Summary
प्राथमिक सिलिया सेंट्रियोल से जुड़ी बाहीय संरचनाएं हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंट स्टेनिंग द्वारा प्राथमिक सिलिया का पता लगाना एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है जिसके परिणामस्वरूप बेहद उच्च गुणवत्ता वाली छवियां होती हैं। इस प्रोटोकॉल में, प्राथमिक सिलिया को व्यक्त करने वाले फाइब्रोब्लास्ट को फ्लोरोसेंट या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में स्थिर, इम्यूनोडांडित और इमेजकिया गया था।
Abstract
प्राथमिक सिलिया को कोशिका चक्र प्रगति के दौरान गतिशील रूप से विनियमित किया जाता है, विशेष रूप से कोशिका चक्र के G0/G1 चरणों के दौरान, माइटोसिस से पहले फिर से आकार दिया जा रहा है। प्राथमिक सिलिया को अत्यधिक परिष्कृत तरीकों के साथ कल्पना की जा सकती है, जिसमें ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, 3 डी इमेजिंग, या प्राथमिक सिलिया का स्वचालित पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करना शामिल है। हालांकि, इन तरीकों को करने के लिए प्राथमिक सिलिया के इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला की आवश्यकता होती है। यह प्रकाशन एसिटिलेटेड अल्फा ट्यूबलिन (एक्सोनेम) और गामा ट्यूबलिन (बेसल शरीर) को धुंधला करके विट्रो में प्राथमिक सिलिया के आसानी से पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह इम्यूनोफ्लोर्सेंट धुंधला प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है और उच्च गुणवत्ता वाली छवियों में परिणाम है। वर्तमान प्रोटोकॉल बताता है कि प्राथमिक सिलिया को व्यक्त करने वाली चार सेल लाइनें (C2C12, एमईएफ, एनएचएलएफ और त्वचा फाइब्रोब्लास्ट) को कैसे ठीक किया गया, इम्यूनोडांड किया गया, और फ्लोरोसेंट या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ इमेज किया गया।
Introduction
प्राथमिक सिलिया कोशिका की मां सेंट्रियोल से जुड़े संवेदी, एकान्त, झिल्ली से बंधे, गैर-असंभव संरचनाएं हैं। प्राथमिक सिलिया लाल रक्त कोशिकाओं, एडिपोसाइट्स1,और हेपेटोसाइट्स 2 के अपवाद के साथ अधिकांश कशेरुकी कोशिकाओं पर पाएजातेहैं। प्राथमिक सिलिया माइक्रोट्यूबुल्स द्वारा बनाई गई एक लम्बी एक्सोनमे के रूप में बनाई जाती है, जिसका मुख्य घटक α-ट्यूबलिन है। एक्सोनेम बेसल बॉडी से बढ़ता है, जिसे γ-ट्यूबलिन से संरचित किया जाता है। प्राथमिक सिलिया की लंबाई 2-10 माइक्रोन के बीच भिन्न होती है; हालांकि, ग्लाइसिलेशन, भुखमरी, हाइपोक्सिया, साइटोटॉक्सिक तनाव, या आयनीकरण विकिरण3,4,,5,,6,,7के संपर्क में आने के बाद इसके आयाम बदल सकते हैं।, आमतौर पर, कोशिकाओं में केवल एक प्राथमिक सिलियम होता है, जो कोशिका प्रसार और भेदभाव8,,9के लिए महत्वपूर्ण मॉर्फोजेनेसिस और सेल सिग्नलिंग रास्तों में शामिल होता है।
प्राथमिक सिलिया को कोशिका चक्र प्रगति के दौरान गतिशील रूप से विनियमित किया जाता है, विशेष रूप से जी0/जी1 चरणों के दौरान, और एचडीएसी 6 (हिस्टोन डेसेटाइलेज 6)10द्वारा मध्यस्थता ट्यूबलिन डेसेटिलेशन से जुड़ी प्रक्रिया में माइटोसिस में प्रवेश करने से पहले फिर से आकार दिया जाता है। प्राथमिक सिलिया अवशोषण का सटीक क्षण कोशिका प्रकार और इस प्रक्रिया में सीधे शामिल जीन की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है, जैसे अरोड़ा ए, पीएलके 1, टीसी टेक्स-1 11,1112,,13।