרן עם 20 Gy4. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: זיהוי של cilia ראשי בתאי NHLF מוקרן. תמונות מייצגות של סיליה ראשונית בתאי NHLF. זיהוי סיליה ראשי (חץ) בוצע על ידי אימונולוסצינציה. האקסונים של cilia הראשי היו מוכתמים עם נוגדן אצטילאט α-טובלין (אדום) ואת הגופים בזל עם נוגדן ơ-tubulin (ירוק). גרעין היו מוכתם DAPI (כחול). סיליה ראשונית אחת 24 שעות לאחר ההתערעות ב-2 Gy. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: שכיחות של cilia ראשוני בתאי MEF לאחר מתח חילוף חומרים המושרה על ידי רעב סרום. תמונות מייצגות של cilia הראשי 24 שעות לאחר רעב סרום (0.1% FBS) בתאי MEF. זיהוי סיליה ראשי (חץ) בוצע על ידי אימונולוסצינציה. אקסונמס סומנו עם נוגדן אצטילאט α-טובלין (אדום). גופים בזל היו מוכתמים עם נוגדן תב"א (ירוק). גרעין היו מוכתם DAPI (כחול). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תצלומים מייצגים של סיליה ראשונית בפיברובלסטים בעור. זיהוי סיליה ראשי (חץ) בוצע על ידי אימונולוסצינציה. Cilia העיקרי היו מוכתמים עם נוגדן אצטילאט α-tubulin (אדום), בעוד הגופים הבזליים היו מוכתמים עם נוגדן תותב (ירוק). גרעין היו מוכתם DAPI (כחול). cilia הראשי זוהו 72 שעות לאחר טיפול עם 120 nM דוקסורצין5. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תצלומים מייצגים של סיליה מרובה בפיברובלסטים בעור. זיהוי סיליה ראשי (חץ) בוצע על ידי אימונולוסצינציה. האקסונים סומנו על ידי נוגדן אצטילאט α-טובלין (אדום) וגופים בזל היו מוכתמים עם נוגדן 0-טובלין (ירוק). גרעין היו מוכתם DAPI (כחול). cilia מרובים זוהו 72 שעות לאחר טיפול עם 120 nM דוקסורובין5. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: תצלומים מייצגים של פיברובלסטים בעור שטופלו בלטסול. סיליה ראשית (חץ) זוהתה על ידי אימונולוסואורסנציה. Cilia העיקרי היו מוכתמים עם נוגדן α-טובלין אצטילאט (אדום) עם נוגדן תופין (ירוק). גרעין אקסואנם היו מוכתמים DAPI (כחול). Cilia הראשי זוהו 72 שעות לאחר טיפול עם 1.25 nM taxol5. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר מחברים תיארו שיטות מגוונות לזיהוי סיליה ראשית, לעתים גם מתארים שיטות קיבעון שונות שיכולות להשפיעעל הגילוי שלהם 6,20,21,22. ללא קשר, קשה למצוא פרוטוקול מלא וישיר לזיהוי. הזמינות המוכנה של שיטה כזו תהיה ללא ספק של סיוע רב לחקר חקירת cilia העיקרית, במיוחד בשלבים מוקדמים של מחקר או לשיטה מהירה וקלה כדי לבדוק את הנוכחות של cilia הראשי בקו התא הנבחר. לכן, פרוטוקול זה מתואר בפירוט רב ככל האפשר לזיהוי cilia הראשי במבחנה לאחר סוגים שונים של טיפול.
הפרוטוקול הנוכחי שונה לשימוש על בסיס יומי20,23,24. לדוגמה, 10% פורמלין הוחלף ב-4% PFA, שההכנה הטרייה שלו מומלצת בשל חיי האחסון הקצרים שלה. PFA היא בחירה טובה לשימור מורפולוגיה של תאים ומתאימה במיוחד להדמיה של חלבונים המאוגדים בממברנה. ממיסים אורגניים, כגון מתנול, יש השפעה מיבשת על התא ולהסיר מולקולות קטנות, מסיסים ושומנים במהלך תהליך הקיבעון, ובכך מה שהופך אותו לא מתאים לשימוש בתרחישים מסוימים25. היציבות מושגת עם 0.5% Triton X-100 ב 1x PBS במשך 15 דקות. סרום עזים 1:20 דילול ב 1x PBS במשך 20 דקות משמש כסוכן חסימה. שני הנוגדנים העיקריים, עכבר נגד אצטילאט טובלין וארנב אנטי-ת'י-טובלין, ניתן לדגור בו זמנית במשך 60 דקות באמצעות 1:800 ו 1:300 דילול ב 1x PBS,בהתאמה 20,21,23,24. בנוסף, הנוגדנים המשניים, אנטי-עכבר IgG (מולקולה שלמה) F(ab′)2 שבר-Cy3 נוגדן המיוצר כבשים ואלכסה Fluor488 AffiniPure F(ab')תסיס עז נגד ארנב IgG, היו מדוללים 1:300 ב 1x PBS. הם היו דגירה בו זמנית במשך 45 דקות.
ייתכן שיהיה צורך לנקוט בצעדי סטנדרטיזציה נוספים במקום הנוגדנים העיקריים לדגירה בן לילה. במהלך הפיתוח של הפרוטוקול נמצא כי דגירה בן לילה צריך נפח של לפחות 500-1,000 μL של פתרון נוגדנים ראשוניים, 6 צלחת באר חייב להיות אטום עם parafilm, אחסון חייב להיות ב 4 ° C כדי למנוע אידוי.
השלבים הקריטיים ביותר עבור הכתמים המוצלחים של cilia הראשי הם: 1) בחירה של קו תא ותרגול תרבות תא אופטימלי; 2) שימוש בסיכות מצופה ג'לטין; 3) שימוש עקבי של טרי 4% paraformaldehyde; 4) דגירה של הנוגדן המשני DAPI בחושך; 5) ביצוע היפוך עדין ומיקום של כיסוי על גבי המדיה הרכבה בשקופית.
אין מגבלות פוטנציאליות צפויות ביישומים העתידיים של הפרוטוקול. יתר על כן, מחקר cilia העיקרי הופך רלוונטי יותר במגוון רחב של תחומים, קל, מהיר, ואמין שיטות זיהוי cilia הם חיוניים. יתר על כן, פרוטוקול זה יקל על המחקר העתידי של cilia ראשוני בסוגי תאים שבו cilia הראשי כבר עד כדי כך מבלי שיבחינו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מהלחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה של הרפובליקה הצ'כית - תוכנית פיתוח ארגונית ארוכת טווח היבטים רפואיים של נשק להשמדה המונית של הפקולטה למדעי הבריאות הצבאית, אוניברסיטת ההגנה; משרד החינוך, הנוער והספורט, צ'כיה (פרויקט מחקר ספציפי מס': SV/ FVZ201703) ו-PROGRES Q40/06. תודה גם לדניאל דיאז על עזרתו האדיב בתיקון בשפה האנגלית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