, सेल प्रकार के आधार पर, प्राथमिक सिलिया विभिन्न प्रकार के रिसेप्टर्स, आयन चैनल और सक्रिय सिग्नलिंग रास्ते व्यक्त करते हैं। इनमें प्रसार और अस्तित्व को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण सिग्नलिंग रिसेप्टर्स, ईजीएफआर, पीडीजीएफआर और एफजीएफआर शामिल हैं। इसके अलावा कुछ सिग्नलिंग रास्ते भी शामिल हैं जो हेजहोग, नॉच और डब्ल्यूएनटी सहित एक या एक से अधिक अंगों के कार्य को प्रभावित कर सकते हैं। इन रिसेप्टर्स और सिग्नलिंग रास्तों के लिए धन्यवाद, प्राथमिक सिलिया भी एक रसायनकारण कार्य करते हैं। यह फ़ंक्शन प्राथमिक सिलिया को पायदान, हार्मोन और जैविक रूप से सक्रिय पदार्थों जैसे सेरोटोनिन या सोमाटोस्टैटिन के लिए विशिष्ट लिगांड का पता लगाने की अनुमति देता है। विभिन्न लंबाई के प्राथमिक सिलिया द्वारा प्रदर्शित अन्य विशिष्ट कार्यों में तापमान, गुरुत्वाकर्षण और ओस्मोलिटी14में परिवर्तन की प्रतिक्रिया शामिल है।
प्राथमिक सिलिया को विभिन्न तरीकों जैसे लाइव विज़ुअलाइज़ेशन, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, 3 डी इमेजिंग, या प्राथमिक सिलिया,5, 15,,16,,17के स्वचालित पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा कल्पना की जा सकती है।17 हालांकि, इन तरीकों अत्यधिक विशिष्ट हैं और चल रहे अनुसंधान अनुसंधान के हर चरण में प्राथमिक सिलिया धुंधला करने के लिए बुनियादी, तेजी से, और आसान तरीकों की जरूरत है। वर्णित सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्राथमिक सिलिया का पता लगाने के लिए एक आसान और उपयोगी तरीका है।
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Protocol
1. संस्कृति मीडिया, समाधान, और व्यंजनों की तैयारी
- कवर्लिप्स (22 x 22 मिमी) को ऑटोक्लेव करें। 6 अच्छी तरह से प्लेटें तैयार करें। गल भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और एंटीबायोटिक पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन और कमरे के तापमान (आरटी) के लिए संस्कृति माध्यम गर्म । ट्राइपसिन-ईडीटीए (0.25%) का उपयोग करें और कोशिकाओं को पारित करने के लिए 1x पीबीएस (कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ फॉस्फेट बफर खारा) ।
- डीएच 2 ओ (डीएच 2 ओ के20मिलीएल में 800 मिलीग्राम पीएफए)2में ताजा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) तैयार करें। पीएफए को प्रत्येक प्रयोग के लिए हौसले से तैयार किया जाना चाहिए। हुड में 30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को हिलाएं और गर्म करें। आरटी में ठंडा करें। समाधान स्पष्ट होने तक 1 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड जोड़ें (पीएच = 7.2-7.4)। 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: पीएफए विषाक्त है; हमेशा पर्याप्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें और रासायनिक हुड में तैयार करें। - संस्कृति मीडिया के 500 एमएल, DMEM (Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम) 10% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2% ग्लूटामाइन युक्त तैयार करें।
- बाँझ डीएच 2 ओ (डीएच2ओ के 13 एमएल में 130 मिलीग्राम जिलेटिन) में 1% जिलेटिन के13एमएल तैयार करें। 6 अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक कुएं के लिए 1% जिलेटिन के 2 एमएल का उपयोग करें। बाँझ रखें।
- 70% इथेनॉल का उपयोग करके लैमिनार फ्लो हुड को साफ करें। प्रयोग शुरू करने से पहले लैमिनार फ्लो हुड के अंदर आवश्यक सामग्री रखें।
2. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री धुंधला के लिए सेल संस्कृति
- कोशिकाओं को गल (इस अध्ययन में C2C12, MEF, NHLF, और त्वचा फाइब्रोब्लास्ट) मानक तकनीकों का उपयोग कर और उन्हें तैयार मीडिया के ~ 10-12 एमएल के साथ पूरक T75 फ्लास्क में प्लेट करें। 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 /90%सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) पर इनक्यूबेट जब तक कोशिकाएं 70% संगम तक नहीं पहुंच जातीं।
- इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को निकालकर लैमिनार फ्लो हुड में रखें। संस्कृति मीडिया को हटा दें और कोशिकाओं को संक्षेप में 1x पीबीएस के साथ 2x कुल्ला। T75 फ्लास्क में 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के ~ 2 मिलील जोड़ें और ~ 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सेल टुकड़ी की निगरानी के लिए उल्टे माइक्रोस्कोप पर समय-समय पर जांच करें।
नोट: इनक्यूबेशन समय सेल लाइन पर निर्भर करता है और इसलिए अनुभवजन्य निर्धारित किया जाना चाहिए । - धीरे-धीरे संस्कृति मीडिया के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए सावधानी से पिपिंग करें। यदि आवश्यक हो तो फिर से फ्लास्क कुल्ला करें।
- सेल सस्पेंशन को 50 एमएल शंकु नली में रखें और 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज ~ 200 एक्स जीपर रखें । सुपरनैंट को डिकंट करें, संस्कृति मीडिया के 10 एमएल जोड़ें, और धीरे-धीरे गोली को फिर से खर्च करें। सेल सस्पेंशन के 20 माइक्रोन लें और ट्राइपैन ब्लू के साथ 1:1 अनुपात में मिलाएं और मानक विधि के बाद एक साइटोमीटर में गिनती करें।
- चिमटी का उपयोग कर एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं के अंदर एक कवरस्लिप रखें। कुओं में ~ 2 एमएल डालने से जिलेटिन के साथ कवरस्लिप कोट करें। इससे कोशिकाओं को कवरस्लिप से अटैच करने में मदद मिलेगी। जिलेटिन का घोल निकालें और कुछ मिनटों के लिए हवा को सूखने दें। अब कोशिकाओं की खेती के लिए कवरलिप तैयार हैं। खेती तुरंत शुरू करें।
- प्रत्येक कुएं में 100,000 फाइब्रोब्लास्ट बीज और संस्कृति मीडिया के 2 एमएल जोड़ें। 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2/90% आरएच पर इनक्यूबेट करें। इस बिंदु पर, कोशिकाओं को उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार इलाज किया जा सकता है। सिलिटेशन को प्रेरित करने के लिए उपचार पहले4,5वर्णित किए गए हैं ।
नोट: प्रारंभिक सीडिंग संख्या कोशिकाओं के दोहरीकरण समय पर निर्भर करती है और तदनुसार निर्धारित की जानी चाहिए।
3. इन विट्रो में प्राथमिक सिलिया का इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला
- आरटी के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड गर्म करें। पाश्चुर पिपेट, 1x पीबीएस (आरटी), अपशिष्ट कंटेनर, 15 एमएल शंकु नली, माइक्रोपिपेट (0.5-10 माइक्रोल, 20-200 माइक्रोल, और 100-1,000 μ) और सुझाव तैयार करें। इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को लें और बेंच में रखें।
नोट: धुंधला प्रक्रिया बाँझ परिस्थितियों में प्रदर्शन करने की जरूरत नहीं है । सभी समाधान आरटी पर होना चाहिए । - प्रत्येक कुएं से मीडिया निकालें। कवरस्लिप को कुएं के अंदर छोड़ दें। बहुत धीरे 1x PBS के 2 एमसीएल के साथ कोशिकाओं 3x धोने। एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, कोशिकाओं को ठीक करने के लिए प्रत्येक कुएं में 4% पीएफए के 2 एमएल जोड़ें। आरटी में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट । पीएफए को हटाएं और 1x पीबीएस के साथ 3x धोएं ।
नोट: इनक्यूबेशन अवधि के दौरान पूरे कवरस्लिप को कवर करने के लिए हमेशा पर्याप्त मात्रा का उपयोग करें। कोशिकाओं को कभी सूखने न दें। कभी भी किसी भी समाधान को सीधे कवरस्लिप पर न डालें। - उपयोग से पहले 1x पीबीएस 10 मिनट के 13 एमएल में 0.5% ट्राइटन एक्स-100 तैयार करें। प्रत्येक कुएं में 2 एमएल जोड़ें। 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट । 1x पीबीएस के साथ धीरे से 4x धोएं।
नोट: ट्राइटन एक्स-100 आरटी में पीबीएस में अघुलनशील है। 05% ट्राइटन एक्स-100 घोल को पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें ताकि इसे भंग किया जा सके। - उपयोग से 5 मिनट पहले बकरी सीरम गल। एक अवरुद्ध समाधान के रूप में 1:20 अनुपात में 1x PBS में बकरी सीरम पतला। प्रत्येक कवरस्लिप में 150 माइक्रोल जोड़ें और आरटी में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: यदि आवश्यक हो तो अवरुद्ध अवधि को 60 मिनट तक लम्बा करें। बकरी सीरम से ब्लॉक करने के बाद कोशिकाओं को न धोएं। - उपयोग से 5 मिनट पहले प्राथमिक एंटीबॉडी (यानी, एंटी-एसीटिलेटेड अल्फा ट्यूबलिन और एंटी-गामा ट्यूबलिन) को पिघलाएं। 1x पीबीएस में एंटीबॉडी को अलग से पतला करें: माउस एंटी-एसिटिलेट अल्फा ट्यूबलिन 1:800 अनुपात में और खरगोश विरोधी गामा ट्यूबलिन 1:300 अनुपात में। ब्लॉकिंग समाधान निकालें। धोएं नहीं। दोनों एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 150 μL जोड़ें कवरस्लिप और आरटी में 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
नोट: यदि रात भर में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधानों के 500-1,000 माइक्रोन का उपयोग करें, तो पैराफिन फिल्म के साथ 6 अच्छी तरह से प्लेट को सील करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, आर्द्रता कक्ष में एंटीबॉडी और इनक्यूबेट के 150 माइक्रोन का उपयोग करें। - प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें। 1x पीबीएस के 2 एमएल के साथ कवरस्लिप को बहुत धीरे से 3x धोएं। 1x पीबीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी को 1:300 अनुपात में Cy3 भेड़ विरोधी माउस और एलेक्सा Fluor488 बकरी विरोधी खरगोश को अलग से कमजोर करके तैयार करें। कवरस्लिप में दोनों माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 150 माइक्रोन जोड़ें। अंधेरे में आरटी में ४५ मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
नोट: फोटोब्लैचिंग से बचने के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें। माध्यमिक एंटीबॉडी के अन्य संयोजनों का उपयोग आवश्यकतानुसार किया जा सकता है। - निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक DAPI (4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल) समाधान तैयार करें। अतिरिक्त एलिकोट्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 1x पीबीएस के 50 एमएल में स्टॉक एलिकोट (1:5,000) से पतला 10 माइक्रोन। इस कमजोर पड़ने के 2 एमएल को कवरस्लिप में जोड़ें। अंधेरे में आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
नोट: फोटोब्लैचिंग से बचने के लिए अंधेरे में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करना महत्वपूर्ण है। दापी कमजोर पड़ने को 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है। - 2 सुई, स्लाइड, चिमटी, और बढ़ते मीडिया तैयार करें। स्लाइड्स को लेबल करें।
- कुओं से दापी समाधान निकालें। 1x पीबीएस के साथ 3x धोएं। प्रत्येक स्लाइड पर बढ़ते मीडिया की एक बूंद रखो । सुई का उपयोग धीरे अच्छी तरह से नीचे से कवरस्लिप उठाने के लिए। चिमटी का उपयोग कर कवरस्लिप फ्लिप और धीरे से यह बढ़ते मीडिया की बूंद पर जगह है । किसी भी बुलबुले को ध्यान से हटा दें।
- स्लाइड्स को लाइट से बचाकर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- प्राथमिक सिलिया की कल्पना करने के लिए उच्च आवर्धन के साथ फ्लोरोसेंट या कॉन्फोसल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
नोट: स्लाइड 2 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है।
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Representative Results
प्राथमिक सिलिया का इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है जिसके परिणामस्वरूप उच्च गुणवत्ता वाली छवियां होती हैं। इन प्रयोगों में, प्राथमिक सिलिया को व्यक्त करने वाले फाइब्रोब्लास्ट को ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद फ्लोरोसेंट या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में स्थिर, इम्यूनोडांडित और इमेजकिया गया था। प्राथमिक सिलियम का पता एसिटिलेटेड α-ट्यूबलिन और γ-ट्यूबलिन का उपयोग करके लगाया गया था। प्राथमिक सिलिया का मूल्यांकन विभिन्न स्तरों पर किया जा सकता है और इस संबंध में किसी भी परिवर्तन को आयनीकरण विकिरण, कोशिका चयापचय (जैसे, भुखमरी), या रासायनिक उपचार (जैसे, साइटोस्टैटिक्स)5,,18के संपर्क से जोड़ा जा सकता है।
प्राथमिक सिलिया पर आयनीकरण विकिरण के प्रभाव का अध्ययन विभिन्न सेल लाइनों (उदाहरण के लिए, मायोब्लास्ट सेल लाइन C2C12) में किया गया है, जो विकिरणित थे (2, 6, 10, और 20 जीवाई) और प्राथमिक सिलिया घटना में परिवर्तन का विश्लेषण किया गया। अल4में फिलिपोवा के अनुसार, कम विकिरण खुराक C2C12 कोशिकाओं में एक भी प्राथमिक सिलिया की घटना को संशोधित नहीं करते हैं । हालांकि, आयनीकरण विकिरण (यानी, 20 जीवाई) की उच्च खुराक ने कई प्राथमिक सिलिया(चित्रा 1ए, बी, सी)की उपस्थिति को प्रेरित किया। इसी तरह, जब NHLF कोशिकाओं को 2 Gy पर विकिरणित किया गया था तो प्राथमिक सिलिया इम्यूनोफ्लोरेसेंस(चित्र 2)द्वारा पता लगाया गया था।
मेटाबोलिक तनाव प्राथमिक सिलिया19की आवृत्ति को बढ़ाने के लिए भी जाना जाता है । इस मामले में, एमईएफ फाइब्रोब्लास्ट को प्राथमिक सिलिया घटना(चित्रा 3)में परिवर्तन के लिए भूखे और विश्लेषण किया गया था।
इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग से पता चला कि फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं ने डोक्सोरुबिन और टैक्सोल के साथ उपचार के बाद प्राथमिक सिलिया किया। 120 एनएम डॉक्सोरुबिकिन के साथ इलाज किए गए उन फाइब्रोब्लास्ट्स ने एक प्राथमिक सिलियम(चित्रा 4)व्यक्त किया; उच्च खुराक ने कई प्राथमिक सिलिया(चित्रा 5)की उपस्थिति को प्रेरित किया। 1.25 एनएम टैक्सोल के साथ उपचार के परिणामस्वरूप एक प्राथमिक सिलियम(चित्र 6)की उपस्थिति भी हुई। डॉक्सोरुबिसिन के साथ उपचार के विपरीत, टैक्सोल5की उच्च खुराक के साथ उपचार के बाद कई सिलिया का पता नहीं चला।
चित्रा 1: किरणित C2C12 कोशिकाओं में प्राथमिक सिलिया की घटना। C2C12 कोशिकाओं में प्राथमिक सिलिया के प्रतिनिधि तस्वीरें । प्राथमिक सिलिया का पता लगाने इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया गया था। प्राथमिक सिलिया के एक्सोनमे (तीर) का मूल्यांकन एसिटिलेटेड α-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (लाल) और बेसल शरीर के साथ γ-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (तीर, हरे) द्वारा किया गया था। नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ था। (A)और(ख)20 Gy के साथ विकिरण के बाद 72 घंटे में कई सिलिया मनाया गया। (ग) 20 जीवाई4के साथ 72 घंटे के विकिरण के बाद एकल प्राथमिक सिलिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: किरणित एनएचएलएफ कोशिकाओं में प्राथमिक सिलिया का पता लगाना। NHLF कोशिकाओं में प्राथमिक सिलिया के प्रतिनिधि तस्वीरें । प्राथमिक सिलिया (तीर) का पता लगाने इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया गया था। प्राथमिक सिलिया के एक्सोनम्स को एसिटिलेटेड α-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (लाल) और बेसल निकायों के साथ γ-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (हरा) के साथ दाग दिया गया था। नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ था। 2 जीआई में विकिरण के 24 घंटे बाद एकल प्राथमिक सिलिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: सीरम भुखमरी से प्रेरित मेटाबोलिक तनाव के बाद एमईएफ कोशिकाओं में प्राथमिक सिलिया की घटना। एमईएफ कोशिकाओं में सीरम भुखमरी (0.1% एफबीएस) के बाद प्राथमिक सिलिया 24 एच की प्रतिनिधि तस्वीरें। प्राथमिक सिलिया (तीर) का पता लगाने इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया गया था। एक्सोनम्स को एसिटिलेटेड α-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (लाल) के साथ लेबल किया गया था। बेसल के शवों पर γ-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (ग्रीन) दाग थे । नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: त्वचा फाइब्रोब्लास्ट में प्राथमिक सिलिया की प्रतिनिधि तस्वीरें। प्राथमिक सिलिया (तीर) का पता लगाने इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया गया था। प्राथमिक सिलिया को एसिटिलेटेड α-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (लाल) से दाग दिया गया था, जबकि बेसल निकायों को γ-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (हरे रंग) से दाग दिया गया था। नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ था। प्राथमिक सिलिया 120 एनएम डॉक्सोरुबिसिन5के साथ उपचार के बाद 72 घंटे का पता चला. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: त्वचा फाइब्रोब्लास्ट में कई सिलिया के प्रतिनिधि तस्वीरें। प्राथमिक सिलिया (तीर) का पता लगाने इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया गया था। एक्सोनम्स को एसिटिलेटेड α-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (लाल) द्वारा लेबल किया गया था और बेसल निकायों को γ-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (हरा) से सना हुआ था। नाभिक दापी (नीला) से सना हुआ था। 120 एनएम डॉक्सोरुबिसिन5के साथ उपचार के बाद 72 घंटे में कई सिलिया का पता चला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के प्रतिनिधि तस्वीरें टैक्सोल के साथ इलाज किया । प्राथमिक सिलिया (तीर) इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा पता लगाया गया था। प्राथमिक सिलिया को एसिटिलेटेड α-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (लाल) और γ-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (हरे रंग) के साथ दाग दिया गया था। एक्सोनेम नाभिक को डीएपीआई (नीला) से सना हुआ था। प्राथमिक सिलिया 72 घंटे उपचार के बाद 1.25 एनएम टैक्सोल5के साथ पाया गया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
कई लेखकों ने प्राथमिक सिलिया का पता लगाने के लिए विविध तरीकों का वर्णन किया है, कभी-कभी विभिन्न निर्धारण विधियों का वर्णन भी किया है जो उनकी पहचान6,20, 21,,,22को प्रभावित कर सकते हैं।,21 भले ही, पता लगाने के लिए एक पूर्ण और सीधा प्रोटोकॉल ढूंढना मुश्किल है। इस तरह की विधि की तैयार उपलब्धता निस्संदेह प्राथमिक सिलिया जांच के अध्ययन के लिए बहुत सहायता की होगी, विशेष रूप से अनुसंधान के प्रारंभिक चरणों में या एक चुने हुए सेल लाइन में प्राथमिक सिलिया की उपस्थिति का परीक्षण करने के लिए एक त्वरित और आसान विधि के लिए। इसलिए, इस प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के उपचार के बाद प्राथमिक सिलिया इन विट्रो का पता लगाने के लिए यथासंभव विस्तार से वर्णित किया गया है।
वर्तमान प्रोटोकॉल को दैनिक आधार पर उपयोग के लिए संशोधित किया गया था20,23,24. उदाहरण के लिए, 10% फॉर्मलिन को 4% पीएफए द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था, जिसकी ताजा तैयारी की सिफारिश इसके छोटे भंडारण जीवन के कारण की जाती है। पीएफए सेल आकृति विज्ञान के संरक्षण के लिए एक अच्छा विकल्प है और विशेष रूप से झिल्ली से बंधे प्रोटीन के दृश्य के लिए अनुकूल है। मेथनॉल जैसे ऑर्गेनिक सॉल्वैंट्स का सेल पर डिहाइड्रेटिंग प्रभाव पड़ता है और फिक्सेशन प्रक्रिया के दौरान छोटे, घुलनशील अणुओं और लिपिड को हटा दिया जाता है, इस प्रकार यह कुछ परिदृश्यों25में उपयोग के लिए अनुपयुक्त हो जाता है। पर्मेबिलाइजेशन 15 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स-100 के साथ हासिल किया जाता है। 20 मिनट के लिए 1x PBS में एक 1:20 कमजोर पड़ने में बकरी सीरम एक अवरुद्ध एजेंट के रूप में प्रयोग किया जाता है । प्राथमिक एंटीबॉडी, माउस एंटी-एसिटिलेटेड ट्यूबलिन और खरगोश विरोधी γ-ट्यूबलिन दोनों को,23,क्रमशः20, 21, 23, 24,21में 1:800 और 1:300 कमजोर पड़ने का उपयोग करके 60 मिनट के लिए समवर्ती रूप से इनक्यूबेटेड किया जा सकता है।24 इसके अलावा, माध्यमिक एंटीबॉडी, एंटी-माउस आईजीजी (पूरे अणु) एफ (ab′) 2 टुकड़ा-Cy3 एंटीबॉडी भेड़ और एलेक्सा Fluor488 AffiniPure एफ (ab') ₂ टुकड़ा बकरी विरोधी खरगोश IgG में उत्पादित, 1x PBS में 1:300 पतला किया गया । वे ४५ मिनट के लिए समवर्ती रूप से इनक्यूबेटेड थे ।
अतिरिक्त मानकीकरण कदम उठाना आवश्यक हो सकता है प्राथमिक एंटीबॉडी को रातोंरात इनक्यूबेटेड किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल के विकास के दौरान यह पाया गया कि एक रात इनक्यूबेशन प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के कम से कम 500-1000μL की मात्रा की जरूरत है, 6 अच्छी तरह से प्लेट पैराफिल्म के साथ बंद किया जाना चाहिए, और भंडारण वाष्पीकरण को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए।
प्राथमिक सिलिया के सफल धुंधला के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) सेल लाइन और इष्टतम सेल संस्कृति अभ्यास का विकल्प; 2) जिलेटिन कोटेड कवर्लिप्स का उपयोग; 3) ताजा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का लगातार उपयोग; 4) अंधेरे में माध्यमिक एंटीबॉडी और DAPI की इनक्यूबेशन; 5) स्लाइड में बढ़ते मीडिया के शीर्ष पर कवरस्लिप के एक सौम्य फ्लिप और प्लेसमेंट का प्रदर्शन करना।
प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों में कोई अप्रत्याशित संभावित सीमाएं नहीं हैं। इसके अलावा, प्राथमिक सिलिया अनुसंधान विभिन्न क्षेत्रों में अधिक प्रासंगिक होता जा रहा है, और आसान, तेज और विश्वसनीय सिलिया का पता लगाने के तरीके आवश्यक हैं। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल सेल प्रकारों में प्राथमिक सिलिया के भविष्य के अध्ययन को सुगम बना देगा जिसमें प्राथमिक सिलिया को पता नहीं चल पाया है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहींहै ।
Acknowledgments
इस काम को चेक गणराज्य के रक्षा मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था - दीर्घकालिक संगठन विकास योजना सैन्य स्वास्थ्य विज्ञान संकाय, रक्षा विश्वविद्यालय के सामूहिक विनाश के हथियारों के चिकित्सा पहलू; शिक्षा, युवा और खेल मंत्रालय, चेक गणराज्य (विशिष्ट अनुसंधान परियोजना नहीं: SV/FVZ201703) और PROGRES Q40/06 । अंग्रेजी भाषा संशोधन में अपनी तरह की सहायता के लिए डैनियल डियाज़ को भी धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
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